厦门大学
硕士学位论文
熔解曲线分析技术用于基因型的研究
姓名：张换敬
申请学位级别：硕士
专业：化学生物学
指导教师：郑立谋；曾骥孟
201106
高分辨熔解曲线(high-resolution melt，HRM)分析技术是近几年来在国外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP 、甲基化、配型等的分析。因操作简便快速，使用成本低，结果准确，实现了真正的闭管操作，HRM技术受到普遍关注。 HRM 原理 HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。同许多荧光 PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。如在SNP 的检测中，SNP 位点由于不匹配双链DNA 在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA 分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在SNP，而且不同SNP 位点、杂合子与否等都会影响熔解曲线的峰形，因此HRM 分析能够有效区分不同SNP 位点与不同基因型。随着高精度PCR 仪（LightCycler 480 和Rotor-Gene 6000）和饱和性染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现为HRM 这一技术的普及使用成为可能。 HRM 特点 由于HRM 完全是基于核酸的物理性质进行分析，因而无需序列特异性探针。基于这种检测原理，HRM 检测不受突变碱基位点和种类的局限，既可以对未知突变进行筛查、扫描，又可以对已知突变进行分析，亦可用于短片段重复序列的分析，所需要的只是在常规 PCR 基础上增加一个饱和染料。所以，相比传统的SNP 或突变分析法和定量探针法，简化了操作时间和步骤，大大降低了使用成本，并且实现了闭管操作，使其用于临床常规化检测成为可能。高分辨率熔解曲线分析可以鉴别出PCR 产物中杂合的单碱基突变 这种方法比起普通的技术来说有更好的灵敏性和特异性。采用这种方法进行的突变的检测不依赖于突变在片段中所在的位置。当片段的大小在400 bp 或者更小时，灵敏性最高。除了能鉴定出未知的杂合突变，高分辨率熔解曲线还可以被用来鉴定特定位点的突变，在这种情况下，扫描未知突变和进行基因分型可以结合在一起，使得分析更为简单。对于目前绝大多数的突变分析方法来说，都很难鉴定出纯合子序列突变。在一些不同种类的小的扩增片段中，高分辨率熔解曲线则显示出了鉴定纯合子序列突变的能力，这种方法能鉴定出大多数的纯合突变。HRM 技术在遗传学研究方面也带来很大便利，只需在PCR 反应体系中加入双链DNA 饱和荧光染料，在PCR 反应之后再花15 分钟，就可以完成96 或384 个样品的DNA 变异扫描。HRM 在这些方面的优势使其具有极强的可操作性，成为近年来国外新兴的遗传学、方法学研究和应用热点。 HRM 技术优势
北京泰格瑞分子检验有限公司 高分辨率熔解曲线 高分辨率熔解（High-resolution melting，简称HRM）分析的主要原理是由于DNA序列的片段长短，GC含量、分布以及碱基互补性差异等的不同，在DNA 分子热变性时会使溶解曲线的形状和位置有所不同。同许多荧光PCR技术一样，HRM 利用特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测温度变化过程中双链DNA 荧光染料与PCR扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测, 可以迅速的检测出核酸片段中 GC 含量和单碱基的突变。高精度PCR 仪及饱和性染料（LC Green 、Eva Green 等）的出现使HRM得到广泛的普及和应用。 项目： 已知SNP位点检测；外显子突变位点筛查；物种鉴定、品种鉴定；甲基化研究；法医学鉴定、亲子鉴定。 样本要求： 新鲜或异硫氰酸胍保存的细胞(﹥5×106)、组织(﹥50mg)、血液(﹥300μl)等样本原材料，或纯化好的DNA(OD260/OD280在 1.7-1.9之间)、总RNA(OD260/OD280在1.9-2.1之间，完整性好)，或反转录好的cDNA不少于30μl(纯度在1.9-2.1之间，及反转录好的cRNA完整性好)。 技术优势： 高通量：1 次可同时检测多个样本。 高敏度：HRM 检测灵敏度达1%-0.1% ，是传统“PCR+ 测序”方法25-250 倍。特异性好：PCR 产物无需后续处理，特异性强。 重复性好：样品经PCR 扩增后直接进行HRM，直接在同一个PCR 管内进行分析，实现闭管操作，避免交叉污染。 操作简便：只需设计PCR 引物，进行PCR 反应，无需序列特异性探针，无需测序，也不受突变碱基位点与类型的局限。 成本低：相比传统的SNP/突变分析法和定量探针法，简化了操作步骤，缩短了实验时间，大大降低了使用成本。
完善中的基因变异分析 简介 - 基因变异研究的重要性基因变异分析方法概述检测已知突变 1.基本方法：终点法基因分型 2.高级方法：基于熔解曲线的基因分型 3.基本方法和高级方法的利弊HRM 法检测未知突变 1.基于高分辨率熔解曲线基因扫描的原理和定义 2.HRM 测定优化 3.HRM 高级应用和下游技术参考文献及更多推荐 目录 1244567781315
简介 – 基因变异研究的重要性 人类在不同层次的个体基因组上存在差异：DNA序列在较长或较短重复单元的拷贝数中可能带有单核苷酸多态性（SNP）的插入、缺失或变异。此外还包括DNA的共价键修饰方式的改变，比如通过CpG岛甲基化。实时PCR提供不同的方法来检测此类不同类型的变异。 造成人类个体差异的基因序列变异90%以上属于单核苷酸多态性（SNP）。虽然有许多SNP对细胞功能无影响，但科学家们认为其他一些SNP可能增加人类患病的可能性或影响他们对药物的吸收。近年来，SNP基因分型成为动植物取证、育种等领域基因研究的重要部分，特别是在药物基因组学上。 定义 SNP及其分类 单核苷酸多态性，即SNP（发音为“snips”），是基因组序列中的单核苷酸（A，T，C或G）发生变化时产生的DNA序列变异（见表1）。被视为SNP的变异必定发生于至少1%的人群中。SNP约占所有人基因变异的90%，发生于共300万个碱基人基因组中的每100－300个碱基。SNP可发生于基因组的编码（基因）和非编码区。根据广泛使用的定义，SNP可被分为以下4级： 1级 SNP包括C/T和G/A转换，由此生成C::G和A::T同质双链以及C::A和T::G异源双链。 2级SNP（C/A和G/T）包括生成C::T和A::G异源双链的颠换。 3级SNP（C/G）生成带有C::C和G::G异源双链的C::G同质双链。 4级SNP（A/T）生成带有A::A和T::T异源双链的A::T同质双链。 在可能存在的单碱基多态性中，A突变成T的 4级SNP是最难解决的，因为纯合基因型在其TM中的差 异最小（通常仅约为0.2°C）（有关在LightCycler? 480实时PCR系统上成功检测4级SNP的示例请参见参考文献3,6）。 在对特异性SNP做基因分型之前（如采用测序或探针基因分型 法，详见第2节），通常先扫描整个基因或某些亚片段，查看在 相关区域是否已产生之前未知的变异。采用PCR扫描，对于没有 出现任何未知变异的区域则不必进行测序，因此可减少测序样本 的数量及成本。 另一方面，实时PCR基因分型还常被用来验证之前在测序或微阵列平台上得到的结果，此方法能从少量样本研究全基因组转换成更有针对性的目标区域和更大量样本数量的研究。
园艺学报 2013，40（6）：1061–1070 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@https://www.doczj.com/doc/b22209797.html, 两种SNP分型方法的比较及其在柚品种鉴定中的应用 杨润婷1,2，吴波1,2，李翀1，曾培1，曾继吾2，钟云2，姜波2，周碧容2，钟广炎2,* （1西南大学园艺园林学院，重庆 400715；2广东省农业科学院果树研究所，农业部热带南亚热带果树生物学与遗传资源利用重点实验室，广州 510640） 摘 要：用两种常用的SNP分型方法，等位基因特异性PCR法（Allele-specific PCR，AS-PCR）和高分辨率熔解曲线分析（High resolution melting analysis，HRMA），对16个柚栽培品种和8个柚杂种后 代材料进行了7个SNP位点的分型研究。结果表明这两种方法所得的分型结果相同，都将24个样本分成 了22种基因型。值得一提的是，样本‘八朔’与‘红八朔’，‘红甘夏’与‘川野夏橙’之间在所测位点 无差别，表明其应当是同一来源的无性系变异。‘早熟真龙柚’和‘中熟真龙柚’的分型结果表明它们的 基因型不同，看来并非是起源同一基因型的不同芽变品种，也不存在亲子关系。可见，AS-PCR和HRMA 均适用于柚类品种的区分和鉴定。AS-PCR法是一种准确、低成本的SNP分型方法，适合普通实验室使 用，惟对PCR反应体系要求严格。HRMA分型法具有准确、快速、简便、分析量大的特点，但需要专门 的设备，试剂成本也高。 关键词：柚；单核苷酸多态性；等位基因特异性PCR；高分辨率熔解曲线分析；基因分型 中图分类号：S 666 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）06-1061-10 Comparison of Allele-specific PCR and High Resolution Melting Analysis in SNP Genotyping and Their Application in Pummelo Cultivar Identification YANG Run-ting1,2，WU Bo1,2，LI Chong1，ZENG Pei1，ZENG Ji-wu2，ZHONG Yun2，JIANG Bo2，ZHOU Bi-rong2，and ZHONG Guang-yan2,* （1College of Horticulture and Landscape，Southwest University，Chongqing 400715，China；2Key Laboratory of Tropical and Subtropical Fruit Biology and Genetic Resource Utilization，Ministry of Agriculture，Fruit Tree Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China） Abstract：Allele-specific PCR（AS-PCR）and high resolution melting analysis（HRMA）are two widely used SNP genotyping methods but no research has been done to compare them in terms of genotyping efficiency. In this study，16 pummelo cultivars and 8 pummelo hybrids were genotyped using AS-PCR and HRMA respectively on two different sets of 7 SNP loci. It was shown that both methods generated the same genotyping results in which 24 accessions were assigned into 22 genotypes. It was noteworthy that Hassaku and Red Hassaku were identical at all SNP loci，indicating both accessions should 收稿日期：2013–03–07；修回日期：2013–06–04 基金项目：国家自然科学基金项目（30971992）；国家重点基础研究发展计划（973）项目（2011CB100600） * 通信作者Author for correspondence（E-mail：gy_zhong@https://www.doczj.com/doc/b22209797.html,）
HRM甲基化位点检测的灵敏性 点击次数：142 发布日期：2010-10-12 来源：本站仅供参考，谢绝转载，否则责任自负 利用LightScanner上的高分辨熔解曲线进行DNA甲基化位点检测的灵敏性 引言 DNA甲基化是一种重要的表观遗传CpG二核苷酸修饰形式，异常的DNA甲基化模式发生在许多基因启动子的CpG岛，这会增加患癌症的风险。CpG岛高甲基化常导致基因沉默，与癌症、老化、基因印记、X-染色体失活密切相关，此外，全基因组CpG高甲基化中也证实了发生在肿瘤形成的早期。传统的检测甲基化位点的方法是通过重亚硫酸盐处理，处理后原甲基化的胞嘧啶被保留，而非甲基化的胞嘧啶转变为胸腺嘧啶，然后进行直接测序。甲基化的胞嘧啶没有发生改变，因此通过测序很容易识别。本研究中我们系统的评价了通过LightScanner的高分辨溶解曲线检测甲基化的可靠性。如果这种方法在检测甲基化中是可靠且灵敏度高，就可以减少测序的繁琐过程。 未处理的和经过SssI处理的pBluescript II SK(+)质粒用Qiagen EpiTect试剂盒进行重亚硫酸盐。通过对有代表性的区域进行测序，确保样品完全甲基化以及亚硫酸盐处理。引物设计在扩增片段大小在 79-216bp的含有1-8个CpG位点的7个不同的片段。100%甲基化的和未甲基化的样品按50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%的比例混合，100%甲基化的和未甲基化的样品可以明显的区分开。当两个样品按以上比例混合后，熔解曲线表现出重复的剂量放映关系，当50%混合时与未甲基化的标准品偏性最大。高分辨溶解曲线的灵敏度足够检测甲基化位点，对小片段的灵敏度可达到2%,大片段的可以10%。 重要的DNA甲基化位点显示在B淋巴细胞增生性疾病，如慢性淋巴细胞白血病（CLL）中。瘤抑制基因的外部沉默可以通过DNA甲基化抑制剂处理而发生转变。本研究中，CLL患者的miR-195基因CpG岛上游甲基化位点用Vidaza或Cladribine处理，重亚硫酸盐处理的CpG甲基化变化的最高的进行PCR扩增，之后用LightScanner进行高分辨溶解曲线分析。样品经亚硫酸盐处理后有不同的的胞嘧啶的转换，然后通过单独和混合后分析检测的灵敏性。不同克隆之间只要有意个被保留的C就可以在异源或同源混合的样品中区分开。这一结果证实了高分辨熔解曲线是检测甲基化位点的简单且灵敏度高的方法。 图1：使用Sssl甲基化酶使2.9Kb的pBluescript CpG甲基化。甲基化的和非甲基化的样品都使用Qiagen EpiTect Kit进行重亚硫酸盐处理，之后进行PCR扩增，Lightscanner检测，最后通过测序验证。 图1A：重亚硫酸盐处理的100%甲基化的和100%非甲基化的四个片段。
高分辨率熔解曲线分析法之Snakback基因分型法 背景：DNA的发夹结构作为自身探针扩增用于PCR产物的分子分析。在这之前实体分离或共价修饰的寡核苷酸荧光是必须的。 方法：我们用饱和染料LC Green做不对称PCR，40-45个循环，其中1条引物的5’端包括了一条尾巴，这条尾巴和其延伸引物互补，但这尾巴没有任何特别的共价修饰。样品可以在LightsCycler的转子中快速的扩增，可以在96/384 模块加热PCR仪中进行高通量的扩增。除了扩增扩增子的双链，通过引物尾巴的“弹回”及其延伸引物的杂交形成单链发夹结构。在HR-1（毛细管）或Lightscanner（96/384孔板）上运行高分辨率熔解曲线。 结果：用弹回引物扩增的PCR产物在低温处显示两个发夹结构熔解峰，在高温处显示全部扩增子的熔解峰。发夹结构的熔解温度与其长度（6-28bp）是线性相关，与环的大小成负相关。我们可以轻松的将杂合突变和纯合突变进行基因分型。用弹回探针对100个未知基因型的临床样本的F5 1691G>A进行基因分型，与之前的分型结果一致。我们用2条弹回引物做不对称PCR，分析CFTR基因外显子10的2个范围，通过稀释产物形成分子内部杂合子进行基因分型，分出7种不同的基因型。 结论：弹回引物结合饱和染料基因分型的方法在闭管体系中，只用2条引物便可以提供一条特异的探针，此探针没有特殊的共价修饰。 在分子诊断学中，DNA的发夹结构是非常有用的工具，包括stem-loop探针和 self-probing扩增。stem-loop探针通常叫做“分子信标”，是一段共价修饰的核苷酸，一端末尾是荧光基团，另一端末尾是淬火剂。self-probing扩增用于弹回单链构想多态性（SSCP）和蝎子引物。弹回单链构想多态性SSCP逐渐用于在PCR产物中人工引入二级结构进行SSCP分析。依赖于扩增序列，与引物尾巴互补的8-11bp序列弹回至其延伸产物上，形成了单链发夹结构，虽然弹回SSCP的引物没有共价修饰，电泳已经足够分离发夹结构。 蝎子引物5’端复杂延伸，包括一个探针元素，一对自己互补的茎干序列，一个荧光基团，一个淬光剂，一个阻止5’端延伸复制的拦截单体。在分子内，蝎子比分子信标有些
PCR实验室建设设备参数 序号设备名称数量参数要求 1实时荧光定 量PCR 1台 一、主要技术指标： ★1、样品容量96孔； 2、适用耗材0.2ML96孔板，8联管，单管（乳白色管、透明管、磨砂 管无可适用）； ★3、检测通道≥4； 4、反应体系：1—100UL 5、光源：免维护LED光源； 6、荧光检测方式：光电二极管作为检测器，顶部激发，顶部扫描，无 荧光边缘效应； ★7、温度精准性：≤±0.1℃； 8、模块控温范围：0—100℃ ★9、温度均匀性：≤±0.1℃ ★10、操控方式：（1）单机运行：全彩触摸屏，可独立运行； （2）PC直连：可用软件与设备连接，进行设置、分析等。 ★11、软件分析功能：定性分析、定量分析、终点荧光分析、熔解曲线分析、SNP分析、高分辨熔解曲线等； ★12、实验数据在仪器内实时保存，具备断电再来电时自动恢复实验功能，以避免实验数据丢失及试剂损失； ★13、具有国家食品药品监督管理局颁布的三类医疗器械注册证； 14、需提供由厂家加盖公章的售后服务承诺书原件。 15、试剂耗材完全开放，支持普通的单管、8联管、96孔板。
16、售后服务：仪器安装、技术培训和售后服务要求由厂家经过专业培训工程师负责。 17、配套1000样品检测耗材，配备可以至少3台设备稳压电源1台。 18、配备笔记本电脑一台，且安装好原装软件。 2自动核酸提 取仪1台 一、仪器技术参数： 1、可从咽拭子、血清、血浆、全血、增菌液、组织、干血斑等多种类型 的样本中实现全自动、快速提取到所需要的目标核酸； ★2、运行原理：利用磁棒的磁性吸附技术将试剂中的磁珠在各个孔位中进行转移和反应，运行中不进行任何液体的转移工作即可完成整个提取过 程； ★3、处理能力：一次性完成1-96个样本的提取；可完成1-96可自由搭配。 4、操控方式：可通过仪器内置的液晶触摸屏进行触控操作； ★5、混合方式：通过微型电机带动磁棒保护套持续旋转使样本与试剂的充 分混合；分6区提取。 6、运行噪音：运行最大噪音不超过60分贝； 7、程序管理：仪器内置10组常用实验程序，且用户可根据需要灵活进 行新建、编辑、删除程序等操作； 8、实验舱内置紫外灯，最大灭菌时间可设置为60分钟； ★9、实验舱具备外排式独立风路，其中的生物滤棉可吸附其中的核酸气溶 胶； 10、数据接口：USB； ★11、配套试剂：具有预封装的病毒、全血、细菌、组织、干血斑等配套 提取试剂盒，其中病毒、全血、细菌提取试剂盒具备医疗器械注册证； 12、配套耗材要求：单条六联管、96深孔板两种不同耗材； 13、取得医疗器械注册证； 14、生产厂家已通过ISO:9001和ISO:13485体系考核； 15、免费质保时间不少于24个月； 16、需提供由厂家加盖公章的售后服务承诺书原件。 二、配置要求： 1、主机*1台；
高分辨熔解曲线突变检测 高分辨熔解曲线（High Resolution Melting）技术是近年来兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法。HRM不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品的分析。该方法与其他遗传分型技术相比具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、高通量检测的优点，是进行突变检测的迅速、廉价而有效的方法。 HRM原理 HRM是在PCR基础上通过测定DNA双链熔解曲线变化来检测突变的方法，溶解曲线的变化取决于DNA序列、长度、GC含量，因此，可以通过饱和燃料监控熔解曲线的变化来反映核酸性质的差异，从而对样品进行分析。 在双链体的溶解曲线检测时需要添加合适的染料，饱和染料例如SYBR Green 在双链解链过程中会发生重排，无法真实反映DNA熔解情况。不适用于需低温解链的样品而且不能检测异源双链体。因此不能用于熔解曲线的检测。而LC Green (Idaho)是一种与DNA有更强的结合位点，对PCR抑制作用很小的饱和染料，已成功的用于HRM检测中。 HRM操作简便，在PCR结束后添加合适的染料，通过监测升温过程中荧光染料与PCR扩增产物的结合情况来实现的，在Lightscanner仪器（Idaho）升温过程中，双链解开，荧光染料从解链的分子上释放，同时荧光强度降低，所以通过荧光强度和曲线的变化上就可以判断是否存在突变。
HRM的特点和应用 HRM应用： ?检测人类疾病相关基因中常染色体的显隐性和X-连锁
?鉴定人类肿瘤的体细胞突变，肿瘤样品中筛选体细胞突变 ?基因突变扫描：单碱基的改变、插入或缺失 ?特定突变、多态性位点的筛选 ?外显子和短扩增子基因型扫描 HRM特点： ?灵敏度高：杂合子突变体的检测的灵敏度可以达到100%，原则上数据分析时温度升高后纯合子或半合子的突变时检测不到的，但实际上，许多纯合子突变是可以检测到的。如基因突变正好与x连锁，可以在PCR之前加入已知野生型样本来检测半合子或纯合子的突变。 ?特异性好：HRM的特异性可以达到90-100%。短的扩增子特异性要更高 ?不受碱基位点局限，适用范围广 ?在封闭的试管内进行，可降低污染操作简单 ?成本低廉、时间少、误差小、高通量检测 ?检测的样品范围广：HRM检测片段范围在38-1000bp不同来源的样品都可以用于HRM如血粉、口腔细胞、冷冻的肿瘤样品、也可用于酒精固定、福尔马林固定或石蜡包埋的组织等，在人类遗传性疾病的研究中，通常用周边血液淋巴细胞中提取DNA，用于HRM分析。 HRM：实验设计中需要考虑的问题 ?高效的扩增方案的设计对于HRM的成功至关重要。最大的灵敏度和特异性有助于最佳的PCR结果的产生，同时扩增子的溶解特性对于结果也非常重 要。这取决于引物的设计和引物的位置。 ?在实验结果中有时会出现假阳性，这时可以通过调整引物或者扩增参数避免出现假阴性的结果。 ?样品的质量对特异性有一定的影响，因此，进行HRM分析时要选用高质量的样品。 总结 HRM灵敏度高、特异性好
LightScanner 高分辨溶解曲线分析系统技术参数 一、功能描述： 1、*不带荧光定量的独立的高分辨溶解曲线分析仪 2、非标记探针法（LunaProbe）进行位点基因分型（Genotyping） 功能；小片段扩增+温度内标法（Small Amplicon）进行位点基因分型（Genotyping）功能 3、针对PCR产物的未知基因突变筛查功能 二、硬件配置： 1、*标准8行x 12列的96孔板模式，高精度96孔板半导体电 加热温控方式，而非空气热循环模式 2、自动侦测、载入样品板装置 3、122阵列光源 4、CCD检测系统 5、cGMP认证并严格按照cGMP标准生产，CE认证 三、技术参数：
1、需配备可PCR前加入的LC Green Plus高分辨溶解曲线分析 荧光染料 2、控温精度：±0.01℃，温度范围：室温-100 °C 3、高分辨溶解曲线分析要求的缓慢升温方式：0.1℃/秒，降温 速率：95°到60 °C (非线性)~ 180 秒（室温25 °C条件下） 4、数据采集密度：100个数据/℃ 5、激发波长：470±20nm，发射波长：510 和600 nm 6、*非标记探针法（LunaProbe）进行位点基因分型（Genotyping） 功能，成本小于1.5元人民币/样本；小片段扩增+温度内标法（Small Amplicon）进行位点基因分型（Genotyping）功能。 7、DNA Genotype特异性99.5%（片段大小小于400bp） 8、反应体系5-100ul 9、分析时间：6分钟内完成96孔板（96个样品）的高分辨溶 解曲线分析 四、数据控制系统及软件： 1、*软件必须具有对PCR产物进行未知突变扫描和针对已知 SNP为点进行非标记探针（LUNA Probe）进行基因型鉴定的功能。 2、*软件必须具有进行低端和高端内标PCR产物进行校正的功 能，从而对小片段PCR扩增产物直接进行基因型鉴定（Genotyping）。 3、戴尔台式电脑，奔腾2.0G CPU，1G内存，80G硬盘，1280x1024
高分辨熔解曲线分析技术 高分辨熔解曲线分析技术，high resolution melting，简称HRM，是近几年来在国内外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的PCR 技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR 结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、基因分型等分析。 HRM 的主要原理是根据DNA 序列的长度，GC 含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。同许多荧光PCR 技术一样，HRM 是利用了特定的染料可以插入DNA 双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA 荧光染料与PCR 扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。 实验前准备 在实验开始前，先准备好本次实验所需的各种试剂，如：PCR检测用到的罗氏的LightCycler? 480 Control Kit和High Resolution Melting Master等。High Resolution Melting Master中含有2× Master Mix(包含热启动Taq DNA Polymerase 反应缓冲液，dNTP mix，高分辨率染料),25mM MgCl2，PCR级别的H2O，用于调整反应的最终体系。 本次实验所涉及到的仪器和耗材有：赛默飞公司提供的单道移液器、QSP 盒装吸头、冰盒，罗氏的LightCycler? 480，还有常规的离心机、水浴锅等。 HRM 体系配制 实验中用到的HRM试剂盒需要对MgCl2溶液进行最近的浓度确认，以一管DNA样品为例展开实验。 先加入1号管的2× Master Mix 165μl，再加入9号管的primer mix 33μl，最后加8号管的mutation突变体33μl，混匀，瞬时离心，分装到相对应的管中。 分装好做mutation样品的Mg2+浓度，以第1第2管来演示配制3.3倍体积加样。在1管中加入4μl MgCl2，再加入16μl水。同样地，在2管中加入5.3μl MgCl2 和14.5μl水，其他管按照对应的体积配制即可。同时根据说明书配制好WT野
目前，有不少人把高分辨率熔解曲线(HRM)和Real-time的熔解曲线混为一谈，只要一听到熔解曲线4个字就和荧光定量联系在一起了，再加上现在市面上有些仪器兼具荧光定量和HRM的功能，使一些同行更加迷惑。今天去给大家讲一下两者之间的区别。（一）.两者的原理HRM：不同核酸分子的片段长短、GC 含量、GC 分布等是不同的，因此任何双链DNA 分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。HRM 技术的基本原理就是在PCR反应之前加入饱和染料，在PCR反应之后进行升温变性，采集荧光信号，根据熔解曲线的不同即Tm值的不同来对样品来进行区分。 Real-time：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监控整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 （二）.两者的采集过程 HRM：高分辨率熔解曲线（HRM）是在PCR反应之后，对PCR产物进行升温变性，采集荧光信号的变化，绘制成不同形状的曲线。Real-time：是在PCR过程中采集荧光信号。 （三）.两者的应用 HRM：筛查未知突变和针对已知位点进行基因分型。基因分型的方法为非标记探针法和小片段法。
Real-time：定量及基因分型。基因分型的方法是：Taqman探针，水解探针等。 （四）.基因分型方法的费用 HRM基因分型方法的费用远低于Taqman探针和水解探针。（五）.两者所用的染料 HRM：LC Green饱和染料，能与DNA双链的碱基紧密结合，不抑制PCR反应，在PCR反应过程中是过饱和的状态。 Real-time：SYBR Green不饱和染料，不能与DNA双链的碱基紧密结合，浓度高时会抑制PCR反应，只能少量加入。 广州誉维生物科技仪器有限公司上传
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910371645.9 (22)申请日 2019.05.06 (71)申请人 上海派森诺生物科技股份有限公司 地址 200030 上海市徐汇区银都路218号2 号楼1、2层 (72)发明人 何小明 钱怡 孙子奎 (74)专利代理机构 上海天翔知识产权代理有限 公司 31224 代理人 吕伴 (51)Int.Cl. C12Q 1/6858(2018.01) (54)发明名称 利用高分辨率熔解曲线法检测左乙拉西坦 用药相关基因SCN1A多态性的试剂盒及其方法 (57)摘要 本发明公开了一种利用高分辨率熔解曲线 法检测左乙拉西坦用药相关基因SCN1A多态性的 试剂盒，其特征在于，包括所述SCN1A基因的多态 性位点rs2298771的检测引物，所述引物的核苷 酸序列如下所示：SCN1A上游引物：5′-CAA GAA AGA CAG TTG TAT GTC CAA TC -3′；SCN1A下游引 物：5′-ACA CTG CTG CCA GTT CCT ATA CC -3′； 其他部分为HRM分析试剂盒的常规试剂。本发明 还公开了一种利用高分辨率熔解曲线法检测左 乙拉西坦用药相关基因SCN1A多态性的试剂盒的 检测方法。本发明的试剂盒适用于对左乙拉西坦 个体化用药基因进行快速检测，可广泛应用于临 床上左乙拉西坦个体化用药方案制定的基因检 测。 权利要求书1页 说明书8页序列表2页 附图1页CN 110106236 A 2019.08.09 C N 110106236 A
StepOnePlus 技术参数 仪器规格 热循环系统：珀耳帖效应系统 通道数：4色荧光通道 Block规格： 96孔专用合金Block，支持标准与快速反应模式 支持容量： 10–40 μL 支持耗材：96孔 mL) 反应板与光学盖膜?96孔 mL) 反应板与光学平盖?8 连管 mL) 条带与光学平盖?单管 mL) 与光学平盖 Block最高升降温速率： 4.6°C/秒 系统可升级性：可升级 HRM 模块 温度范围： 4°C–100°C *数码梯度功能：VeriFlex TM Block技术，6个温控区域可独立控制，最大温差25℃，相邻区域间温差最大可达5℃ 高分辨熔解曲线分辨率：低至 0.1°C 光学系统：单一LED激发光源、检测滤光片、光电二极管 安装时已校准染料： FAM TM、SYBR?Green I、VIC?、JOE TM、ROX TM、NED、TAMRA染料 *荧光内参比：软件支持ROX TM荧光校正，校正孔与孔之间的误差以及加样时的误差。 数据采集：对所有反应孔收集所有滤片的数据，试验结束后反应板设置可修改 *触摸屏控制： LCD/6.5 英寸Full VGA (640x480)/260K 色 *单机运行模式：可连接或不连接电脑，直接定义运行程序，并储存数据结果。 远程监控和e-mail通知：允许用户通过远程网络或是局域网，实时监控反应进程，并且在仪器启动和运行结束的时候，可以发e-mail通知实验者。 已验证性能指标 动态范围：9 个对数的线性动态范围 灵敏度：可在单一报道基因30μL TaqMan?分析中检测 10 拷贝 RNaseP 模板 精密度：使用 TaqMan? RNaseP 仪器验证反应板，可分辨 5,000 至 10,000 个 RNaseP 模板拷贝（置信度 %） 运行时间：同时支持快速模式和标准模式。快速：40 循环少于 40 分钟；标准：40 循环少于 2 小时 软件支持应用