第二章细胞基本功能
[目的要求]
1、了解细胞膜的分子结构，掌握细胞膜的物质转运的形式和影响因素
2、掌握静息电位和动作电位的概念、特点和形成的离子机制，并了解静息电位和动作电位形成的理论的主要证据
3、掌握局部兴奋特点和产生机制，掌握动作电位的引起和兴奋在同一细胞
上的传导机制及特点
4、了解神经-骨骼肌接头的结构特点、掌握神经-骨骼肌接头兴奋传递过程，熟悉影响神经-骨骼肌接头兴奋传递的主要因素及其临床意义
5、掌握肌肉收缩原理和前负荷、后负荷、肌肉收缩能力的概念，熟悉前负荷、后负荷、肌肉收缩能力对肌肉收缩的影响
[讲授重点]
1．细胞膜的物质转运的形式和影响因素
2. 静息电位和动作电位的概念和形成的离子机制
3. 局部兴奋、动作电位的引起和兴奋在同一细胞上的传导机制
4. 神经-骨骼肌接头处的兴奋传递及影响因素
5. 肌肉收缩原理和前负荷、后负荷、肌肉收缩能力对肌肉收缩的影响
[讲授难点]
1. 继发性主动转运
2. 静息电位和动作电位形成的离子机制
3. 前负荷、后负荷对肌肉收缩的影响
[学时] 10h [教材] 姚泰主编，《生理学》（第6版），人们卫生出版社，2004
第一节细胞膜的结构和物质转运功能
一、细胞膜的结构概述
细胞膜（plasma membrane）把C（cell）内容与外界分开，也允许某些物质通透——半透膜。
细胞膜的功能：
１、保护：屏障作用。
２、转运：载体、通道、离子泵。
３、识别：膜外侧的糖链。
４、信息传递：受体——化学信息。
通道——生物电信息。
一、膜的化学组成和分子结构
＊组成：电镜下三层：内外侧致密带、中间透明带各2.5nm。由脂质、蛋白质、少量糖组成。
＊结构：1972年singer提出“流体镶嵌模型”（fluid mosaic model）学说，即：C膜以液态的脂质双分子层为基架，其中镶嵌着不同生理功能的α—螺旋或球形蛋白质。
（一）脂质双分子层
亲水的磷酸和碱基朝向C内外。
磷脂>70% 疏水的烃基，朝向膜中间。
脂质
胆固醇<30%
（二）细胞膜蛋白质
１、结合（嵌入）蛋白质（integrated protein）：贯穿脂质双分子层，亲水肽段于膜两侧。２、表面（周围）蛋白质（peripheral protein）：肽段附着于双分子层的内或外表面。３、膜蛋白质的作用：
（1）构成C膜的载体、通道或离子泵，与物质转运有关。
（2）构成C膜的受体，与激素结合后把信息传入C内。
（3）酶：起催化作用。
4、肌纤蛋白（actin）：具收缩作用，在C的吞噬、吞饮、变形运动中发挥作用。
（三）细胞膜的糖类
*量少、有寡糖、多糖，与膜脂质及蛋白质结合，作为C“标记”膜受体的“识别”部分，
与激素结合。抗原部分，表示免疫信息。
二、物质的跨膜转运
各种物质进出细胞必须经过细胞膜。由于细胞膜的基架是脂质双分子层，脂溶性的物质可以通过细胞膜，而水溶性物质则不能直接通过细胞膜，它们必须借助细胞膜上某些物质的帮助才能通过，其中细胞膜结构中具有特殊功能的蛋白质起着关键性的作用。
常见的跨膜物质转运形式如下:
（一）单纯扩散
单纯扩散（simple diffusion）是指脂溶性物质通过细胞膜由高浓度侧向低浓度侧扩散的过程。
人体体液中的脂溶性物质（如氧气、二氧化碳、一氧化氮和甾体类激素等）可以单纯依靠浓度差进行跨细胞膜转运。
跨膜转运物质的多少以通量表示，其大小取决于两方面的因素：
①细胞膜两侧该物质的浓度差，这是物质扩散的动力，浓度差愈大，扩散通量也愈
大；
②该物质通过细胞膜的难易程度，即通透性（permeability）的大小，细胞膜对该
物质的通透性减小时，扩散通量也减小。
水分子虽然是极性分子，但它的分子极小，又不带电荷，故膜对它是高度通透的。另外，水分子还可通过水通道跨膜转运。
（二）膜蛋白介导的跨膜转运
带电离子和分子量稍大的水溶性分子，其跨膜转运需要由膜蛋白的介导才能完成。根据转运方式不同，介导物质转运的膜蛋白可分为载体、通道、离子泵和转运体等。由它们介导的跨膜转运根据是否消耗能量又可分为被动转运(passive transport)和主动转运(active transport)两大类。
1．易化扩散水溶性小分子或离子（Na＋、K＋、Ca2＋等）在特殊膜蛋白的帮助下，
由细胞膜的高浓度一侧向低浓度一侧扩散的过程，称为易化扩散(facilitated diffusion)。
（1）经载体易化扩散载体是一些贯穿脂质双层的整合蛋白，它与溶质的结合位点随构象的改变而交替暴露于膜的两侧。当它在溶质浓度高的一侧与溶质结合后，即引起膜蛋白质的构象变化，把物质转运到浓度低的另一侧，然后与物质分离。在转运中载体蛋白质并不消耗，可以反复使用。
许多重要的营养物质如葡萄糖、氨基酸、核苷酸等都是以经载体易化扩散方式进行转运的。
经载体易化扩散具有以下特性：
①结构特异性。即某种载体只选择性地与某种物质分子作特异性结合。以葡萄糖为例，右旋葡萄糖的跨膜通量超过左旋葡萄糖，木糖不能被运载。
②饱和现象。即被转运物质在细胞膜两侧的浓度差超过一定限度时，扩散通量保持恒定。其原因是由于载体蛋白质分子的数目和/或与物质结合的位点的数目固定，出现饱和。
③竞争性抑制。如果一个载体可以同时运载A和B两种物质，而且物质通过细胞膜的总量又是一定的，那么当A物质扩散量增多时，B物质的扩散量必然会减少，这是因为量多的A物质占据了更多的载体的缘故。
（2）经通道易化扩散溶液中的Na＋、K＋、Ca２＋、Cl-等带电离子，借助于镶嵌于膜上的通道蛋白质的介导，顺浓度梯度或电位梯度的跨膜扩散，称为经通道易化扩散。中介这一过程的膜蛋白称为离子通道(ion channel)。
离子通道的特征主要是：
①离子选择性。即离子通道的活动表现出明显的对离子的选择性，每一种离子通道都
对一种或几种离子有较大的通透性，而其它离子则不易或不能通过。
②门控特性。通道内具有“闸门”(gate)样的结构控制离子通道的开放（激活）或关
闭（失活），这一过程称为门控(gating)。根据通道的门控机制，离子通道又可分为电压门控通道(voltage-gated ion channel)、化学门控通道 (chemically-gated ion channel)和机械门控通道(mechanically-gated ion channel)。
需要指出的是，以单纯扩散和易化扩散的方式转运物质时，物质分子移动的动力是膜两侧存在的浓度差（或电位差）所含的势能，它不需要细胞另外提供能量，因而这两类转运又称为被动转运（passive transport）。
2．主动转运主动转运（active transport）指细胞通过本身的耗能过程，将物质分子或离子由膜的低浓度一侧移向高浓度一侧的过程。主动转运按其利用能量形式的不同，可分原发性主动转运（由ATP直接供能）和继发性主动转运（由ATP间接供能）。
（1）原发性主动转运原发性主动转运(primary active transport)是指细胞直接利用代谢产生的能量，将物质分子或离子逆浓度梯度或电位梯度跨膜转运的过程。介导这一过程的膜蛋白称为离子泵(ion pump)。离子泵可将细胞内的ATP水解为ADP，并利用高能磷酸键贮存的能量完成离子的跨膜转运。由于离子泵具有水解ATP的能力，所以也把它称作ATP 酶(ATPase)。
在哺乳动物的细胞膜上普遍存在的离子泵就是钠-钾泵(sodium-potassium pump),简称钠泵(sodium pump)，也称Na＋-K＋-ATP酶(Na＋-K＋-ATPase)。
●钠泵（sodium-potassium pump）：糖蛋白，分子量25万，属C膜上的结合蛋白。
α亚单位：转运Na+、K+，分解ATP。
β亚单位：功能不详。
其活性因C 内Na+↑、C外K+↑而激活。
因C内Na+↓、C外K+↓而失活。
* 其每分解一个ATP可泵出3个Na+，同时泵入2个K+，使膜内维持负电位，膜外维持正电位——生电性钠泵。（图）●神经C和肌C正常时：
K+浓度膜内>外30～５０倍。
Na+浓度膜内<外12倍。
这种不均衡的离子分布靠钠泵的作用。
●钠泵活动重要的生理意义：
1、维持细胞正常的渗透压与形态。
2、形成和保持细胞内外Na+、K+不均匀分布及建立一种势能贮备。
3、建立的Na+浓度势能贮备是营养物质（G、aa）跨小肠和肾小管上皮等跨膜主动转运的能
量来源叫继发性主动转运（secondary active trnsport）或联合转运（cotransport）。
（2）继发性主动转运许多物质在进行逆浓度梯度或电位梯度的跨膜转运时，所需的能量并不直接伴随供能物质ATP的分解，而是来自Na+在膜两侧的浓度势能差，后者是钠泵利用分解ATP释放能量建立的，这种间接利用ATP能量的主动转运过程称为继发性主动转运(secondary active transport)。
葡萄糖和氨基酸在小肠粘膜上皮处的吸收以及它们在肾小管上皮处的重吸收，甲状腺上皮细胞的聚碘，Na＋/ Ca2+交换，Na＋、K+、Cl-同向转运等生理过程，均属于继发性主动转运。
如果被转运的离子或分子都向同一方向运动，称为同向转运(symport)，相应的转运体也称为同向转运体(symporter)；如果被转运的离子或分子彼此向相反方向运动，称为反向转运(antiport)或交换(exchange)，相应的转运体也称为反向转运体(antiporter)或交换体(exchanger)。
（三）出胞与入胞
膜蛋白可以介导水溶性小分子通过细胞膜，但它却不能转运大分子，如蛋白质、多聚核苷酸等。这些大分子物质乃至物质团块需要借助于细胞膜的“运动”，以出胞(exocytosis)或入胞(endocytosis)的方式完成跨膜转运。这些过程需要细胞提供能量。
出胞是指细胞内大分子物质以分泌囊泡的形式排出细胞的过程。出胞主要见于细胞的分泌活动，如内分泌细胞分泌激素、外分泌腺分泌酶原颗粒和粘液以及轴突末梢释放神经递质等。
入胞是指细胞外大分子物质或物质团块（如细菌、病毒、异物、大分子营养物质等）借助于与细胞膜形成吞噬泡或吞饮泡的方式进入细胞的过程，并分别称为吞噬(phagocytosis)和吞饮(pinocytosis)。
1．吞噬是指物质颗粒或团块进入细胞的过程，形成的吞噬泡直径较大（1～2μm），吞噬只发生在一些特殊的细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞等；吞饮过程出现于几乎所有的细胞，形成的的吞饮泡较小(0.1～0.2μm)。
2．吞饮又可分为液相入胞(fluid-phase endocytosis)和受体介导入胞(receptor-mediated endocytosis)两种。
a) 液相入胞是指细胞外液及其所含的溶质连续不断地进入胞内，是细胞本身固有的活动，进入细胞的溶质与溶质的浓度成正比。
b) 一些特殊物质进入细胞，是通过被转运物质与膜表面的特殊受体蛋白质相互作用而引起的，称为受体介导入胞。
第二节细胞的跨膜信号转导
调节机体内各种细胞在时间和空间上有序的增殖、分化，协调它们的代谢、功能和行为，主要是通过细胞间数百种信号物质实现的。这些信号物质包括激素、神经递质和细胞因子等。概括它们作用方式的不同，大体可分为两类：一类是疏水性的类固醇激素、维生素D和甲状腺激素，它们可弥散透过细胞膜，与胞内受体结合而发挥作用；另一类是为数更多的信号物质，在化学上属于亲水性分子，只能作用于细胞膜表面的受体或起受体样作用的蛋白质，再通过细胞内一系列以蛋白质构象和功能变化为基础的级联反应来产生生物学效应。这一信号转导过程还具有信号放大功能，使少量的细胞信号分子得以引发靶细胞显著的反应。根据细胞膜上感受信号物质的蛋白质分子的结构和功能的不同，跨膜信号转导（transmembrane signal transduction）的路径大致可分为G 蛋白耦联受体介导的信号转导、离子通道受体介导的信号转导和酶耦联受体介导的信号转导三类。
一、G 蛋白耦联受体介导的信号转导
G 蛋白耦联受体介导的信号转导是通过膜受体、G 蛋白、G 蛋白效应器和第二信使等一系列存在于细胞膜和胞质中的信号分子的活动实现的。
（一）参与G 蛋白耦联受体介导的信号转导的信号分子
1．G 蛋白耦联受体(G protein-linked receptor)。
2．G 蛋白鸟苷酸结合蛋白（guanine nucleotide-binding protein）简称G蛋白(G protein)，G蛋白的种类很多，依α亚单位的不同可将其分为4类，即G s、G i、G q和G12，每一类又分为若干亚型。G蛋白通常由α、β、γ三个亚单位组成。
3．G蛋白效应器 G蛋白效应器(G protein effector)主要指催化生成或分解第二信使的酶。G调控的效应器酶主要有腺苷酸环化酶(adenylyl cyclase，AC)，磷脂酶C(phospholipase C，PLC)，磷脂酶A2(phospholipase A2，PLA2)，鸟苷酸环化酶(guanylyl cyclase，GC)和cGMP磷酸二脂酶(phosphodiesterase，PDE)。
4．第二信使第二信使(second messenger)是指激素、递质和细胞因子等信号分子即第一信使作用于细胞膜后产生的细胞内信号分子，它们可把细胞外信号分子所携带的信息转入细胞内。重要的第二信使有环-磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)，三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)，二酰甘油(diacylglycerol，DG)、环-磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)和钙离子等。
（二）G 蛋白耦联受体介导的信号转导的主要途径
1．受体-G蛋白-AC途径这一途径参与调节AC活性的G蛋白有兴奋性G蛋白(G s)和抑制性G蛋白(G i)。如果配体受体复合物与G s结合可激活AC，在Mg2+存在的条件下，活化的AC使ATP水解产生第二信使cAMP。与此相反，如果配体受体复合物与G i结合可抑制AC 的活性，从而降低细胞内的cAMP水平。
2．受体-G蛋白-PLC途径这一途径参与调节PLC活性的G蛋白是G q和G i。许多配体与结合后，可经G q和G i家族的某些亚型激活PLC，后者可将膜脂质中含量甚少的二磷酸脂酰肌醇(phosphatidylinositol bisphosphate,PIP2)迅速水解为两种第二信使第二信使IP3和DG。IP3和DG分别调节胞质中的Ca2+浓度和蛋白激酶C(protein Kinase C,PKC)来始动细胞的功能。
二、离子通道受体介导的信号转导
离子通道受体又称促离子型受体（ionotropic receptor），受体蛋白本身就是离子通道。例如N2型ACh受体、A型 -氨基丁酸受体和甘氨酸受体都是细胞膜上的化学门控通道。通道的开放（或关闭）不仅涉及离子本身的跨膜转运，而且可实现化学信号的跨膜转导，因而这一信号转导途径称为离子通道受体介导的信号转导。
三、酶耦联受体介导的信号转导
酶耦联受体具有与G蛋白耦联受体完全不同的分子结构和特性，这一跨膜信号转导过程不需要G蛋白的参与，也没有第二信使的产生。酶耦联受体分子的胞质一侧自身具有酶的活性，或者可直接结合并激活胞质中的酶，并由此实现细胞外信号对细胞功能的调节。其中较重要的有以下两类受体。
（一）酪氨酸激酶受体
酪氨酸激酶受体（tyrosine kinase receptor，TKR）的分子都是贯穿脂质双层的整合蛋白，一般只有一个跨膜α螺旋，它在膜外侧有配体的结合位点，而伸入胞质的一端具有酪氨酸激酶的结构域，也就是说受体与酶是同一个分子。但也有一些受体本身并不具有酶活性部位，但可直接与胞质中的酪氨酸激酶结合。酪氨酸激酶受体一旦被激活，由于分子构象发生改变，可引起胞质侧酶活性部位的活化，或导致对胞质酪氨酸激酶的结合和激活。大部分生长因子、胰岛素和一部分肽类激素都是通过酪氨酸激酶受体将信号转导至细胞内，从而实现细胞外信号对细胞功能的调节。
（二）鸟苷酸环化酶受体
鸟苷酸环化酶受体（guanylyl cyclase receptor）的分子只有一个跨膜α螺旋，分子的N端位于膜外侧，具有配体的结合位点，C端位于膜内侧，有鸟苷酸环化酶（GC）结构域。一旦配体与受体结合将激活GC。与AC激活不同的是此过程不需要G蛋白参与。GC使胞质内的GTP环化，生成cGMP，后者可结合并激活依赖cGMP的蛋白激酶G（protein kinase G，PKG）。PKG与PKA、PKC一样，也是丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，通过对底物蛋白的磷酸化实现信号转导。
一氧化氮(nitric oxide,NO)也可激活鸟苷酸环化酶，但这种鸟苷酸环化酶存在于胞质，称为可溶性鸟苷酸环化酶（soluble guanylyl cyclase，sGC）。NO作用于sGC，使胞质内cGMP的浓度和PKG活性升高，从而引起血管平滑肌舒张等反应。
第三节细胞的生物电现象
当环境发生变化时，生物体内的代谢及其外表活动将发生相应的改变，这种改变称为生物机体的反应（response）。
能引起生物机体发生反应的各种环境变化，统称为刺激（stimulus）。
一切具有生命活动的细胞、组织或机体对刺激都具有发生反应的能力或特性，称为兴奋性（excitability）。
一切活组织的细胞，不论在安静状态还是在活动过程中均表现有电的变化，这种电变化是伴随着细胞生命活动出现的，所以称为生物电。
如神经、肌肉和腺体等组织受刺激后，能迅速产生特殊的生物电现象（如动作电位）及其它反应。在传统的生理学中，将神经、肌肉和腺体组织通称为可兴奋组织（excitable tissue），而且将这些可兴奋组织接受刺激后所产生的生物电反应过程及其表现，称之为兴奋（excitation）。
生物电是一切活细胞都具有的基本生命现象。细胞水平的生物电现象主要有两种表现，即在安静时具有的静息电位和受刺激后产生的动作电位。
一、细胞膜的被动电学特征
（一）膜电容和膜电阻
细胞膜主要由脂质构成具有较高的电阻特性。而电阻较高的细胞膜与其内外两侧导电性较高的细胞外液又构成了膜电容。故细胞膜具有一般的电学特征。
（二）电紧张电位
由外加电流引起的细胞膜上的电位，其随电流传导距离的增加而衰减，这种电位叫～。
三-9
二、细胞的静息电位及其产生机制
（一）细胞的静息电位
静息电位（resting potential，RP）是指细胞未受刺激时存在于细胞膜内外两侧的电
位差。静息电位表现为膜内电位较膜外为负，如果规定膜外电位为0mV，则膜内电位都在-10～-100mV之间。
人们通常把静息电位存在时细胞膜内外两侧所保持的外正内负状态，称为膜的极化(polarization)。静息电位的增大称为超极化(hyperpolarization)；静息电位的减小称为去极化(depolarization)；细胞膜去极化后再向静息电位方向的恢复，称为复极化(repolarization)。静息电位与极化是一个现象的两种表达方式，它们都是细胞处于静息状态的标志。
（二）静息电位产生的机制
1．膜外K+浓度，它与膜内K+的浓度差决定E k，因而[K+]O的改变会显著影响静息电位；
K+平衡电位(K+ equilibrium potential，E k)的数值决定于膜两侧初始存在的K+浓度差的大小，它的精确数值可根据Nernst公式算出（37℃条件下）：
式中E k表示K+的平衡电位，[K+]o和[K+]i分别表示K+膜外和膜内的浓度。
2．膜对K+和Na+的相对通透性，如对K+通透性增大，静息电位也增大，反之，如对Na+的通透性增大，静息电位将减小；
3．钠-钾泵活动的水平。
三、动作电位及其产生机制
（一）细胞的动作电位
在静息电位的基础上，如果细胞受到一个适当的刺激，膜电位会发生迅速的一过性的波动，这种波动称为动作电位（action potential）。
神经纤维在安静情况下受到一次足够强度的刺激时，膜内的负电位迅速减小，原有的极化状态去除（即去极化depolarization），并变成正电位，原来的内负外正变为内正外负。这样整个膜内电位变化的幅度约为90~130mV。动作电位变化曲线的上升支，称为去极相。
动作电位上升支中零电位以上的部分，称为超射值。
但是，由刺激所引起的这种膜内电位的倒转只是暂时的，很快就出现膜内电位下降并恢复到刺激前原有的负电位或极化状态（即复极化repolarization），构成了动作电位的下降支，称为复极相。
●单一细胞产生AP的特点：
①只要刺激达到阈值即可产生AP，即使再增加刺激强度，AP的幅度不再增加。
② AP不仅出现在受刺激的局部，它也可向周围C膜传播，且大小不因传播距离而改变。
●即单一细胞的“全或无”（all or none）现象：在同一细胞上AP的大小不随刺激强度
和传导距离的改变而变化。
（二）动作电位的离子机制
1．去极化：当细胞受到一个阈刺激（或阈上刺激）时，膜上的钠通道被激活，有少量的Na+内流，引起细胞膜轻度去极化。当膜电位去极化至某一临界电位时，电压门控式Na+通道开放，此时膜对Na+的通透性突然增大，并且超过了膜对K+的通透性，Na+迅速大量内流，使膜发生更强的去极化。较强的去极化又会使更多的钠通道开放和形成更强的Na+内流，如此便形成钠通道激活对膜去极化的正反馈（又称Na+的再生性循环），使膜迅速去极化，直到膜内正电位增大到足以阻止由浓度差所引起的Na+内流时，膜对Na+的净移动为零，从而形成了动作电位的上升支，此时膜两侧的电位差称为Na+的平衡电位。
2．复极化：Na+通道开放的时间很短，它很快就进入失活状态，从而使膜对Na+通透性变小。与此同时，电压门控式K+通道开放，膜内K+在浓度差和电位差的推动下又向膜外扩散，膜内电位由正值向负值发展，直至恢复到静息电位水平。
在复极期末，膜电位的数值虽然已经恢复到静息电位水平，但细胞内外离子的浓度差已发生变化。细胞每兴奋一次或每产生一次动作电位，细胞内Na+浓度的增加及细胞外K+浓度的增加都是十分微小的变化，但是足以激活细胞膜上的钠泵，使钠泵加速运转，逆着浓度差将细胞内多余的Na+主动转运至细胞外，将细胞外多余的K+主动转运入细胞内，从而使细胞内外的Na+、K+离子分布恢复到原先的静息水平。
（三）动作电位的产生与阈电位
当静息电位减小到某一临界值时，引起细胞膜上大量钠通道的开放，触发动作电位的产生。这种能触发动作电位的临界膜电位的数值称为阈电位（threshold potential）。从静息电位去极化达到阈电位是产生动作电位的必要条件。阈电位的数值约比静息电位的绝对值小10～20mV。
至此，兴奋性的概念可表述为细胞产生动作电位的能力。一般说来，细胞兴奋性的高低与细胞的静息电位和阈电位的差值呈反变关系，即差值愈大，细胞愈不容易产生动作电位，兴奋性愈低；差值愈小，细胞愈容易产生动作电位，兴奋性愈高。
所谓阈强度，是作用于细胞使膜的静息电位去极化到阈电位的刺激强度。
刺激强度低于阈强度的阈下刺激虽不能触发动作电位，但它也会引起少量的Na+ 内流，从而产生较小的去极化，只不过这种去极化的幅度不足以使膜电位达到阈电位的水平，而且只限受刺激的局部。这种产生于膜的局部、低于阈电位值的去极化反应称为局部反应（local response）。
（四）局部电位（兴奋、反应） 阈下刺激虽不能引起AP ，但可引起膜电位有所变化。
局部电位（local potential ）：阈下电流刺激时产生的电紧张电位和由膜自身产生的电活
动（部分Na +通道开放）叠加在一起的膜去极化电位。
● 特性：
1、等级性：其去极化幅度大小与阈下刺激大小呈正比——非“全或无”现象。
2、衰减性：其去极化幅度随传布距离↑而↓－电紧张性扩布（electrotonic propagation ）
3、总和现象
⑴空间（spatial summation ）：在同一细胞的不同部位阈下刺激引起的局部电位可叠加在一起。
⑵时间（temporal summation ）：在同一C 上先后的刺激引起的局部电位也可叠加在一起。 ● 总和或叠加后的局部电位若≥阈电位，则产生AP 。
● 局部电位与动作电位的比较：
（五）动作电位的传导
动作电位一旦在细胞膜的某一点产生，就会迅速沿着细胞膜向周围传播，一直到整个细胞膜都产生动作电位。这种在同一细胞上动作电位的传播称为传导（conduction ）。如果发生在神经纤维上，传导的动作电位又称为神经冲动。
1、无髓NF 的AP 传播—局部电流（local current ）学说
无髓NF 某处产生AP 时，该处膜电位倒转，与邻近未兴奋段之间存在一电位差→电荷移
动→局部电流（local current ）→刺激邻近静息膜去极化到阈电位→Na +大量内流→该处产
生AP 。这一过程连续下去。
2、有髓NF 的AP 传播——跳跃式传导（saltatory conduction ）
有髓NF 传导速度>>无髓NF 。 项目
局部电位 动作电位
刺激强度
开放的钠通道
电位变化幅度
总和
“全或无”现象
传播特点 阈下 少 小（<阈电位） 有（空间，时间） 无 呈电紧张性扩布，随时间和距
离的延长迅速衰减，不能连续
向远处传播。
阈或阈上 多 大（>阈电位） 无 有 以局部电流的形式连续不衰减地向远处传播。
四、组织的兴奋和兴奋性
（一）兴奋和可兴奋细胞
excitation）：可兴奋组织受刺激后产生生物电反应的过程。
可兴奋细胞：凡在受刺激后能产生动作电位的细胞。如：神经、肌、腺细胞。
（二）组织的兴奋性和阈刺激
刺激要引起组织兴奋，必须使以下三个参数达某一临界值：
a、刺激强度
b、刺激的持续时间
c、刺激强度对时间的变化率（对电刺激器而言，其固定）
其中，在参数“C”固定时，在一定范围内，引起组织兴奋的最小刺激强度与时间呈反比。
●（threshold）：
在刺激时间固定时，引起组织兴奋即产生动作电位的最小刺激强度，叫～。
阈下刺激（subthreshold stimulus）：强度<阈值
阈上刺激（hyperthreshold stimulus）：强度>阈值。
（三）细胞兴奋后兴奋性的变化（图）
●不同组织兴奋性不同，同一组织在不同的生理、病理情况下兴奋性的大小也不同。
一次兴奋过程中，细胞的兴奋性经历一系列有次序的变化，然后恢复正常。
1absolute refractory period）：细胞在接受一次有效刺激后的很短时间内，任何强大的刺激都不能使其再次兴奋，这段时间叫~。
2、相对不应期(relative refractory period)：绝对不应期后的一段时间内，大于阈强度的刺激才能引起细胞产兴奋，这一时期叫~。
3、超常期（suranormal period）：在相对不应期之后的一般时间内，小于阈强度的刺激就可引起细胞兴奋，这一时期叫~。
4、低常期（subnormal period）：在超常期之后的较长时间内，需用大于阈强度的刺激才能引起细胞兴奋，这一时期叫~。
●不同C各期时间有较大差异，某些C可缺某期。
●绝对不应期的存在，意味着C不论受频率多高的刺激，其在单位时间内产生兴奋的次数
有限，最多次数≤1/绝对不应期。
●细胞一次兴奋过程的分期：
●不同C各期时间有较大差异，某些C可缺某期。
●绝对不应期的存在，意味着C不论受频率多高的刺激，其在单位时间内产生兴奋的次数
有限，最多次数≤1/绝对不应期。
第四节肌细胞的收缩
人体各种形式的运动，主要是靠肌细胞的收缩活动来完成的。根据形态学特点,可将肌肉分为横纹肌和平滑肌；根据肌肉的功能特性又可将肌肉分为骨骼肌细胞、平滑肌细胞和心肌细胞三种。
一、横纹肌
（一）骨骼肌神经-肌接头处的兴奋传递
每条骨骼肌C至少接受一个运动N末梢的支配，并在其兴奋时发生收缩，故每个肌纤维都是一个独立的功能和结构单位。
神经-肌接头（neuromuscular junction）是由运动神经末梢和与它接触的骨骼肌细胞膜形成的。神经-肌接头处是由接头前膜（prejunctional membrane）、接头后膜
（postjunctional membrane）和它们之间的接头间隙（junctional cleft）三部分组成。
●运动N元⊕→ AP传到N末梢→轴突膜上Ca++通道开放，Ca++入C→ 囊泡靠近接头前膜内侧面→接头前膜量子式释放（quantal release）A ch→ Ach经间隙扩散到接头后膜→Ach—N2受体结合→终板膜Na+、K+通道开放→Na+内流>K+外流→终板膜去极化（终板电位，end-plate potential，EPP）至阈电位→ 肌C膜产生AP→ 经兴奋－收缩耦联使肌细胞收缩。
●一次AP引起运动神经末梢释放的Ach量＞引起肌细胞产生AP需要量的3-4倍，故该处
兴奋的传递是1：1。
●终板膜上的胆碱酯酶水解Ach仅需2.0ms，能保证下次N冲动到来的效应。
终板电位的特点：
1．属于局部反应，不表现“全或无”；
2．没有不应期；
3．具有总和效应。
神经-肌接头的传递有以下特点：
①单向传递。在神经-肌接头处兴奋的传递是单向的，兴奋只能由运动神经末梢传向肌细胞，这是由神经-肌接头的结构所决定的；
②时间延搁。在神经-肌接头处，由于递质的释放、扩散及其与受体结合而发挥作用，均需要时间，兴奋通过一个神经-肌接头头至少需要0.5~1.0ms；
③易受药物和其他环境因素的影响。细胞外液的酸碱度、温度的改变和药物或其他体液性物技的作用都可以影响神经-肌接头处的兴奋传递。
（二）骨骼肌细胞的微细结构
第二章细胞的基本功能 一、名词解释 1、单纯扩散:脂溶性小分子物质由细胞膜的高浓度一侧向低浓度一侧转运的过程。 2、易化扩散:非脂溶性或脂溶性小的小分子物质或离子,在膜蛋白的介导下顺电化学梯度进行的跨膜转运称为易化扩散。 3、主动转运:细胞通过本身的某种耗能过程,在膜蛋白的帮助下将小分子物质逆电化学梯度进行跨膜转运的过程,称为主动运输。 4、静息电位:静息时纯在于细胞膜内、外两侧的电位差,称为静息电位。 5、极化:生物学通常把静息电位存在时细胞膜电位外正内负的状态称为极化。 6、动作电位:在静息电位基础上,可兴奋细胞受到一个有效刺激时能产生一次迅速、可逆、可传导的膜电位波动,称为动作电位。 7、阈电位:能使钠通道大量开放并引发动作电位的临界膜电位值称为阈电位。 8、局部电位:在刺激局部产生的一个较小的膜电位波动称为局部电位。 9、兴奋-收缩耦联:将骨骼肌细胞的电兴奋与机械收缩联系起来的中介过程,称为兴奋-收缩耦联。 10、强直收缩:骨骼肌受到连续刺激时,可产生单收缩的总与,即引起肌肉的持续性收缩,称为强直收缩。 二、填空题 1、易化扩散就是细胞在膜蛋白的介导下顺电化学梯度进行的跨膜物质转运方式,根据借助的膜蛋白的不同,可分为: 通道介导的异化扩散与载体介导的异化扩散。 2、根据门控机制的不同,离子通道通常有三类: 电压门控通道、化学门控通道与机械门控通道。 3、Na+-K+泵有三种功能状态,分别为: 备用(静息) 、激活、失活。 4、主动转运就是细胞通过本身的某种耗能过程,在膜蛋白的帮助下逆电化学梯度进行的跨膜物质转运,根据耗能就是否直接来源于膜蛋白,可分为:原发性主动运输与继
第二章细胞的基本功能 一、单选题 1.人体内O2、CO2和NH3进出细胞膜是通过： A. 单纯扩散 B. 主动转运 C. 易化扩散 D. 出胞作用 E. 入胞作用 2.大分子蛋白质进入细胞的方式是： A. 出胞作用 B. 主动转运 C. 易化扩散 D. 入胞作用 E. 单纯扩散 3.参与细胞膜易化扩散的膜蛋白质是： A. 泵蛋白 B. 通道蛋白 C. 受体蛋白 D. 糖蛋白 E. 免疫蛋白 4.关于载体介导扩散，下述哪项是错误的： A. 能产生竞争性抑制 B. 有高度的特异性 C.有饱和现象 D. 具有时开放、有时关闭的特点 E. 葡萄糖可通过这种方式进行膜转运 5.葡萄糖顺浓度梯度跨膜转运依赖于膜上的： A. 受体蛋白 B. 通道蛋白 C. 紧密连接 D. 载体蛋白 E. 脂质双分子层 6.Na+跨膜转运的方式是： A. 主动转运 B. 单纯扩散 C. 易化扩散 D. 易化扩散和主动转运 E. 单纯扩散和主动转运 7.单纯扩散、易化扩散和主动转运的共同点是: A.需膜蛋白质的帮助 B. 细胞本身都要消耗能量 C. 转运的物质都是大分子物质 D. 转运的物质都是离子或小分子物质 E. 均是从高浓度侧向低浓度转运 8.运动神经纤维末梢释放乙酰胆碱属于： A. 入胞作用 B. 主动转运 C. 易化扩散 D. 单纯扩散 E. 出胞作用 9.Na+由细胞内移到细胞外是： A. 出胞作用 B. 单纯扩散 C. 载体介导转运 D. 主动转运 E. 通道介导转运 10.下列哪项不是影响离子通过细胞膜的直接因素: A. 膜两侧的渗透压差 B. 膜对离子的通透性 C. 膜两侧的电位差 D. 膜上离子泵的活性 E. 膜两侧的浓度差 11.细胞内外正常的Na+和K+浓度差的形成和维持是由于： A. 膜上ATP的作用 B. 膜在兴奋时对Na+通透性增加 C. Na+和K+易化扩散的结果 D. 膜上Na+－K+泵的作用 E. 膜在安静时对K+通透性大 12.主动转运不同于被动转运的是： A. 经过通道蛋白作用 B. 顺浓度梯度和电位梯度转运 C. 需要消耗细胞能量 D. 转运脂溶性物质分子 E. 转运离子、小分子水溶性物质 13.细胞内外离子浓度差的维持: A. 不需耗能 B. 需要耗能 C. 需要通道蛋白质
流式细胞仪入门 ----- 秦华 译
目录 前言 第1章综述 第2章液流系统 第3章散射光信号及荧光信号 3.1 散射光信号 3.2 荧光信号 第4章光电系统 4.1 光平台 4.2 光学滤片 4.3 信号探测器 4.4 阀值 第5章数据分析 5.1 数据采集及显示 5.2 设门 5.3 细胞亚群的数据分析 5.4 流式细胞仪其它应用的数据分析第6章分选 6.1 分选 第7章激光器及光路校正 7.1 激光器的工作原理 7.2 光路校正 第8章习题答案
序论 学习仪器的最好方法是操作仪器，然而在理解原理的基础上进行仪器操作无疑会起到事半功倍的作用。 本书介绍了流式细胞仪的基本知识，并从不同角度详尽阐述了各种台式机（FACScan TM，FACSort TM，FACSCalibur TM，和BD LSR）与大型机（FACS Vantage TM，FACSVantage TM SE，和FACStar PLUSTM）之间的不同，且附习题及答案。阅读本书有助于增强读者操作仪器的动手能力和经验。
第一章综述 流式细胞术是一项快速检测分析单个粒子多物理特性的高技术，通常指细胞通过激光束时在液流中的特性，即粒子的大小，密度或是内部结构，以及相对的荧光强度。通过光电系统记录细胞的散射光信号和荧光信号可得知细胞特性。 流式细胞仪主要由三部分组成：流动室和液流系统；光路系统以及电系统。其作用如下： z液流系统：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区。 z光路系统：细胞由激光激发，通过光学滤片产生光信号，并传送到相应的探测器。 z电系统：把光信号转换为电信号。对于有分选装置的仪器，电系统可初始化分选条件。 在流式细胞仪中，细胞被传送到液流中的激光照射区。任何存在于悬液中的直径为0.2-150微米的粒子或细胞都适用于流式分析。在实际工作中，用实体组织进行流式细胞分析往往是不可能的，分析之前必须对其进行分解。被液滴包绕的粒子称为细胞液柱，当粒子经过激光照射区时，通过激光激发产生散射光。含有荧光的粒子就会表现出其荧光特性。散射光和荧光由光路系统（相应的透镜，滤片和探测器）收集。分光器和滤光片引导散射光和荧光至相应的探测器，把光信号转换为电信号。 单个粒子通过其表现出的光散射和荧光属性，通过列表模式（List mode）完成数据采集，并对样本中的细胞亚群进行分析。
1、流式细胞仪上的FL2-W FL2-A FL2-H 分别是做什么的？ FL2-W是只检测荧光的脉冲宽度， FL2-H是指脉冲高度。通常在做细胞周期分析时应用，用于去除粘连细胞。 2、流式同型对照怎样选择？ 同型对照（Isotype Control）：使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。如果一抗是多抗，可以用an normal serum（与一抗相同的正常血清）（must be the same species as primary antibody）。This control is easy to achieve and can be used routinely in immunohistochemical staining.这个可以咨询试剂商。同型对照为免疫荧光标记中的阴性对照。由于荧光标记单抗的组来源不同，应选用相同来源的未标记单抗作为同型对照来调整背景染色。举个例子：比如检测一抗为单抗的mouse anti rat CD11b，clone OX-42 purified IgG，那么它的isotype 是mouse IgG2a，所以可以用purified（纯化的） mouse IgG2a来做OX-42的同型对照（Isotype Control）。一般的的生物技术公司和国内的代理都有出售。 同型对照：是指与 MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亚类，若使用直接免疫荧光染色法，同型对照也应标记荧光色素，如IgG1 FITC、IgG2ａ、PE等。主要考虑了细胞的自发荧光、FC受体介导的抗体结合和非特异性抗体结合等影响因素。此外，同型对照与MoAb所标记的荧光色素、浓度、F：P比值（标记的荧光色素与免疫球蛋白分子的比值）应该相同为最佳，这对准确设定阴性与阳性细胞的界标有重要意义，切忌使用与MoAb不相匹配的同型对照，最好为同一实验室、采用相同工艺或方法制备（如同一品牌）的产品。 3、流式细胞技术测定细胞内游离钙浓度为何要使用氯化钙.在文献及其他专业网站中都有测定游离钙的方法，具体如下： （1）钙荧光探针负载； （2）随机测定每管细胞悬液样品（以下简称样品）的单个细胞的荧光强度，记为F值。 （3）加入10%Triton X 100，（破膜用）；加入1 mmol/L氯化钙，（问题所在），吹打均匀，孵育1~10min，测定荧光即Fmax值。 （4）加入EGTA，20μl（钙螯合剂），孵育1~10min，激发波长488nm测定荧光，即Fmin 值。 这个过程中的氯化钙的作用如何，请高人指点，谢谢。 因为正常血浆中Ca2＋浓度是1mM，细胞外液的Ca2＋对细胞内Ca2＋有影响。加0.1%triton 是增加膜通透性，使细胞外Ca2＋进入细胞内，作为最大值。加EGTA是为了螯合Ca2＋，作为最小值.生理环境中细胞内钙离子浓度远低于细胞外液（大约1：10000），细胞膜对钙的通透性变化对细胞内钙影响很大。
第二章细胞基本知识概要 本章内容提要: 第一节细胞的基本概念 第二节非细胞形态的生命体 -------病毒及其与细胞的关系 第三节原核细胞与古核细胞 第四节真核细胞基本知识概要 第一节细胞的基本概念 What is a cell? Cells are structural units that make up plants and animals, also there many single cell organisms. What cells all have in common is they are small 'sacks' composed mostly of water. The 'sacks' are made from a phospholipid bilayer. The membrane is semi-permeable (allowing some things to pass in or out of the cell and blocking others), there are also other methods of transport that we will get into later. So what is in a cell? The cell as we mentioned is a fluid like membrane that surrounds the contents of the cell. Each component will be discussed in more detail later. 一、细胞是生命活动的基本单位 1、一切有机体都由细胞构成，细胞是构成有机体的基本单位； 2、细胞具有独立的、有序的自控代谢体系，细胞是代谢与功能的基本单位 3、细胞是有机体生长与发育的基础 4、细胞是遗传的基本单位，细胞具有遗传的全能性 5、没有细胞就没有完整的生命 二、细胞的基本共性 1.所有的细胞表面均有由磷脂双分子层与镶嵌蛋白质构成的生物膜，即细胞膜。 2.所有的细胞都含有两种核酸:即DNA与RNA作为遗传信息复制与转录的载体。 3.作为蛋白质合成的机器─核糖体，毫无例外地存在于一切细胞内。 4.所有细胞的增殖都以一分为二的方式进行分裂。 第二节非细胞形态的生命体—病毒及其与细胞的关系 一、Basic characteristics of viruses Simply stated, viruses are merely genetic information surrounded by a protein coat. They may contain external structures and a membrane. Viruses are obligate（专性的）intracellular parasites--meaning that they require host cells to reproduce. In the viral life cycle, a virus infects a cell, allowing the viral genetic information to direct the synthesis of new virus particles by the cell. There are many kinds of viruses. Those infecting humans include polio（脊髓灰质炎）, influenza, herpes （疱疹）, and human immunodeficiency virus (HIV) causing AIDS. 二、viral reproduction(i.e. the course of viral infection, e.g. HIV infection) 1、Attachment(getting in) On the surface membrane of all living cells are complex protein structures called "receptors". A receptor is often compared to a lock into which a specific key or "ligand" will fit. There are at least two receptors on T-lymphocytes to which the human immunodeficiency virus (HIV) sticks. The primary receptor, called "CD4", is shown on the right in the diagram. But a second receptor that loops through the cell membrane 7 times is critical for
生理学课后练习题二：细胞的基本功能
生理学课后练习题二：细胞的基本功能 A型题 1．下列关于电压门控Na+通道与K+通道共同点的叙述，错误的是 A．都有开放状态 B．都有关闭状态 C．都有激活状态 D．都有失活状态 答案：D 解析：Na+通道至少有静息（关闭）、激活（开放）和失活（关闭）三种状态，而K+通道只有静息和激活两种状态，没有失活状态。 2．在细胞膜的物质转运中，Na+跨膜转运的方式是 A．单纯扩散和易化扩散 B．单纯扩散和主动转运 C．易化扩散和主动转运 D．易化扩散和出胞或入胞 E．单纯扩散、易化扩散和主动转运 答案：C 解析：①离子很难以单纯扩散的方式通过细胞
4．下列跨膜转运的方式中，不出现饱和现象的是 A．与Na+偶联的继发性主动转运 B．原发性主动转运 C．易化扩散 D．单纯扩散 E．Na+-Ca2+交换 答案：D 解析：选项A、B、C、E实现物质转运的前提条件是需要膜蛋白（载体、离子通道、离子泵、转运体等）的参与，而这些膜蛋白的数量是有限的，当其100%发挥就可能发生饱和。而单纯扩散是一种简单的物理扩散，扩散的方向和速度取决于物质在膜两侧的浓度差和膜对该物质的通透性，没有生物学的转运机制参与，所以无饱和现象。 5．葡萄糖从细胞外液进入红细胞内属于 A．单纯扩散 B．通过介导的易化扩散
C．载体介导的易化扩散 D．主动转运 E．入胞作用 答案：C 解析：在小肠黏膜或肾小管管腔侧的上皮细胞膜上存在有葡萄糖的转运体，葡萄糖被逆浓度梯度自管腔液中转运至上皮细胞内，其能量来源于由钠泵活动建立的钠离子浓度势能。葡萄糖通过一般细胞膜为通过载体介导的易化扩散。 6．需要依靠细胞内cAMP来完成跨膜信号转导的膜受体是 A．G蛋白偶联受体 B．离子通道型受体 C．酪氨酸激酶受体 D．鸟苷酸环化酶受体 答案：A 解析：离子通道型受体依靠离子流变化的变化完成跨膜信号转导；酪氨酸激酶受体依靠胞质侧酶活性部位的活化，或导致对胞质酪氨酸激酶的结合和激活，通过Ras-MAPK等途径完成跨膜信号转导；鸟苷酸环化酶受体依靠细胞内鸟苷酸环
细胞的基本功能 二.填空题 33．人体和其它生物体的最基本的功能单位是。 34．机体的每个细胞都被一层薄膜所包被，称为。 35. 细胞膜主要有脂质、蛋白质和少量糖等组成;从重量上看：膜中与脂质在膜内的比例大约在4：1～1：4之间；功能活跃的膜，膜中比例较高。 36. 液态镶嵌模型的基本内容是：以液态的双分子层为基架，其中镶嵌着具有不同分子结构、因而也具有不同生理功能的。 37. 脂质双分子层在热力学上的和它的 ,使细胞膜可以承受相当大的张力和外形改变而不致破裂，而且即使膜结构有时发生一些较小的断裂，也可以自动融合而修复。 38. 体内靠进出细胞膜的物质较少，比较肯定的是氧和二氧化碳等气体分子;它们进出的量主要受该气体在膜两侧的影响。 39.根据参与的膜蛋白的不同，易化扩散可分为：由和由介导的易化扩散。 40.人体最重要的物质转运形式是；在其物质转运过程中，是电-化学梯度进行的。 41. 钠泵能分解使之释放能量，在消耗代谢能的情况下逆着浓度差把细胞内的移出膜外，同时把细胞外的移入膜内，因而形成和保持了不均衡离子分布。 42. 继发性主动转运可分为和两种形式；与其相应的转运体，称之为和。 43. G蛋白的共同特点是其中的亚单位同时具有结合或的能力和酶活性。 44. 膜学说认为生物电现象的各种表现，主要是由于细胞内外分布不均匀和在不同状态下，细胞膜对不同离子的不同。 45.静息电位是由形成的,峰电位的上升支是形成的。 46. 在刺激的以及不变的情况下，刚能引起细胞兴奋或产生动作电位的最小刺激强度，称为阈度；也就是能够使膜的静息电位去极化达到电位的外加刺激的强度。 47. 动作电位的幅度决定于细胞内外的浓度差，当用河豚毒阻断通道后,则动作电位不能产生。 48.神经髓鞘在进化过程中的出现,既增加了神经纤维的又减少了这一过程中的。 49．每个囊泡中储存的Ach量通常是相当恒定的, 释放时是通过作用，以为单位倾囊释放。50. 横管系统的作用是将肌细胞膜兴奋时出现的沿T管膜传入细胞内部; 纵管系统的作用是通过对的储存、释放和再聚集，触发肌节的收缩和舒张。每一条横管和两侧的终池构成，它是兴奋-收缩耦联的关键部位。 51．横桥在一定条件下，可以和细肌丝上的呈可逆性的结合；具有的作用，可以分解ATP而获能量，供横桥摆动。 52.站立时对抗重力的肌肉收缩是收缩，这种收缩因无位移，而没有做功;其作用是保持一定 的，维持人体的位置和姿势。 53. 若每次新的收缩都出现在前次收缩的舒张期过程中，称为收缩;若每次新的收缩都出现在前次收缩的收缩期过程中,称为收缩。肌肉发生复合收缩时，出现了收缩形式的复合，但引起收缩的 电位仍是独立存在的。 54. 肌肉收缩前已存在的负荷, 称为 ;其使肌肉在收缩前就处于某种被拉长的状态，使其具有一定的长度，称为。 55.根据兴奋传导的特征将平滑肌分为两大类，一类称为，其类似于骨骼肌细胞；另一类称 为，类似于心肌细胞。 56．无论哪种平滑肌，都可以产生两种形式的收缩：和；根据平滑肌的收缩形式，也可将平滑肌分为：和两大类。 57.G-蛋白通常由、和 3个亚单位组成，亚单位通常起催化作用。 58内分泌腺细胞把激素分泌到细胞外液中,属于形式的跨膜物质转运;血浆中脂蛋白颗粒、大分子营养物质等进入细胞的过程，属于形式的跨膜物质转运。 59.有机磷农药和新斯的明对有选择性的抑制作用,阻止已释放的的清除,引起中毒症状。
DMEM、RIPA1640、F12、L15等细胞培养基的基本知识 培养细胞的完全培养基由基础培养基（如MEM）和添加剂（如血清或无血清培养用的某些确定的激素及生长因子）组成，培养基的配方一直在改进，其中包括抗生素和抗有丝分裂剂等等。 一、基础培养基 绝大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和其它与血清中浓度相似的营养物质。最广泛应用的培养基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13种必须氨基酸、8种维生素。而Ham`s F12 也包括非必须氨基酸，维生素的范围亦很广，另外常规含有无机盐和代谢添加剂（例如核苷酸）。MEM/F12 这两种培养基各取1/2，形成神经生物学最通用的培养基。Dulbecco`s改良培养基——DMEM，现应用于快速生长的细胞，同MEM 含有相同的营养成分，但浓度高出2~4倍。选择某种培养基，应仔细了解成分表，应知道大多数情形下培养基都有不足。例如，有些培养基在氨基酸中包括有谷氨酸，而这种培养基虽广泛用于神经生物学领域，但它对某些对谷氨酸敏感的可能有细胞外毒性损伤的神经元而言，则并非最佳选择，特别是如果神经元生长在缺乏胶质的环境中时。F12中含有硫酸亚铁，据报道也有神经毒效应。 在所有这些培养基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的浓度，这是因为它具有不稳定性以及在许多细胞培养中它常用作碳源。对于神经元的培养常常在基础培养基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸（若培养基中这两种物质缺乏时）。MEM与F12均要用5%的CO2来平衡，DMEM含更高浓度的NaCO3，要用10%的CO2来平衡，当然也可以在较低CO2浓度下使用。这些基础培养基的组成成分是建立在对不同细胞系生长的研究之上的，但通常在原代培养中使用也能有比较令人满意的结果。 原则上，HEPES作为缓冲剂可用来代替碳酸氢盐，以解除需要高浓度CO2培养环境的限制。实际操作中并非如此简单。显然，溶解的CO2与碳酸氢盐对良好的细胞生长是重要的。Leiboviz`s L15培养基可用来在大气环境中令神经细胞生长，该培养基采用了与众不同的BSS作基础，它含有高浓度的氨基酸来提高缓冲能力，培养基中使用半乳糖作碳源，以阻止培养基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代谢产生。这一培养基的优点是明显的，特别是在保持较高CO2有困难时，例如在长时间的显微操作及生理学研究中。L15培养基已用来成功的培养了外周神经元，但尚未在CNS神经元的发育研究中全面检测过。 二、血清 细胞在单纯的基础培养基中不能存活，在特殊类型的细胞培养中必须提供某些 痕量营养物质及生长因子才能使细胞得以生长并维持生长状态。基础培养基常常要添加血清，血清终浓度多为5~20%。特殊用途的血清来源须用经验确定，广泛应用的血清种类有马血清与胎牛血清。胎牛血清中富含有丝分裂因子，常选其作增殖细胞用的血清，也用于细胞系和原代培养。而马血清常常用来作有丝分裂后的神经元培养。然而，很多人也将胎牛血清
一步一步学流式 第一篇：流式细胞术的历史 概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采集和分析技术等。FCM目前发展的水平凝聚了半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。 1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。1953年Crosland –Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液；细胞悬浮液和鞘液都在作层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。 1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代FCM计数技术的主要历程。 现代的FCM数据采集和分析技术是从组织化学发源的，其开拓者是Kamentsky。1965年，Kamentsky在组织化学的基础上提出了两个新设想：（1）细胞的组分是可以用光光度学来定量测定的，即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学的重要信息。（2）细胞的不同组分可以同时进行多参数测量，从而可以对细胞进行分类。换句话说，对同一细胞可以同时获得有关不同组分的多方面信息，用作鉴别细胞的依据。 流式细胞术在细胞化学中的应用的先驱者是Van Dilla和美国的Los Alamos小组。他们在1967年研制出流液束、照明光轴、检测系统光轴三者相互正交的流式细胞计的基础上，首次用荧光Feulgen反应对DNA染色显示出DNA的活性与荧光之间存在着线性关系，并在DNA的直方图上清楚地显示出细胞周期的各个时相。Gohde 和Dittrich接着把这项技术推向实用，他们用流式细胞术测定细胞周期借以研究细胞药代动力学问题。FCM用于免疫组织化学中的关键是对细胞进行免疫荧光染色，其它和在细胞化学的应用并没有多大差异。（下图为一DNA直方图） DNA直方图 第二篇：流式细胞仪的工作原理 将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够包绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。
流式细胞仪入门 -----导航篇 二OOO年四月
目录 前言 第1章综述 第2章液流系统 第3章散射光信号及荧光信号 3.1 散射光信号 3.2 荧光信号 第4章光电系统 4.1 光平台 4.2 光学滤片 4.3 信号探测器 4.4 阀值 第5章数据分析 5.1 数据采集及显示 5.2 设门 5.3 细胞亚群的数据分析 5.4 流式细胞仪其它应用的数据分析第6章分选 6.1 分选 第7章激光器及光路校正 7.1 激光器的工作原理 7.2 光路校正 第8章答案
序论 学习仪器的最好方法是操作仪器，然而在理解原理的基础上进行仪器操作无疑会起到事半功倍的作用。 本书介绍了流式细胞仪的基本知识，并从不同角度详尽阐述了各种台式机（FACScan TM，FACSort TM，FACSCalibur TM，和BD LSR）与大型机（FACS Vantage TM，FACSVantage TM SE，和FACStar PLUSTM）之间的不同。阅读本书有助于增强读者操作仪器的动手能力和经验。
第一章综述 流式细胞术是一项快速检测分析单个粒子多物理特性的高技术，通常指细胞通过激光束时在液流中的特性，即粒子的大小，密度或是内部结构，以及相对的荧光强度。通过光电系统记录细胞的散射光信号和荧光信号可得知细胞特性。 流式细胞仪主要由三部分组成：流动室和液流系统；光路系统以及电系统。其作用如下： 液流系统：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区。 光路系统：细胞由激光激发，通过光学滤片产生光信号，并传送到相应的探测器。 电系统：把光信号转换为电信号。对于有分选装置的仪器，电系统可初始化分选条件。 在流式细胞仪中，细胞被传送到液流中的激光照射区。任何存在于悬液中的直径为0.2-150微米的粒子或细胞都适用于流式分析。在实际工作中，用实体组织进行流式细胞分析往往是不可能的，分析之前必须对其进行分解。被液滴包绕的粒子称为细胞液柱，当粒子经过激光照射区时，通过激光激发产生散射光。含有荧光的粒子就会表现出其荧光特性。散射光和荧光由光路系统（相应的透镜，滤片和探测器）收集。分光器和滤光片引导散射光和荧光至相应的探测器，把光信号转换为电信号。 单个粒子通过其表现出的光散射和荧光属性，通过列表模式（List mode）完成数据采集，并对样本中的细胞亚群进行分析。
细胞的基本功能 1、细胞膜转运CO2和O2的主要方式是( ) A、易化扩散 B、主动转运 C、单纯扩散 D、入胞作用 E、出胞作用 2、主动转运、单纯扩散、易化扩散三种物质转运形式的共同点是( ) A、被转运物质都是以小分子或离子形式通过细胞膜 B、被转运物质都是以结合形式通过细胞膜 C、均为消耗能量的过程 D、均为不消耗能量的过程 E、顺电-化学梯度 3、下列哪项不属于易化扩散特点 A、特异性 B、饱和性 C、竞争性抑制 D、需要蛋白质帮助 E、不需要蛋白质帮助 4、细胞膜上主动转运Na+的钠泵，其化学本质是 A、糖蛋白 B、脂蛋白 C、糖脂 D、Na+–k+依赖式ATP酶 E、以上均不是 5、钠泵能逆浓度差主动转运Na+和K+,其转运方向是 A、将Na+、K+转入细胞内 B、将Na+、K+转出细胞外 C、将Na+转出细胞外，将K+转入细胞内 D、将Na+转入细胞内，将K+转出细胞外 E、以上均不是 6、细胞内外正常Na+和K+的浓度差的形成和维持是由于 A、膜安静时对K+通透性大 B、膜兴奋时对Na+通透性增加 C、Na+易化扩散的结果 D、膜上Na+–K+泵的作用 E、载体转运的结果 7、存在于细胞膜上的能选择性地和激素等化学物质相结合而引起细胞产生生理效应的物质是 A、钠泵 B、受体 C、载体 D、通道 E、钾泵 8、受体的功能是 A、完成跨细胞膜的信息传递 B、为细胞代谢活动提供能量 C、为细胞内物质合成提供原料 D、实现跨细胞膜的物质转运 E、以上均不是 9、与受体结合后引发细胞产生特定生理效应的物质称为受体的 A、激动剂 B、阻断剂 C、催化剂 D、还原剂 E、可逆性 10、细胞在静息时存在于细胞膜两侧的电位差称为 A、动作电位 B、静息电位 C、阈电位 D、跨膜电位 E、去极化 11、细胞在静息时，正电荷位于膜外一侧，负电荷位于膜内一侧的现象称为 A、极化 B、超极化 C、去极化
iFFF-r-F-FFF F-=. FXF —…八扌彳-FFFFF-* - F.-F- - - = *XFXF* " ~ ' 第一章细胞的基本功能 【习题】 一、名词解释 1. 易化扩散2?阈强度3?阈电位4.局部反应 二、填空题 1. 物质跨越细胞膜被动转运的主要方式有__________ 和________ 。 2. 一些无机盐离子在细胞膜上________ 的帮助下，顺电化学梯度进行跨膜转动。 3. 单纯扩散时，随浓度差增加，扩散速度__________ 。 4. 通过单纯扩散方式进行转动的物质可溶于___________ 。 5. 影响离子通过细胞膜进行被动转运的因素有__________ ，______ 和________ 。 6. 协同转运的特点是伴随 _______ 的转运而转运其他物质，两者共同用同一个___________ 。 7. 易化扩散必须依靠一个中间物即_________ 的帮助，它与主动转运的不同在于它只能浓度梯 度扩散。 8. 蛋白质、脂肪等大分子物质进出细胞的转动方式是___________ 和 _______ 。 9.02和CQ通过红细胞膜的方式是__________ ;神经末梢释放递质的过程属于。 10. 正常状态下细胞内K*浓度_________ 细胞外，细胞外Na*浓度________ 细胞内。 11. 刺激作用可兴奋细胞，如神经纤维，使之细胞膜去极化达_________ 水平，继而出现细胞膜 上______ 的爆发性开放，形成动作电位的_________ 。 12. 人为减少可兴奋细胞外液中________ 的浓度，将导致动作电位上升幅度减少。 13. 可兴奋细胞安静时细胞膜对________ 的通透性较大，此时细胞膜上相关的___________ 处于开放状态。 14. 单一细胞上动作电位的特点表现为_________ 和________ 。 15. 衡量组织兴奋性常用的指标是阈值，阈值越高则表示兴奋性____________ 。 16. 细胞膜上的钠离子通道蛋白具有三种功能状态，即___________ , ______ 和________ 。 17. 神经纤维上动作电位扩布的机制是通过_________ 实现的。 18. 骨骼肌进行收缩和舒张的基本功能单位是__________ 。当骨骼肌细胞收缩时，暗带长度，明带长度_______ , H带_______ 。 19. 横桥与 ______ 结合是引起肌丝滑行的必要条件。 20. 骨骼肌肌管系统包括 ______ 和________ ，其中 _______ 具有摄取、贮存、释放钙离子 的作用。 21. 有时开放，有时关闭是细胞膜物质转动方式中__________ 的功能特征。 22. ________________ 阈下刺激引扩布。 三、判断题 1. 钠泵的作用是逆电化学梯度将Na*运出细胞，并将K*运入细胞。（） 2. 抑制细胞膜上钠-钾依赖式ATP酶的活性，对可兴奋细胞的静息电位无任何影响。（） 3. 载体介导的易化扩散与通道介导的易化扩散都属被动转运，因而转运速率随细胞内外被转 运物质的电化学梯度的增大而增大。（） 4. 用电刺激可兴奋组织时，一般所用的刺激越强，则引起组织兴奋所需的时间越短，因此当刺激强度无限增大，无论刺激时间多么短，这种刺激都是有效的。（） 5. 只要是阈下刺激就不能引起兴奋细胞的任何变化。（） 6. 有髓神经纤维与无髓神经纤维都是通过局部电流的机制传导动作电位的，因此二者兴奋的传导速度相同。（） 7. 阈下刺激可引起可兴奋细胞生产局部反应，局部反应具有“全或无”的特性。（） 8. 局部反应就是细胞膜上出现的较局限的动作电位。（） 9. 局部去极化电紧张电位可以叠加而增大，一旦达到阈电位水平则产生扩布性兴奋。（） 10. 单一神经纤维动作电位的幅度，在一定范围内随刺激强度的增大而增大。（）
1细胞的基本形态结构与功能 四、细胞连接 2 ：原核细胞与真核细胞、动：细胞核、线粒体、：结构组成与功能、流动镶嵌模型特：主动运输的特点、Na -K 泵。 A. V. 4 ）发表的基本单）发表论文结构的基本单位都是细胞。“细这一名言，即细胞只能来自细胞，而不能从进一步指，即” 5所有细胞都具有基本相同的化学组成和代谢活生物体总的活性可以看成是组成生物体的各相关6 证明了达尔文的生物进化论观点，打击了唯心 奠定了生物科学的基础：细胞学说是生命世界有 机结构多样性的统一，从哲学推断走向自然科学19世纪自然科学的重大发现之一。
7细胞是物质、能量和信息过程结合的综 细胞是生物形态结构、生理功能和生长 8 单细胞生物仅一个细胞，大小与细胞体积 多细胞生物的细胞数量一般与生物体个体 9 直径大小（μm）10 ?细胞形态 小分子 大分子 超分子结构 器官及其他结构 细胞 12 (nucleus)，遗传信息量没有分化出以膜为基础的具有专门结构与功能的细原核细胞所形成的生物称为原核生物，包括所有的
13 三部真核细胞：有细胞核，含有以核酸（DNA或RNA）与：染色质、核：细胞膜、核膜、线粒体、叶绿体、溶酶体、内质网、高：微管、真核细胞构成的生物称为真核生物，包括动物、植14 微米），叶绿体DNA ）：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。蛋白质，秒左右，故把沉降系数10 -叶绿体线粒体 细胞壁细胞膜液泡 细胞质光面内质网 细胞核粗面内质网高尔基体 高尔基体 线粒体 细胞质细胞膜细胞核 粗面内质网光面内质网 中心体纤毛 ?动物细胞与植物细胞的比较 z 细胞壁（cell wall)z 叶绿体（chloroplast)z 大液泡（vacuole) z 胞间连丝（plasmodesmata) 植物细胞特有结构 16 ②半透性或选择性透性，即有选择地允许物质通过扩散、渗透和主动运输等方式出入细胞。③大多质膜上存在激素受体、抗原结合点以及其他有关细胞识别的位点，在激素作用、免疫反应和细胞通讯等过程中起重要作用。 17 z 细胞壁 ①植物细胞膜之外的无生命结构，主要由纤维素组成，都是细胞分泌的产物。②功能：支持和保护，同时还能防止细胞吸涨而破裂，保持细胞正常形态。③初生细胞壁簿而有弹性，能随细胞的生长而延伸。待到细胞长大，在初生细胞壁内侧长出另一层细胞壁，即次生细胞壁，或厚或簿，其硬度与色泽因植物、组织而不同。④相邻细胞细胞壁上有小孔，细胞质通过小孔而彼此相通，这种细胞质的连接称胞间连丝。 组成，厚7-8nm。两膜之间的核周腔宽约10-50nm。很多种细胞的外膜延伸而与糙面内质网相连，外膜上附有许多核糖体颗粒，因此外膜实为围核的内质网部分。
流式细胞仪（Flow Cytometry） 1 流式细胞仪的概念及其发展历史 1．1 流式细胞仪的基本概念流式细胞仪（flow cytonletry，FCM）是对高速直线流动的细胞或生物微粒进行快速定量测定和分析的仪器，主要包括样品的液流技术、细胞的计数和分选技术，计算机对数据的采集和分析技术等。流式细胞仪以流式细胞术为理论基础，是流体力学、激光技术、电子工程学、分子免疫学、细胞荧光化学和计算机等学科知识综合运用的结晶。流式细胞术是一种自动分析和分选细胞或亚细胞的技术。其特点是：测量速度快、被测群体大、可进行多参数测量，即对同一个细胞做有关物理、生物化学特性的多参数测量，且在统计学上有效。 1．2 流式细胞仪的发展简史最早的流式细胞仪雏形诞生于1934年，Moldavan提出使悬浮的单个血红细胞流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置测量的设想。1953年Crosland-Taylor根据牛顿流体在圆形管中流动规律设计了流动室。其后又经过Coulter、Parker & Horst、Kamentsky、Gohde、Fulwyler、Herzenberg等人的不断改进，设计了光电检测设备和细胞分选装置、完成了计算机与流式细胞仪的物理连接及多参数数据的记录和分析、开创了细胞的免疫荧光染色及检测技术、推广流式细胞仪在临床上的应用。近20年来，随着流式细胞仪及其检测技术的日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作，以扩大FCM的应用领域和使用效果。 宋平根的《流式细胞术的原理和应用》是迄今为止对流式细胞仪及其技术阐述的最为详尽和透彻的中文著作。这本书非常详细地介绍了流式细胞术的历史、结构、原理、技术指标等，例举了其在医学和生物工程中的应用，非常适合从事此方面专业研究的人。由于这本书是13年前出版的，所以基本上没有涉及植物流式细胞仪检测技术。此外对于只需要对流式细胞仪有些基本认识的人士来说，这本书太复杂太深奥。谢小梅主要介绍了流式细胞仪在生物工程中的应用。杨蕊概括了流式细胞仪的工作原理，简单提及了流式细胞仪的应用。本文在分析这三篇论著或文章的优缺点后，用比较通俗的语言介绍了掌握流式细胞仪检测技术必须了解的一些原理，并对目前市场上的主流型号进行了客观的性能概括。 2 流式细胞仪的工作原理和技术指标 2．1 流式细胞仪工作原理除电源外，流式细胞仪主要由四部分组成：流动室和液流系统：激光源和光学系统；光电管和检测系统；计算机和分析系统，其中流动室是仪器的核心部件。这四大部件共同完成了信号的产生、转换和传输的任务。 流动室和液流系统
第一章细胞的基本功能 【习题】 一、名词解释 1.易化扩散 2.阈强度 3.阈电位 4.局部反应 二、填空题 1.物质跨越细胞膜被动转运的主要方式有_______和_______。 2.一些无机盐离子在细胞膜上_______的帮助下，顺电化学梯度进行跨膜转动。 3.单纯扩散时，随浓度差增加，扩散速度_______。 4.通过单纯扩散方式进行转动的物质可溶于_______。 5.影响离子通过细胞膜进行被动转运的因素有_______，_______和_______。 6.协同转运的特点是伴随_______的转运而转运其他物质，两者共同用同一个_______。 7.易化扩散必须依靠一个中间物即_______的帮助，它与主动转运的不同在于它只能浓度梯度扩散。 8.蛋白质、脂肪等大分子物质进出细胞的转动方式是_______和_______。 9.O2和CO2通过红细胞膜的方式是_______；神经末梢释放递质的过程属于。 10.正常状态下细胞内K＋浓度_______细胞外，细胞外Na＋浓度_______细胞内。 11.刺激作用可兴奋细胞，如神经纤维，使之细胞膜去极化达_______水平，继而出现细胞膜上_______的爆发性开放，形成动作电位的_______。 12.人为减少可兴奋细胞外液中_______的浓度，将导致动作电位上升幅度减少。 13.可兴奋细胞安静时细胞膜对_______的通透性较大，此时细胞膜上相关的_______处于开放状态。 14.单一细胞上动作电位的特点表现为_______和_______。 15.衡量组织兴奋性常用的指标是阈值，阈值越高则表示兴奋性_______。 16.细胞膜上的钠离子通道蛋白具有三种功能状态，即_______，_______和_______。 17.神经纤维上动作电位扩布的机制是通过_______实现的。 18.骨骼肌进行收缩和舒张的基本功能单位是_______。当骨骼肌细胞收缩时，暗带长度，明带长度_______，H带_______。 19.横桥与_______结合是引起肌丝滑行的必要条件。 20.骨骼肌肌管系统包括_______和_______，其中_______具有摄取、贮存、释放钙离子 的作用。 21.有时开放，有时关闭是细胞膜物质转动方式中_______的功能特征。 22.阈下刺激引_______扩布。 三、判断题 1.钠泵的作用是逆电化学梯度将Na＋运出细胞，并将K＋运入细胞。 ( ) 2.抑制细胞膜上钠-钾依赖式ATP酶的活性，对可兴奋细胞的静息电位无任何影响。 ( ) 3.载体介导的易化扩散与通道介导的易化扩散都属被动转运，因而转运速率随细胞内外被转运物质的电化学梯度的增大而增大。 ( ) 4.用电刺激可兴奋组织时，一般所用的刺激越强，则引起组织兴奋所需的时间越短，因此当刺激强度无限增大，无论刺激时间多么短，这种刺激都是有效的。 ( ) 5.只要是阈下刺激就不能引起兴奋细胞的任何变化。 ( ) 6.有髓神经纤维与无髓神经纤维都是通过局部电流的机制传导动作电位的，因此二者兴奋的传导速度相同。 ( ) 7.阈下刺激可引起可兴奋细胞生产局部反应，局部反应具有“全或无”的特性。 ( ) 8.局部反应就是细胞膜上出现的较局限的动作电位。 ( ) 9.局部去极化电紧张电位可以叠加而增大，一旦达到阈电位水平则产生扩布性兴奋。( ) 10.单一神经纤维动作电位的幅度，在一定范围内随刺激强度的增大而增大。 ( ) 11.骨骼肌的收缩过程需要消耗ATP，而舒张过程是一种弹性复原，无需消耗ATP。 ( ) 12.在骨骼肌兴奋收缩过程中，横桥与Ca2＋结合，牵动细肌丝向M线滑行。 ( ) 13.肌肉不完全强直收缩的特点是，每次新收缩的收缩期都出现在前一次收缩的舒张过程中。( )