基于蛋白质的转基因产品检测方法
1.酶联免疫吸附法（Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)
ELISA是抗原抗体免疫反应和酶高效催化反应的有机结合，从20世纪70年代以来已在生物学领域广泛应用，该方法有两个特点，一是抗原抗体免疫反应在固体表面进行，二是用酶作为标记物进行蛋白质测定。
转基因植物表达的外源蛋白的抗体与被检测样品中的外源蛋白结合，再结合酶标抗体或酶标抗抗体，加入底物后通过酶促反应形成有色物质，根据颜色的深浅或酶标仪检测的结果判断是否为阳性。ELISA反应中，抗原抗体反应发生在固相微量滴定板上，抗原与抗体反应并产生稳定的复合物，经加入与酶连接的第二抗体可以显现，加入酶的底物后会产生颜色反应，因此可用分光光度计测量或肉眼检测(图3-1)。
ELISA方法有直接法、间接法和双抗夹心法，使用较多的是双抗夹心法，其检测灵敏度最高。一般的ELISA反应为定性检测，但若作出已知转基因成分含量与光密度值（OD）的标准曲线，也可根据标准曲线由未知样品的OD值来确定此样品中转基因成分的含量，达到半定量测定。一些ELISA试剂盒提供了标定物（已知浓度的液态目标分析物）和阴性对照（已知不含目标分析物）用于测试结果的显现和说明。这些标准品（标定物和对照）在给定的不同浓度（比如：0, 0.5 ppb, 1 ppb ,5 ppb ,10 ppb）显示不同的颜色。通过比较样品与标准品的颜色差别，就可以测定一定范围内样品的浓度，比如“1 ppb到5 ppb之间”。这种结果是
半定量的。若要得到定量的解释，可以将微孔板放到微量板读数仪去读数，微量板读数仪可以一次性准确地读出所有样品和标准品的光密度。再利用读数仪所提供的软件，便可从标准曲线上计算出样品浓度。
ELISA具备了酶反应的高灵敏度和抗原抗体反应的特异性，具有简便、快速、费用低等特点，但易出现本底过高的问题，且只能检测目的蛋白抗原性没有明显变化的粗加工产品。直接法和双抗夹心法都要制备特异的酶标抗体，制备方法较繁琐，且一种酶标抗体只能检测一种蛋白，而适用于间接法的酶标抗抗体已有商品出售。一种转基因蛋白的检测试剂盒是否能在表达相同外源蛋白的不同植物之间通用还要进行试验。
2.侧向流动免疫测定法（Lateral Flow Strips)
“侧流”型免疫测定是最近15年发展起来的，该方法之前主要用于医学领域。与ELISA相似，这种测定方法也是基于三明治夹心式技术原理，但该方法是在一种固相支持物上而不是在管子里进行，标记的抗原-抗体复合物侧向迁移，直至遇到在一种固定表面上的抗体。目前市场上已出现了用于侧向流动免疫测定并能用于野外测试的试剂盒。与DNA为基础的检测方法相比，该方法的样品处理简单。由于目标蛋白一般是水溶的且抗体具有高度专一性，因此检测样品仅需要初步处理便能达到测试的要求，具有快速、简便、适合野外操作等优点。
侧向流动免疫测定试纸条可用于检测叶片、种子和谷粒中的转基因成分。侧向流动试纸条被放入少量含有外源蛋白的植物组织抽提物中后，配对抗体与蛋白之间的发生结合形成了三明治形式的复合物，但并不是所有的抗体都与显色试剂相结合。由于膜上具有两个捕获区段，一个捕获外源蛋白结合物，另一个捕获显色试剂。当三明治形式和/或非反应的显色试剂在膜上的特异区段被捕获时，捕获区段显示微红色。若膜上显示单一的一条线（控制线），表明样本是阴性的，若出现两条线，表明样本是阳性的（图3-2）。
与ELISA相比，试纸条检测蛋白也是根据抗原抗体特异性结合的原理，不同之处是以硝化纤维代替聚苯乙烯反应板为固相载体。对外源蛋白特异结合的抗体上联结了显色剂，被固定在试纸条内，当试纸条一端被放入含有外源蛋白的植物组织提取液中，另一端吸水垫的毛细管作用使提取液向上流动，当特异抗体与外源蛋白相结合时，呈现颜色反应。试纸条上含有2个“捕获”区域：1个“捕获”结合外源蛋白的抗体蛋白复合物，另1个“捕获”显色剂。当所形成的夹心复合物及未反应的显色剂被试纸条上的相应“捕获”区捕获时，这些捕获区显红色区带。当在试纸条上只显示1条区带(质控线)时，为阴性结果，表明不含有被检测的转基因蛋白，而当显示2条带时则为阳性结果时则表明含有被检测的转基因蛋白。
美国检测StarLink玉米中的Cry9C蛋白的试纸条已成为美国官方的检测方法。Trait RUR Lateral Flow试剂条可用于检测整合在生物体内的源自根癌农杆菌CP4菌株的基因所表达的CP4-EPSPS蛋白。
侧向流动免疫测定试纸条是一种很快速简便的定性检测方法，将试纸条放在待测样品抽提物中，5～10分钟就可得出结果，不需要特殊仪器和熟练技能。但一种试纸条只能检测一种蛋白质，且只能检测有无存在外源蛋白而不能区分具体的转基因品种。侧向流动免疫测定方法是定性或是半定量。按照合适的采样步骤，可以在给定的一批样品中以99%的置信水平检测出少于0.15%的转基因成分。
3.Western blot 杂交
在基因工程研究中, 经常需要检测外源基因是否能表达，即转录的mRNA能否翻译出特异蛋白质。外源基因表达产物若是酶，可测定该酶活性；若表达产物不具酶活性，就要采用免疫学方法检测，一般采用Western blot杂交。转化的外源基因正常表达时，转基因植株细胞中含有一定量的目的蛋白。从植物细胞中提取总蛋白，将蛋白质样品溶解于含去污剂和还原剂的溶液中，经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳使蛋白质按分子大小分离，将分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，膜在高浓度的蛋白质（如牛血清白蛋白）溶液中温浴，以封闭非特异性位点。随后步骤同ELISA间接法，即加入目的蛋白的特异性抗体（一抗），印迹上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一结合的酶标记第二抗体, 最后通过第二抗体上标记化合物的性质进行检测。根据检测结果，可分析出被检植物细胞内目的蛋白表达与否、浓度大小、及大致的分子量。程英豪等以黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）外壳蛋白（coat protein，CP）单克隆抗体, 采用Western blot 杂交检测转CMV CP基因的番茄中外源基因的表达情况, 结果表明，在16株具有PCR扩增产
物的转基因植株中有11株表达出CMV CP。
Western blot杂交是植物基因工程中检测外源基因是否表达出蛋白质的权威方法，将蛋白质的电泳、印迹、免疫测定融为一体，具有很高的灵敏性，可以从植物细胞总蛋白中检出50 ng的特异蛋白质，若是提纯的蛋白质，可检出1～5 ng。但其操作较繁琐，费用较高，不适于口岸快速、大量样品的检测。植物病毒检测方法之一为斑点免疫吸附法，与Western blot 杂交相比不同的只是蛋白质样品不经过凝胶电泳，而是直接点在膜上，此方法很适合于大量样品的检测，是否也适用于转基因产品蛋白质的检测还有待试验验证。
基于核酸的转基因产品检测方法
转基因产品的核酸检测方法主要有三种，一是核酸分子杂交技术（Southern blot），二是PCR检测技术，三是基因芯片技术。目前，PCR方法是最主要、最准确地检测转基因产品检测的方法，包括定性PCR方法、复合PCR方法、竞争性定量PCR方法、荧光定量PCR 方法。目前基因芯片技术正处于发展阶段，应用于转基因产品检测还不多。
一、按检测策略分类：
转基因产品PCR检测方法建立的主要依据是扩增特异性的转基因植物的外源基因片段，选择不同的特异性目的基因片段得到的PCR检测结果可能不太一致，因此建立一种转基因植物的PCR检测方法需要充分考虑扩增的特异性目的片段。在转基因植物过程中，外源DNA片段可以分为通用元件、目的基因、外源载体序列这三大类，因此根据不同的外源DNA 片段，PCR检测策略可以分为四种，即通用元件筛选PCR检测、基因特异性PCR检测、构建特异性PCR检测、品系特异性PCR检测。图4-1说明了四种转基因产品检测策略的重点和每种策略的灵敏度比较。表4-1列出了商业化转基因植物的主要外源基因。
1.通用元件筛选PCR(Screen PCR) 检测
通用元件筛选PCR检测主要以转基因产品的通用元件和标记基因为特异性扩增片段，例如CaMV35S启动子、FMV35S启动子、NOS终止子、7S 3’终止子等通用元件以及NptII、Hpt、Pat、GUS、aad等标记基因。由于相同的通用元件和标记基因经常被用于多种转基因产品的研究与生产中，从而大大降低了筛选PCR检测的特异性，只能用于转基因产品检测的初步筛选。目前常用的启动子、终止子和标记基因的PCR检测方法都已经建立起来，并用于转基因产品PCR检测。表4-2列出了主要转基因植物的筛选标记基因。
2.基因特异性PCR(Gene-specific PCR) 检测
基因特异性PCR检测以插入外源基因的特异性DNA片段作为目的检测片段，例如Cry1Ac、Cry1Ab和CP4-EPSPS等基因，如图4-1所示。目前已经建立很多种外源目的基因的特异性PCR检测方法，基本上涵盖了所有商业化种植的转基因产品的外源目的基因。但是，由于相同的外源基因可能在相同或不同的植物中表达，形成新的具有相同农艺性状的品系或新的转基因植物，因此基因特异性检测方法不能特异性的区分具有相同农艺性状的转基因植物及其品系，在建立基因特异性检测的同时还用引用其他PCR检测方法作为辅助。表4-3列出了转基因植物中的主要外源目的基因和已有的相关检测方法。
3.构建特异性PCR(Construct-specific PCR) 检测
构建特异性是通过检测外源插入载体中两个元件的连接区的DNA序列实现的，如图4-1所示。这种方法具有相对较高的特异性，在转基因产品检测种使用较多，目前商业化种植的各种转基因植物的构建特异性PCR检测方法已经基本上建立，尤其是用于食品原材料的转基因大豆、玉米、番茄、油菜和马铃薯等农作物。但是由于相同的转基因外源表达载体在转基因转化过程中，可能以一个、两个或者多个拷贝的形式插入到不同或者相同的植物基因组中，形成具有相同农艺性状的不同的转基因品系，因此构建特异性检测方法不能特异性的区分具有相同农艺性状的转基因植物和不同培育品系。
4.品系特异性PCR(Event-specific PCR) 检测
品系特异性检测是通过检测外源插入载体与植物基因组的连接区序列实现的，如图4-1所示。由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，并且连接区序列是单拷贝的，所以品系特异性检测方法具有非常高的特异性和准确性。鉴于上述四种转基因产品检测策略的优缺点，品系特异性检测已经成为目前转基因产品检测研究的重点，并逐步地为国际检测标准和国际各检测实验室所采用。到目前为止，已有相当部分的转基因植物品系的品系特异性检测方法的报道，例如转基因Roundup Ready大豆、转基因玉米品系（Mon810、NK603、T25、Bt11、Mon863、StarLink、GA21和Bt176）、转基因油菜GT73等。
二、按PCR技术原理分类：
在转基因PCR检测过程中，由于不完全一致的检测原理和检测结果形式，PCR检测方法可以分为定性PCR检测、复合定性PCR检测、竞争性定量PCR检测、PCR-ELISA、荧光定量PCR检测等类型。
1.定性PCR检测方法
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成。主要过程是将提取的样品DNA作模板，以20 nt左右的寡核苷酸链作引物，引物能与外源基因DNA特定序列互补配对，通过聚合酶的作用，在体外快速特异地扩增目的基因片段，使微量、特定的目标DNA
片段在几个小时内迅速扩增到百万倍。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色后很容易观察，不通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的特定核苷酸序列，因而具有快速、灵敏等优点。具体操作程序包括样品的DNA提取纯化、PCR扩增、扩增产物的检测。检测通常会设立空白对照（如无菌双蒸水）、阴性对照（非转基因样品DNA）或阳性对照（如载体质粒或转基因样品DNA）以保证检测结果的准确性。
PCR是一种快速、灵敏的核酸检测方法，灵敏度一般为0.01%。在转基因产品检测上已得到广泛应用。转基因产品检测过程中，一般是先检测样品的来源，通过检测常用植物的内标准基因实现，然后检测转基因产品中普遍存在的3种通用元件：启动子、终止子、标记基因。如果结果为阳性则进一步检测外源结构基因。目前我国已经形成了以定性PCR检测方法为主的转基因产品方法，并出台了相关行业和国家技术标准。
针对全球商业化转基因产品（大豆、油菜、玉米、棉花和番茄等）的定性PCR检测方法研究报道很多，且相应的转基因特异性检测试剂盒也已经研发成功。例如，通过对35S 启动子、NOS终止子的检测，实现了对抗草甘膦大豆Roundup-Ready转基因成分的筛选检测。Matsuoka等通过对7种转基因玉米转入的外源基因的序列分析，设计了14对引物检测7种转基因玉米启动子、终止子和结构基因，分别对转基因玉米、非转基因玉米、转基因大豆、非转基因大豆进行了PCR扩增检测，同时为检测所设计的引物特异性，还对其他作物如水稻、大麦、小麦等进行了PCR扩增，检验结果表明该方法能够快速有效地检测转基因玉米品种。V ollenhofer等设计了针对35S启动子、NOS终止子、NPTII基因检测的特异性引物，利用PCR 方法检测了转基因大豆Roundup-Ready、抗虫Bt玉米种子及深加工食品，并采用Southern blot 杂交和限制性内切酶酶切对实验结果进行了确证。
2.复合定性PCR(multiplex PCR)检测
复合PCR检测，就是将两对或者两对以上的引物在同一个反应管中进行扩增，达到同时检测两个或两个以上目的DNA片段的目的。复合PCR检测的优点是PCR检测的效率高，实际检测时间短、费用低，且具有很高的检测灵敏度。复合PCR检测方法建立的难点在于PCR引物的设计和PCR反应条件的优化和每对引物反应效率不一致。因此在建立复合PCR 检测体系时必须考虑上述因素。
目前，复合PCR检测方法已经在转基因产品检测中广泛应用，例如Delano等建立了转基因玉米(Bt 176, Bt11, Mon810和T14/25)、大豆(Roundup Ready)、油菜(GT73, HCN92/28, MS8/RF3和Oxy 235)的复合PCR检测方法，其检测灵敏度为0.1%。潘爱虎等报道了转基因油菜GT73的复合PCR检测。Germini等报道了在一个PCR反应中最多可以同时检测五种转基因植物品系（转基因玉米品系MON810、Bt11、Bt 176、GA21和转基因Roundup Ready大豆）的7个目的基因，且具有较高的检测灵敏度（0.06～0.25%）。
3.巢式PCR(Nested PCR)
巢式PCR，又称为套式引物（nested primer）PCR，有两对引物：一对引物在目的模板DNA的外侧，称为外引物（outer-primer）；另一对引物对应的序列在同一模板DNA的外引物的内侧，称为内引物（inner-primer），即外引物的扩增产物中含有内引物的互补序列，外引物扩增后的产物成为内引物的模板，这样经过两次PCR扩增可以大大地提高PCR检测的灵敏度，从而实现对微量模板DNA样品的分析和检测。同时，巢式PCR减少了引物非特异性褪火，从而增加了特异性扩增，提高了扩增效率，也提高了检测的灵敏度。巢式PCR对
转基因食品样品的快速检测非常有效。
4.竞争性定量PCR(QC-PCR) 检测
定量竞争PCR法的实验原理比较巧妙，实验程序设计较为严谨，采用构建的竞争DNA与样品DNA中相互竞争相同底物和引物，并根据电泳结果作出工作曲线图，从而得到可靠的定量分析结果，具体的反应原理见图4-2。1998年欧盟的12个实验室共同对竞争PCR 法进行了研究，结果表明竞争PCR法与定性PCR法相比大大降低了实验室间的实验误差，竞争PCR法完全可以对转基因食品的转基因含量进行检测。此方法对实验仪器的要求不高，不足之处是需要利用基因重组技术构建标准竞争DNA，且每次检测需要作多个标准样品的对照，不太适合高通量的样品检测。
Hardegger等人建立了CaMV35s启动子和Nos终止子的竞争性定量PCR分析体系。Zimmermann等人利用该方法建立了转基因Bt11玉米的定量PCR分析体系。Van den Eede G 等建立了转基因大豆、转基因玉米Bt176的定量分析。Studer E和Hardegger M等人成功利用该方法对转基因大豆、玉米的转基因含量进行了定量分析。
5. PCR－ELISA检测
传统的PCR产物是利用琼脂糖凝胶电泳法分析，它只能粗略判断产物的大小，并不能鉴别产物的特异性，因此在常规PCR检测中常出现非特异性、假阳性等问题。新近发展起来的PCR－ELISA是用免疫学方法检测PCR产物，将PCR的高效性和ELISA的高特异性结合在一起。目前国外已开发出转基因产品PCR－ELISA检测试剂盒，我国也已建立了检测转基因产品的PCR－ELISA法。该方法用一种特殊的管（也可用PCR管代替）经过处理后共价交联结合诱捕分子，诱捕分子是与需扩增的目的DNA分子互补的一段寡聚核苷酸分子；以诱捕到的目标DNA为模板进行PCR扩增，其中大部分扩增DNA分子以共价键固定在管上，经变性去掉互补链，清洗后只有互补目标分子保留在管上，用生物素或地高辛标记的探
针进行杂交，用碱性磷酸酯酶标记的抗生物素或抗地高辛进行ELISA检测，颜色反应通过酶标仪读数。液相的PCR产物可通过凝胶电泳进行检测，也可进行杂交检测。常规的PCR－ELISA法只是定性实验；若加入内标，作出标准曲线，也可实现半定量的检测目的。
与常规PCR相比，PCR－ELISA增加了杂交步骤来检测PCR产物的特异性，用酶联反应来放大信号提高了检测的准确性、灵敏度及自动化程度，比常规PCR、ELISA的灵敏度大大提高；杂交检测可自动化，适于大批样品检测；包被管可长时间保存，使用时不需临时包被，是适合推广的一种转基因产品检测方法。
6.实时荧光定量PCR(Real-time PCR) 检测
实时荧光定量PCR的基本原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法，定量的原理参见图4-3。在实时荧光定量PCR技术发展过程中，两个重要的发现起着关键的作用：（1）在90年代早期，Taq DNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的发现，它能降解特异性荧光标记探针，因此使得间接地检测PCR产物成为可能。（2）此后荧光双标记探针的运用使在一密闭的反应管中能实时地监测反应全过程。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展，导致实时荧光定量PCR方法在研究工作中的普遍应用。实时定量PCR中反应信号的检测贯穿于整个反应过程，适于高通量和常规分析，是目前最受亲睐的转基因产品检测方法。
在荧光定量PCR方法发展过程中，由于采用的荧光基团发光原理的不同，该方法又可以分为很多种，例如SYBR Green I荧光染料、FRET技术、TaqMan探针、Molecular Beacon、sunrise、scorpion、Self-quenched技术和UT－PCR等。
目前已有很多利用上述探针建立的转基因产品PCR检测方法的报道，其中TaqMan 荧光定量PCR方法由于其探针的简单和高度特异性得到最广泛的应用。
摘要：为了了解欧盟转基因生物安全检测技术发展现状，提高我国转基因安全监管水平。本研究根据对欧盟8家转基因检测相关机构现状的调查和分析结果，阐述了转基因检测过程中的关键技术要点及欧盟的实施情况，具体包括抽样与制样方法，转基因检测方法的循环验证与参数要求，样品的检测策略与实验室环境要求，以及检测结果的表述与不确定度评估。并结合我国转基因生物安全检测发展现状，提出了开展检测方法的实验室联合验证和加强转基因定量PCR检测技术的研发和应用的建议。 关键词：欧盟;转基因生物;检测技术 引言 1.随着转基因技术的兴起和快速发展，转基因产品的安全性问题逐渐成为国际社会普遍关注的热点和焦点[1，2]。为促进转基因产业的健康发展，保障消费者的知情权和选择权，世界上许多国家和地区颁布了相关的转基因生物安全管理与标识制度[3-5]。其中，欧盟是世界上转基因生物安全管理与标识管理制度较为严格和完善的地区，也是第一个提出进行阈值管理的地区[6]。为了给转基因生物安全管理与标识制度提供技术支撑，欧盟花费庞大人力、物力和财力进行转基因检测技术研究。 2.构建了完善的转基因检测方法循环研制实验室网络和转基因检测标准物质研制机构[7，8]。在欧洲，执行转基因检测的机构组成了欧洲转基因检测网络实验室(EuropeanNetworkofGMOLaboratories，ENGL)。ENGL除了进行日常检测，还对欧盟设置在欧盟联合研究中心(JointResearchCentre，JRC)下属健康与消费者保护研究所(InstituteforHealthandConsumerProtection，IHCP)的欧盟转基因食物与饲料基准实验室(EuropeanUnionReferenceLaboratoryforGMFood&Feed，EURL-GMFF)研制和提供的转基因检测方法进行验证[9，10]。 3.目前国际上研制的转基因检测标准物质和发布的转基因检测标准方法有一半以上来自欧盟，因此有必要对欧盟的转基因检测技术平台进行分析研究。根据在欧盟联合研究中心健康及消费者保护研究所下属欧盟转基因食品和饲料基准实验室、意大利拉齐奥大区和托斯卡纳大区动物预防性实验研究院下属转基因检测国家基准实验室、翁布里亚区食品科技园(3A-PTA)内第三方食品安全检测实验室(Analysis)、洛迪省Tavazzano种子检测实验室等8家转基因检测相关机构(实验室)和单位进行的调研和考察，本文重点阐述了转基因检测过程中的关键技术要点以及欧盟的实施情况。并结合我国转基因生物安全检测发展现状提出相应建议，旨为我国转基因检测技术的发展提供参考。 一、抽样与制样 1.1抽样是转基因成分检测的第一个环节，也是非常复杂和重要的环节。抽样要有代表性，要能准确反映出样品的总体情况[11]。欧盟国家转基因安全管理主要遵循预防原则，与我国采取的源头控制理念类似。以意大利为例，目前意大利尚未批准转基因作物的商业化种植，在转基因生物监控计划实施过程中，边境检查站、国家宪兵队和地区卫生部门等执法机构负责抽样工作，样品主要来自进口等环节;农业部执法机构抽检样品则主要来源于种子企业的种子库，基本不对市场上销售的产品进行检测。 1.2因此，意大利转基因检测抽样主要是针对批次货物，不涉及田间种植样品。在典型情况下，欧盟国家执法机构的抽样工作参照《Rec.2004/787/ECTechnicalguidanceforsampl-inganddetectionofGMOs》进行[12]，可以对多至109粒的样品进行抽样。多个取样点至少可以获得105粒种子，将多个取样点的样品混匀，从中取出3份各3000粒种子交给转基因检测机构进行检测。转基因检测机构将其中一份3000粒种子粉碎，取少量(至少包含105个粉碎的颗粒)粉末提取DNA，用于转基因检测(批
SN/T1194—×××× I ICS SN 植物及其产品转基因成份检测 抽样及制样方法 Methods of sampling and preparation of samples for detection of genetically modified components in plants and their derived products （征求意见稿） 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布
SN/T1194—×××× II 前言 本标准由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准由中华人民共和国质量监督检验检疫总局批准发布。 本标准代替SN/T1194-2003《植物及其产品转基因成份检测抽样和制样方法》。 本标准起草单位：辽宁出入境检验检疫局、厦门出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：曹际娟、郑江、陈红运、黄新、陈颖、朱水芳。 本标准系代替了SN/T1194-2003。
SN/T1194—×××× 植物及其产品转基因成份检测 抽样和制样方法 1 范围 本标准规定了植物及其产品转基因成份检测的抽样和制样方法。 本标准适用于植物及其产品转基因成份检测的抽样和制样。 2 规范性引用文件 下列文件对本文件的应用是必不可少的。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 0798 进出口粮油、饲料检验检验名词术语 SN/T 0799 进出口粮油、饲料检验检验一般规则 SN/T 0800.1 进出口粮油、饲料检验抽样和制样方法 SN/T 0952 进出口商品抽样检验程序孤立批计数抽样批不合格品率的估计及样本量的选（适用于批量较大的情形） GB/T 10111 随机数的产生及其在产品质量质量抽样检验中的应用程序 GB/T19495.1 转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.7 转基因产品检测抽样和制样方法 3 定义及术语 3.1 定义 转基因植物 Genetically Modified Plants 指用基因工程技术或者现代生物技术改变基因组构成的植物。 3.2 术语 本标准采用SN/T 0798中的一般术语以及GB/T19495.1、GB/T19495.7中的术语。 4 总则 4.1 一般规定 4.1.1 抽取及制备的样品应具有代表性。 4.1.2 应确保抽样器具清洁、干燥、无异味，抽样、制样器具及样品容器所用材质不应对待抽取样品造成污染。 4.1.3 为避免交叉污染，尽可能使用不同的抽样和制样器具或设备抽取和制备不同交付批的样品，盛装样品的容器或包装应尽可能一次性使用。如果不能做到（例如使用机械取样设备时），则应在抽取和制备一个交付批的样品后使用适当方法清洁所有器具和设备。 4.1.4 在所有抽样过程中应避免样品散落，防止有活性的生物污染生态环境。 4.1.5 应在物理隔离的区域制备样品，防止对其他区域或实验室的污染，并应及时清洁制样区域。4.1.6 必要时使用DNA销毁剂处理抽样和制样器具和设备、样品容器及制样区域。 4.1.7 适用时，应参照GB/T 1949 5.1《转基因产品检测通用要求和定义》中的规定防止污染。 4.1.8 抽样时应注意保护样品，抽样器具和样品容器应存放于清洁的环境中，避免雨水和灰尘等外来物引起的污染。 1
转基因技术的理论基础来源于进化论衍生来的分子生物学。基因片段的来源可以是提取特定生物体基因组中所需要的目的基因，也可以是人工合成指定序列的DNA片段。DNA片段被转入特定生物中，与其本身的基因组进行重组，再从重组体中进行数代的人工选育，从而获得具有稳定表现特定的遗传性状的个体。该技术可以使重组生物增加人们所期望的新性状，培育出新品种。 1992年荷兰培育出植入了人促红细胞生成素基因的转基因牛，人促红细胞生成素能刺激红细胞生成，是治疗贫血的良药。转基因技术标志着不同种类生物的基因都能通过基因工程技术进行重组，人类可以根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，创造新的生命类型。同时转基因技术在药物生产中有着重要的利用价值。转基因技术，包括外源基因的克隆、表达载体、受体细胞，以及转基因途径等，外源基因的人工合成技术、基因调控网络的人工设计发展，导致了21世纪的转基因技术将走向转基因系统生物技术2000年国际上重新提出合成生物学概念，并定义为基于系统生物学原理的基因工程与转基因技术。 1.转基因的细胞学原理： (1)细胞周期及MPF：细胞周期可人工分成4个时期，分别为G1期、S期、G2期和M期。细胞在正常情况下，沿着G1-S-G2-M路线运转。S期为DNA合成期，M期为有丝分裂期，M期结束到S期开始之前为G1期，S期末到有丝分裂期(M期)为G2期。有丝分裂的启动由成熟促进因子也叫M期促进因子(maturation/mitosism/meiosis promoting factor，MPF)调控，MPF 在细胞分裂中呈周期性变化即分裂后逐渐积累，到G2晚期达到高峰，由中期向后期转换时骤然消失。因此推测MPF是真核细胞M期的一个基本调节物质，能引导细胞由间期向M期转变。MPF由蛋白激酶激活，存在于所有的真核细胞中(包括减数分裂的性细胞)。但并非所有的细胞都是周期中细胞，某些细胞在一定的条件下可以脱离细胞周期进入G0期或分化为不分裂的细胞，而且G0期细胞可通过诱导重新进入周期。 (2)通过MⅡ期的卵母细胞转基因：MⅡ期的卵母细胞的MPF含量很高，可以诱导细胞核发生一系列变化包括核膜破裂(NEBD)和早熟染色体凝集(premature chromosome condensation，PCC)，处于减数分裂MⅡ期的卵母细胞无核膜的时间远远长于有丝分裂M期的细胞。所以此时期的卵母细胞可作为基因导入的受体。据此1998年Anthonv等对逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎方法加以改进，用逆转录病毒载体注射MⅡ期的卵母细胞，注射完毕的卵母细胞同获能后的精子共同孵育后，体外发育至囊胚，再移植到母牛体内得到了转基因小牛。1999年Anthonv等又将精子与外源基因共孵育，然后将精子头部显微注射入MⅡ期的卵母细胞，这两种方法共同之处都是利用MⅡ期的卵母细胞无核膜，外源基因易导入的 特点。 2.转基因的胚胎学原理： (1)哺乳动物转基因的胚胎学原理：精子和卵子只有发育成熟后，精卵相遇时才能完成受精过程。精子进入卵子后头尾分离，胞核出现核仁，形成核膜，头部膨大形成雄原核；同时卵子排出第二极体形成雌原核。一般来说雄原核比雌原核大。接着雌雄原核的核膜消失，雌雄原核融合。随后细胞周期性卵裂，分裂球增加到32个时形成桑葚胚，进入子宫再发育至囊胚，此前的胚胎细胞具有很强的分化能力。从哺乳动物受精卵分裂发育的规律来看，转基因操作时较合适的部位是受精卵的雄原核，精子进入卵细胞后的1小时，雄原核和雌原核还未融合，在显微镜下容易看到雄原核。多数研究者在此时期把外源基因显微注射到雄原核，通
专题4 生物技术的安全性和伦理问题 4.1 转基因生物的安全性 1．转基因生物的安全性问题主要包括( ) ①食物安全②生物安全③环境安全④社会安全 A．①②③B．②③④ C．①②④D．①②③④ 解析：转基因生物的安全性问题主要包括食物安全、生物安全和环境安全三个方面。 答案：A 2．自从1983年第一株转基因植物问世以来，已有数十种乃至上百种转基因植物在世界各地的实验室中诞生，随着转基因技术的发展，“基因污染”应运而生，关于基因污染的下列说法不正确的是( ) A．转基因植物的果实或其他部分作为食物可能会引起食用者产生不良反应 B．转基因植物可能与它们的近缘野生种发生自然杂交，可能破坏生态系统的稳定性C．基因污染是一种不可以增殖的污染 D．为了防止转基因的扩散，在大面积种植时，必须在周围设置缓冲带作物 解析：食用转基因的食物时，可能会因外源基因产生的性状对食用者不适而造成不良反应，故A对；转基因植物是人造物种，可能与自然物种杂交，而危及生态系统的稳定性，故B对；在大面积种植转基因植物时，要在周围设置缓冲带作物以防转入基因的扩散，故D 对；基因污染是一种可增殖的污染，可通过繁殖而传递下去，故C错。 答案：C 3．科学家通过基因工程的方法，能使马铃薯块茎含有人奶蛋白。以下有关该基因工程的叙述正确的是( ) A．虽然转基因马铃薯与普通马铃薯之间可以相互授粉并产生可育的种子，但两者已属于不同的种了 B．人工种植的转基因马铃薯种群的人奶蛋白基因频率将不会发生改变 C．马铃薯的叶肉细胞不可作为受体细胞 D．处理质粒和含有目的基因的DNA时通常用同一种限制酶 解析：转基因马铃薯与普通马铃薯之间可以相互授粉并产生可育的种子，因此属于同一物种；人工种植的转基因马铃薯种群因导入了人奶蛋白基因，该种群的基因频率将会发生改变而发生进化；基因工程中的受体细胞可以是植物细胞、动物细胞、微生物细胞，马铃薯的叶肉细胞可作为受体细胞。 答案：D
收稿日期:2006-09-28转基因植物的检测与鉴定 宫雪超,于丽杰,高金秋 (哈尔滨师范大学环境与生命科学院,黑龙江哈尔滨150025) 摘要:对植物转基因过程中报告基因的种类和应用范围、转基因植物的检测和鉴定方法、转基因植物检测和鉴定方法的评价进行了综述. 关键词:转基因植物;检测;鉴定;评价 [中图分类法]Q943[文献标识码]A[文章编号]1003-6180(2007)01-0015-03 植物转基因实验因受体系统的限制,外源基因的转化频率较低,为了达到转化目的,必然要获得大量的转化材料,如何在数以千万计的转化植株或细胞中,快速、有效地检测出转基因阳性植株或细胞,外源基因是否整合到植物染色体上,整合的方式如何,整合到染色体上的外源基因是否正确表达等问题,就成为重要的研究课题.根据外源基因表达的不同水平,对外源基因的检测和鉴定可以分为三个水平进行:整合水平、转录水平和翻译水平.本文从外源基因表达的不同水平,阐述转基因植物的检测与鉴定. 1外源基因整合水平的鉴定 检测外源基因是否转化成功,首先是对报告基因进行检测,必要时再进行目的基因的检测,检测目的基因需要采用分子杂交方法. 1.1报告基因 报告基因必须具有两大特点:一是表达产物和产物的类似功能在未转化的植物细胞内并不存在;二是便于检测.目前植物基因工程中使用的报告基因一般是编码酶的基因.大致分为两类:抗性基因和编码催化人工底物产生颜色变化的酶基因.现在常用的报告基因主要有:gus基因、cat基因、冠瘿碱合成酶基因、np tò基因、gf p基因、bar 基因[1]、荧光素酶基因、二氢叶酸还原酶基因等.近年来,绿色荧光蛋白基因作为一种新型的报告基因在植物基因转化及基因表达调控中得到应用,并显示出较其他几个报告基因更大的优越性. gf p基因的检测gf p基因具有以下优点:1适用于各种生物的基因转化;o检测方法简便,无需底物、酶、辅因子等物质,只要有紫外光或蓝光照射,其表达产物就可以发出绿色荧光,这对转化细胞的检测极为有利;?便于活体检测,十分有利于活体内基因表达调控的研究;?检测时可获得直观信息,有利于转基因植物安全性问题的研究及防范.若此报告基因通过自然杂交扩散到其他栽培植物或杂草中时,很容易通过光照获得直观信息. gus基因的检测g us基因也是广泛用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因,尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化试验中,gus基因应用的最多.gus基因3-端与其他结构形成的融合基因能正常表达,所产生的融合蛋白仍具有gus活性,这为研究外源基因表达的具体细胞部位及组织部位提供了条件,这是它的一大优点.但是需要注意的是,有一些植物在胚胎状态时能产生内源gus活性,Sory u[2]在转基因R0和R1代的子叶、花粉和胚珠中检测到g us活性,随着组织的成熟衰老,g us表达逐渐停止.在实验过程中要设定严格的阴性对照.g us活性的检测方法有很多,包括组织化学法、色谱法、荧光法等,其中植物切片gus 组织化学定位分析是分辨组织中不同细胞个体和不同的细胞类型基因表达差异的一种有效方法. 1.2转基因植株的PCR检测 PCR(聚合酶链式反应poly merase chain re-actio n)是首选的转基因产品检测方法.PCR技术能够有效地扩增低拷贝的靶片段DNA,可以检测到每克样品含有20pg~10ng的转化基因成分,对转基因产品大分子量DNA检测的灵敏度可以达到样品含量的0.0001%[3].因为PCR的高度特异性及检测所需的模板量仅为10ng以内,所以为外源基因整合的检测提供了便利条件,尤其是在转化材料少又需及早检测的时候.现在已经利用该技术对欧美杨[4]、番茄[5]、辣椒、葡萄、豆瓣菜、小麦[6]等转基因植物进行鉴定,是转基因植物鉴定中最简单、最常用的方法[7].PCR检测具有DNA用量少,操作简单,成本低,耗时少,不需要同位素等优点,但PCR检测也存在缺点,由于PCR扩增十分灵敏,有时会出现假阳性扩增,因此检测只能作为初步结果. 1.3Southern杂交 证明外源基因在植物染色体上整合情况的最可靠方法是DNA So uther n杂交,只有经过分子杂交鉴定为阳性的植株才可以称为转基因植物. # 15 #
80年代初,美国最早对转基因生物进行研究。首例转基因生物 (Genetically Modified Organism, GMO 于 1983年问世, 转基因作物 (1986批准进行田间试验,延熟保鲜番茄(1993(Calgene 公司生产在美国批准上市,开创了转基因植物商业应用的先例。 6年来,其发展更为迅速, 超出人们预料。 1998年全球转基因作物和种植面积达 2780万公顷, 1999年增至 3990万公顷,增长 44%。 1995-1998年全球转基因作物的销售额由 0.75亿美元猛增至 12-15亿美元。 4年间增加了 20倍。迄今,美国已批准 50种转基因植物产品商业化, 1/4的耕地种植的是转基因作物,其中转基因抗除草剂大豆占美国大豆总面积的 55%, 转基因玉米占总面积的 30%。美国市场上已有近 4000种食品来自转基因化生物。据国际有关方面的预测, 到2010年, 全世界的转基因食物的种植面积将增至 6000万公顷,市场总收入将达到 3万亿美元,其种子收入将达到 1200亿美元。因而可以毫不夸张地说, 转基因食品的新时代已经到来。随着 GMO 的发展, 近来在全球范围内引起一场转基因生物、食品安全性的争论。支持和反对两派争锋相对,势不两立。为此,有关转基因生物安全成为历次缔约国大会、国际和区域性组织、民间团体等讨论的重要议题之一。本文就有关转基因生物和食品存在的安全性问题、检测和评价研究综述如下。 一、转基因食品的安全性 GMO系一种或几种植物或动物乃至人类的基因植入某一种生物, 从而表现出本身自然不能拥有的由转入基因带来的新特性,达到改善其产品的品质、提高营养成份、增加其抗病、虫、害、增加产量、抗逆转、延长货架期等。转基因食品(Gene Food系以转基因生物为原料,加工为人类所食用的产品。转基因食品是一项新技术。 1,转基因技术本身的主要不足 (1,不精确的技术:基因技术将一异源基因从一生物转入另一生物,虽然其 DNA 可以精确地切割, 但不能将新基因准确地植入另一生物中, 从而影响这一生物其它基因的基本功能。科学家无法预见植物基因化后产生新的, 未知的蛋白质, 也不能完全准确的预见对受体影响的结果表现为不成熟性。
转基因食品快速检测试纸的检测原理 一、转基因食品快速检测试纸简介概述： 托普云农转基因食品快速检测试纸用于快速检测种子或植物叶片等样品中的转基BtCry1Ab/1Ac，灵敏度为1%，整个检测过程只需要10-15分钟，适用于各类企业及检测机构。 大多数转基因植物有可能在耕种、收割、运输、储存与加工过程同时混入食品，不管是要对转基因食品贴示标签，亦或是对转基因与非转基因原料分别进行输送，转基因食品的原料和食品检测都是必不可少的；还有，要区别开来转基因和非转基因食品，对转基因食品进行进行标识，而食品中转基因含量的多少加以限制，更加需要有效准确的基因检测设备与良好的检测技术。 跟随着每个国家转基因标识制度纷纷相继建立和老百姓对转基因产品高度关注度的提高，老百姓对转基因技术的认知度与准确性相继提出了更加严格性的要求，而因此各个转基因检测技术与转基因检测设备更成为了大家研究的热点和探讨的话题，最近十几年来国外的科学研究一直处于前沿，为了促进我国转基因作物相关科技技术研发、推广发展，托普云农也致力于让老百姓对转基因检测技术的现状以及未来发展趋势有较为清晰和全面的认知了解！ 托普云农专业检测团队采用PCR技术，从分子水平检测农产品、加工原料、成品中的转基因成分，为食品生产加工和流通企业、检测机构、研究院所提供全面快速、简便经济的专业基因检测服务。为您食品的安全保驾护航！ 二、转基因食品快速检测试纸仅需30秒转基因现真身 在实验室里，托普云农工作人员演示转基因快速检测的过程。桌上的两个纸袋中，分别装有转基因和非转基因稻谷。工作人员各取数粒研磨成粉，分别装入两只试管，滴入缓冲液静置，待固体物质沉底后，取出2张转基因检测试纸分别蘸取上面的清液。30秒后，试纸呈现出不同的标记。 其中1张上、下两条检测线均呈现紫红色，为转基因样本，另外一张仅下检测线呈现紫红色，为非转基因。“试纸样式、检测原理、使用方法与早孕试纸类似。”试纸应用双抗体夹心免疫层析原理，如果样本中存在转基因抗原，与试纸上的转基因抗体结合就会使上、下检测线同时显色。 三、转基因食品快速检测试纸快速检测意义不凡 农业部印发《2015年农业转基因生物安全监管工作方案》，其中提到对水稻、玉米等进行重点监管，建议利用试纸条等快速检测方法，降低成本，扩大监测范
生命科学前沿讲座论文 转基因食品的检测方法 姓名：陈继款 系别：生命科学学院 专业：生物信息学 年级：2008级 学号：080567011 指导老师：薛李春 总成绩： 2010年07月02日
转基因食品的检测方法 自1983年世界第一例转基因作物问世以来，目前全球转基因农作物种植面积已达到5 000万hm2以上，大量的转基因农产品被直接或间接的制成人类的食品，呈迅猛发展的趋势。但是转基因作物作为一种新物种，其对人体健康、生态平衡是否具有危害还未确定。许多国家以立法或其他形式要求对转基因产品进行标记。我国于2001年5月23日颁布《农业转基因生物安全管理条例》，2002年3月20日开始实行的《农业转基因生物标识管理办法》规定，国家对农业转基因生物实行检验检疫和标识制度。世界各国均对转基因食品及其加工产品出具是否为转基因产品的认定报告。因此转基因产品的检测就显得尤为重要。转基因食品的检测主要从两个方面人手，一是核酸水平，即检测遗传物质中是否含有插入的外源基因；二是蛋白质水平，即通过插入外源基因表达的蛋白质产物或其功能进行检测，或者是检测插入外源基因对载体基因表达的影响，主要检测外源基因对插入位点附近基因影响及对其代谢产物的影响，由于该类型检测成本高，所需时间长，且被认为重要性较低，目前该类检测实际工作中较少涉及。本文分别对核酸和蛋白质两种水平上的检测方法进行综述。 1核酸水平 主要检测报告基因、启动子和终止子，是当前转基因产品检测的重要手段。椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子、胭脂碱合酶NOS终止子等10多种基因和基因片段广泛存在于转基因植物中，这就为检测转基因食品提供了便利。核酸水平的检测可以分为定性和定量两种。 1．1定性检测 1．1．1聚合酶链式反应(PCR) 1996年德国伯恩斯坦大学的Meyer Rolf等论证了PCR检测转基因食品的可能性。利用该方法在鉴定转基因抗除草剂大豆RoundUp ReadyTM Soybean(RRS)和转基因抗虫玉米系列标准品Btl76 Maxi maizer的实验中，可以检测到仅为0．5％转基因成分。Matsuoka等通过对7种转基因玉米转入的外源基因的序列分析，设计了14对检测该7种转基因玉米启动子、终止子和结构基因的引物，分别对转基因玉米、非转基因玉米、转基因大豆、非转基因大豆进行了PCR扩增检测，同时为检测所设计引物的特异性，还对其他作物如水稻、大麦、小麦等进行了PCR扩增，检验结果表明该方法能够快速有效地检测转基因玉米品种。每一次实验均需要设有阴性及阳性对照以确保实验结果可靠性。在样品采集及处理过程中也需要注意防止污染。 1．1．2多重PCR 多重PCR是常规PCR方法的改进，它是在同一个反应中同时扩增两个或多个目标基因序列。这种方法具有更大的可靠性和适应性，并且能降低检测成本。多重PCR可以同时针对几个靶位点进行PCR技术检测。V．T．Forte等利用其设计的多重PCR方法对转基因大豆和Bt玉米样品进行实际检测，结果表明该方法能够准确的检测食品中是否含有转基因成分，其检测结果可以精确到2％～0．1％的范围。Permingeat等仅用两
食品中转基因成分检测 第4章 DNA提取和纯化 M.Somma
目录 第４章 DNA提取和纯化 引言 3 提取方法 4 纯化方法 4 CTAB提取和纯化方法 6 分光光度计测定DNA含量9 分光光度计测定DNA的原理9 核酸浓度测定10 实验12 参考文献16
引言 在所有重组DNA技术和大多数分子生物学研究中，核酸的提取和纯化是实验的第一步。核酸提取方法研究的目的，是为了从不同来源的材料中获得高纯度的核酸，以便于利用聚合酶链式反应 (Polymerase Chian Reaction, PCR) 进行转基因品系的特异性分析。核酸的质量和纯度是PCR分析的关键因素之一。获取高纯度的核酸，避免抑制污染物，需要选择合适的DNA提取方法。表1列出了在PCR检测中可能抑制反应效率的污染物。为了防止由于样品中PCR抑制物的存在导致出现假阴性结果，强烈推荐设置一个对照实验以测试PCR抑制作用。基于此目的，一般采用植物特异性(真核或叶绿体) 或种属特异性的PCR检测。 表1. PCR反应过程中的一些抑制物 抑制物抑制浓度 SDS > 0.005% 苯酚> 0.2% 乙醇> 1% 异丙醇> 1% 乙酸钠> 5 mM 氯化钠> 25 mM EDTA > 0.5 mM 血色素> 1 mg/ml 肝磷脂> 0.15 i.m/ml 尿素> 20 mM 反应混合物> 15% 目前有许多种核酸提取和纯化技术，一般基于以下准则来选择最适宜的提取纯化技术：z目标核酸 z来源生物 z起始材料(组织、叶片、种子、加工过的材料等) z对结果的要求(产量、纯度、纯化所需时间等等) z下游应用 (PCR、克隆、标记、印迹、RT-PCR、cDNA合成等等)
转基因食品法律法规
国务院颁布的《农业转基因生物安全管理条例》及其三个配套的管理办法，即《农业转基因生物安全评价管理办法》、《农业转基因生物进口安全管理办法》和《农业转基因生物标识管理办法》。这些法规已明确规定，发放安全证书需要进行环境安全与食用安全检测，并对含有转基因成分的产品进行强制性标识。《农业转基因生物标识管理办法》规定:列入农业转基因生物标识目录的农业转基因生物，必须进行标识。该办法第六条规定了标识的标注方法：转基因动植物（含种子、种畜禽、水产苗种）和微生物，转基因动植物、微生物产品，含有转基因动植物、微生物或者其产品成份的种子、种畜禽、水产苗种、农药、兽药、肥料和添加剂等产品，直接标注转基因某某0；转基因农产品的直接加工品，标注为转基因某某，加工品（制成品）或者加工原料为转基因某某0；用农业转基因生物或用含有农业转基因生物成份的产品加工制成的产品，但最终销售产品中已不再含有或检测不出转基因成份的产品，标注为本产品为转基因某某加工制成，但本产品中已不再含有转基因成份或者标注本产品加工原料中有转基因某某，但本产品中已不再含有转基因成份。 （二）我国转基因食品安全法律规制的缺陷
纵观我国食品安全的现状，从2008年的“毒奶粉”事件，到今年的“地沟油”事件和“龙虾门”事件，食品安全问题始终十分突出。下面对我国食品安全法律规制的缺陷进行分析： 1、现有立法层次不高。国际上以美国、日本等为代表的很多国家都是针对转基因食品安全进行专门立法，而我国对于转基因生物技术颁布的多是行政法规和部门规章。这些法规大多从本部门的职责角度出发，对转基因技术及其产品进行管理，具有临时性和应急性，难以从整个生物安全角度出发，对转基因生物技术及其产品安全的监督管理作出全面系统规定。 制定专门的转基因食品安全法 我国的转基因食品安全立法与国外（如美国、欧盟、日本）的差距主要表现在我国缺乏转基因食品安全的专门立法。虽然有关转基因食品安全的有关规定可散见于《农业转基因生物安全管理条例》等，但适用于转基因食品安全的一些特殊规定，如转基因食品的检测标准，就与转基因生物安全有所不同。而且这种分散的部门法规在执行中也存在很大的阻力。笔者建议由我国立法机关制定专门的转基因食品安全法，将现行的《转基因食品卫生管理办法》从转基因食品安全角度进行修改和完善，成为对转基因食品安全的有关问题，作出专门规定的转基因食品安全法。在制定专门的转基因食品安全法时要注意借鉴国外的立法模式，建立完善的转基因食品安全评价、监控及标识制度，以有效保证转基因食品的安全。
转基因材料的检测 —转病毒复制酶基因“华农1号”番木瓜的PCR检测 摘要：本实验采用定性的一次PCR反应分析方法，根据提供的转基因植物材料中转入基因，启动子，终止子和基因本身的DNA序列，设计出四对特异的PCR扩增引物35S-F与35S-R、NPT1-F与NPT1-R、HN1F与HN1R、HN2F与HN2R，两对非特异性的PCR扩增引物Nos2-F与Nos2-R 、HN3F与HN3R，然后以华农1号转基因木瓜、野生型木瓜、待测样品的DNA为模板，为模板进行PCR扩增，电泳结果显示野生型木瓜都没有扩增出条带，转基因木瓜都扩增出条带，待测样品除了NPT1-F与NPT1-R没有扩增出条带，其他都有，可以确定待测样品为转基因产品。关键词：转基因；PCR定性检测；转病毒复制酶基因；华农1号 转基因作物从1996年在全球开始进入商品化生产，经过12年的发展,其种植的面积从当年的170万hm2扩大到2007年的1.14亿hm2 [1]，为保护消费者的知情权和选择权，多个国家和地区强制要求对含有一定阈值以上转基因成分的产品进行标识，如欧盟规定转基因成分含量标识的阈值是0.9%[2]，韩国为3.0%[3], 日本是5%[4]等，而美国和加拿大则采用了推荐而非强制的标识制度。我国也从2002年3月开始,要求对大豆、玉米、棉花、番茄、油菜等5种作物的17种产品进行标识[5]，为了适应对转基因产品的标识要求，已经建立了一系列的检测方法，
以基于其中外源DNA检测的聚合酶链式反应PCR应用最广泛[6]。 转基因材料的检测主要是针对选择性标记和报告基因、转入基因、启动子和终止子等方面的检测，是当前转基因产品检测的重要手段。如椰菜花叶病毒(CaMV)35s启动子、胭脂碱合酶NOS终止子等10多种基因和基因片段广泛存在于转基因植物中，这就为检测转基因材料/食品提供了便利。核酸水平的检测可以分为定性和定量两种。 早在20世纪初科学家就发现了病毒具有交互保护作用，近年来，科研工作者也利用这一原理开展了大量的转病毒部分基因组的转基因工作，使得植物病毒病的防治有了新的发展。抗病毒基因多数来自于病毒本身的基因，病毒的外壳蛋白基因、复制酶基因、运动蛋白基因等，并已经在番木瓜上获得成功转化[7]。 本实验根据提供的转基因植物材料中转入基因，启动子，终止子和基因本身的DNA序列，设计出几个适用于检测转基因材料的引物对，然后以野生型番木瓜和转基因番木瓜“华农1号”以及待测样品DNA为模板进行PCR扩增，鉴别待测样品是否为转基因材料。 1 材料与方法 1.1 材料 华农1号 野生型木瓜 待检测样品 1.2 方法 1.2.1 DNA提取 1.2.1.1 称取0.5 g的植物叶片，搁置于研钵中，加入液氮，捣碎叶片。
两种常见的转基因食品检测技术 由于转基因物质有可能在耕种、收割、运输、储存和加工过程中混入食品，对食品造成偶然污染。因此，不论是对转基因食品贴示标签，或是对转基因与非转基因原料进行分别输送，转基因原料和食品的检测都是必不可少的；另外，要区分转基因与非转基因食品，对转基因食品进行选择性标记，对食品中的转基因含量的多少加以限制，也需要准确有效的基因检测技术。从发展来看转基因食品的检测技术根据检测的直接对象可分为三类：(1)利用导入外源基因所表达的特殊性状直接鉴定；(2)针对导入外源基因表达的蛋白质的鉴定方法；(3)以导入外源基因的特定DNA序列为检测对象的检测技术。其中目前用的比较多的是PCR技术、ELISA技术（酶联免疫法）和生物芯片技术三种。 3.1免疫学检测法 是从蛋白质水平对转基因食品进行检测(即对外源蛋白质的测定可将其分为Western杂交、酶联免疫法(ELISA)、试纸条法和快速检测试剂盒法。免疫学检测法，其基本原理是通过抗原(antigen)抗体之间的特异反应来实现的。抗原抗体反应是一种非共价键特异性吸附反应，即通常情况下，抗原只和它自己（或者具有相同抗原决定族的抗原）诱导产生的抗体发生反应。 3.1.1杂交 Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异蛋白检测方泫，它具有很高的灵敏性，可以从植物细胞总蛋白中检测出50ng的特异蛋白。Western杂交检测的关键是抗体的制备。 3.1.2酶联免疫吸附法 ELISA(EnzymeLinkedImmuneabsorbentAssay)，此法则通过酶反应将抗原抗体反应信号放大，从而提高了检测灵敏度，而且还能产生有颜色的底物，通过仪器或肉眼识别，此法一般在酶联板上或膜上进行，检测一次需要4小时左右。 3.1.3试纸条法试纸条法(LateralFlowStrip)，此法主要将特异的抗体交联到试纸条上和有颜色的物质上，当纸上抗体和特异抗原结合后，再和带有颜色的特异抗体进行反应，就形成了带有颜色的三明治机构，并且固定在试纸条上，如果没有抗原，则没有颜色。 3.1.4快速检测试剂盒法 此法具有操作简易%使用方便的特点，但是试剂盒本身价格较昂贵，在称取样量上用量较少，代表性不能保证，这将影响到检测结果的正确性。目前见得多的产品主要是国外的，如DneasyPlantMiniKit(QIAGEN)等试剂盒）． 3.2PCR检测法 PCR检测法是目前转基因存在的检测方法中最为成熟的，它具有灵敏度较高／特异性强厂可准确定量等优点，PCR技术即“．聚合酶链反应技术”，是指模拟体内DNA复制方式在体外选择性扩增DNA某个特殊区域的技术，它能在短时间内准确地将目的顺序大量复制，PCR的基本要素包括模板、引物、合成DNA 的原料即DNTP和DNA聚合酶．PCR即可做定性又可做定量分析。目前大多以定性检测为主，定性检测的检出范围为0.1%，但该项技术的检测结果也有可能与实际不相符合，会出现假阴性或假阳性结果（即检测物质本身含有转基因特制而未被检出，或是本身没有转基因物质，而检出有转基因成分）。 3.2.1定性PCR技术 转基因食品重组DNA的基本结构包括启动动子、目的基因、终止子和标记基因，到目前为止，全世界已有30多种源基因食品得到相关国家的安全评价，在现有的商品化源基因食品中绝大多数含转录启动子CaMV35、转录终止子NOS及抗生素抗性基因NPTII。这就为人们建立相应的PCR筛选检测方法提供了便利[22]迄今为止，利用定性PCR检测技术可检测如大豆、玉米、番茄、油菜等多种转基因作物. 3.2.2定量PCR技术
《医用基因工程》复习思考题 第一章基因和基因组及基因工程的概念 一、名词概念 ①移动基因(插入序列；转位子)；②断裂基因；③RNA剪辑； ④内含子(间隔序列)与表达子；⑤重叠基因；⑥重复序列；⑦假基因；⑧启动子与终止子；⑨起始位点、终止位点。 二、讨论题 1.什么叫基因?何谓基因的新概念?基因的主要功能是什么? 2.一种基因一种酶的提法妥否？ 3.基因密码子三联体间是否存在着逗号？ 4.基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？ 5.何谓转位子和转位作用?转位的后果如何? 6.基因中最小的突变单位和重组单位是什么？ 7.基因工程应包括哪些内容？何谓基因工程的四大里程碑和三大技术发明? 8.真核细胞基因组中常有内含子存在，能否在原核细胞获得表达？能，为什么？不能，为什么？ 第二章基因工程中常用的工具酶 1.什么是限制性核酸内切酶？ 2.什么是R/M现象？如何解释？ 3.II型核酸内切酶的基本特点有哪些？ 4.影响II型核酸内切酶活性的因素有哪些？如何克服和避免这
些不利因素？ 5.DNA连接酶有哪两类？有何不同？ 6.甲基化酶有哪两类？有何应用价值？ 7.什么叫同尾酶、同裂酶？在基因工程中有何应用价值？ 8.平末端连接的方法有哪些？(图示) 9.Klenow酶的特性和用途有哪些？举例说明。 10.反转录酶的特性有哪些？有何应用价值？ 11.列举碱性磷酸酶BAP/CAP的应用之一。 12.列举末端核苷酸序列转移酶的应用之一。 13.质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？ 14.基因片段与载体的平末端连接的方法有哪些？ 15.用寡核苷酸和衔接物DNA的短片段连接时为使基因内部的切点保护，常用何种办法解决？ 第三章基因克隆载体 1.基因工程常用的载体有哪5种？其共同特性如何？ 2.什么是质粒？质粒分哪几种？有哪两种复制类型，质粒的分子生物学特性有哪些？ 3.质粒存在的三种形式是什么？ 4.分离质粒的基本步骤有哪些？ 5.分离纯化质粒的方法有哪几种？简述CsCl密度梯度(浮密度)分离法、碱变性法的原理，如何选择合适的分离方法？ 6.作为理想质粒载体的基本条件有哪些？ 7.什么叫插入失活，举例说明之。 8.构建pBR322质粒载体的亲本质粒有哪些？ 9.什么叫插入型和替换型噬菌体载体?插入型和替换型入噬菌体
中国市场上的转基因食品及鉴别方法 国内市场上的转基因食品清单 一、我国转基因作物有哪些? 1、已批准安全证书的有棉花、水稻、玉米和番木瓜， 只有棉花、番木瓜批准商业化种植 “截至目前，我国批准了转基因生产应用安全证书并在有效期内的作物有棉花、水稻、玉米和番木瓜。”中国农科院植保所副研究员谢家建介绍说。 “目前，转基因水稻和转基因玉米尚未完成种子法规定的审批，没有商业化种植。”谢家建表示，“我国已经进行商业 化种植的转基因作物只有棉花和番木瓜。” 我国批准进口用作加工原料的转基因作物有大豆、玉米、油菜、棉花和甜菜。这些食品必须获得我国的安全证书。 2、目前市售圣女果、彩椒、小南瓜、小黄瓜都不是转 基因食品 网上流传一份转基因食品名单，包括“圣女果、大个儿彩椒、小南瓜、小黄瓜”。对此专家并不认同。 中国农科院生物所研究员王志兴说，小番茄也叫圣女果、樱桃番茄，是自古就有的番茄品种，只是因为个头小、采摘不便、产量低，最早仅作为观赏用，后来发现食用方便，口味经过改良后逐渐流行。个头小是天生的基因差异，不是转
基因的结果。 中国农科院油料所副研究员吴刚说，小南瓜和小黄瓜也不是转基因食品，仅仅是未充分成熟的南瓜和黄瓜。如果继续在田间种植，小南瓜和小黄瓜最终会生长成普通的大南瓜和老黄瓜。 关于大个儿彩椒，吴刚表示，大个儿彩椒含有不同类型的花青素，表现为更丰富的颜色。花青素的变异在植物中很常见，像鲜花同一个品种就有不同颜色，萝卜也有红萝卜、绿萝卜、白萝卜等。“我国曾经批准过抗病毒甜椒的商业化种植，但与常规甜椒相比，转基因甜椒并没有明显优势，因此被市场自然淘汰。” 3、我国市场转基因食品主要是大豆油和木瓜 中国农业大学食品工程与营养科学院院长罗云波介绍，目前中国市场上的转基因食品主要有两种，一种是转基因食用油，就是我们所说的大豆色拉油，来源主要是从美洲，尤其是从美国、阿根廷、巴西等国家进口的大豆所生产出来的食用油。 还有一种就是转基因木瓜，因为木瓜容易得一种农药很难治的病，用基因的技术能够控制，转基因木瓜也是我们能够吃到的转基因食品。除此之外，我国很少能够见得转基因种类的食品。 4、吃了转基因大豆豆粕饲料长大的牛羊，其肉制品不
12江苏农业科学2017年第45卷第5期 —12— 阮先乐，张杰?转基因成分的检测方法综述[J]?江苏农业科学，2017,45(5):12-15. doi：10. 15889/j. issn. 1002 - 1302. 2017. 05. 003 转基因成分的检测方法综述 阮先乐，张杰 (周口师范学院生命科学与农学学院，河南周口466〇01) 摘要:随着转基因生物在全世界的广泛应用，转基因成分检测技术越来越受到广大消费者、各国政府及相关机构 人员的重视。本文从聚合酶链式反应（PCR)检测技术、环介导等温扩增检测技术、近红外光谱检测技术、生物传感器 检测技术、生物芯片检测技术和蛋白质检测技术等方面进行综述，并提出今后转基因成分检测技术的发展趋势和研究 方向。 关键词:转基因;成分;检测方法 中图分类号：Q785 文献标志码：A文章编号：1002 -1302(2017)05 -0012 -03 转基因成分检测技术是进行转基因生物研究和安全管理 的重要技术保障。研究人员可以利用此技术辅助判断是否成 功地把目的基因转人受体细胞，目的基因是否在受体细胞中 成功地表达及转基因生物对环境、食用安全性的影响，从而建 立一套高效的技术研究体系;另一方面，转基因生物安全管理 部门也有必要建立一套转基因成分检测技术标准，使各项工 作得以顺利实施。2002年欧盟要求对转基因产品从生产、运 输、保存、销售等过程进行全程的跟踪和检测[1]。现在已有 65个国家和地区对转基因产品采取强制性的标志管理制度，但也有一些国家和地区采取自愿标志模式[2]。2014年5月27日，我国农业部发布《农业部关于进一步加强农业转基因 生物安全监管工作的通知》，要求各级农业部门，要以水稻、玉米、大豆和油菜种子为重点，依法严厉查处非法生产、加工、销售转基因种子的行为。2015年10月1日起施行的《中华 人民共和国食品安全法》第六十九条明确要求生产经营转基 因食品应当按照规定显著标志。 1转基因成分检测技术 1.1 PCR检测技术 PCR检测技术是一种灵敏度高、技术较成熟的转基因成 分检测方法。根据特异性的不同可把它分为筛查法、目的基 因特异性、构造特异性和事件特异性4种方法[3]。检测的主 要基因包括调控基因、标记基因和目的基因，其中调控基因包 括启动子和终止子。常用的启动子是花椰菜花叶病毒CaMV 33S,终止子是脂肪碱合成酶NOS,标记基因有抗草丁 膦基因）(抗卡那霉素基因）、他