固相萃取-高效液相色谱串联质谱法
测定原料奶中5种环境雌激素残留量的研究
李雪1,2，牟光庆1，陈历俊1,2,*，姜铁民2
（1.大连工业大学食品学院，辽宁大连116034；
2.北京三元食品股份有限公司，北京100076）
摘要：建立固相萃取-高效液相色谱串联质谱法测定原料乳中环境雌激素（雌酮、雌二醇、雌三醇、己烯雌酚、双酚A）的方法。原料乳用NH2-SPE固相萃取小柱进行富集，旋转蒸发浓缩后，采用高效液相色谱串联质谱法测定。实验结果表明：各待测物在0.01 ~0.5μg/mL 范围内具有良好的线性关系，相关系数均大于0.9978，加标回收率为68.5%~105.6%，RSD 为2.56%~7.59%，最低检出限为0.22 ~0.56μg/L（S/N=3）。本方法操作简便，快速灵敏，适合于牛奶中痕量环境雌激素的残留分析检测。
关键词：高效液相色谱串联质谱，固相萃取，环境雌激素，原料奶，残留检测Research of the determination of 5 kinds of environmental estrogens residues in raw milk by solid phase extraction-high performance liquid chromatography
tandem mass spectrometry
LI Xue1,2,MU Guang-qing1,CHEN Li-jun1,2,*,JIANG Tie-min2 （1.College of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University , Dalian 116034,China;
2.Beijing Sanyuan Foods Co., Ltd, Beijing 100076,China）
Abstract: A solid phase extraction-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for simultaneous determination of environmental estrogens including estrone,estradiol,estriol,diethylstilbestrol and bisphenol A in raw milk was established. 5 kinds of environmental estrogens were extracted from the raw milk sample by a NH2-SPE column, and concentrated with a rotary evaporator. The extract was analyzed by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometric.Results showed that:a good linear range from 0.01~0.5μg/mL with correlation coefficient of above 0.9978 was obtained.The extraction recovery were 68.5%~105.6% and the relative standard deviation were 2.56%~7.59%.The limit of detection was 0.22~0.56μg/L(S/N=3).The descri bed method was simple,sensitive and accurate.
*通讯作者：陈历俊，chlj@https://www.doczj.com/doc/af5299961.html,。
作者简介：李雪(1986-)，女，硕士研究生，研究方向：食品安全。
基金资助：奶牛产业技术体系北京市创新团队建设项目；国家科技部“863”计划(2011AA100903) 。
Key words: high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; solid phase extraction ; environmental estrogens; raw milk; residue detection
中图分类号：TS252.1 文献标识码：A
环境雌激素[1-2]属于环境内分泌干扰物，是指由于人类活动而释放发到环境中的一类有害化学物质，这些物质进入生物体后能够扰乱生物体内分泌功能，通常被称为“外因型内分泌扰乱化学物质”。原料奶的质量是乳制品的根本，是保证奶制品食用安全、维护人类健康的基础。原料乳中是否存在雌激素至关重要，其中若残留激素，则对人体有一定的毒性[3]。
作者对原料乳中5种雌激素进行了分析检测，其中既有内源性雌激素（雌酮、雌二醇和雌三醇）也有环境雌激素（己烯雌酚和双酚A），都属于人工合成或自然界存在的，它们可通过食物链或直接接触等多种途径进入体内，模拟动物体内内源性激素，具有协同或拮抗正常的内源性激素的作用，干扰内分泌功能，多被称为环境雌激素。
近来，对牛乳中环境激素检测的研究较多，常用的方法有：气相色谱-质谱（GC-MS）法、高效液相色谱（HPLC）法、酶联免疫吸附测定（ELISA）法、荧光分析法等[4-11]。例如张红英等人[11]的研究是在有机溶剂提取的基础上对样品进行衍生，然后采用气相色谱-质谱法检测原料乳，但是前处理过程复杂，并且接触大量的有毒试剂，需要长时间的衍生化过程。而本文用固相萃取替代衍生过程，优化了提取、净化、色谱测定等参数，成功建立了固相萃取、LC-MS测定原料乳中5种环境雌激素残留量的方法。不仅提高了分析样品的工作效率，还在优化前处理方法的基础上，取得了比较满意的结果。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
原料奶采自北京市11个不同的奶牛养殖场；雌三醇标准品纯度97.4%、雌二醇标准品纯度96.7% 中国药品生物制品检定所；雌酮标准品纯度99.5%、双酚A标准品纯度98.5% 德国Dr. Ehrenstorfer 公司；己烯雌酚标准品纯度99.7%，中国计量科学研究院；甲醇HPLC级、乙腈LC/MS级美国Fisher 公司；氮气、氩气（>99.999%）；超纯水美国Milli-Q纯水系统制；其他试剂均
为市售国产分析纯试剂。
ACQUITY Ultra Performance LCTM超高效液相色谱仪、Quattro Premier Micromass质谱仪、MassLynx数据处理系统美国Waters公司；KQ-500DE医用数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；Sigma 2K-15高速冷冻离心机博劢行仪器有限公司；Cleanert NH2-SPE固相萃取柱500mg/3mL美国Agela公司；旋转蒸发仪RE-52A 上海振捷实验设备有限公司；SHB-Ⅲ型水循环真空泵郑州市上街区仪器厂。
1.2 LC-MS/MS条件
1.2.1色谱条件色谱柱：ACQUITY UPLCTM HSS T3（2.1×50mm，1.8μm）；流动相：乙腈-甲醇（4：1，A）与0.01%氨水（B），流速0.3mL/min，梯度洗脱程序见表1；柱温35℃；样品室温度25℃；进样量为10μL。
表1 梯度洗脱程序
Table.1 The program of gradient elution
时间（min）A（%）B（%）梯度变化曲线
0 40 60
3.0 50 50 6
5.0 80 20 6
5.5 80 20 6
5.6 40 60 6
8.5 40 60 6
1.2.2质谱条件电喷雾离子源；负离子扫描模式；毛细管电压2.37kV；离子源温度120℃；去溶剂气温度450℃；去溶剂气流量800L/h；锥孔气流量50L/h；碰撞气体为氩气，碰撞气流速度为0.14mL/min，多反应检测（MRM）模式检测。
1.3 标准溶液的配制
分别称取标准品10.0mg于10mL容量瓶中，加入乙腈溶解并稀释定容，得到质量浓度为1.0g/L的单标准储备溶液，于-20℃冰箱保存备用。分别取上述储备液用乙腈-水（1:1，v/v）或乙腈-0.01%氨水（1:1，v/v）稀释为1mg/L的标准溶液用来优化质谱条件。
各取单标准储备液适量，用初始流动相做稀释液配制所需浓度的混合标准溶
液。
1.4 样品前处理
量取2mL原料奶样品于15mL离心管中，加入10mL乙腈，漩涡混匀1min，于25℃超声25min，在4℃下以12000r/min离心10min，移取上清液，待上清液恢复至室温后过NH2柱。在NH2柱中加入约2cm高无水硫酸钠（经650℃烘烤4h，保存在干燥器内，冷却后备用），下接旋转瓶放在固定架上。加样前先用4mL 乙腈-甲苯（3：1）预洗柱，当液面到达硫酸钠的顶部时，迅速将上清液转移到净化柱上，再用25mL乙腈-甲苯（3：1）洗涤柱子，收集所有流出物于旋转瓶中并在40℃水浴中旋转蒸发浓缩至近干。用1mL乙腈/甲醇4:1-0.01%氨水（2:3，v/v）溶液溶解残渣，经0.22μm滤膜过滤，移入1.5mL自动进样器样品瓶中，供HPLC-MS/MS测定。
2 结果与讨论
2.1 样品处理方法的选择
2.1.1 提取溶剂的选择这5种环境雌激素都属于疏水性有机化合物，易溶于大多数有机溶剂。本实验采用超声提取方式对样品进行提取，先后比较了甲醇、叔丁基甲醚、乙腈和乙酸乙酯4种溶剂的提取效果，得到5种环境雌激素的回收率，如图1所示。结果发现，乙腈能有效沉淀蛋白质，其总提取效率最高，且提取液清澈，本地干扰少；由于牛乳本身含有很多脂溶性化合物，以叔丁基甲醚和乙酸乙酯为提取剂时乳化现象严重，即使在12000r/min条件下离心10min也不能很好的消除乳化现象，从而造成提取液中含有大量的杂质，给接下来的净化工作带来了很大的困难，而且乙酸乙酯提取环境雌激素的回收率低于20%；甲醇提取效果没有乙腈好，且甲醇很难与水相分层，提取液中残存少量杂质，不利于净化过程，易造成固相萃取小柱堵塞。实验也考察了在提取过程中加入三氯乙酸和0.1%乙酸溶液对蛋白质和脂肪的沉淀效果，以期能得到更纯净的提取液，结果表明，加入0.1%乙酸溶液的样品过固相萃取柱时会使小柱堵塞；而加入三氯乙酸溶液的样品提取率反而降低，因此，选择乙腈作为本实验的提取溶剂。通过不同提取温度（20℃、25℃、30℃）和超声时间（20min、25min、30min）对提取效率的影响发现，在25℃下超声25min时提取效率最高，故本实验选择在此条件下进行提取。
图1提取溶剂对牛奶样品中5种环境雌激素回收率的影响
Fig.1 Influence of selected solvents on the recoveries of 5 environmental estrogens in bovine milk 注：1雌酮(Estrone);2.雌二醇(Estradiol);3.雌三醇(Estriol);4.己烯雌酚(Diethylstilbestrol);5.双酚A(bisphenol A);A.乙腈(Acetonetrile);B.乙酸-乙腈(Acetic acid-acetonetrile,1:99,v/v);C.三氯乙酸-乙腈(Trichloroacetic acid-acetonetrile,1:9,v/v);D.甲醇（Methanol);E.叔丁基甲醚(Tert-butyl methyl ether);F.乙酸乙酯（Ethyl acetate).
2.1.2 固相萃取净化条件的选择通过实验，比较了PEP柱、C18柱和NH2柱的净化效果，发现3种固相萃取小柱对这5种化合物有不同的吸附能力，回收率范围在25%~105%之间，其中NH2小柱的平均回收率最高，均在68%以上，且结果稳定，见图2。这可能是由于NH2柱作为正相萃取柱，其键合硅胶填料极性相对较强，更适合从非极性溶剂中提取弱极性到中等极性物质，通过用非极性有机溶剂活化和洗脱，能很好地将目标物洗脱下来，而牛乳中强极性表面活性物质仍吸附在小柱上，再通过旋转蒸发浓缩和溶剂交换，可以除去样品中的非极性干扰物质。文献报道，采用C18或HLB柱净化激素类药物时，上样溶液的组成影响回收率和净化效果，而通常采用再与NH2柱双结合的方式进一步进化[12]。通过实验证明，乙腈不仅洗脱回收率高，净化效果也好，且只需NH2柱即可达到净化目的，因此本实验选择NH2柱最为固相萃取净化小柱。
图2固相萃取柱对牛奶样品中5种环境雌激素回收率的影响
Fig.2 Influence of solid phase extraction columns on the recoveries of 5 environmental estrogens
in bovine milk
注：1雌酮(Estrone);2.雌二醇(Estradiol);3.雌三醇(Estriol);4.己烯雌酚(Diethylstilbestrol);5.双酚A(bisphenol A);A.PEP;B.C18;C.NH2.
2.2 色谱条件的优化
根据文献和实验证明，反相HPLC技术用于这5种环境雌激素的分析检测，在此基础上选用ACQUITY UPLCTM HSS T3柱（2.1×50mm，1.8μm）和ACQUITY UPLCTM BEH C18柱（2.1×50mm，1.7μm）作为分离色谱柱进行试验。文献中报道，BEH C18色谱柱属三键键合，适合在负离子电离模式条件下对激素类物质的检测[8]，但由于不同的色谱柱对同一样品有不同的保留时间，经过实验证明，HSS T3柱由于填料颗粒细，使峰形更加对称尖锐、信噪比更高，比BEH C18柱更适合用于疏水性物质的分离检测，且能将这5种目标物质全部分离，分析时间更短，8.5min即可完成5种物质的全部分离检测，因此选用ACQUITY UPLCTM HSS T3柱作为分离色谱柱。
实验研究比较了在甲醇-水、乙腈-水二元溶剂体系，以及流动相体系中分别加入0.1%甲酸、10mmol/L乙酸铵、0.1%氨水、0.01%氨水等对这5种环境雌激素电离喷雾的影响。实验发现，以乙腈为流动相的各环境雌激素信号响应强度稍逊于甲醇，但是峰形比甲醇要好，且保留时间早，而在乙腈中加入一定比例的甲
醇，效果更佳。在流动相中加入0.01%氨水后流动相的pH为9左右，色谱柱HSS T3具有较宽的pH应用范围，且分离这5种环境类激素时柱效高，这与文献中所报道的效果基本一致[12]，故最终决定以乙腈/甲醇（4:1）-0.01%氨水作为流动相，此时可以得到最优的色谱分离效果和质谱信号响应，获得对称、尖锐的峰形，且基线平稳。这5种环境雌激素的MRM色谱图见图3。
Fig.3 MRM of 5 environmental estrogens
2.3 质谱条件的优化
采用流动注射泵连续进标准样品，由于这5种环境雌激素的分子结构中含有大量的-OH，易于脱去一个H而形成[M-H]-离子峰，故选择在电喷雾负离子模式下进行母离子全扫描，考察质谱响应。然后对雌酮、雌二醇、雌三醇、己烯雌酚和双酚A进行二级质谱分析，最终选择离子丰度高、基线噪音低的2对离子，同时进一步优化碰撞能量、质谱分辨率等质谱参数，使各个离子的质谱响应信号达到最高。然后对离子源温度、去溶剂气温度及流量、锥孔气流量进行优化，使离子化效率达到最佳。优化的质谱条件见表2。这与文献中报道的质谱条件相一致[5-6]。
表2 5种环境雌激素的质谱检测参数
Table.2 MS parameters for the determination of 5 environmental estrogens
编号
环境雌激素
名称电离模式检测离子对(m/z)
锥孔电压
（V）
碰撞能量
（eV）
1 雌酮ESI-
269.2>145 *
269.2>159 70
35
32
2 雌二醇ESI-
271.2>145 *
271.2>183.1 70
40
40
3 雌三醇ESI-
287.1>145
287.1>171 * 60
40
35
4 己烯雌酚ESI-
267.1>237.1
267.1>251.2 * 55
25
24
5 双酚A ESI-
227.1>133
227.1>212.1 * 45
25
18
注：*为定量离子
2.4 方法的定性、定量、线性范围和检出限
精确配制一系列混合标准工作溶液，在选定的色谱条件和质谱条件下进行测定，以峰面积（Y）为纵坐标、质量浓度（X）为横坐标进行回归分析，由实验得出的线性回归方程、线性范围、相关系数、LOD和LOQ如表3。其中，以3倍信噪比（S/N）为方法检出限（LOD），10倍信噪比（S/N）为方法定量限（LOQ），
经样品添加实验确定各物质的检出限和定量限。
表3 5种环境雌激素的回归分析、检出限和定量限
Table.3 Regression analysis,limits of detection(LOD,S/N=3) and limits of quantification(LOQ,S/N=10) of 5 environmental estrogens
环境雌激素回归方程
线性范围
（μg/mL) 相关系数(r2)
检出限
（μg/L）
定量限
（μg/L）
雌酮Y=72783.1X+51.98 0.01~0.5 0.9995 0.49 1.63 雌二醇Y=6947.57X+0.28 0.01~0.5 0.9990 0.39 1.29 雌三醇Y=13701.7X-22.77 0.01~0.5 0.9978 0.22 0.73
己烯雌酚Y=73156.3X-24.71 0.01~0.5 0.9995 0.43 1.42 双酚A Y=41315.8X+47.25 0.01~0.5 0.9989 0.56 1.88 2.5 方法的添加回收率与精密度
本实验采取外标定量法，在空白样品中添加目标化合物，对原料奶分别进行添加回收率和精密度试验，样品中添加不同浓度的混合标准溶液，按本实验前处理方法进行处理，用高效液相色谱-串联质谱法进行检测。在低浓度、中浓度、高浓度3个添加水平范围内测定平均回收率（每个添加浓度平行测试6次），其平均回收率及相对标准偏差（RSD）结果见表4，内源性激素需扣除空白值。样品加标色谱图见图4。
表4 原料奶基质中5种环境雌激素的添加回收率和精密度（n=6）Table 4 The recoveries and accuracies of 5 environmental estrogens in bovine milk(n=6)
样品名称加标浓度/(μg/mL) 平均回收率（%）RSD（%）雌酮0.01，0.1，0.2 85.7~91.3 4.04
雌二醇0.01，0.1，0.2 85.3~105.6 7.59
雌三醇0.01，0.1，0.2 68.5~83.9 3.42
己烯雌酚0.01，0.1，0.2 81.4~94.7 4.74
双酚A 0.01，0.1，0.2 88.8~97.2 2.56
图4 牛奶样品加标色谱图
Fig.4 Standard chromatogram of the milk sample
2.6 样品测定
应用本方法对来着11个不同养殖场的原料奶进行了分析测定，结果显示，选择的11个原料奶样本中6个样本中检测出雌酮（2.1~4.3μg/L），3个样本中检测出己烯雌酚（2.4~4.6μg/L），5个样本中检测出双酚A（3.9~4.2μg/L），其他激素均为未检出。其中，雌酮的含量属于内源性激素范围，检出结果与文献[12]报道牛奶中内源性激素含量一致；而己烯雌酚和双酚A的痕量存在也是极有可能的，由于养殖场的微环境因素（土壤、空气、水源）的影响，这两种物质通过富集等途径残存在环境中，又被植物吸收，极有可能会在奶牛体内得以转换和富集，而且在实验检测过程中，不可避免的会使用塑料制品（如仪器管路，离心管等），而奶样的前处理过程中又大量使用了有机溶剂，会使塑料制品中存在的痕量双酚A部分溶出，进入所测样品中，故双酚A的含量在允许范围内存在，这与文献[11]中的检测结果相一致。
3 结论
本研究以原料奶为基质，详细研究了样品的前处理方法，优化了高效液相色谱分离条件和串联质谱测定条件，建立了固相萃取净化与高效液相色谱-串联质谱法多组分同时检测原料奶中5种环境雌激素的分析方法，该方法采用外标法定
量，保证了方法的准确性。本方法操作简单快速、灵敏度高、分析时间短、回收
率较好、结果准确且方法稳定，适合于大批量样品的快速检测。在当今乳制品质量安全备受关注的环境下，该方法能为牛乳中环境雌激素的监管与监督提供技术依据，且可应用于牛奶的实际检验工作和产品质量控制，有一定的应用价值。参考文献：
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消毒产品中丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星测定?液相色谱-串联质谱法 Determination of clobetasol propionate and levofloxacin hydrochloride in disinfection product - LC-MS-MS method 1 范围 本方法规定了膏霜类消毒产品中丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星残留量液相色谱-串联质谱测定方法。 本方法适用于膏霜类消毒产品中丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星残留量的测定。 取样量为0.1g时，本方法对丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星的检出限见表1。 表1 丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星的检出限、保留时间和特征离子 中文名称英文名称 检出限 （μg/g） 保留时 间（min） 特征离子(m/z) 丙酸氯倍他索Clobetasol propionate 0.009 7.83 467.0/355.2/373.4 盐酸左氧氟沙星Levofloxacin hydrochloride 0.06 1.11 362.0/260.9/318.2 2 规范性引用文件 3 原理 试样中丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星用甲醇提取，提取液经0.45μm滤膜过滤，用C18柱分离后，用液相色谱-串联质谱仪测定，正离子扫描，离子对定性，峰面积定量。 4 试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为不含有机物的纯水，纯水中干扰物的浓度需低于方法中待测物的检出限。 4.1甲醇：农药残留级。 4.2乙腈：农药残留级。 4.3甲酸：分析纯。
4.4标准品：丙酸氯倍他索和盐酸左氧氟沙星均购自中国药品生物制品检定所，纯度≥99.8%。 4.5标准溶液：准确称取丙酸氯倍他索适量，用乙腈－水（1：1）配制成100μg/mL 的标准贮备液。准确称取盐酸左氧氟沙星适量，用纯水配制成100μg/mL的标准贮备液。准确量取上述标准贮备溶液适量，用乙腈稀释配制成浓度为10.0μg/mL 的混合标准中间溶液，将标准中间溶液转移到安瓿瓶中于4 C保存。临用前，再根据需要用甲醇配制成不同浓度的标准使用溶液。 4.6甲酸溶液(0.2%，v/v)：量取2mL甲酸，用纯水定容至1000mL。 4.7 0.45μm滤膜。 5 仪器 5.1 液相色谱-串联质谱联用仪：HP1100高效液相色谱仪(Agilent) - API 4000质谱仪(Applied Biosystems) ，电喷雾离子化源(ESIMS，NI/PI模式)。 5.2 分析天平：感量0.1mg和0.001g。 5.3实验室纯水机：Barnstead纯水机。 5.4涡旋振荡器：Scientific Industries 涡旋振荡器。 5.5 具塞试管：10mL。 6 试样的制备与保存 6.1 试样的制备 取有代表性样品5g，搅拌均匀，制成实验室样品。 6.2 试样保存 制备好的试样置于室温保存。 7 测定步骤 7.1样品前处理 称取0.1g~0.2g样品(精确到0.001 g) ，置于10mL试管中，加入3.00mL甲醇溶液，涡旋振摇使样品分散后，超声振荡10min。静置，吸取上清液经滤膜（4.7）过滤后，供液相色谱-串联质谱测定。
一、开机 water 2695/micromass zq4000: 开机步骤 1. 分别打开质谱、液相色谱和计算机电源，此时质谱主机内置的CPU会通过网线与计算机主机建立通讯联系，这个时间大约需要1至2分钟。 2. 等液相色谱通过自检后，进入Idle状态，依照液相色谱操作程序，依次进行操作。（具体根据液相色谱不同型号来执行，下面以2695为例）。 a.打开脱气机 (Degasser On)。 b.湿灌注(Wet Prime)。 c.Purge Injector。 d.平衡色谱柱。 3.双击桌面上的 MassLynx 4.0图标进入质谱软件。 4.检查机械泵的油的状态（每星期），如果发现浑浊、缺油等状况，或者已经累积运行超过3000小时，请及时更换机械泵油。 5.点击质谱调谐图标（MS Tune）进入质谱调谐窗口。 6.选择菜单“Options –Pump”，这时机械泵将开始工作，同时分子涡轮泵会开始抽真空。几分钟后，ZQ就会达到真空要求，ZQ前面板右上角的状态灯“Vacuum”将变绿。 7.点击真空状态图标，检查真空规的状态，以确认真空达到要求。 8. 确认氮气气源输出已经打开，气体输出压力为90 psi。 9.设置源温度（Source Temp）到目标温度。 关机 1．点击质谱调谐图标进入调谐窗口。 2.点击Standby 让MS 进入待机状态时，这时状态灯会由绿变红，这一过程是关质谱高电压的过程。 3．停止液相色谱流速，如果还需要冲洗色谱柱，可以将液相色谱管路从质谱移开到废液瓶。4．等脱溶剂气温度（ESI）或APCI探头温度降到常温，点击气体图标关闭氮气。 5．逆时针方向拧开机械泵上的Gas Ballast 阀，运行20分钟后关闭（镇气）。 a) 对于ESI源，至少每星期做一次。 b) 对于APCI源，每天做一次。 6．再次确认机械泵的Ballast阀是否已经关闭。 7．选择Option / Vent，这时质谱开始泄真空，ZQ 前面板的状态灯“Vacuum”开始闪烁，几分钟后机械泵会停止运行，这时可以关闭质谱电源。 FINNIGEN DECA 开关机及校正流程—— 1开机前准备事项 （1）确保质谱总电源开关（白色开关）及主板电源开关（黑色开关）处于关闭状态（O）； （2）检查真空泵油液面，确保泵内油页面处于标定的上下两线之间； （3）查看离子源洁净程度，ESI源查看喷口是否有固体析出，毛细管口是否完好；APCI喷口是否有积液； （4）气体压力，打开高纯氮气钢瓶总阀，调节出口压力调至0.65MPa，打开高纯氦气钢瓶总阀,调节出口压力调至0.25Mpa; （5）检查壳气及辅助气接口连接紧固，松开液相管路与离子源的接口； （6）开启动力电源，电压稳定，正常；
液相色谱串联质谱联用仪检测技术 实验指导 （2014、2015级） 课程内容（一个实验8学时）： （1）AB Sciex Qtrap 4500 三重四级杆/离子阱液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用。 （2）利用液相色谱串联质谱联用仪快速测定水果中7种农药的残留量。 吉林农业大学农业部参茸质检中心 2017.03
实验一AB Sciex Qtrap 4500 三重四级杆/离子阱液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用 一.实验目的和意义 通过学习液质联用仪的构成和使用方法，及其在定性、定量分析中的应用，培养学生使用液质联用仪进行仪器分析的能力，并培养学生严谨的科学态度、细致的工作作风、实事求是的数据报告和良好的实验习惯（准备充分、操作规范，记录简明，台面整洁、实验有序，良好的环保和公德意识）。培养培养学生的动手能力、理论联系实际的能力、统筹思维能力、创新能力、独立分析解决实际问题的能力、查阅手册资料并运用其数据资料的能力以及归纳总结的能力等。 （一）检测仪器 1、仪器名称高效液相色谱串联质谱联用仪（简称LC-MS-MS）。型号：4500 QTRAP（美国Applied Biosystems公司）。 2、仪器组成液相色谱部分：岛津LC-30A，配有在线脱气机、超高压二元泵、自动进样器；串联质谱部分：QTRAP4500，配有ESI离子源、串联四级杆/线性离子阱。 3、主要性能指标离子化方式：ESI电离质量范围：（5 ~ 1700）amu 分辨率：> 6900 质量稳定性：0.1 amu/12h 灵敏度：1pg reserpine, ESI+, MRM扫描（m/z : 609/195），信噪比S/N > 120:1 扫描速度：4000 amu/sec 质量准确度：< 0.01%（全质量数范围） 4、方法原理高效液相色谱二元泵将流动相泵人系统并混合，自动进样器将待测样品注入流动相中，随流动相进入色谱柱，由于样品不同组分在色谱柱中保留时间不同，各组分被分开，依次进入离子源。在离子源中，各组分以ESI或APCI方式电离，被加速后进入质量分析器。4500QTRAP 的质量分析器主要由Q1、Q2、Q3三组四级杆串联组成。Q1可将分子离子按质荷比（m/z）大小分开；Q2是碰撞室，可将母离子进一步破碎为碎片离子；Q3具有四级杆和线性离子阱两种功能，作为四级杆时可将分子离子或碎片离子按质荷比大小分开，作为离子阱还可富集离子从而提高检测灵敏度。各组分的不同离子在质量分析器中被破碎、分离，并按质荷比大小依次抵达监测器，经记录即得到按不同质荷比排列的离子质谱图。4500QTRAP通过串联四级杆/线性离子阱两种不同质谱技术的结合，可以在单次分析中对复杂样本中的单个成分同时进行定性和定量，也可以对多个化合物进行定量分析。整台仪器的控制、数据采集、数据处理、结果输出均由PC计算机Windows操作系统支持下的Analyst软件控制完成。
附件 面膜类化妆品中氟轻松检测方法 （高效液相色谱-串联质谱法） 1范围 本方法规定了面膜类化妆品中氟轻松的高效液相色谱-串联质谱测定方法。 本方法适用于面膜类化妆品中氟轻松的定性定量测定。 2方法提要 面膜类化妆品用饱和氯化钠溶液分散，用乙腈从分散液中提取氟轻松，用亚铁氰化钾和乙酸锌沉淀提取液中大分子基质，经固相萃取小柱净化，用高效液相色谱仪分离，质谱检测器检测，采用保留时间和特征离子对丰度比定性，以待测物质相对应离子峰面积定量，以标准曲线法计算含量。 本方法的检出限为0.03 μg/g，定量限为0.05 μg/g。 3试剂和材料 除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯或以上规格，水为纯化水。 3.1甲醇：色谱纯。 3.2乙腈：色谱纯。 3.3冰醋酸：优级纯。 3.4饱和氯化钠溶液。 3.5 10%亚铁氰化钾溶液：称取115 g亚铁氰化钾K4Fe(CN)6·3H2O固体，
用水溶解定容至1000 mL。 3.6 20%乙酸锌溶液：称取239 g乙酸锌C4H6O4Zn·2H2O固体，用水溶解定容至1000 mL。 3.7Oasis HLB固相萃取小柱或相当者：60 mg，3 mL。 3.8 标准物质：氟轻松，纯度不小于99.0%；标准物质的分子式、相对分子质量、CAS登录号、化学结构图参见附录A。 3.9 标准储备液（ρ=1g/L）：准确称取氟轻松标准物质（3.8）10mg，精确到0.01 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，于－18℃下冷冻保存。 3.10 标准工作溶液：临用时，取标准储备液（3.9）适量，用乙腈稀释成0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.80μg/mL系列浓度的标准工作溶液。 4仪器和设备 4.1 高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪（ESI源）。 4.2 分析天平：感量0.0001g；0.00001g。 4.3 涡旋混合器。 4.4离心机：转速5000r/min，容量10mL；50mL。 4.5 固相萃取装置。 5分析步骤 5.1样品处理 5.1.1提取 称取样品（带有载体的面膜，去除载体后取样）0.2 g，精确至0.0001 g，置15 mL具塞离心管中，加入3 mL饱和氯化钠溶液（3.4），于涡旋混合器上混合使样品分散，准确加入2 mL乙腈，充分涡旋提取2 min，以
液相色谱串联质谱的 小知识
一、开机 water 2695/micromass zq4000: 开机步骤 1. 分别打开质谱、液相色谱和计算机电源，此时质谱主机内置的CPU会通过网线与计算机主机建立通讯联系，这个时间大约需要1至2分钟。 2. 等液相色谱通过自检后，进入Idle状态，依照液相色谱操作程序，依次进行操作。（具体根据液相色谱不同型号来执行，下面以2695为例）。 a.打开脱气机 (Degasser On)。 b.湿灌注(Wet Prime)。 c.Purge Injector。 d.平衡色谱柱。 3.双击桌面上的 MassLynx 4.0图标进入质谱软件。 4.检查机械泵的油的状态（每星期），如果发现浑浊、缺油等状况，或者已经累积运行超过3000小时，请及时更换机械泵油。 5.点击质谱调谐图标（MS Tune）进入质谱调谐窗口。 6.选择菜单“Options –Pump”，这时机械泵将开始工作，同时分子涡轮泵会开始抽真空。几分钟后，ZQ就会达到真空要求，ZQ前面板右上角的状态灯“Vacuum”将变绿。 7.点击真空状态图标，检查真空规的状态，以确认真空达到要求。 8. 确认氮气气源输出已经打开，气体输出压力为90 psi。 9.设置源温度（Source Temp）到目标温度。 关机 1．点击质谱调谐图标进入调谐窗口。 2.点击Standby 让MS 进入待机状态时，这时状态灯会由绿变红，这一过程是关质谱高电压的过程。 3．停止液相色谱流速，如果还需要冲洗色谱柱，可以将液相色谱管路从质谱移开到废液瓶。 4．等脱溶剂气温度（ESI）或APCI探头温度降到常温，点击气体图标关闭氮气。 5．逆时针方向拧开机械泵上的Gas Ballast 阀，运行20分钟后关闭（镇气）。 a) 对于ESI源，至少每星期做一次。 b) 对于APCI源，每天做一次。 6．再次确认机械泵的Ballast阀是否已经关闭。 7．选择Option / Vent，这时质谱开始泄真空，ZQ 前面板的状态灯“Vacuum”开始闪烁，几分钟后机械泵会停止运行，这时可以关闭质谱电源。 FINNIGEN DECA 开关机及校正流程—— 1开机前准备事项 （1）确保质谱总电源开关（白色开关）及主板电源开关（黑色开关）处于关闭状态（O）； （2）检查真空泵油液面，确保泵内油页面处于标定的上下两线之间； （3）查看离子源洁净程度，ESI源查看喷口是否有固体析出，毛细管口是否完好；APCI喷口是否有积液； （4）气体压力，打开高纯氮气钢瓶总阀，调节出口压力调至0.65MPa，打开高纯氦气钢瓶总阀,调节出口压力调至0.25Mpa;
固相萃取-高效液相色谱串联质谱法 测定原料奶中5种环境雌激素残留量的研究 李雪1,2，牟光庆1，陈历俊1,2,*，姜铁民2 （1.大连工业大学食品学院，辽宁大连116034； 2.北京三元食品股份有限公司，北京100076） 摘要：建立固相萃取-高效液相色谱串联质谱法测定原料乳中环境雌激素（雌酮、雌二醇、雌三醇、己烯雌酚、双酚A）的方法。原料乳用NH2-SPE固相萃取小柱进行富集，旋转蒸发浓缩后，采用高效液相色谱串联质谱法测定。实验结果表明：各待测物在0.01 ~0.5μg/mL 范围内具有良好的线性关系，相关系数均大于0.9978，加标回收率为68.5%~105.6%，RSD 为2.56%~7.59%，最低检出限为0.22 ~0.56μg/L（S/N=3）。本方法操作简便，快速灵敏，适合于牛奶中痕量环境雌激素的残留分析检测。 关键词：高效液相色谱串联质谱，固相萃取，环境雌激素，原料奶，残留检测Research of the determination of 5 kinds of environmental estrogens residues in raw milk by solid phase extraction-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry LI Xue1,2,MU Guang-qing1,CHEN Li-jun1,2,*,JIANG Tie-min2 （1.College of Food Science and Technology,Dalian Polytechnic University , Dalian 116034,China; 2.Beijing Sanyuan Foods Co., Ltd, Beijing 100076,China） Abstract: A solid phase extraction-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry method for simultaneous determination of environmental estrogens including estrone,estradiol,estriol,diethylstilbestrol and bisphenol A in raw milk was established. 5 kinds of environmental estrogens were extracted from the raw milk sample by a NH2-SPE column, and concentrated with a rotary evaporator. The extract was analyzed by high performance liquid chromatography tandem mass spectrometric.Results showed that:a good linear range from 0.01~0.5μg/mL with correlation coefficient of above 0.9978 was obtained.The extraction recovery were 68.5%~105.6% and the relative standard deviation were 2.56%~7.59%.The limit of detection was 0.22~0.56μg/L(S/N=3).The descri bed method was simple,sensitive and accurate. *通讯作者：陈历俊，chlj@https://www.doczj.com/doc/af5299961.html,。 作者简介：李雪(1986-)，女，硕士研究生，研究方向：食品安全。 基金资助：奶牛产业技术体系北京市创新团队建设项目；国家科技部“863”计划(2011AA100903) 。
液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS）法测定癫痫患者血清中 卡马西平的浓度 谢 华ì，王 荣，贾正平?， 徐丽婷 （兰州军区兰州总医院临床药理基地，兰州 730050） 摘要目的：本文建立了液相色谱-串联质谱（LC/MS/MS）法测定患者血清中的卡马西平浓度的方法。方法：色谱柱：Zorbax Extend-C18柱（150×4.6 mm I.D，5μm）；流动相：甲醇-0.01mmol·L-1乙酸 胺溶液（80:20，v/v）；流速：0.3 mL·min-1。结果：卡马西平浓度在2～40 ng·mL-1范围内，峰面积与浓度线性关系良好，平均回收率为101.1%，日内精密度、日间精密度的RSD分别为3.39%和4.11%。并测定了10名患者血清中卡马西平的浓度。结论：本方法具有良好的灵敏度、准确度、精确度及专属性，结果准确，重现性好，易于操作，可用于患者血清中卡马西平浓度的测定。 关键词卡马西平；LC/MS/MS；血清 Content Determination of Carbamazepine in epileptic patient serum by Liquid Chromatographic Tandem Mass Spectrometry XIE Hua, JIA Zheng-ping*, WANG Rong, XU Li-ting (Base of Clinic Pharmacology, Lanzhou General Hospital, Lanzhou Command, Lanzhou 730050, China) ABSTRACT OBJECTIVE:An analytical method based on Liquid Chromatography with tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) detection was developed for the content determination of carbamazepine in epileptic patient serum. METHODS: The method included that the column was Zorbax Extend-C18(150×4.6 mm I.D.，5μm ); mobile phase was methanol-0.01mmol·L-1amine acetic acid (80:20，v/v) at a flow rate of 0.3 mL·min-1. RESULTS: The method was proved to be linear in the range of 2~40ng·mL-1 with a regression confficient of 0.9976. The average recovery rate was 101.1%(n=5). The RSD of average contents of intra-day and inter-day was 3.39% and 4.11% respectively. The carbamazepine concentrations of ten epileptic patient’s serums were detected. CONCLUSION: This method is accurate, precise, sensitive and specific to be used in the content determination of carbamazepine serum. KEY WORDS Carbamazepine; LC/MS/MS; Serum ?基金项目：国家科技部重大项目（2008ZXJ09014-010） ì主管药师。研究方向：临床治疗药物监测。电话：(0931)8994675; E-mial: xiehua-72@https://www.doczj.com/doc/af5299961.html, ?通讯作者：教授，主任药师，博士。研究方向：临床药学。电话：(0931)8994652。
浅谈液相色谱质谱联用技术 刘谦 保定出入境检验检疫局，保定 071000 摘要：液相色谱-质谱联用技术以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统，经纯化后的样品在液相色谱和质谱部分经过分离和离子化，经由检测器得到质谱图。液质联用体现了色谱和质谱优势的互补，结合了色谱对复杂样品的高分离能力和质谱的高选择性，高灵敏度及能够提供相对分子量和结构信息的优点，在药物分析，食品检测等领域有广泛的应用。 关键词：液相色谱质谱食品检测 高效液相色谱是一种准确度高，分离范围广的快速分离方法，它对化合物的结构破坏性小，适合有机分子和生物分子的分离。质谱具有其他分析方法无可比拟的灵敏度，对于未知化合物的结构分析定性十分准确，对相应的标准样品要求也比较低。质谱可以和气相联用如GC/MS,也可以和高效液相色谱联用如HPLC/MS。由于色谱和质谱灵敏度相当，再加上分离效果很好的色谱可以作为质谱的进样系统，质谱作为色谱的鉴定仪速度快，分离好，应用广。色谱-质谱联用成为最好的用于分析微量有机混合物的仪器。 在1970年后，质谱-质谱法（mass separetion-mass spectra Characterization）迅猛发展起来。这种方法让母离子进一步裂解，从而获得裂解过程和分子结构的信息，通常我们称为串联质谱，二维质谱法，序贯质谱等。 我们知道，质谱的分析建立在物质离子化的基础上，按照荷质比分离离子，通过测量离子谱峰的强度实现分析目的。通过色谱纯化后的样品气化离子化形成的离子在电场和磁场的综合作用下，按照质量数和电荷数的比值大小依次排列成谱被记录下来。常见的质谱图的纵坐标是离子信号强度，横坐标就是离子核质比。在液相色谱质谱中通常所用的离子源有ESI 和APCI，我们常用的是ESI。ESI 是比APCI软电离程度较小的电离方式，应用范围较APCI 的大，只有少部分有机分子ESI 做不出，可以用APCI 辅助解决问题。一般用ESI 和 APCI 搭配使用比 ESI 和APCI 的应用范围更广一些。 下面说一说ESI和API源的异同点。 ESI 和APCI通常产生(M+H)+或(M-H)-等准分子离子，源参数调整简单，容易使用，仪器灵敏度高。对APCI源来说，不足就是给出的结构信息有限，样品易发生热裂解，低质量时基线噪声大。ESI通常只产生分子离子峰，可以直接测定混合物，并可以测定热不稳定的极性
第39卷2011年4月 分析化学(FEN XI H U A XU E) 研究报告Chinese Journal o f Analytical Chemistr y 第4期534~539 DOI:10.3724/SP.J.1096.2011.00534 高效液相色谱 串联质谱法分析大肠杆菌代谢组中样品提取方法的比较 梅辉 1,2 戴军 *1 刘文卫3 凌霞3 朱鹏飞3 赵志军 1 1 (江南大学食品科学与技术国家重点实验室,无锡214122) 2 (江南大学食品学院,无锡214122) 3 (无锡市疾病预防控制中心,无锡214002) 摘 要 比较了基于液相色谱和串联质谱联用技术(L C M S/M S)的E.co li 代谢组分析的5种不同样品提取方法。在对样品进行淬灭和洗涤后,分别使用冷甲醇法、热乙醇法、甲醇/氯仿法、热甲醇法和高氯酸法对样品平行提取3次,每个样品重复进样3次。结果显示,冷甲醇法所得到的相对提取率最高,且重复性好(RSD <5%)。从相对提取率、重复性等方面综合考察5种提取方法,从优到劣依次为:冷甲醇法>甲醇/氯仿法>高氯酸法>热乙醇法>热甲醇法。此外,以冷甲醇法的提取溶剂配制系列不同浓度的代谢物标样测定的结果表明,本方法的代谢物检测线性较好,线性范围较宽,提取溶剂的基体效应对代谢物的定量分析影响较小。本方法的检出限为0.05~0.36m mol/L 。 关键词 代谢组分析;液 质联用;提取方法;大肠杆菌 2010 07 20收稿;2010 10 29接受 本文系江南大学食品科学与技术国家重点实验室自由探索课题基金(No.SKLF T S 200803)资助项目*E mail:d j998lc@https://www.doczj.com/doc/af5299961.html, 1 引 言 饲料工业的发展及在医药工业上应用的不断扩大使色氨酸的需求量越来越大,目前我国色氨酸主要依赖进口。采用微生物直接发酵法生产色氨酸,其合成代谢途径较长,代谢流弱,调控机制复杂,很难实现工业化。代谢组学技术已应用于微生物表型分类、突变体筛选、代谢途径及微生物代谢工程等方面,但有关色氨酸生产的代谢组学及其分析策略的研究尚未见报道。 微生物代谢组学定义为对胞内所有低分子量代谢物的定性和定量分析[1]。微生物样品前处理是对代谢物进行准确定性和定量的关键步骤,一般包括微生物培养、淬灭、洗涤和代谢产物的提取等步骤[2]。本实验所研究的E scherichia coli (E.coli )全部代谢物仅占细胞干重的3%~5%,但其化学成分的复杂性和生物活性的多样性远超过一般化学合成和组合化学体系[3]。应用现代分析技术对大部分中心代谢途径的磷酸化代谢产物以及三羧酸循环中间代谢物的提取方法已有报道[4~6],多采用气 质联用(GC MS)[7]检测目标代谢物。但气 质联用法往往需要衍生化,且高温条件下易导致热敏性化合物的变性分解。本研究对生产色氨酸的E.coli 发酵液进行淬灭、洗涤处理后,分别运用冷甲醇法、热乙醇法、甲醇/氯仿法、热甲醇法和高氯酸法提取胞内代谢物,在LC M S/M S 的多反应检测模式(M RM )对目标代谢物进行检测,由于胞内代谢物数量巨大,而在代谢流研究磷酸化糖和磷酸化有机酸、有机酸和氨基酸起到关键作用。因此分别选择以上3类物质中有代表性的8种代谢物(共计24种)作为考察对象,比较5种提取方法的提取率及重复性。结果表明,冷甲醇法的相对提取率及其重复性均优于其它方法。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 1200型高效液相色谱仪(Agilent 公司);3200Q TRA P 质谱仪(Applied Biosystems 公司),配有电喷雾离子源;3L 发酵罐(NBS);高速冷冻离心机(T erm o 公司),超低温冰箱(NBS 公司);真空冷冻干燥机(Labconco 公司);JY 2006电子分析天平(Mettler T pledo 公司);YDS 6液氮罐(乐山东亚公司)。 苹果酸、富马酸、琥珀酸、柠檬酸、草酰乙酸、2 酮戊二酸、邻氨基苯甲酸的标准品均购自BBI 公司,其它
DO I :10.3724/S P.J .1096.2010.00214 固相萃取 液相色谱串联质谱法测定城市污水中他莫昔芬和来曲唑 刘先军 1,2 张晶1 邵兵 *1,2 尹杰 1,3 1 (北京市疾病预防控制中心,北京100013) 2 (首都医科大学公共卫生与家庭医学学院,北京100058) 3 (北京大学医学部公共卫生学院,北京100191) 摘 要 他莫昔芬和来曲唑常用于治疗雌激素依赖型乳腺癌。本研究建立了城市污水中他莫昔芬和来曲唑的超高效液相色谱 串联质谱(UPLC M S /M S)联用检测方法。水样通过O asis HLB 固相萃取柱富集后串联氨基柱,先用6mL 甲醇洗脱,再用3mL 甲醇洗脱氨基柱,合并洗脱液后浓缩。使用ACQU I TY U PLC T M BE H C 18反相柱,流动相为0.1%甲酸 乙腈,在梯度条件下分离;目标分析物使用超高效液相色谱 电喷雾串联质谱进行测定。本方法对他莫昔芬和来曲唑的线性范围分别是1.0~100 g /L 和0.1~100 g /L,相关系数R 2>0 997,检出限分别为1.0和0.1ng /L,进水和出水的3个不同水平的加标平均回收率为68.8%~103 0%,相对标准偏差小于15%。本方法可用于城市污水中相关物质的分析。关键词 超高效液相 串联质谱法;他莫昔芬;来曲唑;环境污水;固相萃取 2009 06 22收稿;2009 11 18接受本文系国家自然科学基金(N os .20607004,20837003)资助项目*E m ai:l s h aob i ngch @s i na .co m 1 引 言 现有毒理学实验和野外调查研究表明,一些人工合成的化合物表现出类激素或抗激素作用 [1~5] ,其 中环境雌激素类物质如烷基酚、双酚A 、多氯联苯类等报道较多[6~8] ,而有关环境抗雌激素类物质的研 究却较少[9~13] 。他莫昔芬和来曲唑是典型的抗雌激素药物,主要用于治疗雌激素依赖型乳腺癌。据估计2005年国内他莫昔芬的年产量约为5万吨,这些药物在使用后最终会随着医疗废水、生活污水等排放进入污水处理系统。2006年,Roberts 等 [10] 在英国北部泰恩河下游污水处理厂出水中检测出他莫昔 芬,检出率为100%,最高浓度达212ng /L ;同年,Ann ick 等[11] 在瑞士Lausanne 和M o r ges 两个污水处理 厂出水中检测出1~4ng /L 他莫昔芬。有关环境水体中来曲唑的存在水平的报道很少。他莫昔芬及其光解产物能抑制网纹蚤等水生物生长分化,具有明显的慢性毒性作用[12] 。因此,研究环境水体中抗雌 激素类药物的存在水平和生态效应具有重要意义。 本研究以抗雌激素类药物他莫昔芬和来曲唑为研究对象,利用固相萃取富集净化,液相色谱 串联质谱技术分析城市生活污水中相关化合物,并应用于实际污水样品分析。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 W aters AC QU I TY TM 超高效液相色谱,M icro m ass Quattro Pre m ier XE 质谱仪(W aters 公司)。O asis HLB (500m g ,6mL)、Sep Pak C 18(500m g ,6mL)、Sep Pak NH 2(500m g ,3mL)和Sep Pak S ilica(500m g ,6mL)固相萃取(SPE )柱(W aters 公司);GF /A 玻璃纤维滤纸(W hat m an 公司)。 甲醇、乙腈(H PLC 级,D i k m a 公司),甲酸(H PLC 级,Fl u ka 公司),NH 3 H 2O 和H C l(分析纯,北京化学试剂公司)。他莫昔芬和来曲唑标准品(加拿大To r onto Research Che m icals 公司)。2.2 标准溶液的配制 准确称取他莫昔芬和来曲唑标准品各0.0100g ,分别置于10mL 棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容,混匀,配制成1.0g /L 的标准储备溶液,-18 避光保存。精密量取他莫昔芬和来曲唑储备液各 第38卷2010年2月 分析化学(FENX I HUAXU E) 研究报告Ch i nese Journa l o f A na l y tica l Che m i stry 第2期214~218