常用染料介绍
（一）天然染料
1、苏木精
苏木精是从南美的苏木（热带豆科植物）干枝中用乙醚浸制出来的一种色素，是最常用的染料之一。苏木精不能直接染色，必须暴露在通气的地方，使他变成氧化苏木精（又叫苏木素）后才能使用，这叫做“成熟”。苏木精的“成熟”过程需时较长，配置后时间愈久，染色力愈强。被染材料必须经金属盐作媒剂作用后才有着色力。所以在配制苏木精染剂时都要用媒染剂。常用的媒染剂有硫酸铝按、钾明矾和铁明矾等。
苏木精是淡黄色到锈紫色的结晶体，易溶于酒精，微溶于水和甘油，是染细胞核的优良材料，他能把细胞中不同的结构分化出各种不同的颜色。分化时组织所染的颜色因处理的情况而异，用酸性溶液（如盐酸—酒精）分化后呈红色，水洗后仍恢复青蓝色，用碱性溶液（如氨水）分化后呈蓝色，水洗后呈蓝黑色。
2、洋红
洋红又叫胭脂红或卡红。一种热带产的雌性胭脂虫干燥后，磨成粉末，提取出虫红，再用明矾处理，除去其中杂质，就制成洋红。单纯的洋红不能染色，要经酸性或碱性溶液溶解后才能染色。常用的酸性溶液有冰醋酸或苦味酸，碱性溶液有氨水、硼砂等。
洋红使细胞核的优良染料，染色的标本不易褪色。用作切片或组织块染都适宜，尤其适宜于小型材料的整体染色。用洋红配成的溶液染色后能保持几年。洋红溶液出现浑浊时要过滤后再用。
（二）人工染料
人工染料，即苯胺染料或煤焦油染料，种类很多，应用极广。它们的缺点是经日光照射容易褪色，苯胺蓝、亮绿、甲基绿等更易褪色。在制片中注意掌握酸碱度，并避免日光直射，也能经几年不褪色。
1、酸性品红
酸性品红是酸性染料，呈红色粉末状，能容于水，略溶于酒精（0.3%）。他是良好的细胞制染色剂，在动物制片上应用很广，在植物制片上用来染皮层、髓部等薄壁细胞和纤维素壁。他跟甲基绿同染，能显示线粒体。
组织切片在染色前先浸在带酸性的水中，可增强它的染色力。酸性品红容易跟碱起作用，所以染色过度，易在自来水中褪色。
2、刚果红
刚果红是酸性染料，呈枣红色粉末状，能溶于水喝酒精，遇酸呈蓝色。他能作染料，也用作指示剂。他在植物制片中常作为苏木精或其他细胞染料的衬垫剂。他用来染细胞质时，能把胶制或纤维素染成红色。在动物组织制片中用来染神经轴、弹性纤维、胚胎材料等。刚果红可以跟苏木静作二重染色，也可用作类淀粉染色，由于他能溶于水和酒精，所以洗涤和脱水处理要迅速。
3、甲基蓝
甲基蓝是弱酸性染料，能溶于水和酒精。甲基蓝在动植物的制片技术方面应用极广。他跟伊红合用能染神经细胞，也是细菌制片中不可缺少的染料。它的水溶液是原生动物的活体染色剂。甲基蓝极易氧化，因此用他染色后不能长久保存。
4、固绿
固绿是酸性染料，能溶于水（溶解度为4%）和酒精（溶解度为9%）。固绿是一种染含有浆质的纤维素细胞组织的染色剂，在染细胞和植物组织上应用极广。他和苏木精、番红并列为植物组织学上三中最常用的染料。
5、苏丹Ⅲ
苏丹Ⅲ是弱酸性染料，呈红色粉末状，易溶于脂肪和酒精（溶解度为0.15%）。苏丹Ⅲ是脂肪染色剂。
6、伊红
这类染料种类很多。常用的伊红Y，是酸性染料，呈红色带蓝的小结晶或棕色粉末状，溶于水（15摄氏度是溶解度达44%）和酒精（溶于无水酒精的溶解度为2%）。伊红在动物制片中广泛应用，是很好的细胞质染料，常用作苏木精的衬染剂。
7、碱性品（复）红
碱性品红是碱性染料，呈暗红色粉末或结晶状，能溶于水（溶解度1%）和酒精（溶解度8%）。碱性品红在生物学制片中用途很广，可用来染色胶原纤维、弹性纤维、嗜复红性颗粒和中枢神经组织的核质。在生物学制片中用来染维管束植物的木质化壁，又作为原球藻、轮藻的整体染色。在细菌学制片中，长用来鉴别结核杆菌。在尔根氏反应中用作组织化学试剂，已核查脱氧核糖核酸。
8、结晶紫
结晶紫是碱性染料，能溶于水（溶解度9%）和酒精（溶解度8.75%）。结晶紫在细胞学、组织学和细菌学等方面应用极广，是一种优良的染色剂。他是细胞核染色常用的，用来显示染色体的中心体，并可染淀粉、纤维蛋白、神经胶质等。凡是用番红和苏木精或其他染料染细胞核不能成功时，用它能得到良好的结果。用番红和结晶紫作染色体的二重染色，染色体染成红色，纺锤丝染成紫色，所以也是一种显示细胞分裂的优良染色剂。用结晶紫染纤毛，效果也很好。用结晶紫染色的切片，缺点是不易长久保存。
9、龙胆紫
龙胆紫是混合的碱性染料，主要是结晶紫和甲基紫的混合物。在必要是，龙胆紫能跟结晶紫互相替用。医药上用的紫药水，主要成分是甲基紫，需要时能代替龙胆紫和结晶紫。
10、中性红
中性红是弱碱性染料，呈红色粉末状，能溶于水（溶解度4%）和酒精（溶解度1.8%）。它的碱性溶液中呈现黄色，在强碱性溶液中呈蓝色，而在弱酸性溶液中呈红色，所以能用作指示剂。中性红无毒，常做活体染色的染料，用来染原生动物和显示动植物组织中活细胞的内含物等。陈久的中性红水溶液，用作显示尼尔体的常用染料。
11、番红
番红是碱性染料，能溶于水和酒精。番红是细胞学和动植物组织学生常用的染料，能染细胞核、染色体和植物蛋白质，示维管束植物木质化、木栓化和角质化的组织，还能染孢子囊。
12、亚甲蓝或美蓝
亚甲蓝或美蓝是碱性染料，呈蓝色粉末状，能溶于水（溶解度9.5%）和酒精（溶解度6%）。亚甲蓝是动物学和细胞学染色上十分重要的细胞核染料，其优点是染色不会过深。
13、甲基绿
甲基绿是碱性染料。它是绿色粉末状，能溶于水（溶解度8%）和酒精（溶解度3%）。甲基绿是最有价值的细胞和染色剂，细胞学上常用来染染色质，跟酸性品红一起可作植物木质部的染色。
1. 碘－硫酸法
植物细胞细胞壁的主要成分是纤维素，纤维素被硫酸水解后，遇碘呈蓝色反应。因此用碘－硫酸法可鉴定细胞壁的成分。
试剂配制方法：
1% 碘液将1.5 克碘化钾溶于100 毫升的蒸馏水中，待完全溶解后，加入1 克碘，震荡溶解。
66.5% 硫酸7 份浓硫酸加入3 份蒸馏水配制而成。配制时要将浓硫酸慢慢地加入水中，并不断地用玻璃棒搅拌，否则会因急剧发热，而使容器炸裂。
2. 苏丹Ⅲ反应
苏丹Ⅲ可将细胞中脂肪、栓质、角质染为桔红色，因此可用此染料显示出上述物质在细胞中的分布和位置。
配制方法：将苏丹Ⅲ（或苏丹Ⅳ）染料0.1 克，溶于10 毫升95% 酒精中，然后加入10 毫升甘油。
3. 间苯三酚反应法
间苯三酚反应是植物显微化学中确定木质化细胞壁的最常用和最简单的方法。这一反应的原理是当间苯三酚在酸性环境下与细胞壁中的木质素相遇时，发生樱桃红色或紫红色反应。其方法是将要鉴定的切片先用一滴1mol/L 盐酸浸透（间苯三酚要在酸性环境下才能与木质素起作用），然后滴一滴5-10% 间苯三酚的85% 酒精溶液，木质化的细胞壁即发生颜色反应。4．碘液测试淀粉法
淀粉遇碘呈蓝色反应，它是鉴定淀粉的最常用方法。
碘液配制方法：将2 克碘化钾放入5 毫升蒸馏水中，加热使其完全溶解；然后加入1克碘，完全溶解后用蒸馏水稀释至300 毫升，放入具有毛玻璃塞的棕色玻璃瓶中，置于暗处保存。测定淀粉时，可将上述溶液稀释2-10 倍，使染色不致过深，效果更好。
5. 压片法常用的染料
(1) 醋酸洋红为压片法中最常用的染料。
配制方法是：先将100 毫升45% 醋酸水溶液放于烧瓶中煮沸，移去火焰，停止加热。然后缓慢加入1 克洋红粉末，全部加入后再煮沸1-2 分钟。此时可将一枚生锈铁钉用棉线悬入溶液中约1 分钟后取出（铁为媒染剂）。静置12 小时后经过过滤，放入磨口玻璃塞棕色瓶中保存备用。
(2) 石炭酸---品红为近年创用的一种优良核染色剂，将细胞核和染色体染为红紫色，细胞质一般不着色，背景清晰。
其配制方法有二：
配方Ⅰ：
原液A：取3 克碱性品红溶于100 毫升的70％酒精中（此液体可长期保存）。
原液B：取10 毫升原液A，加入90 毫升5% 的石炭酸(酚)水溶液中(可保存两周)。
染色液：取55 毫升原液B 加6 毫升冰醋酸和6 毫升37% 甲醛。
此染色液因含有较多的甲醛，可使原生质体硬化，而能保持其固有的形态。但也因此不易使组织软化，因而不太适用于植物组织的染色体压片染色（本染色液适于植物原生质体培养中使用）。在此基础上加以改进的配方Ⅱ，则可普遍地用于一般植物组织的染色体压片的染色。配方Ⅱ：
取配方Ⅰ中的染色液20 毫或加80 毫升45% 醋酸和1.8 克山梨醇。
染色液配制后为淡品红色，如立即使用染色较浅。放置 2 周后，染色能力显著增强，而且放置时间越久，染色效果越好。
6．铬酸－硝酸离析法
为了观察一个细胞完整的立体形态结构，可以用一些化学药品把细壁中的中层物质（果胶质）溶解，使细胞分离散开，便于观察。
离析前先把材料洗净，用刀切成1-2 毫米宽的狭条（如叶片）或切成火柴棍粗细的长约1 厘米的小条(如根或茎)。然后把切好的材料放进小玻璃瓶中，加入离析液（加入量约为材料的20 倍），塞紧瓶塞，放于30-40℃温箱中。浸渍时间因材料性质而异，叶片和幼嫩的根茎组织3-4 小时即可，而有些次生结构（如木质部）则需要更长的时间。离析情况应随时检
查，检查的方法是取少许离析材料，放在载玻片上，加一滴水，盖上盖玻片，然后用解剖针尖端轻轻敲打，如果材料分离则表明浸渍时间已够。浸渍时间超过一天以上时，应更换离析液一次。离析时间已够的材料，用水洗净后放入70% 酒精中保存。
离析液配方：
10% 铬酸1份
10%硝酸1 份
两种溶液应在使用时才混合，混合均匀后再使用。
二、常用染色液的配制
1、吕氏(Loeffer )碱性美蓝染液
A液：
B液：
分别配制A液和B液，配好后混合即可。
2、齐氏（Ziehl）石炭酸复红染色液
A液：
B液：
配制方法：将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%乙醇，继续研磨使其溶解，配成A液。
将石炭酸溶于水中，配成B液。
混合A液及B液即成。通常可将此混合液稀释5~10倍使用，稀释液易变质失效，一次不宜多配。
3、革兰氏（Gram）染色液
（1）．草酸铵结晶紫染液
A液：
B液：
混合A液及B液，静置48h后使用。
（2）．卢戈氏（Lugol
配制方法：先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘全溶后，加足水分既成。
（3）．95%的乙醇溶液
（4）．番红复染液
取上述配好的番红乙醇溶液10mL与80mL蒸馏水混匀既成。
4、芽孢染色液（1）．
（2）．番红水溶液
（3）．苯酚品红溶液
配制方法：取上述溶液10mL与100mL5%的苯酚溶液混合，过滤备用。
（4）．黑色素（
配制方法：称取10g黑色素溶于100mL蒸馏水中，置沸水浴中30min后，滤纸过滤两次，补充水到100mL，加0.5g甲醛，备用。
5、荚膜染色液
（1）．黑色素水溶液
配制方法：将黑色素在蒸馏水中煮沸5min，然后加入福尔马林作防腐剂。
（2）．番红染液
与革兰氏染液中番红复染液相同。
6、鞭毛染色液
（1）．硝酸银鞭毛染色液
A液：
冰箱内可以保存3~7天，延长保存期会产生沉淀，但用滤纸除去沉淀后，仍能使用。
B液：
配制方法：待AgNO3溶解后，取出10mL备用，向其余的90mL AgNO3中滴入NH4OH，使之成为很浓厚的悬浮液，再继续滴加NH4OH，直到新形成的沉淀又重新刚刚溶解为止。再将备用的10mL AgNO3慢慢地滴入，则出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状沉淀又消失，再滴入AgNO3，直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止。冰箱内保存通常10天内仍可使用。如雾重，则银盐沉淀出，不宜使用。
（2）．Leifson氏鞭毛染色液
A液：
B液：
C液：
临用前将A，B，C液等量混合均匀后使用。三种溶液分别于室温保存可保存几周，若分别置冰箱保存，可保存数月。混合液装密封瓶内置冰箱几周仍可使用。
（六）染色剂
1、细菌染色剂
配方一齐氏（Ziehl）石炭酸品红染液
甲液取石炭酸5克，溶解在95毫升蒸馏水中。
乙液取0.3克碱性品红，放入研钵中研磨，逐渐加入10 毫升95%酒精，继续淹没，使它溶解。
将甲液和乙液混合后，摇匀，过滤，装瓶，备用。
配方二罗氏（Loeffler’s）美蓝染液
甲液取5克美蓝，溶于100 毫升95%酒精中，制成美蓝—酒精饱和液。
乙液取氢氧化钾0.01 克（或1%氢氧化钾溶液1 毫升），溶液也可用于放线菌染色，0.1%浓度可用于酵母菌染
色。
配方三革兰氏（Gram’s）染液
用此液染色因先用甲液染色，再加乙液固定，用丙液处理，最后用丁液复染。四种液体的配方如下：
甲液（结晶紫液）
（1）结晶紫2克95%酒精20 毫升
（2）草酸铵0.8 克蒸馏水80毫升
使用钱江（1）、（2）液相混，静置48 小时后使用。
乙液(碘液)
碘1克碘化钾2克蒸馏水300 毫升
将碘化钾溶于少量蒸馏水中，然后加入碘，待碘全部溶解后，加水稀释至300 毫升。
丙液95%酒精溶液
丁液（番红花红液）
2.5%番红花红酒精溶液10毫升蒸馏水100毫升
2、细菌特殊染色剂
配方一芽孢染液用此配方染色是用甲液染色后，用乙液复染。
甲液取5克孔雀绿，加入少量蒸馏水，使它溶解后，用蒸馏水稀释到100毫升，即成孔雀绿染液。
乙液取番红花红0.5克，加入少量蒸馏水，使它溶解后，用蒸馏水稀释到100 毫升，集成番红花红复染液。
配方二荚膜染液此配方先用甲液染色，后用乙液复染。
甲液取结晶紫0.1 克，溶于少量蒸馏水后，加水稀释到100 毫升，再加入0.25 毫升冰醋酸一结晶紫染液。
乙液取硫酸铜（）31.3 克，溶于少量蒸馏水后，加水稀释到100毫升，即成20%硫酸铜脱色剂。
配方三鞭毛染液
甲液
饱和明矾溶液2 毫升5%石炭酸溶液5 毫升
20%丹宁酸溶液2毫升
乙液
碱性品红11 克95%酒精100毫升
使用前取甲液9 毫升和乙液1毫升相混，过滤即可。
3、植物细胞壁染色剂
配方一纤维素细胞壁染液（Ⅰ）
取固绿0.1 克，溶于100 毫升95%酒精中，即成0.1%固绿—酒精溶液。
该液能染色纤维素细胞壁，还用于动植物中作浆质染色剂。
配方二纤维素细胞壁染液（Ⅱ）
氯化锌20 克碘化钾 6.5 克
碘1.5 克蒸馏水加至100 毫升
先把氯化锌溶于少量蒸馏水中，再加入6.5克碘化钾，在碘完全溶解后，用蒸馏水稀释到100毫升，即成碘—
氯化锌溶液。
该染液能把细胞壁染成紫色，胞质染成淡黄色，胞核染成棕色。
配方一纤维素细胞壁染液（Ⅲ）
甲液取1克碘和1.5克碘化钾，溶于100毫升蒸馏水中，即成1%碘液。
乙液取7份硫酸和3份蒸馏水相混，即成66.5%硫酸溶液。
染色时，在材料上滴加甲液，再加一滴乙液，纤维素细胞壁就染成黄色。
配方四木质化细胞壁染液（Ⅰ）
硫酸化苯胺（或盐酸话本安）1份
蒸馏水70 份95%酒精30份
硫酸30 份
将上述各组分相混，将细胞材料放入混合液里染色，可是木质化细胞壁呈鲜黄或姜黄色。配方五木质化细胞壁染液（Ⅱ）
取间苯三酚4～5克，溶于100毫升95%酒精中，即成间苯三酚—酒精液。
先在材料上滴上1 滴浓盐酸，然后滴上间苯三酚—酒精液1 滴，木质化的细胞壁就染上樱红或紫红色。
配方六木质化细胞壁染液（Ⅲ）
取1 克番红，溶于99毫升蒸馏水中，即成1%番红溶液。
4、细胞质染色剂
配方一伊红染液
伊红染液一般配用水溶液和酒精溶液两种。
（1）取1 克伊红，溶于99毫升蒸馏水中，即成1%伊红水溶液（市售红墨水内含伊红成分，可以用红墨水稀
释液来代替本溶液）。
（2）取1 克伊红，溶于99 毫升70%酒精中，即成1%伊红—酒精溶液。
配方二甲基蓝染液
取1克甲基蓝，溶于29 毫升70%酒精中，加入70 毫升蒸馏水，即成1%甲基蓝染液。
配方三亮绿染液
取0.5 克亮绿，溶解在100 毫升蒸馏水中，即成0.5%亮绿溶液。
5、细胞核染色剂
配方一甲基绿染液
取1克甲基绿，溶于99 毫升蒸馏水中，加入1毫升冰醋酸。本染液能染细胞核，还用来染木质化细胞壁。
配方二龙胆紫染液
取1 克龙胆紫，溶于少量2%醋酸溶液中，加2%醋酸溶液，直到溶液不呈深紫色止。
配方三美蓝（亚甲基蓝）染液
取0.5 克美蓝，溶于30毫升95%酒精中，加100 毫升0.01%氢氧化钾溶液，保存在棕色瓶内。
此溶液能染细胞核，还用来染细菌、血和神经组织等。
配方四硼砂—洋红染液
取4克硼砂，溶于96毫升蒸馏水中。再加入2 克洋红，加热溶解后煮沸30分钟，静置3 日，用100 毫升70%
酒精冲淡，放置24 小时后过滤。
此染液能染细胞核，还用来染糊粉粒和一般动物、植物的整体染色，如水螅、血吸虫等整体标本。
配方五德氏（Delafield’s）苏木精染液
甲液取1 苏木精，溶于6 毫升无水酒精中，即成苏木精—酒精溶液。
乙液取10克铵矾溶于90 毫升蒸馏水中，即成10%铵矾水溶液。
取甲液逐滴加入到乙液中，用纸遮盖，放在阳光明亮处，使它充分氧化。3～4 天后将溶液过滤，在滤液中加
入25 毫升甘油和25毫升甲醇，保存在密闭玻璃瓶内。静置1～2 个月，待该液颜色变深时过滤，可长久保存。
本染液是染色体的优良染色剂，除能染细胞核外，还用来染纤维素、细胞壁和动植物组织。配方六席夫（Schiff’s）试剂
称取0.5 克碱性品红，加到100毫升煮沸的蒸馏水中，再微微加热5 分钟，不断搅拌，使它溶解。在溶液冷却
到50 摄氏度时过滤，滤液中加入10毫升1N 盐酸。再冷却到25 摄氏度时加入0.5 克偏重亚硫酸钠（）或无
水亚硫酸氢钠（）。把溶液装入棕色试剂瓶内，摇荡后，塞紧瓶塞，放在黑暗中24 小时。在溶液颜色退到淡
黄色时，加入0.5 克活性炭，用力摇荡1 分钟，过滤后把滤液贮在棕色试剂瓶内，塞紧瓶塞，滤液应该是无色
的。在使用时勿让溶液长时间暴露在空气中和见光（瓶外用黑纸或暗盒遮光）。如溶液变成红色，即失去染色
能力。
碱性品红是较强的核染色剂，在孚尔根氏（Feulgen’s）反应中作为组织化学试剂，以检查DNA。
6、染色体染色剂
配方一醋酸—洋红染液
取45 毫升冰醋酸，加蒸馏水55 毫升，煮沸后徐徐加入洋红1 克，搅拌均匀后加入1 颗铁锈钉，煮沸10分钟，
冷却后过滤，贮存在棕色瓶内。
配方二醋酸—地衣红染液
取45 毫升醋酸，跟55 毫升蒸馏水相混，加热，徐徐加入地衣红粉末1～2克，搅拌溶解后，缓缓煮沸2小时。
冷却后过滤，贮存在棕色瓶里。
配方三龙胆紫染液
取1 克龙胆紫，用少量蒸馏水溶解后，加蒸馏水，稀释到100 毫升，保存在棕色瓶内。
配方四甲苯胺蓝染液
取0.5 克甲苯胺蓝，溶解在100毫升蒸馏水中，即成0.5%甲苯胺蓝水溶液。
7、线粒体染色剂
配方一詹钠斯绿B(Janu’s green 酒精饱和溶液
取125 毫升詹钠斯绿B，加入到62.5 毫升无水酒精中，搅拌，即成烟鲁绿B酒精饱和染液。（1）取詹钠斯绿酒精饱和染液按1：30000 比例加蒸馏水稀释，用来染原生动物线粒体。
(2)取詹钠斯绿酒精饱和液，按1：10000 比例加蒸馏水稀释，用来染新鲜蛙血线粒体。
配方二詹钠斯绿B中性红染液
先配制詹钠斯绿B和中性红酒精饱和液。詹钠斯绿酒精饱和液见配方一。中性红酒精饱和液配制方法：取125
毫升中性红，加入到50 毫升无水酒精中，搅拌。
在10 毫升生理盐水（两栖类生理盐水浓度为0.65%；哺乳类生理盐水浓度为0.9%）中，加入詹钠斯绿B酒精
饱和液0.7～1 毫升，中性红酒精饱和液2 毫升，混合。
詹钠斯绿B稀释液是活体染液。
8、脂肪染色剂
苏丹Ⅲ染液
取0.1 克苏丹Ⅲ，溶于20 毫升95%酒精中，即成0.5%苏丹Ⅲ染液。
这染液能染脂肪，还能染木栓、角质层。
9、血液染色剂
配方一瑞氏（Wright’s）染液
取瑞氏染料粉末0.1 克和甲醇60 毫升。把染料放在研钵内，加少量甲醇研磨，使染料溶解，然后把溶解的染
料倒入干净的棕色玻璃瓶。并用完甲醇为止。配制好的染液在室温中保存，即可使用。新鲜配制的染液偏碱性，
放置后呈酸性，染液贮存愈久染色愈好。这染液的适宜pH 值是6.4～6.8。因此，染色时加入缓冲液，可维持
一定的酸碱度，使染色效果更好。
这种染液除能染血液，还能染疟原虫。
瑞氏染料可以自制。在100 毫升0.5%碳酸氢钠水溶液里加入1 克美蓝，溶解后放在锅内，蒸上1 小时，取出
冷却后过滤。在滤液里加入0.1%伊红水溶液500 毫升，随加、随搅拌，使混合液呈紫色。静置一夜后，用滤
纸过滤。滤纸上的沉淀物，在室内风干或放在干燥箱内，充分干燥后研磨成粉末，即成瑞氏染料。
配方二甲基紫染液
取甲基紫0.5克，加到100 毫升生理盐水中，溶解后加入冰醋酸0.02 毫升。
10、吸虫染色剂
梅耶氏（Mayer’s ）明矾—洋红染液
取铵明矾（硫酸铝铵）5 克，溶于95毫升蒸馏水中，再加入0.5 克洋红酸，加热溶解，冷却后过滤。在滤液中
加入少量防腐剂，如麝香草酚、樟脑粉、水杨酸钠、苯酚（石炭酸）等，以防生霉。
这种染液适合于染小型动物材料，如吸虫等寄生虫的整体，也能染高等植物的表皮和蕨类植物的原叶体。
11、活体染色剂
配方一中性红染液
先配成1%中性红水溶液（1 克中性红溶于100 毫升蒸馏水中）。取这种溶液1 毫升，用0.6%生理盐水（或蒸
馏水）稀释到50 毫升，即成0.02%中性红水溶液，贮存在棕色瓶里，放在黑暗处。
本染液用来显示原生动物的食物泡以及动植物组织中活细胞的内含物等。
配方二尼罗蓝（Nile Blue）染液
取0.1 克尼罗蓝，溶解于1000～1500 毫升蒸馏水中，即成尼罗蓝染液。
这种染液能把原生动物大核染成绿色，食物泡染成蓝色。
配方三亚甲蓝染液
取0.1 克亚甲蓝，溶解于1000毫升蒸馏水中，即成亚甲蓝染液。
这种染液用于原生动物的活体染色。
12、透明骨骼标本染色剂
配方一茜素红染液（Ⅰ）
取冰醋酸5毫升、甘油5毫升、1%水合氯醛60毫升混合。在这种混合液中方入少量茜素红，制成茜素红饱和
溶液。
配方二茜素红溶液（Ⅱ）
取1克茜素红，溶于100毫升95%酒精中，搅拌，然后跟900 毫升1%氢氧化钾溶液相混，即成深紫色的茜素
红染液。
1．黑色素液水溶性黑素10g，蒸馏水100mL, 甲醛（福尔马林）0.5mL。可用作荚膜的背景染色。
2．墨汁染色液国产绘图墨汁40mL，甘油2mL，液体石炭酸2mL。先将墨汁用多层纱布过滤，加甘油混匀后，水浴加热，再加石炭酸搅匀，冷却后备用。用作荚膜的背景染色。3．吕氏(Loeffier)美蓝染色液
A 液：美蓝(methylene blue, 又名甲烯蓝)0.3g, 95%乙醇30mL;
B 液：0.0l% KOH l00mL。
混合A 液和B 液即成，用于细菌单染色，可长期保存。根据需要可配制成稀释美蓝液，按1：10 或1：100 稀释均可。
4．革兰氏染色液
(1)结晶紫(crystal violet)液：结晶紫乙醇饱和液(结晶紫2g 溶于20mL95%乙醇中)20mL，1%草酸铵水溶液80mL 将两液混匀置24h 后过滤即成。此液不易保存，如有沉淀出现，需重新配制。
(2)卢戈(Lugol)氏碘液：碘1g，碘化钾2g，蒸馏水300mL。先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，
然后加入碘使之完全溶解，再加蒸馏水至300mL 即成。配成后贮于棕色瓶内备用，如变为浅黄色即不能使用。
(3)95%乙醇：用于脱色，脱色后可选用以下(4)或(5)的其中一项复染即可。
(4)稀释石炭酸复红溶液：碱性复红乙醇饱和液(碱性复红1g, 95%乙醇l0mL, 5%石炭酸90mL 混合溶解即成碱性复红乙醇饱和液)，取石炭酸复红饱和液l0mL 加蒸馏水90mL 即成。(5)番红溶液：番红O(safranine，又称沙黄O)2.5g, 95%乙醇100mL，溶解后可贮存于密闭的棕色瓶中，用时取20mL 与80mL 蒸馏水混匀即可。
以上染液配合使用，可区分出革兰氏染色阳性(G+)或阴性(G-)细菌，G-被染成蓝紫色，G+被染成淡红色
5. 鞭毛染色液
A液：丹宁酸5.0g, FeCl3 1.5g，15%甲醛(福尔马林)2.0mL，l%NaOH 1.0mL，蒸馏水l00mL;
B 液：AgNO3 2.0g, 蒸馏水100mL。
待AgNO3 溶解后，取出l0mL 备用，向其余的90mLAgNO3 中滴加NH4OH，即可形成很厚的沉淀，继续滴加NH4OH 至沉淀刚刚溶解成为澄清溶液为止，再将备用的AgNO3 慢慢滴入，则溶液出现薄雾，但轻轻摇动后，薄雾状的沉淀又消失，继续滴入AgNO3，直到摇动后仍呈现轻微而稳定的薄雾状沉淀为止，如雾重，说明银盐沉淀出，不宜再用。通常在配制当天便用，次日效果欠佳，第3 天则不能使用。
6. 0.5%沙黄(Safranine)液：2.5%沙黄乙醇液20mL，蒸馏水80mL。将2.5%沙黄乙醇液作为母液保存于不透气的棕色瓶中，使用时再稀释。
7. 5%孔雀绿水溶液：孔雀绿5.0g，蒸馏水100mL。
8. 0.05%碱性复红：碱性复红0.05g，95%乙醇100mL。
9．齐氏(Ziehl)石炭酸复红液：碱性复红0.3g 溶于95%乙醇l0mL 中为A 液：0.01%KOH 溶液l00mL 为B 液。混合A、B 液即成。
10．姬姆萨(Giemsa)染液
(1)贮存液：称取姬姆萨粉0.5g，甘油33mL，甲醇33mL。先将姬姆萨粉研细，再逐滴加入甘油，继续研磨，最后加入甲醇，在56℃放置1～24h 后即可使用。
(2)应用液(临用时配制)：取1mL 贮存液加19mL pH7.4 磷酸缓冲液即成。亦可取贮存液：甲醇=1：4 的比例配制成染色液。
11．乳酸石炭酸棉蓝染色液(用于真菌固定和染色) 石炭酸(结晶酚)20g，乳酸20mL，甘油40mL，棉蓝0.05g，蒸馏水20mL。将棉蓝溶于蒸馏水中，再加入其他成分，微加热使其溶解，冷却后用。滴少量染液于真菌涂片上，加上盖玻片即可观察。霉菌菌丝和孢子均可染成蓝色。染色后的标本可用树脂封固，能长期保存。
12. 1%瑞氏(Wright’s)染色液：称取瑞氏染色粉6g，放研钵内磨细，不断滴加甲醇(共600mL)并继续研磨使溶解。经过滤后染液须贮存一年以上才可使用，保存时间愈入，则染色色泽愈佳。
13．阿氏(Albert) 异染粒染色液：
A 液：甲苯胺蓝(toluidine blue)0.15g，孔雀绿0.2g，冰醋酸lmL，95%乙醇2mL，蒸馏水100mL;
B 液：碘2g, 碘化钾3g，蒸馏水300ml。
先用A 液染色1min，倾去A 液后，用B 液冲去A 液，并染1min。异染粒呈黑色，其他部分为暗绿或浅绿。
染料
1％溴酚蓝（bromophenol blue）
加1g 水溶性钠型溴酚蓝于100ml 水中，搅拌或涡旋混合直到完全溶解。
1％二甲苯青FF（xylene cyanole FF）
溶解1g 二甲苯青FF于足量水中，定容到100ml。
10mg/ml 的溴化乙锭（ethidium bromide）
小心称取1g溴化乙锭，转移到广口瓶中，加100ml 水，用磁力搅拌器搅拌直到完全溶解。用铝箔包裹装
液管，于4℃贮存。
0.3％台盼兰染液
称取台盼兰(Trypan blue)粉0.3克，溶于100ml 生理盐水中，加热使之完全溶解，用滤纸过滤除渣，
装入瓶内室温保存。
0.5％酚红指示剂
酚红0.5g
0.1N(0.4％)NaOH 15ml
双蒸水85ml
将0.5 克酚红置研钵中，缓漫滴加0.1NNaOH 溶液边加边磨，并不断吸出已溶解的酚红液，直至全部
溶解，然后加入85ml 双蒸水，颜色为深红，经粗滤纸过滤后使用，室温保存。
0.2％次甲基兰染液
称次甲基兰(Methylene blue)0.2克，加蒸馏水100ml，室温保存。
0.5％醋酸洋红(Aceio Carmine)染液
洋红lg
醋酸90ml
蒸馏水110ml
将90ml 醋酸加入110ml 蒸馏水煮沸，然后将火焰移去，立即加入1 克洋红，使之迅速冷却过滤，加
饱和氢氧化铁(媒染剂)水溶液数滴，直到呈葡萄酒色。室温保存。加铁使洋红沉淀于组织而着色。此染液
室温存放时间越长效果越好，室温保存。
1％甲苯胺兰(Toluidine blue)
称取甲苯胺兰1克，加蒸馏水lOOml。
1/3000中性红染液
取中性红(Neutral red)0.1克，加蒸馏水300ml。室温保存。
埃利希(Ehrlich)苏木精染液
苏木精1.0g
乙醇50ml
醋酸5ml
甘油50ml
硫酸铝钾5g
蒸馏水50ml
将苏木精溶于少量的乙醇中，再加醋酸并搅拌，以加速其溶解。当苏木精溶解后将甘油加入并摇动容器，
同时加入其余的乙醇；硫酸铝钾需研磨并加热，然后溶解于蒸馏水中，将其一滴滴地加入上边的溶液，并不断摇动，此液配好后，将瓶口用纱布盖好，置通风处，经常摇动以加速其成熟，成熟约需4周左右，成熟的染液为深红色。
（三）0.2％考马斯亮兰R-250染液
甲醇46.5ml
醋酸7.0ml
考马斯亮兰0.2g
蒸馏水加至100ml
(四)A．0.1％碱性固绿染液(pH8.0～8.5)
1．0.1％固绿水溶液
固绿(Fast green) 0.1g
蒸馏水100ml
2．0.05％Na2CO3溶液
Na2CO3 50mg
蒸馏水100ml
用时按1:1体积混合即可。
B．0.1％酸性固绿染液(pH2.2)
1．0.1％固绿水溶液。
2．mol／L×75盐酸液
盐酸(比重1.19)0.109ml 加蒸馏水至100ml
用时按l:1混合。
(五)甲基绿一哌咯宁染液
1.1mol／L醋酸缓冲液(pH4.8)：
(1)醋酸17ml
蒸馏水加至200ml
(2)醋酸水13.5g
蒸馏水加至l00ml
用时分别取两液40ml、60ml 混匀即可。
2．甲基绿一哌咯宁(methyl green—Pyrcnln)
5％哌咯宁水溶液6ml
2％甲基绿水溶液6ml
蒸馏水16ml
lmol/L醋酸缓冲液16ml
lmol/L醋酸缓冲液临用时才可加入染液中。
1％詹纳斯绿B染液
取詹纳斯绿(Janus green B)1.0g Ringer氏液100ml
1％刚果红染液
刚果红1g
蒸馏水100ml
染料染色法测定细胞数具体包括：结晶紫检测法、NBB检测法、美蓝染色检测法、中性红染色检测法，具体操作如下：
1）结晶紫检测法：
1、在96孔细胞培养板各孔中加0.1ml含5×104～10×4 WEHI-164细胞的培养液（含10％小牛血清的RPMI-1640培养液），37℃5％CO2的二氧化碳培养箱中培养2～3 小时，让细胞帖壁。
2、用RPMI-1640培养液10倍递次稀释TNF标准品，根据需要3～5倍递次稀释待检样品，每孔加0.1ml稀释的标准品或待检样品，每个稀释度3 个重复孔。对照孔6个，3个阳性对
照孔各加0.1ml含4μg TNF的RPMI-1640培养液，3个阴性对照孔各加100μl RPMI-1640培养液。继续培养18～24小时。
3、甩去培养液，用PBS小心洗涤一次，每孔加0.1ml 10％甲醇溶液固定细胞30秒钟。
4、吸去甲醇溶液，每孔加0.1ml结晶紫染液，室温中放置20分钟。
5、轻轻甩去染色液，用蒸馏水洗涤各孔，将培养板倒置于吸水纸上吸干水分。自然干燥或37℃烘干。此板可以在室温中长期保存。
6、测定前，每孔加0.1ml 33％醋酸脱色，充分振荡后在570nm处测定光吸收度。用光吸收度（OD）值对样品稀释度作图，比较标准品曲线和待检样品曲线即可得到待测样品中的细胞因子活性
2）NBB检测法：
1、在用细胞因子处理靶细胞以后倾去培养液，倒置培养板于吸水纸上吸干培养液。再用100μl磷酸缓冲盐水小心洗去死细胞，用吸水纸吸干培养液。
2、每孔加100μl NBB染液，室温中染色30分钟。轻轻染液。用吸水纸吸干染液。
3、每孔加100μl福尔马林固定液固定15分钟。用自来水轻轻洗去固定液，倒置培养板，用吸水纸吸干染液。
4、每孔加150μl 50mmol/L氢氧化钠。轻轻振荡培养板直到染料全部溶解并均匀分布。在分光光度计上读取各孔在620nm处的光密度（OD）值。计算TNF的活性。
3）美蓝染色检测法：
1、用细胞因子处理靶细胞，在含100μl细胞培养液的检测孔中，每孔加0.02ml 25％戊二醛固定活细胞15分钟，用自来水缓缓洗去死细胞和固定液。
2、每孔加0.1ml 0.05％美蓝染液，染色20分钟，用自来水缓缓冲净染液，晾干。
3、每孔加0.2ml 0.33mol/L盐酸溶解美蓝，振荡混匀。在665nm波长处测定光吸收度。计算TNF的活性。
4）中性红染色检测法：
1、用细胞因子处理靶细胞，在含100μl细胞培养液的检测孔中，每孔加50μl 5％中性红染液。继续培养2小时。
2、小心倒去培养液。用200μl Hanks液洗涤细胞1次。小心倒去培养液，减少细胞丢失。
3、每孔加100μl脱色液，在摇床中轻轻摇晃溶解30分钟。在550nm波长处测定OD值。
染色剂名称碘－碘化钾苏丹Ⅲ4％铁矾0.5％苏木精氧化苏木精改良品红碱性品红1％醋酸洋红洋红（胭脂红）0．1％结晶紫地衣红（苔红素）医药紫药水番红染液1%苯胺蓝
0.2%考马斯亮蓝R250 甲基绿—哌洛宁染液0.2%（或1%）詹纳斯绿B染液1%中性红溶液酸性品红二丙酸酯吖啶橙溴化乙锭卡宝品红
黑色素液墨汁染色液吕氏美蓝染色液革兰氏染色液鞭毛染色液0.5%沙黄液碱性孔雀绿碱性复红复红（酸性）姬姆萨染色液乳酸石炭酸棉蓝染色液1%瑞氏染色液阿氏异染粒染色液
染色剂名称化学性质作用典型实验备注
碘－碘化钾遇淀粉变蓝色对细胞内淀粉的检验细胞内后含物质的测定
苏丹Ⅲ红棕色粉末，溶于氯仿、冰乙酸，稍溶于乙醚、醇、丙酮、石油醚、不挥发油、热甘油和挥发油、不溶于水对细胞内脂肪及类似物质的检验细胞内后含物质的测定密封保存
4％铁矾色譜分析试剂胞间连丝观察
0.5％苏木精
氧化苏木精棕红色结晶、有黄绿色金属光泽、易溶于稀NaOH，呈鲜红色，微溶于醇和醚、不溶于苯和氯仿、与金属生成盐类细胞核染色、指示劑
改良品红能使粘朊、弹性组织及嗜品红的颗粒染色、中枢神经的核染色、细菌学中用于鉴别结核杆菌细胞有丝分裂的观察最强的核染料
碱性品红绿色金属光泽结晶，溶于乙醇、戊醇，微溶于水、溶液红色，不溶于醚品红的盐酸盐
1％醋酸洋红蝗虫精巢的压片法观察动物精母细胞减数分裂染色体密封避光保存
洋红（胭脂红）鲜红色片状，能溶于硼砂液，其碱性溶液为深红色，部分溶于热水，不溶于冷水或稀酸
0.1％结晶紫绿色有金属光泽结晶或深绿色结晶性粉末，易溶于醇。能溶于氯仿，尚溶于水，不溶于醚密封保存
地衣红（苔红素）淡棕红色结晶粉末，溶于醇，丙酮和乙酸中呈红色在弱碱性的溶液中淡蓝色，几乎不溶于水，醚，氯仿，苯，CS2 鞭毛媒染剂检验痰液中的弹性组织密封保存
医药紫药水
番红染液染色导管
0.2%考马斯亮蓝R250 紫色粉末，微溶于热水和醇，不溶于冷水蛋白质染色凝胶电泳
植物细胞骨架的观察密封保存
0.2%考马斯亮蓝G250 溶于醇和热水，微溶于冷水
甲基绿—哌洛宁染液核染色剂
细菌染色细胞核分离与鉴定密封保存
不可久置
0.2%（或1%）詹纳斯绿B染液（janus green）棕色、深棕色结晶粉末、溶于水呈蓝色、微溶于醇专一性的染色线粒体超活染色实验存放于冰箱内
碱性染料
1%中性红溶液深绿色、棕色或灰黑色粉末；溶解度：水4%、无水乙醇1.8%，几乎不溶于二甲苯其水溶液或醇溶液呈红色对液泡的染色有专一性，细胞核、细胞质完全不着色酵母菌活体染色
与健那绿共用于血液体外活体染色
神经细胞的尼氏小粒染色密封保存
弱碱性染料
荧光染料
酸性品红检定游离氯结缔组织染色
二丙酸酯生活性强的细胞紫外线下发出黄绿色荧光分解酶活性
吖啶橙橙红色粉末，易溶于水、乙醇、丙酮及热苯，能溶于稀酸使细胞核DNA在荧光显微镜下发出绿色荧光密封干燥保存
溴化乙锭深红色结晶或粉末，无气味，有持久的苦味，室温下稳定溶于水、乙醇、甲醇琼脂糖凝胶电泳分离鉴定核酸结构密封避光保存，强致癌物
卡宝品红对原生质体融合产物染色，鉴别异核体
1%苯胺蓝蓝色粉末，溶于水，几乎不溶于乙醇，与盐酸反应颜色不变，有沉淀，与NaOH 反应，溶液变成棕红色，与H2SO4反应，溶液呈红黄色。神经组织、细胞质、结缔组织染色密封避光保存
黑色素液用作荚膜的背景染色
墨汁染色液
吕氏美蓝染色液细菌单染色（棘孢小单孢菌，酵母菌）
革兰氏染色液G+蓝紫色
G-淡红色
鞭毛染色液染变形菌
0.5%沙黄液红棕色粉末，易溶于水，溶于醇HCl为蓝红色溶液，过多则是蓝色，对NaOH，有红棕色沉淀，对H2SO4，溶液变成绿色，稀释时先变成蓝色，后渐变成紫色，最后为红色，芽孢染色
碱性孔雀绿易溶于水，溶于乙醇、甲醇、戊醇，水溶液为蓝绿色植物病毒感染的宿主染色，细菌芽孢染色，红血球蛔虫卵染色
碱性复红褐球固氮菌荚膜染色
复红（酸性）绿色金属光泽的深红色检定游离氯，结缔组织染色
姬姆萨染色液（giemsa）沙眼衣原体的4种不同类型包含体；肺炎支原体动物精母细胞减数分裂染色体制片与观察
乳酸石炭酸棉蓝染色液霉菌菌丝和孢子均可染成蓝色
1%瑞氏染色液对原生质的染色有区别嗜中性、碱性、酸性部分的作用血液的染色密封避光保存，系复合中性染色剂
阿氏异染粒染色液
第一章蛋白质 1．两性离子：指在同一氨基酸分子上含有等量的正负两种电荷，又称兼性离子或偶极离子。 2．必需氨基酸：指人体（和其它哺乳动物）自身不能合成，机体又必需，需要从饮食中获得的氨基酸。 3.氨基酸的等电点：指氨基酸的正离子浓度和负离子浓度相等时的pH 值，用符号pI表示。 4．稀有氨基酸：指存在于蛋白质中的20 种常见氨基酸以外的其它罕见氨基酸，它们是正常氨基酸的衍生物。 5．非蛋白质氨基酸：指不存在于蛋白质分子中而以游离状态和结合状态存在于生物体的各种组织和细胞的氨基酸。 6．构型：指在立体异构体中不对称碳原子上相连的各原子或取代基团的空间排布。构型的转变伴随着共价键的断裂和重新形成。 7．蛋白质的一级结构：指蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序，以及二硫键的位置。 8．构象：指有机分子中，不改变共价键结构，仅单键周围的原子旋转所产生的原子的空间排布。一种构象改变为另一种构象时，不涉及共价键的断裂和重新形成。构象改变不会改变分子的光学活性。 9．蛋白质的二级结构：指在蛋白质分子中的局部区域内，多肽链沿一定方向盘绕和折叠的方式。 10．结构域：指蛋白质多肽链在二级结构的基础上进一步卷曲折叠成几个相对独立的近似球形的组装体。 11．蛋白质的三级结构：指蛋白质在二级结构的基础上借助各种次级键卷曲折叠成特定的球状分子结构的构象。 12．氢键：指蛋白质在二级结构的基础上借助各种次级键卷曲折叠成特定的球状分子结构的构象。 13．蛋白质的四级结构：指多亚基蛋白质分子中各个具有三级结构的多肽链以适当方式聚合所呈现的三维结构。 14．离子键：带相反电荷的基团之间的静电引力，也称为静电键或盐键。15．超二级结构：指蛋白质分子中相邻的二级结构单位组合在一起所形成的有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。 16．疏水键：非极性分子之间的一种弱的、非共价的相互作用。如蛋白质分子中的疏水侧链避开水相而相互聚集而形成的作用力。 17．范德华力：中性原子之间通过瞬间静电相互作用产生的一种弱的分子间的力。当两个原子之间的距离为它们的范德华半径之和时，范德华力最强。 18．盐析：在蛋白质溶液中加入一定量的高浓度中性盐（如硫酸氨），使蛋白质溶解度降低并沉淀析出的现象称为盐析。 19．盐溶：在蛋白质溶液中加入少量中性盐使蛋白质溶解度增加的现象。20．蛋白质的变性作用：蛋白质分子的天然构象遭到破坏导致其生物活性丧失的现象。蛋白质在受到光照、热、有机溶剂以及一些变性剂的作用时，次级键遭到破坏导致天然构象的破坏，但其一级结构不发生改变。 21．蛋白质的复性：指在一定条件下，变性的蛋白质分子恢复其原有的天然构象并恢复生物活性的现象。 22．蛋白质的沉淀作用：在外界因素影响下，蛋白质分子失去水化膜或被中和其
一、名词解释 1.分配常数：又称分配系数，是指一种分析物在两种不相混合溶剂中的平衡常数。 2.多肽链的末端分析：确定多肽链的两末端可作为整条多肽链一级结构测定的标志，分为氨基端分析和羧基端分析。 3.连接酶：指能将双链DNA中一条单链上相邻两核苷酸连接成一条完整的分子的酶。 4.预杂交：在分子杂交实验之前对杂交膜上非样品区域进行封闭，用以降低探针在膜上的非特异性结合。 5.反转录PCR：是将反转录RNA与PCR结合起来建立的一种PCR技术。首先进行反转录产生cDNA,然后进行常规的PCR反应。 6.稳定表达：外源基因转染真核细胞并整合入基因组后的表达。 7.基因敲除：是指对一个结构已知但功能未知或未完全知道的基因，从分子水平上设计实验，将该基因从动物的原基因组中去除，或用其它无功能的DNA片断取代，然后从整体观察实验动物表型，推测相应基因的功能。 8.物理图谱：人类基因组的物理图是指以已知核苷酸序列的DNA片段为“路标”，以碱基对(bp，kb，Mb)作为基本测量单位(图距)的基因组图。 9.质谱图：不同质荷比的离子经质量分析器分开后，到检测器被检测并记录下来，经计算机处理后所表示出的图形。 10.侧向散射光：激光束照射细胞时，光以90度角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
11.离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的层析。 12.Edman降解：从多肽链游离的N末端测定氨基酸残基的序列的过程。 13.又称为限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是能够特异识别双链DNA序列并进行切割的一类酶。 14.电转移：用电泳技术将凝胶中的蛋白质，DNA或RNA条带按原位转移到固体支持物，形成印迹。 15.多重PCR：是在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份模板样品中不同序列的PCR 过程。 16.融合表达: 在表达载体的多克隆位点上连有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。 17.同源重组：发生在DNA同源序列之间，有相同或近似碱基序列的DNA分子之间的遗传交换。 18.遗传图谱又称连锁图谱(linkage map)，它是以具有遗传多态性的遗传标记为“路标”，以遗传学距离为图距的基因组图。 19.碎片离子：广义的碎片离子为由分子离子裂解产生的所有离子。 20.前向散射光：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度向前方散射的讯号用于检测细胞等离子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。 21.亲和层析:利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其他分子的一种层析法。(利用分子与其配体间特殊的、可逆性的亲和结合
第六章生物化学实验基本知识 主编：齐锦生编委： 孔德娟齐锦生许丽辉杨崇辉周秀霞罗湘衡君智炜张晓玲王芳 实验室要求 一、实验课的目的 1、加深理解：加深对生物化学基本理论的理解。 2、掌握技术：掌握生物化学的基本实验方法和实验技术（四大基本技术：离心、电泳、层析、比色）及分子生物学的一些基本技术和方法。 3、培养能力：培养学生的思维能力、动手能力和表达能力。 4、掌握精髓：科学的精髓是实事求是、敢于探索、善于创新的精神，要对实验中出现的一切反常现象进行讨论，并大胆提出自己的看法。 二、生化实验室规则和要求 1、预习：课前要预习实验教材，了解实验目的、原理，熟悉操作规程。 2、秩序：自觉遵守纪律，维护教学秩序，不准迟到、早退，保持安静，严禁谈笑打闹，听从教师指导，未经教师同意，不得随意离开实验室。 3、整洁：搞好实验环境和仪器的卫生整洁，实验台面必须保持整洁，仪器药品要井然有序，公用试剂用毕，应立即盖严放回原处，勿使药品试剂撒在实验台面和地面。实验完毕，需将药品试剂排列整齐，仪器要洗净倒置放好。固体废物，如滤纸、棉花、血块不得倒入水池中，以免堵塞下水道；一般性废液可倒入水池中冲走，但强酸强碱或有毒有害溶液必须用水高度稀释后，方可倒入水池中，同时放水冲走，以免腐蚀水管。全体同学由班长安排轮流值日，负责当天实验室卫生、安全和一些服务性工作，经教师验收合格后，方可离开实验室。 4、节约：使用仪器、药品、试剂及各种物品必须厉行节约，并节约水电。应特别注意保持药品和试剂的纯净，严防混杂、乱用和污染。使用和洗涤仪器应小心仔细，防止损坏，贵重仪器使用前应熟悉使用方法，严格遵守操作规程，严禁随意开动，发现故障后应立即报告指导教师，不要自己动手检修，如有损坏按学校规定赔偿。 5、安全：注意人身和国家财产安全是至关重要的，要时刻注意防火、防水、防电、防危险品、防事故，以免发生意外。实验室内严禁吸烟。使用乙醚、苯、乙醇、丙酮等易燃品时，不允许在电炉、酒精灯上直接加热。实验中须远离火源，如有危险发生，应首先关掉电源；有机溶剂着火时，勿用水泼，以免扩大燃烧面积，可用沙土、灭火器具灭之。用火时必须严格做到：火着人在，人走火灭。用毕电器后及时切断电源。加热试剂、液体时，管口不要对人，要十分小心操作，避免灼伤人。实验室内一切物品未经本室负责教师批准，严禁携带出室外，有毒物品尤其如此。借物必须办理登记手续。
Southern杂交: 是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。 将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。 RNAi技术: 是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。 Southern杂交一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量]。 扫描电镜技术：是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与样品表面结构有关，次级电子由探测器收集，信号经放大用来调制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。 细胞显微分光光度计：用来描述薄膜、涂层厚度超过1微米的物件的光学性能的显微技术。 免疫荧光技术：将免疫学方法(抗原抗体特异结合)与荧光标记技术结合起来研究特异蛋白抗原在细胞内分布的方法。由于荧光素所发的荧光可在荧光显微镜下检出，从而可对抗原进行细胞定位。 电镜超薄切片技术：超薄切片是为电镜观察提供极薄的切片样品的专门技术。用当代较好的超薄切片机，大多数生物材料，如果固定、包埋处理得合适，可以切成50-100微米的超薄切片。 Northern印迹杂交（Northern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。 放射自显影技术：放射自显影技术是利用放射性同位素的电离辐射对乳胶（含AgBr或AgCl）的感光作用，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究的一种细胞化学技术。放射自显影技术（radioautography；autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。 核磁共振技术：可以直接研究溶液和活细胞中相对分子质量较小(20，000 道尔顿以下)的蛋白质、核酸以及其它分子的结构，而不损伤细胞。 DNA序列分析：在获得一个基因序列后，需要对其进行生物信息学分析，从中尽量发掘信
常见的微生物检测 方法
摘要：微生物的检测，无论在理论研究还是在生产实践中都具有重要的意义，本文分生长量测定法，微生物计数法，生理指标法和商业化快速微生物检测简要介绍了利用微生物重量，体积，大小，生理代谢物等指标的二十余种常见的检测方法，简要介绍了这些方法的原理，应用范围和优缺点。 概述： 一个微生物细胞在合适的外界条件下，不断的吸收营养物质，并按自己的代谢方式进行新陈代谢。如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量，体积，大小）就不断增加，于是出现了个体的生长现象。如果这是一种平衡生长，即各细胞组分是按恰当的比例增长时，则达到一定程度后就会发生繁殖，从而引起个体数目的增加，这时，原有的个体已经发展成一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长，就引起了这一群体的生长，这可从其体积、重量、密度或浓度作指标来衡量。微生物的生长不同于其它生物的生长，微生物的个体生长在科研上有一定困难，一般情况下也没有实际意义。微生物是以量取胜的，因此，微生物的生长一般指群体的扩增。微生物的生长繁殖是其在内外各种环境因素相互作用下的综合反映。因此生长繁殖情况就可作为研究各种生理生化和遗传等问题的重要指标，同
时，微生物在生产实践上的各种应用或是对致病，霉腐微生物的防治都和她们的生长抑制紧密相关。因此有必要介绍一下微生物生长情况的检测方法。既然生长意味着原生质含量的增加，因此测定的方法也都直接或间接的以次为根据，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础上。微生物生长的衡量，能够从其重量，体积，密度，浓度，做指标来进行衡量。 生长量测定法 体积测量法：又称测菌丝浓度法。 经过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是，取一定量的待测培养液（如10毫升）放在有刻度的离心管中，设定一定的离心时间（如5分钟）和转速（如5000 rpm），离心后，倒出上清夜，测出上清夜体积为v，则菌丝浓度为（10-v）/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放，简便，快速，但需要设定一致的处理条件，否则偏差很大，由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物，结果会有一定偏差。 称干重法：
《生物化学》常用名词解释 （一） 1.氨基酸（aminoacids）: 是含有一个碱性氨基和一个酸性羧基的有机化合物，氨基一般连接在α-碳上。氨基酸是肽和蛋白质的构件分子。 2.必需氨基酸（essentialaminoacids）： 指人（或其它脊椎动物）自己不能合成，需要从饮食中获得的氨基酸，例如赖氨酸、苏氨酸等氨基酸 3.非必需氨基酸（nonessentialaminoacids）： 指人（或其它脊椎动物）自己能由简单的前体合成的，不需要由饮食供给的氨基酸，例如甘氨酸、丙氨酸等氨基酸。 4.等电点（pI，isoelectricpoint）： 使分子处于兼性分子状态，在电场中不迁移（分子的净电荷为零）的pH值。 5.茚三酮反应（ninhydrinreaction）： 在加热条件下，氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫色（与脯氨酸反应生成黄色）化合物的反应。 6.肽键（peptidebond）： 一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的氨基缩合，除去一分子水形成的酰胺键。 7.肽（peptides）：
两个或两个以上氨基酸通过肽键共价连接形成的聚合物。 8.蛋白质一级结构(primarystructure)： 指蛋白质中共价连接的氨基酸残基的排列顺序。 9.层析(chromatography)： 按照在移动相（可以是气体或液体）和固定相（可以是液体或固体）之间的分配比例将混合成分分开的技术。 10.离子交换层析(ion-exchangecolumnchromatography)： 使用带有固定的带电基团的聚合树脂或凝胶层析柱分离离子化合物的层析方法。 11.透析（dialysis）： 通过小分子经半透膜扩散到水（或缓冲液）的原理将小分子与生物大分子分开的一种分离纯化技术。 12.凝胶过滤层析(gelfiltrationchromatography)： 也叫做分子排阻层析（molecular-exclusionchromatography）。一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。 13.亲和层析（affinitychromatography）： 利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其它分子的层析技术。 14.高压液相层析（HPLC，high-pressureliquidchromatography）： 使用颗粒极细的介质，在高压下分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。
毫升甘氨酸毫升，再加水稀释至毫升
NaHPO- 2HO分子量=,mol/L溶液含35.01克/升。 C4H2O7 - H b O分子量=,mol/L 溶液为21.01克/升。 4 .柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液 pH 钠离子浓度 (mol/L) 酸（克） a - h2O 氢氧化钠 （克） NaOH 97% 盐酸（毫升） HCl （浓） 最终 （升） 210 84 160 10 210 83 116 10 210 83 106 10 210 83 45 10 245 144 68 10 285 186 105 10 266 156 126 10 ① 体积 使用时可以每升中加入1克克酚，若最后pH值有变化，再用少量50% 氢氧化
钠溶液或浓盐酸调节，冰箱保存。 5.柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（mol/L ） 柠檬酸钠Na C6H5O7 ? 2HQ分子量，mol/L 溶液为29.41克/毫升。.乙酸-乙酸钠缓冲液（）
Nc2Ac- 3H2O分子量=,mol/L 溶液为27.22克/升。 7.磷酸盐缓冲液 (1)磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液() NaHPO -12^0分子量=,mol/L溶液为克/升。 NaHPQ?2H2O分子量=,mol/L溶液为克/升。
磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，由于它们是二级解离，有二个 值，所以用它们配制的缓冲液，pH范围最宽：NaHPQ：PKa1 =, pKa2=；NaHPO： pKa1 =,PKa2= 溶的十二烷基硫酸钾。 磷酸盐缓冲液的优点为：①容易配制成各种浓度的缓冲液；②适用的 受温度的影响小；④缓冲液稀释后pH变化小，如稀释10倍后pH的变化小于。 其缺点为：①易与常见的钙Ca24离子、镁Mg24离子以及重金属离子缔合生成沉淀；②会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。 )磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液() pH mol/L/15Na 2HPO （毫升）mol/L pKa 配酸性缓冲液: 用NaHPO, pH= 1 ?4, 配中性缓冲液: 用混合的两种磷酸盐，pH= 6?8, 配碱性缓冲液: 用NaHPO, pH= 10?12。 用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS十二烷基硫酸钠)会与钾盐生成难 pH范围宽；③pH 15M11.876 克15M9.078 克0.05M0.2M
生物化学常用缓冲液 （一）基本概念 ⑴ Bronsted-Lowry酸碱理论（酸碱质子理论）: 1923年由丹麦化学家J.N.Brφnsted和英国化学家T.M.Lowry同时提出了酸碱质子学说，认为凡能释放质子的分子或离子（如：H2O，HCl，NH4+，HSO4- 等）称为酸，凡能接受质子的分子或离子（如：H2O，NH3，Cl-等）称为碱。因此，一种酸释放质子后即成为碱，称为该酸的共轭碱，同样一种碱与质子结合后，形成对应的酸，称为该碱的共轭酸。 如盐酸在水中的解离： HCl Cl- ＋H+ HCl是酸，Cl-是它的共轭碱。 pH = pKa+log{[质子受体]/[质子供体]} ⑵缓冲体系的设计： 1960年，N.E.Good和他的同事们提出，适合生命科学研究使用的缓冲体系应具有以下特性： ① pKa值在6-8之间； ②在水中的溶解度高； ③不易穿透生物膜； ④盐效应小； ⑤离子浓度、溶液组成和温度对解离的影响小； ⑥不与金属离子生成复合物或沉淀； ⑦该缓冲剂化学稳定； ⑧紫外和可见光波长范围内光吸收小； ⑨易制得高纯度的盐。 （二）生物化学常用缓冲液 ⑴磷酸盐缓冲液： 磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，由於它们是二级
解离，有二个pKa值，所以用它们配制的缓冲液，pH范围最宽： NaH2PO4： pKa1＝2.12， pKa2＝7.21 Na2HPO4： pKa1＝7.21， pKa2＝12.32 配酸性缓冲液：用NaH2PO4，pH＝1-4， 配中性缓冲液：用混合的两种磷酸盐，pH＝6-8， 配碱性缓冲液：用Na2HPO4，pH＝10-12。 用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS（十二烷基硫酸钠）会与钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。 磷酸盐缓冲液的优点为： ①容易配制成各种浓度的缓冲液； ②适用的pH范围宽； ③pH受温度的影响小； ④缓冲液稀释后pH变化小，如稀释十倍后pH的变化小于0.1。 其缺点为： ①易与常见的钙Ca++离子、镁Mg++离子以及重金属离子缔合生成沉淀； ②会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。 ⑵ Tris（三羟甲基氨基甲烷）缓冲液： Tris缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多，有超过磷酸盐缓冲液的趋势，如在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中已都使用Tris缓冲液，而很少再用磷酸盐。 Tris缓冲液的常用有效pH范围是在“中性”范围，例如： Tris-HCl缓冲液： pH＝7.5-8.5 Tris-磷酸盐缓冲液： pH＝5.0-9.0 Tris-HCl缓冲液的优点是： ①因为Tris的碱性较强，所以可以只用这一种缓冲体系配制pH范围由
第三章 细胞生物学研究方法 第一节细胞形态结构的观察方法 分辨率： 肉眼0.2mm 光镜0.2μm 电镜0.2nm 一、光学显微镜技术 （light microscopy ） （一）普通复式光学显微镜技术 a ． 光学放大系统：目镜和物镜 光镜 照明系统：光源、折光镜和聚光镜，有时另加各种滤光片 组成 机械和支架系统 b ．分辨率D ：分开两个质点间的最小距离。 0．61 λ 其中： λ为光源波长 D ＝ α为物镜镜口张角 N ·sinα/2 N 为介质折射率 c.普通光镜样品制备： 固定（如甲醛）、包埋（如石蜡）、切片（约5μm）、染色 （二）荧光显微镜技术（fluorescence microscopy 光镜水平对特异蛋白定性定位） 1．FM 包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术 2．不同荧光素的激发光波长范围不同，所以同一样品可以同时用两种以上荧光 素标记。荧光显微镜中只有激发荧光可以成像。 （三）激光共焦点扫描显微镜技术（laser scanning confocal microscopy ） 1．特点：瞬间只用很小一部分光照明，保证只有来自焦平面的光成像，成像清晰 分辨率比普通荧光显微镜提高1.4－1.7倍。 通过改变焦平面位置可以观察较厚样品的内部构造，进行三维重构。 2． 共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。 （四）相差和微分干涉显微镜技术 1．相差显微镜（phase-contrast microscopy ） 光线通过不同密度物质产生相位差，相差显微镜将其变成振幅差。它与普通光镜 的不同是其物镜后有一块“相差板”，夸大了不同密度造成的相位差。 2．微分干涉显微镜（differential －interference microscopy ）——用的是平面偏振光 光经棱镜折射成两束，通过样品相邻部位，再经棱镜汇合，使样品厚度上的微 小 差别转化为明暗区别，使样品产生很强的立体感。 二、电子显微镜技术（electron microscope ） （一）电子显微镜基本知识 1．与光镜的基本区别：电子束作光源、电磁透镜聚焦、镜筒高真空、荧光屏等成像 2．分辨本领与有效放大倍数： 分辨率0.2nm ，比肉眼放大有效放大倍 数 分辨本领指电镜处于最佳状态下的分辨率。 实际情况中，分辨率受样品限制。 3．电子显微镜 电子束照明系统：电子枪、聚光镜 基本构造 成像系统：物镜、中间镜、投影镜等 真空系统：用两级真空泵不断抽气 记录系统：荧光屏或感光胶片成像 （二）主要电镜制样技术介绍
常用试剂配制-生物、化学．常规试剂配制和测定方法
一、溶液的配制1000 mL）1. Mandels营养盐溶液（g）称重 量（名 14 ）)硫酸铵（(NHSO42420 ）磷酸二氢钾（KHPO423 尿素）HNCONH （223 ）MgSO·7HO硫酸镁（244 O）氯化钙（CaCl·2H22注：用煮沸10 min后的蒸馏水配制。 微量元素溶液（1000 mL）2. Mandels）量（g称重名
3.7 氯化钴（CoCl·O）6H221.4 ）·ZnSO7HO硫酸锌（241.6 O）MnSO硫酸锰（·H245.0 ）硫酸亚铁（FeSO·7HO24后的蒸馏水配制。注：用煮沸10 min 3. DNS试剂的配制（1000 mL） （1）取：3,5-二硝基水杨酸（CHNO）7.5 g 7472氢氧化钠（NaOH ）14.0 g 充分溶解于1000 mL 水中（水预先煮沸10 min） （2）加入：酒石酸钾钠（CHOKNa·4HO）216.0 g 24465.5 mL ℃水浴中融化）50 苯酚（在 6.0 g 偏重亚硫酸钠（NaSO）522使5天后便可使用，平时盛一小瓶(250 mL)（3）充分溶解后盛于棕色瓶中，放置
用，要放在冰箱中冷藏。此溶液每月配制一次。注意：倒入瓶中时要尽量装满！！ 的配制（1000 mL）4. 考马斯亮蓝G-250mL 乙醇中，加入100 mL 即0.1g溶于50 95%称考马斯亮蓝G-250 100 mg）（w/v85 %磷酸，用蒸馏水稀释至1000 mL ，滤纸过滤。最终试剂中含0.01 % w/v）磷酸。（w/v）乙醇，8.5 %（，考马斯亮蓝G-2504.7 % 1000 mL）5. 1.0 M柠檬酸缓冲溶液的配制（(g) 量量Mn
30%聚丙烯酰胺溶液-----30%（w/v）Acrylamide 100mL 将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。0.45μm微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。 【保存条件】 4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存 【注意事项】 丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。 5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液----- 5×Tris-Glycine buffer （SDS-PAGE电泳缓冲液） 称取15.0gTris，94.0g甘氨酸（glycine），5.0gSDS，用800ml蒸馏水或去离子水溶解，充分搅拌溶解，定容至1000ml，室温保存。得0.125mol/L Tris-1.25mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释5倍。【保存条件】 室温保存，两年有效。 【注意事项】 配制好的电泳液使用时间不宜超过两周。 电泳缓冲液可以回收，回收后可再使用1-2次，但为了取得最佳的电泳效果，应使用新电泳液。 摘自Takara 商品目录--实验室常规试剂配制方法 10%十二烷基硫酸钠SDS溶液-----10%(w/v)SDS 配制20mL 【组分浓度】10%(w/v)SDS 【配制方法】 称取2g高纯度的SDS置于100~200ml烧杯中，加入约16ml的去离子水，68℃加热溶解，滴加浓盐酸调节PH至7.2，定容至20ml后，室温保存 【保存条件】 室温保存 【注意事项】 对人体有害，请注意防护。 摘自Takara 商品目录--实验室常规试剂配制方法
常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍 (2011-04-23 11:01:29)转载▼ 标签：分子生物学细胞生物学常用实用技术基本实验室技术生物学实验教育 常用的分子生物学基本技术 核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。 固相杂交 固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 斑步杂交（dot hybridization） 是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交（blotting hybridization） Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA 变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显
生物化学答疑库 1.糖类化合物有哪些生物学功能？---------------答案 2.葡萄糖溶液为什么有变旋现象？---------------答案 3.什么是糖蛋白？有何生物学功能？-------------答案 4.纤维素和糖原都是由D-葡萄糖经1→4连接的大分子，相对分子质量相当，是什么结构特点造成它们的物理性质和生物学功能上有很大的差异？ -------------------答案 5.天然脂肪酸在结构上有哪些共同特点----------答案 6.为什么多不饱和脂肪酸容易受到脂质过氧化？---答案 7.人和动物体胆固醇可能转变为哪些具有重要生理意义的类固醇物质？ ---------------------------------------------------------------------------------答案 8.判断氨基酸所带的净电荷，用pI-pH比pH-pI更好，为什么？ -------------------------------------------------------------------------------------------答案 9.甘氨酸是乙酸甲基上的氢被氨基取代生成的，为什么乙酸羧基的pKa是4.75，而甘氨酸羧基的pKa是2.34？------------------------------------------- -------答案
10.（1）Ala，Ser，Phe，Leu，Arg，Asp，Lys 和His的混合液中pH3.9进行纸电泳，哪些向阳极移动？哪些向阴极移动？（2）为什么带相同净电荷的氨基酸如Gly和Leu在纸电泳时迁移率会稍有差别？ ----------------------------------------------------------------------答案 11.（1）由20种氨基酸组成的20肽，若每种氨基酸残基在肽链中只能出现1次，有可能形成多少种不同的肽链？（2）由20种氨基酸组成的20肽，若在肽链的任一位置20种氨基酸出现的概率相等，有可能形成多少种不同的肽链？ ----------------------------------------------答案 12.在大多数氨基酸中，-COOH的pKa都接近2.0，-NH 的pKa都接近9.0。但是，在肽链中，-COOH的pKa为3.8，而-NH3＋的pKa值为7.8。你能解释这种差别吗？----答案 13. -螺旋的稳定性不仅取决于肽链部的氢键，而且还与氨基酸侧链的性质相关。室温下，在溶液中下列多聚氨基酸哪些能形成螺旋？哪些能形成其他有规则的结构？哪些能形成无规则的结构？并说明其理由。（1）多聚亮氨酸pH7.0；（2）多聚异亮氨酸pH7.0；(3) 多聚精氨酸pH7.0；(4) 多聚精氨酸pH13.0；（5）多聚谷氨酸pH1.5；(6) 多聚氨酸pH7.0；(7) 多聚羟脯氨酸pH7.0.-答案 14.球蛋白的相对分子质量增加时，亲水残基和疏水残基的相对比例会发生什么变化？
生物化学常用缓冲液 ⑴ 磷酸盐缓冲液 磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，由於它们是二级解离，有二个pK a 值，所以用它们配制的缓冲液，pH范围最宽： NaH 2PO 4 ： pK a1 ＝2.12， pK a2 ＝7.21 Na 2HPO 4 ： pK a1 ＝7.21， pK a2 ＝12.32 配酸性缓冲液：用 NaH 2PO 4 ，pH＝1～4， 配中性缓冲液：用混合的两种磷酸盐，pH＝6～8， 配碱性缓冲液：用 Na 2HPO 4 ，pH＝10～12。 用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，但若配制SDS-聚丙烯 酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS（十二烷基硫酸钠）会与钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。 磷酸盐缓冲液的优点为：①容易配制成各种浓度的缓冲液；②适用的pH范围宽；③pH受温度的影响小；④缓冲液稀释后pH变化小，如稀释十倍后pH的 变化小于0.1。 其缺点为：①易与常见的钙Ca++离子、镁Mg++离子以及重金属离子缔合生成沉淀；②会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。 ⑵Tris（三羟甲基氨基甲烷，N-Tris(hydroxymethyl)aminomethane）缓冲 液 Tris缓冲液在生物化学研究中使用的越来越多，有超过磷酸盐缓冲液的趋势，如在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中已都使用Tris缓冲液，而很少再用磷酸盐。 Tris缓冲液的常用有效pH范围是在“中性”范围，例如： Tris-HCl缓冲液： pH＝7.5～8.5 Tris-磷酸盐缓冲液： pH＝5.0～9.0 配制常用的缓冲液的方法有两种：①按书后附录中所列该缓冲液表中的方法，分别配制0.05mol/L Tris和0.05mol/L HCl溶液，然后按表中所列体积混合。由于标准浓度的稀盐酸不易配制，所以常用另一种方法；②若配1L 0.1mol/L 的Tris-HCl缓冲液：先称12.11g Tris碱溶于950mL～970mL 无离子水中，边 搅拌边滴加4N HCl，用pH计测定溶液pH值至所需的pH值，然后再加水补足到1L。 Tris-HCl缓冲液的优点是：①因为Tris碱的碱性较强，所以可以只用这 一种缓冲体系配制pH范围由酸性到碱性的大范围pH值的缓冲液；②对生物化学过程干扰很小，不与钙、镁离子及重金属离子发生沉淀。 其缺点是：①缓冲液的pH值受溶液浓度影响较大，缓冲液稀释十倍，pH值的变化大于0.1；②温度效应大，温度变化对缓冲液pH值的影响很大，即： △pK a ／℃＝－0.031 ，例如：4℃时缓冲液的pH＝8.4，则37℃时的pH＝7.4，所以一定要在使用温度下进行配制，室温下配制的Tris-HCl缓冲液不能用于 0℃～4℃。③易吸收空气中的CO 2 ，所以配制的缓冲液要盖严密封。④此缓冲液对某些pH电极发生一定的干扰作用，所以要使用与Tris溶液具有兼容性的电极。
第三章 细胞生物学研究方法 第一节 细胞形态结构的观察方法 分辨率： 肉眼0.2mm 光镜0.2μm 电镜0.2nm 一、光学显微镜技术 （light microscopy ） （一）普通复式光学显微镜技术 a ． 光学放大系统：目镜和物镜 光镜 照明系统：光源、折光镜和聚光镜，有时另加各种滤光片 组成 机械和支架系统 b ．分辨率D ：分开两个质点间的最小距离。 0．61 λ 其中： λ为光源波长 D ＝ α为物镜镜口张角 N ·sin α/2 N 为介质折射率 c.普通光镜样品制备： 固定（如甲醛）、包埋（如石蜡）、切片（约5μm ）、染色 （二）荧光显微镜技术（fluorescence microscopy 光镜水平对特异蛋白定性定位） 1． FM 包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术 2． 不同荧光素的激发光波长范围不同，所以同一样品可以同时用两种以上荧光 素标记。荧光显微镜中只有激发荧光可以成像。 （三）激光共焦点扫描显微镜技术（laser scanning confocal microscopy ） 1．特点：瞬间只用很小一部分光照明，保证只有来自焦平面的光成像，成像清晰 分辨率比普通荧光显微镜提高1.4－1.7倍。 通过改变焦平面位置可以观察较厚样品的内部构造，进行三维重构。 2． 共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点。 （四）相差和微分干涉显微镜技术 1．相差显微镜（phase-contrast microscopy ） 光线通过不同密度物质产生相位差，相差显微镜将其变成振幅差。它与普通光镜的不同是其物镜后有一块“相差板”，夸大了不同密度造成的相位差。 2．微分干涉显微镜（differential －interference microscopy ）——用的是平面偏振光 光经棱镜折射成两束，通过样品相邻部位，再经棱镜汇合，使样品厚度上的微小 差别转化为明暗区别，使样品产生很强的立体感。 二、电子显微镜技术（electron microscope ） （一） 电子显微镜基本知识 1．与光镜的基本区别：电子束作光源、电磁透镜聚焦、镜筒高真空、荧光屏等成像 2．分辨本领与有效放大倍数： 分辨率0.2nm ，比肉眼放大 分辨本领指电镜处于最佳状态下的分辨率。 实际情况中，分辨率受样品限制。 3．电子显微镜 电子束照明系统：电子枪、聚光镜 基本构造 成像系统：物镜、中间镜、投影镜等 真空系统：用两级真空泵不断抽气 记录系统：荧光屏或感光胶片成像 （二） 主要电镜制样技术介绍 制样要求：①要求样品很薄（数十纳米） ②要求保持精细结构 1．超薄切片技术 ①固定：保持样品形态结构，甚至超微和分子水平上结构。 固定剂：常用饿酸（OsO 4）和戊二醛等，另外有物理方法如高频微波。
常用缓冲溶液的配制方法 1．甘氨酸–盐酸缓冲液（L） X毫升 mol/L甘氨酸+Y毫升 mol/L HCI，再加水稀释至200毫升 ) 甘氨酸分子量 = ， mol/L甘氨酸溶液含15.01克/升。 2．邻苯二甲酸–盐酸缓冲液（ mol/L） 邻苯二甲酸氢钾分子量 = ， mol/L邻苯二甲酸氢溶液含40.85克/升3．磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲液
Na 2HPO 4分子量 = ， mol/L 溶液为28.40克/升。 - Na 2HPO 4·2H 2O 分子量 = ， mol/L 溶液含35.01克/升。 C 4H 2O 7·H 2O 分子量 = ， mol/L 溶液为21.01克/升。 4．柠檬酸–氢氧化钠-盐酸缓冲液 ① 使用时可以每升中加入 1克克酚，若最后pH 值有变化，再用少量50% 氢氧化 钠溶液或浓盐酸调节，冰箱保存。 5．柠檬酸–柠檬酸钠缓冲液（ mol/L ） 6872柠檬酸钠Na 3 C 6H 5O 7·2H 2O ：分子量， mol/L 溶液为29.41克/毫升。 ;
22 # 7．磷酸盐缓冲液 242 Na2HPO4·12H2O分子量 = ， mol/L溶液为克/升。 NaH2PO4·2H2O分子量 = ， mol/L溶液为克/升。 磷酸盐是生物化学研究中使用最广泛的一种缓冲剂，由于它们是二级解离，有二个pKa 值，所以用它们配制的缓冲液，pH 范围最宽：NaH2PO4： pKa1＝，pKa2＝；Na2HPO4：pKa1＝，pKa2＝ 配酸性缓冲液：用NaH2PO4，pH＝1～4，
配中性缓冲液：用混合的两种磷酸盐，pH＝6～8， 配碱性缓冲液：用Na2HPO4，pH＝10～12。 《 用钾盐比钠盐好，因为低温时钠盐难溶，钾盐易溶，但若配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用磷酸钠而不能用磷酸钾，因为SDS(十二烷基硫酸钠)会与钾盐生成难溶的十二烷基硫酸钾。 磷酸盐缓冲液的优点为：①容易配制成各种浓度的缓冲液；②适用的pH 范围宽；③pH 受温度的影响小；④缓冲液稀释后pH 变化小，如稀释10倍后pH 的变化小于。 其缺点为：①易与常见的钙Ca2+离子、镁Mg2+离子以及重金属离子缔合生成沉淀；②会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制作用。 1M溶液为12.114克/升。Tris溶液可从空气中吸收二氧化碳，使用时注意将瓶盖严。 > 硼砂Na2B4O7·10H2O,分子量=;溶液（=0.2M硼酸根）含19.07克/升。 硼酸H3BO3,分子量=,溶液为12.37克/升。 ) 硼砂易失去结晶水，必须在带塞的瓶中保存。 12．甘氨酸–氢氧化钠缓冲液（0.05M）
第二节细胞生物学实验方法与技术 细胞生物学是生命科学中的重要分支，它以生命基本单位细胞为研究对象，应用近代物理、化学和实验生物学方法，从显微、亚显微和分子水平来揭示细胞生命活动及规律，其中包括细胞的生长、发育、分裂、分化、遗传、变异（包括癌变）、兴奋、运动、代谢、衰老与死亡等基本生命现象，并且利用与调控细胞的行为活动，已达到为生产实践尤其为医药卫生事业服务。当前细胞生物学与医药保健事业联系的较为紧密的热点问题主要有以下几种：1）真核细胞基因结构及其表达调控；2）细胞膜、膜系、受体与信号传递研究；3）细胞生长、分化、衰老、癌变、死亡，尤其是程序性细胞死亡的研究；4) 细胞工程，包括基因工程及体细胞核移植的研究。 一、细胞培养常用方法 1、细胞原代培养（primay culture）又称初代培养，即直接从机体取下细胞、组织、或器官、让他们在体外维持与生长。原代细胞的特点是细胞或组织刚离开机体，他们的生物状态尚未发生很大的改变，一定程度上可反映他们在体内的状态，表现出来源组织或细胞的特性，因此用于药物实验尤其是药物对细胞活动、结构、代谢、有无毒性或杀伤作用等研究是极好工具。常用的原代培养方法有组织快培养法及消化培养法。前者方法简单，细胞也较易生长，尤其是培养心肌有时能观察到心肌组织块的搏动。细胞从组织块外长并铺满培养皿或培养瓶后即可进行传代。 2、细胞的传代培养当细胞生长至单层汇合时，便需要进行分离培养否则会因无繁殖空间、营养耗竭而影响生长，甚至整片细胞脱离基质悬浮起来直至死亡。为此当细胞达到一定密度时必须传代或再次培养，目的是借此繁殖更多的细胞，另一方面是防止细胞的退化死亡。 二、器官培养方法 器官培养（organ culture）是指用特殊的装置使器官、器官原基或它们的一部分在体外存活，幷保持其原有的结构和功能。器官培养可模拟体内的三维结构，用于观察组织间的相互反应、组织与细胞的分化以及外界因子包括药物对组织细胞的作用。 器官培养方法很多，最经典的方法即表玻皿器官培养法；一种最常用的方法是不锈钢金属网格法及Wolff培养法和扩散盒培养法，实验者可根据情况选择采用。 三、放射自显影术测定 放射自显影术（autoradiography）是利用放射性同位素电离辐射对核子乳胶的感光作用，显示标本或样品中放射物的分布、定量以及定位的方法。放射性同位素能在紧密接触的感光乳胶中记录下它存在的部位和强度，准确显示出形态与功能的定位关系。现已可将放射自显影术与电镜以及生物分子结合起来。不但可以研究放射性物质在组织和细胞内的分布代谢，而且可以揭示核酸合成及其损伤等改变，目前已在生命科学各领域被广泛应用。 四、染色体分析技术 染色质或染色体是遗传物质在细胞水平的形态特征。前者是指当细胞处于合成期时遗传物质经碱性染料着色后，呈现出细丝状弥漫结构；当细胞进入分裂期时，染色质细丝高度螺旋化凝聚为形态有特征的染色体。特别是在分裂中期，复制后的染色体达到最高程度的凝聚，称为中期染色，是进行染色体形态观察分析的最佳时期。染色体分析应用领域越来越广，主要用于以下几方面：1）为临床诊断提供新手段；2）研究不育和习惯性流产发生的遗传基础； 3) 通过检查胎儿的染色体，预防有染色体异常患儿出生（先天愚型）；4）根据染色体的多肽性进行亲子和异型配子的起源研究；结合DNA重组技术可以将基因定位于染色体的具体