原子荧光实验常见故障排除方法
您遇到了什么问题？
1、软件初始化显示“通讯失败”提示
2、出现“超8V”现象
3、测量无信号或信号异常
4、还原剂瓶中和载流液中冒气泡
5、单/双阴极灯判断错误和双泵停、转异常和气路电磁阀控制异常
6、显示“无载气”
7、其它问题检查
8、测量结果误差
故障排除方法
1、通信失败
通讯失败的原因：
（1）仪器主机电源开关未打开
★（2）电脑和仪器开机顺序不对
（3）通讯接口（RS-232电缆及插头）有问题
（4）主机电路不正常（硬件80C196KB或AD574坏）
（5）软件系统
解决方法
（1）关闭所有装置，重新开启，先开微机、再开仪器主机
（2）检查接口是否正确、电缆是否正常、插头接触是否良好
（3）重新安装操作软件
2、出现“超8V”现象
硬件74HC244或AD574或RS－232C坏
3、测量无信号或信号异常（所有曲线测量值很小）
1）、仪器电路故障：
判断方法：在灯能量显示处反射，有能量带变化，仪器电路正常。否则，仪器电路不正常。
★2）、反应系统：
管道堵、漏，水封无水、未进或进不足样品和还原剂（检查进样管路），氢化物未进入原子化器
★3）、未形成氩氢火焰
还原剂是否现配、还原剂浓度、酸度不够，产生的氢气量太少，点火炉丝位置与石英炉芯的出口相距远。
4）、反应条件不正确
5）、硬件D18－8255损坏
4、还原剂瓶中和载流液中冒气泡
★泵管压块未压紧
5、单/双阴极灯判断错误和双泵停、转异常和气路电磁阀控制异常
硬件D18－8255损坏，双泵停、转异常也可能是D15－8253引起的。
6、显示“无载气”
★气瓶未打开或气压不够，需调节气体压力开关
7、其它问题检查
1）、光路调节不正
2）、炉子过高或过低
3）、气路漏气或堵塞
4）、泵管压块未压紧或过紧
5）、二级分离器忘加水或水被抽干。
6）、WIN98设置——关掉“屏幕保护”和“计划任务”
8、测量结果误差
样品处理过程中由于环境污染，导致回收率偏高
样品处理过程中所使用的试剂含有较高的被测元素，为防止此误差产生，所使用的试剂应选用优级纯。样品空白处理不当。
★测量结果小数位数达不到要求，需调整“测量条件”下标准溶液浓度的输入小数位数然后重新测量。（注：带“★”号为已碰到的故障，所有故障原因只是可能原因，并不排除有其它的引起原因）
在日常原子荧光光谱分析中，特别是当仪器使用时间长、频率高时，常会出现一些问题，常见的有：灵敏度突然降低；无荧光信号；空白信号很高；荧光信号不稳定；工作曲线线性差；图形不正常等情况。有资料[3-4]对这些问题及其解决办法进行了总结。这些现象的出现通常与以下因素有关：
1．空心阴极灯
由于受到设计和制造工艺的限制，目前生产的高强度空心阴极灯在稳定性和使用寿命方面还存在一些问题，尤其是Hg、Bi、Te、Se灯。因此，在原子荧光光谱分析中要特别注意由空心阴极灯引起的问题。
a、灵敏度降低;稳定性差,空心阴极灯老化。适当提高灯电流或负高压；更换空心阴极灯。
b、新购置的空心阴极灯，但基线空白不稳定。空心阴极灯预热时间不够。空心阴极灯预热30分钟，并空载运行10-20分钟。
c、测定灵敏度变化较大。双道不平衡，空心阴极灯照射氩氢火焰的位置不正确。用调光器调节空心阴极灯至合理位置。
d、没有信号。空心阴极灯未点燃。点燃空心阴极灯。
2．光路系统
光路系统的问题主要是由空心阴极灯的聚焦和照射氩氢火焰的位置引起,常出现基线信号值很高现象，特别是在测定Hg和Pb的时候。主要是因为石英炉的高度和透镜聚焦点没有调节到最佳位置。另一个光路系统的问题是双道干扰。
a、基线信号值很高，原子化器的高度不合适。调节原子化器高度。
b、一些元素灵敏度很低，透镜聚焦点不合适。调节透镜聚焦点。
c、一道荧光信号很强,另一道测定结果偏高或低。双道干扰。单道测定。
3．管道系统
原子荧光光谱分析中，管道系统是仪器非常重要的部分，也是使用中常出问题的部分。特别是仪器使用频率高、工作量大时，由于硅胶老化、破裂、管道积水和反应沉淀物堵塞管道系统等原因，经常使仪器不能正常工作。
a、灵敏度降低；信号图形改变；积分时间增加。泵管老化、破裂。压紧泵管或更换泵管。
b、没有荧光信号或很低；图形有尖峰状。气路系统积水、漏气、堵塞；连接件破裂。清洗、疏通或更换管道；更换连接件。
c、图形有锯齿状，不稳定。通风口风量太大。调小通风口风量。
d、稳定性差；灵敏度降低；“记忆效应”严重。石英炉芯、气液分离器、反应模块玷污。取下用15%HC煮沸30分钟。
4．试剂空白
原子荧光光谱法常用于痕量元素分析中，试剂空白是影响分析质量的重要因素，特别是在汞、锑、硒、铅和镉的测定中，试剂空白的影响尤其突出。使用时必须对所用试剂进行检查，选择生产厂家、试剂级别和生产批号。
测定元素主要试剂影响解决方法
Hg HCl 选择生产厂家,进行检查
Sb 酒石酸选择生产厂家,进行检查
Se H2SO4 选择生产厂家,进行检查；NaBr/HBr除硒
Pb HCl和铁氰化钾重结晶或吸附提纯试剂
Cd HCl 选择生产厂家,进行检查
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤：
计算机硬件常见故障排除及解决方法 1.CPU常见故障排除 常见的CPU故障大致有以下几种:散热故障、重启故障、黑屏故障及超频故障。由于CPU 本身出现故障的几率非常小，所以大部分故障都是因为用户粗心大意造成的。 1.CPU针脚接触不良导致电脑无法启动 2.CPU高温引起的死机或重启（风扇及硅胶或本身损坏） 3.CPU超屏引起显示器黑屏 4.夏日里灰尘引发的死机故障 2.主板常见故障排除 电脑主板产生故障的原因，一般有三个方面：一是元器件质量引起的故障。这种故障在一些劣质的板子上比较常见，主是指主板的某个元器件因本身质量问题而损坏，导致主板的某部分功能无法正常使用，系统无法正常启动，自检过程中报错等现象。 1.电容爆奖在一些劣质主板上是常有的事情 2.是环境引发的故障。因外界环境引起的故障，一般是指人们在未知的情况下或不可预测、不可抗拒的情况下引起的。如雷击、市电供电不稳定，它可能会直接损坏主板，这种情况下人们一般都没有办法预防;外界环境引起的另外一种情况，就是因温度、湿度和灰尘等引起的故障。这种情况表现出来的症状有：经常死机、重启或有时能开机有时又不能开机等，从而造成机器的性能不稳定。 3.人为故障。有些朋友，电脑操作方面的知识懂得较少，在操作时不注意操作规范及安全，这样对电脑的有些部件将会造成损伤。如带电插拔设备及板卡，安装设备及板卡时用力过度，造成设备接口、芯片和板卡等损伤或变形，从而引发故障。 4.开机无显示的故障处理。一般认为，开机无显示故障是硬件引起，这种看法有一定的片面性。在检修这类故障的时候，我们一般还是应该先从软故障的角度入手解决问题。开机时，若电源指示灯没有亮，一般应该怀疑外接电源没有接好或电源有问题。若开机电源指示灯亮但无显示，这种情况一般应按以下的顺序去排查故障： 一是通过主板的跳线(一般在CMOS的电池旁边)清除主板上CMOS原有的设置再开机。 二是重新安装CPU后再开机。 三将电脑硬件组成最小系统后再开机。 经过以上三个步骤后，若开机还是没有显示，这时可以在最小系统中拔掉内存。若开机报警，则说明主板应该没有太大的问题。故障的怀疑重点应该放在其他设备上。若在拔掉内存后开机不报警，一般来说，故障可能出在主板上。维修或更换 开机有显示但自检无法通过的故障处理。开机有显示但自检无法通过，这类故障一般都会有错误提示信息。我们在排除这类故障时，主要是根据该提示信息，找出故障点。但这类故障一般是因为主板的某个部件损坏引起，多数应该属于硬故障，但也不排除软故障引起的可能。针对软故障的排查，我们可以依照以下的顺序进行： ①.主板温控失常引发主板“假死” 故障分析：由于现在CPU发热量非常大，所以许多主板都提供了严格的温度监控和保护装置。一般CPU温度过高，或主板上的温度监控系统出现故障，主板就会自动进入保护状态。拒绝加电启动，或报警提示。上述例子就是由于主板温度监控线脱落，导致主板自动进入保护状态，拒绝加电。所以当你的主板无法正常启动或报警时，先检查下主板的温度监控装置
免疫荧光操作步骤及注意事项 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4?或-20?避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4?保存3个月。PBS洗涤3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4?过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 (一)细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好
01 点火问题 在分析工作中，经常会碰到部分仪器点火线圈不亮，无法正常点火。首先要检查点火炉丝是否正常，如炉丝断则需要更换炉丝，如炉丝亮但点不燃火焰，就需要检查燃气或控制阀，检查炉丝与炉芯的位置是否合适，排除这些故障后仪器可正常点火。 02 无信号强度 在仪器检定过程中，经常遇到仪器测量标准溶液后无响应荧光强度。遇到此类问题，首先，应该检查静态光源，检查元素灯是否点亮。若仪器灯能量正常，说明仪器电路部分正常，则需要进一步检查反应系统或原子化系统。检查仪器泵管松紧是否合适，管道有无堵塞破裂。如出现上述情况，试剂没有进系统，仪器没有发生氧化还原反应，则不会产生信号。更换管道，调整泵管松紧可以解决此问题。 检定标准溶液的酸度或还原剂浓度不够，不能生成被测元素的氢化物，无法正常原子化也会造成仪器无响应荧光强度，这就需要检查配置标准溶液所使用的酸和还原剂浓度。 03 仪器灵敏度低 在检定过程中，由于要检定仪器的测量线性及检出限，需要在仪器上测量0.0 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL、10.0 ng/mL砷锑混合标准溶液的线性。重复测量3次，记录荧光强度值，按照线性回归计算斜率b，再对空白溶液连续进行11次荧光强度测量，计算其标准偏差，然后计算仪器的检出限QL。JJG939-2009《原子荧光光度计检定规程》要求仪器检出限为0.4 ng。检定中经常碰到仪器灵敏度低，调整仪器的灯电流和负高压后仍无法达到检定规程的要求，这就需要排查解决灵敏度低的问题。 首先检查炉丝是否老化，必要时更换炉丝，然后检查原子化器位置是否偏移造成焦距的变化而影响仪器的灵敏度。调光不好，焦距不在炉芯中心也会造成仪器灵敏度低，这就需要重新调整炉芯和光路位置。载气流量低，排废太快，载流管或毛细管变形或折弯等原因，都会造成标准溶液无法正常原子化而导致仪器灵敏度降低，这就需要检查仪器的进样系统，有必要时需更换仪器进样系统管路。在检定过程中，经常碰到仪器所使用的氩气纯度不够而造成仪器灵敏度降低，更换高纯度氩气后可解决此问题。所选用元素灯的强度也会对仪器的灵敏度造成影响，在仪器灵敏度较低时需要更换元素灯。 04 仪器信号不稳定 可以降低仪器的灯电流和负高压后信号值，如果还是不稳定，这时需要检查仪器所处的环境是否有强光干扰，仪器的检测窗口若有强光照射，会引起仪器荧光信号不稳定，这就需要遮光进行检定。然后观察仪器的火焰是否跳动，若有明显跳动则检查仪器抽排风口是否抽力太大，有气流影响而造成仪器火焰不稳定。 排除上述问题后，仪器信号仍不稳定，就需要检查仪器的水封、废液管，水封和废液管不畅
（2）实验方法 （1）用PBS浸洗准备好的细胞涂片3次，每次3min。 （2）0.1%的TritonX-100（用PBS配制）处理涂片5-10min。 （3）PBS洗净载玻片上的TritonX-100，加0.1%的牛血清白蛋白BSA溶液(用PBS 配制)孵育固定好的细胞30min。 （4）弃去BSA，滴加0.1%BSA稀释的一抗(1:200)，即软骨多糖诱导48hH22细胞免疫的小鼠血清，免疫湿盒中4℃过夜。同时用正常小鼠血清作对照。 （5）用PBS浸洗细胞涂片3次，每次3min，以确保一抗清洗彻底。 （6）避光条件下滴加BSA稀释的荧光标记的山羊抗小鼠IgG二抗(1:200)，然后室温、暗室中孵育1.5-2h。 （7）PBS洗净荧光二抗，用荧光显微镜观察。 为了防止由于一抗未洗净带来的假阳性现象，实验中同时设置一组阴性对照，涂片染色操作步骤同上，把一抗换成PBS。 3.4.1.1免疫荧光染色法检测抗原、抗体结合情况将H22鼠肝癌细胞制成细胞涂片，分别以空白组小鼠血清、模型组小鼠血清和免疫组小鼠
血清为一抗，经荧光二抗染色后得到免疫荧光检测结果，并计算各组细胞的阳性表达率，结果如图3-1所示。 (a) (b) (c) (d)*P<0.01vs模型 组,#P<0.01 vs空白组图3-1免疫荧光染色法检测抗体生成 Fig.3-1 Theimmunofluorescent staining for antibody test图3-1中(a)、(b)、 (c)一抗分别为空白组小鼠血清、模型组小鼠血清、免疫成功小鼠血清， (d)为免疫荧光阳性表达率。从图3-1中可以看出，一抗为空白小鼠血清的荧光极弱，一抗为模型组小鼠血清的荧光仍然不强，而一抗为治
细胞免疫荧光实验步骤 细胞免疫荧光实验步骤 简单实验步骤如下: 1.漂洗血清蛋白H7.2-7.4 37度 PBS 2小时. 2.-20度甲醇固定20分钟后,自然、干燥 10分钟 3.PBS洗净:3min＊3 4.1%Triton:25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS 5.PBS洗净:2＊5min 6.羊血清封闭：３７度，２０分钟 ７.一抗，４度过夜，一般要大于１８小时或者３７度１－２小时 ８.４度PBS洗净，３min＊５次 ９.二抗３７度小于一小时 １０.３７度PBS洗净，３＊５min 凉干封片（封闭液ＰＨ８.５） 活细胞免疫荧光技术－流式细胞仪标本的制备 （一）制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、 胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法) ↓ 用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为 5×10６～１×10７／ml ↓ 取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl) 的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS 稀释)灭活正常兔血清 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右 1000rpm×5min
↓ 弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠 (或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇 ↓4℃ 30min 用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右 1000rpm×5min ↓ 加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入 1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察， 视细胞浓度加入100～500μl固定液) ↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察 (标本在试管中可保存5～7天) （二）试剂和器材 1. 各种特异性单克隆抗体。 2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。 3. 10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。 4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。 （三）注意事项 1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN ３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。 2. 洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。 3. 加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。 4. 细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。 附: 1. DPBS (×10, 贮存液)
原子荧光常见问题及解决方法 一、有没有那位做过植树式样的汞砷前处理？前处理后试样使用原子荧光检测,使用汞砷同测或者分测，样品有120个,需要一种可以大批量检测的方法。我今天使用3个国标样，参照土壤使用50ml具塞比色管90度水浴消煮,结果好像蛋白含量高,全部溢出了 称1g样于150ml烧杯中，加入10ml浓硝酸放置过夜.次日在电热板上蒸至尽干,再加入5ml浓硝酸蒸至小体积，稍冷后加入1:1HCl5ml溶解盐类，转入25ml试管中，用水定容后测定。 二、原子荧光法(AFS230)测锑在低温氢化时砷锡气相干扰严重，升高原子化温度又产生较大记忆效应，请教有什么解决办法解决？ 1。不知道您测试什么样品,在10—20％酸度下,锡应该不产生干扰,一般含量的砷及锑测定之间无干扰，10ng/ml砷不产生干扰，对于50ml样品您加入5ml硫脲（5％)-抗坏血酸(5％)试试。 2。加入硫脲与搞抗坏血酸试试。 3. 加点HBr，即可消除 三、我在一次测定的时候发现了一个新问题:我用同一种溶液进行测定，其荧光值很不稳定，一会儿大、一会儿小。开始的时候我以为是蠕动泵的原因，但是我调整了蠕动泵的松紧后也出现这种情况。不知道是什么原因 看看管路是不是堵了；看看氩气是不是漏了；看看炉子的位置是不是正确。 四、在AFS法测定时，要用Ar气作载气和屏蔽气，但是瓶口阀门处的两个压力表，都起什么作用？ 第一个副表是气瓶的压力，第二个是进到仪器内部的气压. 五、原子荧光的电路系统的检测方法 检测电路系统的方法：1。两个灯互换；2。用黑纸遮住光电倍增管，仪器读数应在20—100内，此为正常，最最最直接的本底。 六、现在我感觉汞真的难测了。以前汞的曲线还能做好，现在汞的曲线都老是做不好。现象就是前面二个或三个点还正常,到第四个点突然就下降了许多。而第五个点正常。有时候几个点都不正常。很难一次就做出3个9的曲线. 我也经常遇到你的问题，我的感觉是，仪器条件降低时,线形比较好。还有就是可能你用的汞灯可能有问题，它的寿命不长,检测的时候注意观察一下,看汞灯是否有闪烁现象。 你说前几个值好,但是后面的有问题.应该可以排除试剂方面的问题。 七、我刚接触原子荧光分析方法,有很多问题都不懂，想请教一下，我用的是海光的AFS—2202E。测定茶叶中的汞。 请问1硼氢化钾的浓度为多少适宜 2用0.5/L的重铬酸钾配置汞标准储备液和使用液会影响汞的测定吗？也就是说重铬酸钾不会对汞的测定造成干扰吗？ 3我用5％的硝酸做载流是否合理（汞固定液用的是5％的硝酸和0。5/L的重铬酸钾溶液）. 4文献中规定测定汞一般要在低温下进行，可是我怎么没有找到设置炉温的地方呢？ 1. 1、你要作条件最佳化。 2、不会有太大的干扰。 3、用10％盐酸好一点.
原子荧光常见故障解决建议 一、请先仔细阅读《原子荧光应用手册》第68、69页。 二、通讯失败，参考文件《原子荧光光度计电脑通讯失败的详细解决方法》。 三、空白污染。 参考文件《仪器试剂污染处理方法》。 问题1．试剂污染：主要是酸的纯度不够，或纯度够了质量不好。解决方法：配制一个2%的和10%的HCL，上机看两个浓度酸的荧光值有多大差距，一般好酸荧 光值不会有太大差距，若10%的酸是2%酸荧光值好几倍，则判断酸的纯度不 能够（此方法不适用于做铅）。 问题2．容器污染：主要是器皿质量不好，或泡器皿的酸不好，或容器没有清洗干净。 解决方法：判断是否是器皿的问题，用一个干净的容器配制好2%酸若干，部分倒入被怀疑有污染的容器中，震荡几分钟后上机，看两容器中荧光值是否相近，若 被浸染，被浸染的器皿中的酸出的荧光值会高很多。器皿质量不好（有些厂家 器皿本身含所测元素的量比较大），只能更换，尽量选用A级的容量瓶、刻度 管；泡器皿的酸不好，泡器皿的酸尽量用优级纯的硝酸，并定量更换；容器没 有清洗干净，进行清洗。 问题3．还原剂试剂被粘污。 问题4．环境污染（主要是汞浸染）：若室内以前打碎过温度计，或做过高浓度的元素实验，容易引起环境污染。 解决方法：只能更换实验室。开着排风扇用电风扇吹，并在房间中放硫磺（汞污染）。 四、无信号。 问题：测完标准空白后，测标准点，荧光值自动扣空白后在0上下浮动，各点乱无线性关系。 解决方法： 1．检查水封有没有加水（主机内，部分仪器没有水封）。 2．检查排废管有没有夹好。夹管方法：在做样时拧松夹块上的螺钉，让废液在蠕动泵不转时也能排出。逐渐拧紧螺钉，拧到以下刚出现情况后再拧半周为好：蠕动泵转动时废液排出，不转时废液马上停止在管路中。 3．检查点火炉丝有没有点亮。 4．如果是Hg做样无信号，查看Hg灯有无点亮。激发点亮，点亮后必须重新预热！ 5．8X仪器，检查样品管和还原剂管有没有夹好样品和还原剂是否进到反应块。9X仪器检查进样针中是否有空气，有空气则说明中间已经折断。 6．拿一纸条，在进标准液后，回到载流槽时，悬在原子化器炉口（距炉口1CM以内），看纸条是否被点着（熏黑不算点着），若点不着检查下一步。能点着即有火焰无信号看第10步。 7．检查气液分离器内所进混合液是否反应，若有大量气泡生成（也可观察排出废液中是否有大量小气泡），无气泡生成则看下一步；有气泡则正常，检查气液分离器至原子化器毛细管是否漏气或被堵塞，无漏气、堵塞第一步肯定有火焰生成。能点着即有火焰无信号看第10步。 8．检查载流液、标准点是否有5%左右的酸（保证至少要3%的酸），还原剂硼氢化钾的量保证8X仪器不小于2%，9X仪器不小于1%，检查硼氢化钾是否失效（硼氢化钾易吸潮，易结块）。
在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(double immunofluorescence labeling method)也分为直接法和间接法。 (1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A 和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。直接法简便可靠，但灵敏度较低。 (2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。 免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项 一、免疫荧光技术中标本制作的基本程序近似于酶免疫组化，不同点如下： 1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其相同。 2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。 3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。 4、免疫荧光在封片时常使用专用封片剂或甘油：0.01M PBS (1：1)。条件许可，建议购买抗淬灭的封片液，使标本可以保存更久。
5、荧光抗体的孵育以及后续处理需要避光。 6、荧光抗体染色假阳性可能会多，需要分别设定阳性和阴性对照。 二、注意事项 1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，可能会使荧光提前衰退。 2、每次试验均需设置以下三种对照： (1) 阳性对照：阳性血清+荧光标记物; (2) 阴性对照：阴性血清+荧光标记物; (3) 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。 三、免疫荧光双标的经验之谈 1、选取一抗时，要求来源于两种不同的动物，我用的是来源于家兔和大鼠的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC(绿)和donkey anti-rat-Tex-Red(红)。 2、我的做法是两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要自我摸索，我感觉一抗4℃孵育过夜比较好，背景比较清晰。 3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 4、封闭血清是二抗来源动物的正常血清，我用的是10%正常donkey 血清。 5、其余事项同免疫荧光单标操作。 免疫组化双重染色方法和步骤 在生物医学和临床研究实践中，经常需要检测两种不同物质是否在同一
原子荧光分光光度计常见故障排除方法 在日常原子荧光光谱分析中，特别是当仪器使用时间长、频率高时，常会出现一些问题，常见的有：灵敏度突然降低；无荧光信号；空白信号很高；荧光信号不稳定；工作曲线线性差；图形不正常等情况。有资料对这些问题及其解决办法进行了总结。这些现象的出现通常与以下因素有关： 1、空心阴极灯 由于受到设计和制造工艺的限制，目前生产的高强度空心阴极灯在稳定性和使用寿命方面还存在一些问题，尤其是Hg、Bi、Te、Se灯。因此，在原子荧光光谱分析中要特别注意由空心阴极灯引起的问题。 a、灵敏度降低；稳定性差，空心阴极灯老化。适当提高灯电流或负高压；更换空心阴极灯。 b、新购置的空心阴极灯，但基线空白不稳定。空心阴极灯预热时间不够。空心阴极灯应预热30分钟，并空载运行10～20分钟。 c、测定灵敏度变化较大。双道不平衡，空心阴极灯照射氩氢火焰的位置不正确。用调光器调节空心阴极灯至合理位置。 d、没有信号。空心阴极灯未点燃。点燃空心阴极灯。 2．光路系统 光路系统的问题主要是由空心阴极灯的聚焦和照射氩氢火焰的位置引起，常出现基线信号值很高现象，特别是在测定Hg和Pb的时候。主要是因为石英炉的高度和透镜聚焦点没有调节到最佳位置。另一个光路系统的问题是双道干扰。 a、基线信号值很高，原子化器的高度不合适。调节原子化器高度。 b、一些元素灵敏度很低，透镜聚焦点不合适。调节透镜聚焦点。 c、一道荧光信号很强，另一道测定结果偏高或低。双道干扰单道的测定。 3．管道系统 原子荧光光谱分析中，管道系统是仪器非常重要的部分，也是使用中常出问题的部分。特别是仪器使用频率高、工作量大时，由于硅胶老化、破裂、管道积水和反应沉淀物堵塞管道系统等原因，经常使仪器不能正常工作。
免疫荧光双标记在心肌石蜡切片中的应用 陈绪军肖明第吕志前卢成宝薛松袁忠祥徐根兴 作者单位：200080 上海市第一人民医院心血管外科 细胞性心肌塑型术（cellular cardiomyoplasty）用于缺血性心肌病的治疗受到人们越来越多的关注［1］，在证实移植的人干细胞在缺血/损伤的环境中分化为人心肌细胞方面，免疫荧光技术的运用逐渐增多，但多用的是新鲜冰冻切片，在石蜡心肌切片中应用较少，而且多是单一抗原的荧光标记［2］。有研究表明，酪胺信号放大( tyramide signal amplifications, TSA)技术可以提高反应的灵敏性［3］。为此，我们以人心肌石蜡切片标本为例，运用TSA－免疫荧光法与常规间接免疫荧光法分别对人心肌连接蛋白(connexin-43，Cx-43)蛋白及肌凝蛋白（myosin）进行标记，旨在为心肌石蜡切片建立一个免疫荧光双标记的方法。 一、材料与方法 1. 主要试剂：兔抗人肌凝蛋白（myosin）多克隆IgG抗体购自美国Chemicon 公司，标记异硫氰酸酯荧光素（FITC）的驴抗兔多克隆IgG抗体与标记有辣根过氧化物酶（HRP）的驴抗小鼠多克隆IgG抗体均购自美国Jackson Immunity 公司, 小鼠抗人Cx-43单克隆抗体、碘化丙啶(PI)与牛血清白蛋白（BSA）购自美国Sigma 公司，酪胺 (tyramide)-coumrian 结合物试剂盒购自美国PerkinElmer公司。 2．标本的取材、固定、切片及抗原修复: 人心肌取自一例6岁先天性心脏病小孩右房耳，中性福尔马林固定，4°C过夜固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，5 μm石蜡切片。石蜡切片常规脱蜡、梯度酒精浸泡后行抗原修复：浸入0.01 mol/L的柠檬酸缓冲液(pH 6.0)中，95℃，浸泡30 min, 室温冷却10 min。 3．Cx-43的免疫荧光标记：采用TSA-免疫荧光法［4］，按试剂盒说明书进行。磷酸盐缓冲液（PBS）室温洗涤2次，每次5 min。置入3% 过氧化氢/甲醇溶液中，室温，孵育10 min。再室温PBS洗涤3次，每次5 min。 3%的BSA室温孵育30 min。加入小鼠抗人Cx-43单克隆IgG抗体，4℃孵育过夜。TnT缓冲液（0.1 mol/L Tri-HCI, pH 7.5, 0.15 mol/L NaCl, 0.05% 吐温-20）室温洗涤3次，每次5 min。加入标记有HRP的驴抗小鼠IgG抗体，室温孵育1 h。TnT液室温洗涤3次，每次5 min。配制酪胺-coumrian 工作液：将酪氨-coumrian 结合物加入放大缓冲液中配成酪胺-coumrian 工作液（1∶50），避光，室温孵育15 min。再次TnT液洗涤3次。 4． Myosin的免疫荧光标记：接上一步。采用间接免疫荧光法［5］。兔抗人肌凝蛋白多克隆IgG抗体（1∶20）， 37°C孵育1 h，PBS洗涤3次。加入标记FITC的驴抗兔多克隆IgG抗体(1∶100)，避光，室温孵育1 h。PBS室温洗涤3次，每次5 min。 5．PI染细胞核：加入碘化丙啶（PI/PBS，1 μg/ml），室温避光孵育3 min。PBS室温洗涤3次后甘油封片。 6．荧光显微镜观察：运用带有3通道的AX-80型Olympus 荧光显微镜镜检：绿通道中观察FITC信号；蓝通道中观察coumrian信号；红通道中观察PI信号。图像的编辑采用Advanced SPOT 软件。 二、结果 在3通道的AX-80型Olympus 荧光显微镜中红、绿、蓝通道中分别可以观察到PI、FITC 及coumrian的信号，再经Advanced SPOT 软件叠加得到图1~4，红色代表PI标记的人心肌细胞核，绿色代表FITC标记的人心肌肌凝蛋白蛋白，蓝色为coumrian标记的人心肌Cx-43蛋白。图1显示为未加myosin抗体而加Cx-43抗体的人心肌石蜡切片; 图2中均加myosin 抗体与Cx-43抗体; 图3中加myosin抗体而未加入Cx-43抗体；图4均未加入 myosin抗体与Cx-43抗体。 三、讨论 1.心肌石蜡切片的免疫荧光双标记：在本研究中，图1与图2相比，人心肌石蜡切片中，不加myosin抗体的心肌纤维不着色，而加了myosin抗体的心肌纤维呈绿色，这表明心肌纤维被成功地标记上抗人myosin抗体，而且特异性高。Cx-43蛋白位于心肌细胞的周围，在本研究中由图1、图2与图3可以观察到，加Cx-43抗体的人心肌Cx-43蛋白呈
免疫荧光染色大全（精华版） 组织免疫荧光法 （1）将待染组织切片置于65摄氏度恒温箱烤片1h，脱蜡 （2）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （3）0.5%Triton X-100（PBS 配制）室温通透 10min （4）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 注意：步骤（3）和（4）用于检测细胞核抗原，细胞膜抗原直接跳过此步骤（5）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火3min，后转成低火 15min。 （6）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （7）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。 （8）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （9）使用1% BSA进行室温封闭 30min，用于封闭非特异性抗原表位。 （10）按抗体推荐使用说明书孵育特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜。（11）次日取出切片，室温下复温 30min。 （12）1×PBS 洗涤 3 次，每次 5min。 （13）选取相应的免疫荧光二抗滴加于血管组织上，37°C避光孵育30min。（14）1×PBS洗涤 3 次，每次 5min。 （15）避光条件下，DAPI 染液染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用（16）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （17）在血管组织上滴加抗荧光淬灭剂进行封片。 （18）使用荧光显微镜进行观察拍照。 贴壁细胞免疫荧光法 （1）在培养板中接种的带染色的细胞爬片用PBS泡洗3次×3min （2）4%多聚甲醛固定细胞爬片15min （3）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （4）0.5%Triton X-100（PBS配制）室温通透10min （5）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （6）1%BSA室温封闭30min （7）弃掉封闭液，细胞爬片滴加适量稀释至适当比例的一抗，4℃孵育过夜（8）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （9）细胞爬片滴加稀释至适当比例的荧光二抗 （10）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （11）DAPI染细胞核，浓度和时间根据试剂说明书使用 （12）1×PBS洗涤 3 次，每次5min。 （13）用抗荧光淬灭剂封片 （14）荧光显微镜下观察采集图像 细胞免疫荧光（悬浮细胞方法一） （1）收集悬浮细胞，细胞在冰浴中冷却，然后用台式离心机于4℃以800 g 离心5 min，吸去培养液并以4℃ 1×PBS重悬细胞。
免疫荧光技术的实验方法及其分类 一、免疫标记法及其分类 1.荧光免疫法 原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮, 检测产物发出的荧光, 荧光强度与Mb浓度呈正比, 可在 8min内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。该法重复性好, 线性范围宽, 具有快速、敏感、准确的特点。 以双抗夹心法为例, 首先将特异性抗体与固相载体连接, 形成固相抗体。除去未结合抗体, 然后加受检标本, 使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物, 接着加入荧光标记的抗体, 使之与抗原特异性结合, 形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根据荧光强度, 即可对蛋白抗原进行定量。 传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大, 时间分辨荧光免 疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕, 作为标记物, 加入正常液后激发测定, 能有效去除短寿命本底荧光的干扰。 2.放射免疫法
放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原, 竞争性地与抗体结合, 形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物, 并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后经过离心沉淀等方法, 将抗原—抗体复合物与游离抗原分离, 分别测定其放射性强度与标准曲线比较, 即可对未标记的待测抗原进行定量。 RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强, 可准确定量到 ng/ml水平。但早期的方法操作麻烦, 耗时长, 且有放射性污染。近年来, 随着单克隆抗体的应用, RIA的灵敏度又有了较大提高, 且操作大为简化, 并已有商品试剂盒供应, 使用方便。 3.酶联免疫法(ELISA) ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立, 该法的最低检测限为10μg/L, 线性范围达1 000ug/L。夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。ELISA法具有灵敏度高, 特异性强, 精密度好, 操作简单, 适用于多份标本的检测, 不需特殊仪器设备等优点, 易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。
石蜡切片免疫荧光染色方 法 Prepared on 22 November 2020
对于石蜡切片： 1、烤片：60℃ 60分钟 2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟 →蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。 3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入l柠檬酸钠，(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。 2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H 2O2 2 (2ml H 2 O2 2 加入18ml蒸馏 水中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。（也可不用去除内源性酶）。 3. 封闭(Blocking) 加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。不用洗，用滤纸吸干周边水分。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。 4. 一抗孵育(Primary antibody incubation) 参考一抗的说明书，按照适当比例用（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。 立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。PBS洗3次，每次5分钟。 5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation) 按照适当比例用稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
免疫组织化学染色原理和操作步骤 一、免疫组织化学原理 免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。 PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP 复合物孵育标本，最后用H2O2和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。 生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行显色。ABC法的敏感性较PAP法更高。
图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》） SP 法与ABC 法相似，其不同于ABC 法之处在于用 生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。 在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧 化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB 进行 显色。与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相 似而非特异性结合较亲和素低。SP 法简化了操作步骤， 同时也减少了非特异性背景，是目前应用最为广泛的免 疫绥化染色技术。 二、实验准备： 1. 标本准备 ①石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理 ②冰冻组织切片：由病理室常规处理 ③细胞爬片：将无菌盖玻片置于六孔板中，接种细胞，待细胞生长达到60％以上后取出玻片，4%多聚甲醛固定2 h 。 2. 试剂准备 ①抗体选择 单克隆抗体针对单一表位，具有较高的特异性，但在该表位破坏后将得不到阳性结果；多克隆抗体表位针对多个表位， 可避免单克隆抗体图2. SP 法原理示意图
荧光免疫染色和DAPI染色实验 1．实验原理 免疫染色的实验原理类似于Western Blotting，两者都是运用抗体的特异性识别作用来显示目的蛋白，但是由于免疫染色需要在原位进行，而且蛋白没有经过富集，因此其实验难度较高。 实验的基本原理是：利用固定剂（通常是甲醛或多聚甲醛）将细胞固定，使得细胞膜的通透性大大增加，并且利用Triton-X-100使得一部分膜蛋白变性，从而使通透性进一步加强。利用正常羊血清封闭，可以令许多蛋白先与血清内的非特异性抗体结合，而特异性的抗体由于动力学的关系可以通过竞争性的反应与目的蛋白结合，这一过程可以保证抗体识别的特异性。二抗可以特异性识别一抗的Fc区域，利用二抗连接不同的荧光基团，就可以在荧光显微镜下观察到不同的荧光，从而显示目的基因的表达情况。 另外，免疫荧光实验由于其较高的敏感性可以显示出基因表达的亚细胞情况(核内，核外，膜上以及一些较大的细胞器上)，所以通常被用来作为基因定位的方法。 DAPI的中文名称是4，6-联脒-2-苯基吲哚，是一种常用的荧光染料，其作用机理与溴化乙锭（EB）等染色剂的机理类似：它们与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA 的双链紧密结合。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而散射峰是461nm，正好UV （紫外光）的激发波长是356nm，使得DAPI成为了一种常用的荧光检测信号。 Jagielski M. et. Al在1976年首次运用该技术检测细胞培养中的支原体感染。后来随着技术的进步，该技术被运用于各种微生物的检测、生长监测，胚胎发育过程的检测，细胞周期的检测和各种核定位的实验。 本实验就是利用DAPI染色标记细胞核的位置。 免疫染色实验方法和步骤 免疫染色(immunol staining)包括免疫荧光(immunol fluorescence)、免疫组化(immunol histochemistry)、免疫细胞化学(immunol cytochemistry)等，可以参考如下步骤进行操作。 1. 样品准备(Sample preparation) 对于贴壁细胞： 可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培养细胞，然后到预定时间时进行固定等后续操作。 也可以用洁净的盖玻片，70%乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到6孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。这时就可以种入细胞进行培养，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，即可进行固定等后续操作。 对于悬浮细胞： 把细胞先在固定液中固定，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。然后就可以进行后续操作。如果细胞的粘附能力不佳，可以在载玻片上用PDL等物质进行处理，以增强载玻片的粘附能力。 对于冷冻切片： 切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。 对于石蜡切片：
【ibidi--focus on cells】通道载玻片--新的免疫荧光方法 细胞的免疫荧光实验是一个基础的细胞实验，传统的方法是在培养板中放入预先处理好的盖玻片，待细胞贴壁后，使用镊子将盖玻片拿出再开始进行固定，染色等系列工作。 现在分享一种简便的免疫荧光方法，无需爬片，培养-操作-镜检，在一个培养皿/载玻片上完成所有工作！一气呵成！ 使用如图的培养皿和载玻片，免疫荧光步骤将简化为： 1.直接细胞培养 2.冲洗玻片/培养皿 3.固定细胞 4.冲洗玻片/培养皿 5.染色 6.冲洗玻片/培养皿 7.冻存液处理细胞 8.直接镜检观察 免去了指甲油封片的传统免疫荧光方法中的冗长步骤： 1.无需对盖玻片和载玻片消毒灭菌 2.无需对盖玻片进行包被 3.无需等细胞爬片 4.无需指甲油封片 之所能如此简便完成免疫荧光实验，是因为这些ibidi培养皿和载玻片的底部为特殊处理的材质，绝大多数细胞可以直接贴壁生长，而不需要另外包被。同时，这些耗材的底部薄如盖玻片，可以直接使用倒置显微镜进行观察，得到高质量的成像，适用于高端显微镜比如共聚焦显微镜。 成像效果：
下面再分享一种极致的免疫荧光方法，不仅更加简化实验步骤，而且可以节约试剂和细胞，同时还能得到更出色的成像效果。 如图的ibidi通道载玻片，简单快速完成免疫荧光实验。 步骤：培养-固定-染色-镜检，只需在这个载玻片上进行4个步骤，免疫荧光实验轻松完成~ 优点总结： 1、节约细胞和试剂 ibidi通道载玻片里的通道只有400μm高，以μ-slide VI为例，通道的容积只有30μl，而普通8well的腔式载玻片一个孔的容积有300μl。这意味着通道需要的试剂和细胞量仅需约十分之一！对于非常珍贵的细胞和试剂来说，这可是非常重要的。 2、成像效果好 使用通道载玻片时，能在相差显微镜下获得更好的成像效果。因为通道上下都是平坦的，不会因为凹液面的折射现象影响到相差显微镜成像。而well式的开放小室的相差成像会受到培养皿盖和液面的折射现象影响。