免疫沉淀法是一种将蛋白质视为抗原，并利用抗体与之进行特异性结合的特性研究蛋白质间交互作用的生物技术。这项技术可以从含有不同蛋白质的样品中，分离和浓缩出特定蛋白质，即纯化蛋白质，比如沈涛等在研究骨肉瘤细胞中ArgBP2的表达和定位中就用到这项技术来纯化ArgBP2蛋白。
其原理是在细胞裂解液中加入抗目的蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于sepharose beads上的proteinA/G，与细胞中有目的蛋白结合，就形成一种免疫复合物，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。
免疫沉淀的操作过程主要分三个阶段：第一步是制备抗原溶液，任何抗原溶液均可作为免疫沉淀的材料来源，一般采用细胞或组织制备的裂解物；第二阶段是对裂解物进行预处理，免疫沉淀要求抗原的纯度尽可能高，用不与待检抗原结合的非特异性抗体预处理，可以从抗原溶液中除去非特异性结合蛋白；最后阶段是免疫复合物的形成与纯化，即在预处理过后的裂解物中加入特异性抗体形成免疫复合物，然后将免疫复合物经蛋白A或蛋白G结合的琼脂糖或聚丙烯酰胺微珠等固相基质进行纯化。蛋白A和蛋白G对抗体的Fc段有较高的亲和力。蛋白A/G与抗体结合后，通过洗涤微珠即可除去未结合的蛋白，剩下与基质结合的即是纯化的抗原抗体复合物。
具体步骤可以如下进行：
（1）收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上或者4℃裂解30min, 12,000r/min离心30 min后取上清；
（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜；
（3）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 r/min速度离心5 min,将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟；
（4）SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。
免疫共沉淀一般用于低丰度蛋白的富集和浓缩，为SDS-PAGE和MS质谱分析鉴定准备样品。如贺莉等在筛选肿瘤血管靶向肽CGNSNPKSC的结合受体时就用了这个方法：先利用天然膜蛋白提取试剂盒提取人脐静脉内皮细胞的膜蛋白，然后将提取的膜蛋白与亲和素标记的磁珠在4°C孵育2h，除去与亲和素结合的蛋白。利用磁力架，将上清液转移到EP 管中，弃去磁珠。生物素标记的无关对照肽和亲和素标记的磁珠孵育，形成对照肽-磁珠复合物，然后该复合物与上述的上清液在4°C孵育过夜，除去与生物素及二硫键等结合的膜
蛋白。利用磁力架,将上清液转移到另一EP管中。生物素标记的GX1肽与亲和素标记的磁珠孵育，形成GX1-磁珠复合物,然后该复合物与EP管中的上清液在4°C孵育过夜，利用磁力架收集上清液,磁珠用100μl漂洗液[50mol/LTRIS-HCl(PH7.5)，150mol/LNaCl，0.1%NP-40]洗两遍。加入30μl1×样品缓冲液到磁珠混合物中，95°C变性10分钟。收集洗脱液，保存于-20°C或-70°C。
除了富集蛋白，如开头所述的纯化蛋白也是常见应用，如李兴华等就用这个方法进行肿瘤相关抗原SC的分离纯化：
（1）单克隆抗体与凝胶耦联。
①将400μl轻轻搅拌混匀的耦联凝胶加入过滤柱，置于一离心管中离心。0.4 ml 耦联缓冲液洗凝胶柱2 次。
②以耦联缓冲液稀释单克隆抗体至1μg /μl后加入凝胶柱。于通风柜中，加入还原剂1μl/100μl，孵育过夜，此过程中需不断轻轻翻转混合。
③离心后将过滤柱置于一新离心管中，加入0.4 ml 耦联缓冲液，轻轻翻转10 次后离心。
④加入0.4 ml 抑制缓冲液，翻转10 次并离心。
⑤向凝胶中加入0.4ml 抑制缓冲液。于通风柜中，加入还原剂4μl，孵育30min，此过程中不断轻轻翻转混合。
⑥离心后0.4 ml洗液洗凝胶6次，0.4ml结合缓冲液洗凝胶3次。
（2）抗原的免疫沉淀。
将过滤柱置于新离心管中，向已结合抗体的凝胶中加入粗提抗原样品，4°C过夜（此过程中不断轻轻翻转混合）后离心。将过滤柱置于新离心管中，0.4 ml IP缓冲液洗3次。
（3）目标抗原的洗脱。
向凝胶-抗原抗体复合物中加入200μl洗脱缓冲液，轻叩混匀后离心。所获样品经过真空干燥适当浓缩后，以A280紫外分光光度法定量，-20°C保存备用。
免疫沉淀还可以用来筛选蛋白，如林小玲等就用免疫沉淀来筛选能与HBDSP蛋白相互作用的肝细胞蛋白④：利用anti-Flag抗体偶联的树脂，同Ad-HBDSP感染后的蛋白裂解液上清结合后，获得树脂沉淀复合物，首先验证IP 实验中所用的anti-Flag 抗体偶联的树脂能否结合HBDSP-Flag融合蛋白，结果显示树脂能结合有HBDSP-Flag融合蛋白。随后以SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白样品，所得凝胶经考马斯亮蓝染色后进行扫描，获得两组清晰的蛋白条带，比对后获得5条差异的蛋白条带。
United States/Canada 800.662.2566Asia Paci?c +1.650.919.7300Europe +33.(0)1.3904.6880Japan +81.(0)77.543.6116Clontech Laboratories, Inc.A T akara Bio Company U s e r M a n u a l Antibodies Protocol Guide PT3407-1 (PR99224) Published 14 September 1999
Antibodies Protocol Guide Table of Contents I. Introduction 3 II. Materials Required 3 III. Western Blotting 4 A. Preparation of Cell Lysate and Electrophoresis 4 B. Western Blotting 5 IV. Immunoprecipitation 6 A. Preparation of Cell Lysate 6 B. Immunoprecipitation 7 V. Immunofluorescence and immunocytochemistry 8 A. Sample Preparation 8 B. Immunofluorescence 9 C. Immunocytochemistry 9 VI. ELISA 11 VII. References 12 Notice to Purchaser Clontech products are to be used for research purposes only. They may not be used for any other purpose, including, but not limited to, use in drugs, in vitro diagnostic purposes, therapeutics, or in humans. Clontech products may not be transferred to third parties, resold, modified for resale, or used to manufacture commercial products or to provide a service to third parties without written ap-proval of Clontech Laboratories, Inc. Clontech, the Clontech logo and all other trademarks are the property of Clontech Laboratories, Inc. Clontech is a Takara Bio Company. ?2006
酶联免疫吸附试验方法类型及反应原理 ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体；②酶标记的抗原或抗体；③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 （一）双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： （1）将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 （2）加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时问，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 （3）加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量成正相关。 （4）加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗原分别制备固医学教丨育网整理相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 （二）双位点一步法 在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步法不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。 在一步法测定中，应注意钩状效应（hookeffect），类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再医学教丨育网整理形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。 （三）间接法测抗体 间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： （1）将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。
免疫共沉淀实验原理及方法 免疫共沉淀（CoIP）概述及原理 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，CoIP）是研究蛋白-蛋白间相互作用的经典方法，属于免疫沉淀技术的一类，常被用于鉴定特定蛋白复合物的中未知蛋白组分。免疫共沉淀的设计理念是，假设一种已知蛋白是某个大的蛋白复合物的组成成员，那么利用这种蛋白的特异性抗体，就可能将整个蛋白复合物从溶液中“拉”下来（常说的“pull-down”），进而可以用于鉴定这个蛋白复合物中的其他未知成员。免疫共沉淀的特点可以概括为两点，第一是天然状态，第二是蛋白复合物。 免疫共沉淀的优势： 与其他研究蛋白质相互作用技术（如GST-Pull down、酵母双杂交等）相比，免疫共沉淀鉴定的相互作用蛋白是在细胞内与目的蛋白发生的天然结合，避免了人为的影响，因此符合体内实际情况，得到的蛋白可信度更高。 免疫共沉淀的局限性和注意事项： 1. 免疫共沉淀是建立在蛋白复合物成员间彼此紧密结合的基础上，意味着松散结合的蛋白组分很可能检测不到； 2. 由于蛋白质形成复合物以后，某些表位就会被掩盖，因此可能导致使用某一种pull-down抗体，无论怎么增加抗体浓度，也极少能将不到一半的目标蛋白复合物沉淀出来，如有必要最好使用多种不同抗体分别进行CoIP；
3. 由于检测的是天然状态，因此在不同的时间和不同的处理下，CoIP拉下来的蛋白复合物都可能是不同的，当然随着实验次数的增加，得到的蛋白复合物成员也会越来越庞大； 4. 如果使用Western Blot的方法检测的蛋白复合物中的目标蛋白，则需要在试验前进行预测，具有一定的冒险性；当然如果将蛋白复合物直接进行质谱分析就不存在上述问题，但需要得到较高纯度和浓度的蛋白复合物样品也非易事，并且成本较高； 5. CoIP鉴定得到的蛋白间相互作用可能是直接作用也可能是间接作用，进一步区分还需要进行GST-Pull down等实验检测； 6. 为了保证CoIP实验的可靠性和严谨性，需要使用复合物的不同成员分别独立进行CoIP实验，并且结果应该能够彼此验证，因为原则上使用复合物的任一成员进行CoIP都会得到其他所有成员[1] 免疫共沉淀的一般操作流程（中英文对照）：
Pierce? Co-Immunoprecipitation (Co-IP) Kit（26149） 中文说明书 介绍： Thermo 公司的Pierce?免疫共沉淀试剂盒，可通过将铆钉抗体固定在琼脂 糖支撑物上，从裂解液中或其他复杂混合物中，分离出天然蛋白复合物。Co-IP 是一种研究蛋白与蛋白相互作用通用的方法，该方法使用一种诱饵蛋白与抗原 进行免疫沉淀反应，然后可通过免疫共沉淀任何与诱饵蛋白具有相互作用的猎 物蛋白。传统的Co-IP方法使用蛋白A或G共同洗脱抗体的重链和轻链，这很 可能导致将相关的蛋白一起洗脱下来，掩盖一些重要的结果。Pierce?免疫共沉 淀试剂盒通过将共价结合抗体固定在一个胺类活性反应树脂上解决了这一问题。该试剂盒包含足够的用于蛋白结合和恢复的缓冲液，完成对照试验的高校离心 柱和收集管，这些产品进一步缩短了操作实验的时间。 重要产品信息： 略 Co-IP实验步骤： A.抗体固定 注意：以下试验步骤是针对用无胺和其他载体蛋白稀释的10-75μg亲和纯 化抗体（参考重要产品信息一节）。根据实际使用比例参考这一协议步骤。参 考重要产品信息节表1中的建议抗体用量和树脂体积用量。 1.室温平衡胺连接耦合树脂（AminoLink?Plus Coupling Resin）和试剂； 2.为每个Co-IP反应准备2ml 1×Coupling Buffer（超纯水稀释20×Coupling Buffer）；
3.轻轻涡旋混匀装有AminoLink?Plus Coupling Resin的瓶子，使其处于悬浮状态。使用大口径（或剪掉一段枪头端），添加50μl树脂悬液到Pierce提供的离心柱中，将离心柱放入微量离心管中，1000g离心1min，弃滤液； 4.添加200μl 1×Coupling Buffer 清洗树脂2次，离心弃滤液； 5.将离心柱放于纸巾上，轻巧离心柱底部，去除剩余的液体，插上底塞； 6.准备10-75μg亲和纯化抗体用于结合蛋白，调整体积至200μl，使用足够的超纯水和20×Coupling Buffer来制备1×Coupling Buffer。例如：添加10μl 20×Coupling Buffer，180μl超纯水和10μl浓度为1μg/μl。可直接添加含有超纯水、20×Coupling Buffer、亲和纯化抗体的树脂在离心柱中。 7.在通风厨中，每200μl反应体系，添加3μl氰基硼氢化钠溶液； 注：氰基硼氢化钠属剧毒物质，操作时要小心并穿戴防护服。 8.拧紧离心柱上螺帽，室温涡旋孵育90-120min，确保浆体在孵育过程中处于悬浮状态； 9.握紧底塞，拧开并拿走螺帽，将离心柱置于收集管中离心，保存滤液以便验证抗体耦合； 10.打开螺帽，添加200μl 1×Coupling Buffer，离心弃滤液，重复此步骤1次； 11. 向离心柱中添加200μl Quenching Buffer，离心弃滤液； 12. 将离心柱放于纸巾上，轻巧离心柱底部，去除残留液体，插上底塞。在树脂上添加200μl Quenching Buffer； 13. 在通风厨中，添加3μl氰基硼氢化钠溶液，拧紧螺帽；轻轻摇动并孵育15min； 14.取出底塞，拧开螺帽，将离心柱置于一收集管中，离心弃滤液； 15.打开螺帽，采用200μl 1×Coupling Buffer洗脱树脂，离心。再次重复此步骤； 16.用150μl Wash Solution洗脱树脂6次，每次洗脱后离心； 17.不管是进行细胞裂解、Co-IP，还是储存树脂，都需要继续进行下列步骤； 18.用200μl 1×Coupling Buffer洗脱树脂2次，每次需离心；
精心整理 免疫共沉淀详细步骤 实验原理 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互白质Y beads ）蛋1.RIPABuffer 配制： 基础成分： Tris-HCl （缓冲液成分，防止蛋白变性） NaCl （盐份，防止非特异蛋白聚集）
NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液） 去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存） 注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。 RIPA蛋白酶抑制剂 EDTA RIPA 激活的 NaF（ 2. 配制 1) 直到全部溶解，用HCl调节PH值到7.4 2)加10ml10%的NP-40 3)加2.5ml10%的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清 4)加1ml100mM的EDTA，用量筒定容到100ml，2-8℃保存
5)理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂各100μl；PMSF，Na3VO4，NaF各500μl），但是PMSF在水溶液中很不稳定，30分钟就会降解一半，所以PMSF应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5天。 各种成分在工作液中的终浓度： 预冷PBS，RIPABuffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机 1.用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS； 2.加入预冷的RIPABuffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶， 0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶)； 3.用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上）；
免疫沉淀与免疫共沉淀原理及方法 一、基本概念 免疫沉淀（immunoprecipitation）是利用抗体可与抗原特异性结合的特性，将抗原（常为靶蛋白）从混合体系沉淀下来，初步分离靶蛋白的一种方法。 免疫共沉淀（coimmunoprecipitation）是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。其原理是如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话，那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时，另一个蛋白也会被同时沉淀下来。与酵母双杂交技术不同，免疫共沉淀技术所利用的是抗原和抗体间的免疫反应，是一种基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用的方法。 不难看出，免疫共沉淀与免疫沉淀技术所使用的原理与方法大致相似，所不同的是，在免疫共沉淀中，对靶蛋白的结合与沉淀由另一个与之发生相互作用的蛋白替代。在免疫共沉淀或免疫沉淀的基础上，通过进一步与其它技术的结合，如聚丙烯酰胺凝胶电泳，还可进一步对靶蛋白的的分子量等特性进行鉴定。 二、抗体的选择 （一）多克隆抗体 多克隆抗体因其制备相对简单，可与靶蛋白分子的多个位点结合，所形成的抗原抗体复合物较稳定因而应用的最为广泛。但多克隆抗体的缺点在于非特异性结合较多，常会导致反映本底（是否是背景）升高和一定的假阳性结果。 （二）单克隆抗体 与多克隆抗体相比，单克隆抗体往往只结合一种抗原表位，具有单一结合特异性，所以发生非特异结合的机会少，可被用于确定靶蛋白上某一部位的特殊结构，甚至可被用于区分相同靶蛋白的不同形式如构象变化和修饰。但反过来，单克隆抗体仅与单一表位结合的特性也会引起具有同一表位的不同靶蛋白间的交叉反应。 三、免疫沉淀方法 免疫沉淀的靶蛋白一般来自细胞裂解液，可以是被同位素标记的也可以是未被标记的。若为前者，免
论坛里发的都是关于细胞的免疫共沉淀的实验方法,这是我做组织时用到的方法,希望能给大家有点帮助 实验方法如下: 第一步：制备组织裂解物 1. 把组织剪切成细小的碎片。 2. 融解Western及IP细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF,使PMSF的最终浓度为1mM。 3. 按照每20毫克组织加入100-200微升裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。) 4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。 5. 充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。 6. 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。 或 1. 使用洁净的工具用最快的速度切取待测组织。最好在冰上操作。以防止蛋白降解 2. 将组织放入圆底离心管中，浸入液氮以达到“snap freeze”. 如果马上裂解则将组织冰浴，否则将组织保存-80°C以备后用。 3. 每5mg组织加入300ul裂解液，使用玻璃匀浆器匀浆，直至充
分裂解。 4. 用300ul裂解液冲洗刀片两次，然后将组织液在4°C缓慢摇动2小时 5. 12000rpm 4°C.离心20分钟。轻轻的将离心管取出冰浴，将上清吸出到新的预冷的离心管中（保持冰浴），弃沉淀。 裂解液的体积要根据组织量来确定。蛋白提取物不能太过稀释一方面避免蛋白的损失，另一方面也减少后续电泳的上样量（如果需要的话）。蛋白的合适浓度为1-5 mg/ml ，最低不能少于0.1 mg/ml。第二步：预纯化裂解物 使用无关抗体或血清可以将裂解物非特异性结合Ig的蛋白去除，随后加入的agarose beads一方面将裂解物中非特异结合agarose 或sepharose beads的蛋白去除，另一方面也将加入的无关抗体和血清蛋白去除。经过处理的裂解物所得试验结果背景更低、信噪比更好。但如果最后是使用WB来检测的话，预纯化就不是特别的必要了。 主要步骤： 1. 每1ml裂解物加入50ul和IP抗体来源及亚型相同的无关抗体（例如后续免疫沉淀时用的是小鼠IgG，则在本步骤中可以加入normal mouse IgG）或者正常血清（常用兔血清），冰浴1小时 2. 加100 μl Preotein A/G agarose beads，4°C缓慢摇动10-30分钟 3. 14,000 x g 4°C离心10分钟 4. 取上清，弃沉淀
关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结 ChIP实验原理 在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。 可以利用ChIP研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）的关联性。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。 一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。 ChIP实验步骤 第一天：
（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。 1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9ml） 2、37摄氏度孵育10min。 3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。 450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。 4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。 5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。 6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。 假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。 将2管混在一起，共800ul。 7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。当然，如果实验室有Bioruptor这种神器的话那就轻松了。 （二）、除杂及抗体哺育。 8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。去除不溶物质。 留取300ul做实验，其余保存于－80度。 300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul 加入4ul 5M NaCl （NaCl终浓度为0.2M），65度处理3h解交联，跑电泳，
免疫共沉淀操作步骤 具体步骤： 1. 细胞用预冷的PBS液洗涤2次，最后洗涤完成后吸干PBS液。 2. 加入预冷的RIPA Buffer（1ml/107个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶）。 3. 刮留细胞：用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶中上刮下，将悬液转入 1.5mlEP 管中，EP管插冰上，置于水平摇床上缓慢晃动15min。 4. 4℃，14000g离心15min。 5. 立即将上清液转移到一个新的离心管中。 6. 准备Protein A琼脂糖，用PBS液洗两遍珠子，然后用PBS液配制成50%浓度。 *为避免操作中破坏琼脂糖珠，减掉移液器枪头的尖部分。 7. 每ml总蛋白中加入100ul Protein A琼脂糖珠（50%），EP管插冰上，置于水平摇床上4℃摇晃10min。 *目的是去除非特异性杂蛋白，可降低背景。 8. 4℃，14000g 离心15min，将上清转移到一个新的离心管中。 9. 测定蛋白浓度，可选用Bradford法做蛋白标准曲线。 10. 蛋白定量，分装，-20℃保存，可保存1个月。 11. 用PBS液将总蛋白稀释至约1ug/ml。 12. 加入500ul稀释好的兔抗到总蛋白中。 13. 于摇床上4℃缓慢摇动抗原抗体混合物，可选择过夜或室温放置2h。 14. 加入100ul Protein A琼脂糖珠用以捕捉抗原抗体复合物，摇床4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或者室温孵育1h。 15. 14000rpm瞬时离心5s，去上清，收集琼脂糖珠-抗原抗体的复合物。 16. 用800ul预冷RIPA buffer冲洗3遍。
17. 用60ul 2倍上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻敲打混匀。 18. 将上样样品煮5min。 19. 14000g离心，收集剩余琼脂糖珠。 20. 将上清电泳，电泳前应再次煮5min变性。 21. 上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳。 基础成分 （1）Tris-HCl（防止蛋白变性的缓冲液成分） （2）NaCl（防止非特异性蛋白聚集的盐分） （3）NP-40（用H2O配置成10%储存液。NP-40为非离子去污剂，用于提取蛋白） （4）去氧胆酸钠（用H2O配置成10%储存液；提取蛋白用离子去污剂；避光保存） *因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失，准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠。
·因为你IP的时候用的抗体，为了说明是你的抗体特异性的IP下来的东西，而不是其他抗体IP 下来的，所以要用IgG作为对照。 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整的细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间结合的保持下来。这一事实可被用于检测和确定生理条件下相关的蛋白质-蛋白质之间的相互作用。这种方法叫做免疫共沉淀 IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“prorein A"特异性地结合到免疫球蛋白的FC 片段的现象活用开发出来的方法。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。 其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 实验流程为： （1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C，最大转速离心30 min后取上清； （2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜； （3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm 离心3 min； （4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A琼脂糖珠偶连； （5）免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl 的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5分钟； （6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。 注意的问题： （1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer。 （2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用 （3）使用对照抗体： 单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗 兔多克隆抗体：正常兔IgG 在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性，应注意以下几点： (1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；
免疫共沉淀Co-IP实验操作步骤 一、原理： 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads 上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 二、准备工作： 预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机 1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；
2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶， 0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶) 3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上） 4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中 5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减 掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠 6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插 冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景 7. 4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子 8. (Bradford 法)做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释1：10倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在-20℃保存一个月） 9. 用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μl，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如果兴趣蛋白 在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 μg/μl） 10. 加入一定体积的兔抗到500μl总蛋白中，抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异 11. 4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h 室温孵育
染色体免疫共沉淀（Chip）实验报告 步骤一：样品准备 试剂和仪器： Biopulverizer(biospec) 37% formaldehyde 甘氨酸(Glycine) PBS protease inhibitors 步骤二：细胞交联 1. 向客户提供的细胞沉淀中加入1ml 细胞培养基，混匀细胞后转移到15ml离心管中。 2. 向15ml离心管中加入270ul 37%甲醛溶液，使得甲醛的终浓度为1%，室温温育10min。 3. 向反应体系中各加入505ul 2.5M甘氨酸到终浓度为125mM，室温温育5min以终止交联反应。 4. 135x g，4°C离心10min，去上清，并用冰冷的10ml 1XPBS迅速漂洗两次。 5. 吸净PBS后，加入1ml PBS+protease inhibitors混合液，并转移到1.5ml离心管中。800Xg，4°C离心 5min，小心去掉上清。 步骤三：细胞裂解 试剂: 裂解缓冲液1: 50mM Hepes-KOH pH7.5; NaCl 140mM; EDTA 1mM; glycerol 10%;NP-40 0.5%; Tritonx -100 0.25%。 裂解缓冲液2: 10mM Tris-HCl pH8.0; NaCl 100mM; EDTA 1mM pH8.0; Na-Deoxycholate 0.1% Protease inhibitors。 步骤: 1. 加入蛋白酶抑制剂(终浓度为1x) 到所有的裂解缓冲液中。 2. 用1ml的裂解缓冲液1重悬上述处理的样品，4°C旋转混合10min后，800g，4°C离心5min，弃上清。 3. 用300ul 裂解缓冲液2重悬样品，冰上放置30min。 步骤四：超声破碎ＤＮＡ 仪器: Bioruptor(Diagenode) 步骤: (1)、将超声仪器Bioruptor 调到中档“Mid”(M)。 (2)、在超声池中注入一定量的冰水。 (3)、将上述1.5ml Ep管置于超声固定架中。 (4)、将带有Ep管的固定架放入已注入冰水的超声池中，超声10分钟。(30 seconds “ON” & 30 seconds “OFF”。) (5)、超声完成后，各取25ul直接接交联和纯化(具体操作见后洗脱和纯化步骤)后于2%琼脂糖凝胶电泳。超声后电泳图附件1。
免疫共沉淀详细步骤 实验原理 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 实验试剂 1. RIPA Buffer配制：
基础成分： Tris-HCl（缓冲液成分，防止蛋白变性） NaCl（盐份，防止非特异蛋白聚集） NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液） 去氧胆酸钠（离子去污剂，提取蛋白；用H2O配制成10%储存液；避光保存） 注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。 RIPA蛋白酶抑制剂 苯甲基磺酰氟（PMSF）（用异丙醇配制成200mM的储存液，室温保存） EDTA（钙螯合剂；用H2O配制成100mM的储存液，PH 7.4） 亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存） 抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存） 胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的储存液，分装，-20℃保存） RIPA磷酸（酯）酶抑制剂 激活的Na3VO4（用H2O配制成200mM的储存液，见Sodium Orthovanadate Activation Protoco） NaF（200mM的储存液，室温保存）
免疫共沉淀与Western Blot 实验步骤: 1．以60mm细胞培养皿为例，细胞转染后24－36小时后，吸净培养液（可用PBS 小心漂洗一次）。 2．加入500μl预冷的1×lysis buffer,于4℃或冰上放置裂解细胞5分钟。 3．将细胞裂解液转移到1.5ml eppondorf管内，于冷冻离心机4℃，13000g离心30分钟。 4．将离心后的上清液分为两份：一份35μl，加入等体积的2×SDS sample buffer,混匀后于100℃煮10分钟，做为总细胞裂解液（total cell lysate，TCL）于－20℃保存，或取6－10μl进行SDS－PAGE电泳，Western blot检测目的蛋白的表达水平（接第5步）。另一份用于免疫沉淀，具体操作如下： 1）分A/G beads：按每管（一个免疫沉淀样品）加入5μl Agrose A/G beads 及5μl（1μg）抗体计算一次实验所用beads及抗体的总量，将抗体和beads混合，补充lysis buffer（补充的lysis buffer的量能使每管能均匀分配到50μl beads 及抗体的混合物），将beads及抗体的混合物按每管50μl（含5μl beads及5μl抗体）分配到1.5ml Eppendorf管中，再加入400μl1×lysis buffer，备用； 2）从步骤4中另一份用于免疫沉淀的上清液中取400μl加入到上一步（步骤1））已分好的beads中，使终体积达到850μl，将管子固定到混匀器上使混匀器匀速旋转（15rpm）免疫沉淀3小时； 3）将免疫沉淀后的溶液于4℃3000rpm离心3分钟，去上清，加入500μl 1×lysis buffer洗涤beads，于冷冻离心机4℃3000rpm离心3分钟，弃上清，共洗涤三次。 4）最后一次洗涤完毕，弃上清，管中只剩Beads，加入35μl1×lysis buffer与等体积2×SDS sample buffer混合，于100℃煮沸10分钟，稍离心后取10μl左右上样到PAGE胶，进行电泳，或－20℃冻存。 5．电泳完毕，取下PAGE胶，与PVDF膜做成"三明治"形状，用湿转法进行电转1小时。 6．电转完毕，取下PVDF膜，加入5％脱脂奶粉，于脱色摇床摇荡（75rpm）封闭1小时以消除非特异背景。
主题：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP） 概述： 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）是一种以抗体和抗原之间的特异免疫反应为基础，研究蛋白质与蛋白质间相互作用的经典方法。其基本原理是在细胞裂解液中加入抗原特异性的抗体，抗体、抗原、以及与抗原具有相互作用的蛋白质通过抗原与抗体之间免疫沉淀反应将形成免疫复合物，经过纯化，洗脱，收集免疫复合物，SDS-PAGE电泳，western blot和（或）质谱可鉴定出与抗原相互作用的蛋白质。其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 目的： 研究一种已知蛋白质与已知或者未知蛋白质间相互作用 原理： 当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合
的蛋白质Y也能沉淀下来。 步骤： 1.用RIPA裂解缓冲液裂解细胞； 2.用PBS配制成50%的protein A/G-agarose工作液； 3.在样品中以每1ml中加100μl的比例，加入50%的Protein A/G agarose工作液。水平摇床4℃摇动10min（该步骤的目的是去除非特异性结合的蛋白）； 4.4℃，14000g离心15min，将上清转移到一个新的离心管中，去除protein A/G-agraose微球； 5.使用BCA法或者其他方法测定总蛋白的浓度； 6.加入一定体积的一抗； 8.用摇床缓慢摇动抗原抗体混合物，4℃过夜； 9.14000g离心收集沉淀，并且用预冷的洗涤缓冲液（或者预冷的PBS）洗涤3遍； 10.收集上清，用于进一步的下游SDS-PAGE、western-blot或者质谱分析。流程图：
免疫共沉淀原理及步骤 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)原理 IP是利用抗原蛋白质和抗体的特异性结合以及细菌蛋白质的“protein A/G"特异性地结合到抗体(免疫球蛋白)的FC片段的现象开发出来的方法。目前多用protein A/G预先结合在argarose beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A/G就能达到吸附抗原的目的。通过低速离心，可以从含有目的抗原的溶液中将目的抗原与其它抗原分离。 免疫沉淀实验的操作步骤比较多，同时由于在非变性条件下进行实验，所以要得到一个完美的实验结果，不仅需要高质量的抗体，同时对免疫沉淀体系也需要有严格的控制指标。免疫沉淀实验从：蛋白样品处理；抗体-agarose beads孵育；抗体-agarose beads复合物洗涤到最后的鉴定，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个关键步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 IP实验步骤 基本实验步骤 (1)收获细胞，加入适量细胞IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4℃裂解30min， 12,000g 离心30 min后取上清； (2) 取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50 μl protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4°C缓慢摇晃孵育过夜； (3)免疫沉淀反应后，在4°C 以3,000 g速度离心5 min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 加样缓冲液，沸水煮10分钟； (4)SDS-PAGE, Western blotting或进行质谱分析。一、样品处理： 免疫沉淀实验成功与否，第一步处理样品非常关键。免疫沉淀实验本质上是处于天然构象状态的抗原和抗体之间的反应，而样品处理的质量决定了抗原抗体反应中的抗原的质量，浓度以及抗原
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation） 一原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互 作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险
性。 二、准备工作： 预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机 1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS； 2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶) 3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上） 4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中 5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS 配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠 6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10min（EP管插冰上，置水平摇床上），
ELISA的概念、原理、操作步骤 ELISA是酶联接免疫吸附剂测定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的简称。它是继 免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。此项技术自70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛用于生物学和医学科学的许多领域。 (一)原理 ELISA是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作 用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。 由于抗原、抗体的反应在一种固相载体──聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在实际应用中，通过不同的设计，具体的方法步骤可有多种。即：用于检测抗体的间接法(图a) 、用于检测抗原的双抗体夹心法(图b)以及用于检测小分子抗原或半抗原的抗原竞争法等等。比较常用的是ELISA双抗体夹心法及ELISA间接法。 (二) 操作步骤 方法一：用于检测未知抗原的双抗体夹心法: 1.包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。 2. 加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。 3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。
4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。 5. 终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。 6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA 检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。 方法二：用于检测未知抗体的间接法：用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW 洗涤。 其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。 (三) 试剂器材 1. 试剂： (1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液): NaCO31.59g, NaHCO32.93g加蒸馏水至1000ml； (2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2g, Na2HPO4·12H2O 2.9g, NaCl 8.0g, KCl 0.2g Tween-20 0.05％0.5ml 加蒸馏水至1000ml (3) 稀释液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1g 加洗涤缓冲液至100ml 或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。 (4) 终止液(2M H2SO4）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。 (5) 底物缓冲液(PH5.0磷酸棗柠檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4克／L) 25.7ml 0.1M 柠檬酸