引物设计的原理和程序
一、设计原理
1、选择合适的靶序列：设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计。
2、长度：一般来说，寡核苷酸引物长度为15-25bp。
3、Tm值：引物的Tm值一般控制在55-65℃，尽可能保证上下游引物的Tm值一致。若G+C含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退货温度。
4、G+C含量：有效引物中的G+C含量一般为40%-60%。
5、碱基的随机分布：引物中四种碱基的分布最好是随机的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的3’端不应超过3个连续的G或C。
6、引物末端：只有引物的3’端与模板结合，PCR才能进行，所以3’端最好是G或C。
7、引物自身：引物自身不存在连续4个碱基以上的互补序列，否则会影响到引物与模板之间的结合，尤其避免3’端的互补。
8、引物之间：上下游引物之间尽量少的存在互补序列，否则上下游引物退火结合，将影响到PCR的扩增效率。
二、序列查找
根据所需检测的待检定基因，在
https://www.doczj.com/doc/af13940585.html,/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide&itool=toolbar
网址查询有关序列。
三、引物设计与筛选
分别以Primer Premier 5.0和Beacon Designer 5.1软件为例，进行引物设计和筛选。（一）、Primer Premier 5.0软件
1、打开软件，调入序列
2、选择序列文件名，加入右框
3、序列显示如图，
4、点击“Primer”，按照引物设计的原理，设定引物的各种参数，点击“OK”进行引物搜寻
5、等待引物搜寻，显示结束后，点击“OK”，进入下一页，
6、按照搜寻结果显示，逐条分析，在主窗口中检查该引物对的二级结构，依次筛选
（二）、Beacon Designer 5.1软件
1、打开软件，调入序列
2、选择序列文件名，加入右框
3、序列显示如图，
4、选择引物设计方式
5、点击“Primer Search（图标）”，按照引物设计的原理，设定引物的各种参数，点击“Search”进行引物搜寻
6、等待引物搜寻，显示结束后，点击“OK”，进入下一页，
7、按照搜寻结果显示，逐条分析，点击“All Structures”，检查该引物对的二级结构，依次筛选
四、引物比对
比对设计的引物是否满足需要和引物的特异性，在https://www.doczj.com/doc/af13940585.html,/BLAST/ 网址进行比对
1、输入所需比对的序列，选择数据库“nr”
2、点击“Blast”，进入下一页
3、点击“Format”，进入比对结果
引物和探针设计软件Primer Express操作步骤(2009-06-13 23:43:40)
标签：杂谈分类：专业
1. 软件登录
双击Primer Express软件的图标，登录软件，显示主页面。
如果是首次登录，会出现一个对话框要求创建或打开一个Archive文件。点击New创建一个新archive文件，点击Save将此文件保存为PXArchive。
从File菜单中选择New，再选择DNA PCR或其他类型的引物设计页面，如Nested PCR、Multiplex PCR等，打开一个新DNA PCR文件。
2. 输入DNA序列
在Sequence页面，点击Import DNA File按钮，出现搜索路径对话框。
找到所需序列文件，点击Open。
3. 计算引物
从Optains菜单中选择Find Primers Now，几秒钟后，显示其中一对引物在Sequence中的位置。点击Primers标签打开引物页面，可以看到总共有多少对引物被设计出来，以及所有引物的序列。这时显示的引物多少取决于模板的序列和引物参数的严格程度，可能只有几对，可能有很多，也有可能一对引物也没有。在所得引物中选择罚分(Penalty)最低的引物即为引物设计结果。
如果计算后没有任何引物，或者你对缺省的引物参数不满意，则需要对引物参数进行适当调整以符合特定实验的要求，得到最佳引物。引物太多，可以严格参数，使引物数量减少，质量提高；引物没有，可以放宽非关键性的参数，以便在不影响引物质量的前提下计算出引物。
4. 修改参数，计算最佳引物
点击Params标签打开参数页面。根据需要调整引物参数，如Tm值，GC百分含量，引物和扩增子的长度等。然后点击Primers标签打开引物页面，再从Optains菜单中选择Find Primers Now，重新计算引物，几秒钟后，显示新的计算结果。
此步骤可以反复多次，直到得到满意的引物为止。
根据罚分(Penalty)由低到高的秩序排列所得引物，取罚分最低的第一对引物。罚分是该引物与参数符合程度的衡量指标。分数越低，表示该引物与要求符合得越好。
5. 引物参数定义
Primer T m Requirements
Min Tm Minimum melting temperature allowed for either primer.
Max Tm Maximum melting temperature allowed for either primer.
Optimal Tm Optimal melting temperature desired. This figure is used when
calculating optimal primer pairs.
Maximum Tm Difference
Maximum difference allowed between the T m s of each primer
in the primer pair.
Primer GC Content Requirements
Min %GC Minimum percentage of G and C contained by either primer.
Max %GC Maximum percentage of G and C contained by either primer.
GC Clamp Number of residues on the 3′end required to be a G or C.
Primer Length Requirements
Min Length Minimum length allowed for either primer.
Max Length Maximum length allowed for either primer.
Optimal Length Optimal primer length desired. This figure is used when
Calculating optimal primer pairs.
5' Tail
Forward Primer You can specify a sequence to search for as the forward primer. Reverse Primer You can specify a sequence to search for as the reverse primer.
6. 保存
从File菜单中选择Save或Save as，出现保存对话框，命名以后保存文件。从File菜单中选择Quit退出Primer Express软件。
引物的原理 引物是短的寡核苷酸片段，充当DNA复制的起点。因为几乎所有DNA聚合酶都不能从头合成，所以它们需要一个3’-羟基作为DNA合成的起始点。这个3’-羟基由相配的引物提供。在体内，由于DNA聚合酶的忠实性，不能从头合成DNA，因此只能由RNA聚合酶（称为引物酶）生成，采用RNA引物来延伸，在延伸过程中，RNA引物降解并由DNA 取代。在体外PCR反应中所用到的DNA引物，是根据不同的要求及模板序列设计，然后用化学法人工合成的，与模板形成双链后在DNA聚合酶的作用下就可以继续链的延伸；对于大多数PCR反应，决定整个反应成功与否的最重要因素是引物的序列和质量。 1. 不同实验要求的引物选择 在开始设计引物之前，必须弄清以下几点： （1）明确PCR的目的（例如克隆、SNP检测、定量检测等） （2）确定样品材料（基因组DNA、RNA、微小RNA） （3）确定PCR的类型（普通的、定量PCR、RT-PCR、长片段PCR)，在查找序列的时候还需要考虑可能存在的问题（如假基因等） 2.引物设计的重要因素 有一些不同的软件工具可用于引物设计和引物分析。引物设计的软件如Oligo 6.22 ，Premier 5.0，Primer Express 3。引物分析常用Primer 5，Oligo 6.22，Primer-Blast。目前生工生物给客户提供的引物设计服务引物用的是在线软件Primer 3 plus， 引物长度和专一性 ?常见的引物长度为18-30个碱基。短的引物（≤15碱基）能非常高效地结合, 但是它们的专一性不够。较长的引物能提高专一性，然而退火效率低，从而导致PCR产量低下。同时应避免编码单一序列和重复序列的引物。 平衡GC含量，避免GC-和AT-富集区域 ?引物的GC含量应介于40%～60%之间。应避免聚-（dC）-或聚（dG）-区域，因为它们会降低退火反应的专一性。聚-（dA）-和聚（dT）-也应避免，因为这样会形成不稳定的引物-模板复合物，从而降低扩增效率。 3’-序列
Primer 5.0搜索引物： 1.Primer Length我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。 2.PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。 3.Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以了。 4.搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多,或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。 Oligo 6.0评估引物： 1.在analyze里,Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，The most stable Dimer ove rall 6.7kcal/mol没有问题。 2.Hairpin Formation根据黄金法则 3.False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。 4.在PCR栏，个人感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。 5.Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。下图1引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。 最后说一句，敢于尝试就会成功。 第二贴 －－科室工作很多，小医生了，没有办法，所以肯怕不能满足很多战友的要求（qq聊或帮助设计），在此表示抱歉。就楼上的问题我试着回答一下，不一定正确，供参考吧。 －－1、两个评价系统不一样，个人感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，我一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。 －－2、3端的二聚体应该避免，这个要看你的退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（个人观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。 －－3、个人感觉3端有A无A影响不大，3端有T的没有经验。有T是不是一定不行，个人感觉不见得。软件是评估，法则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。 －－4、错配和二聚体谁轻谁重，个人觉得“到致命的程度”谁都重要，我也说不好。我设计的时候，尽量两个都不得罪。 －－5、GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以我设计的时候，尽量避免这样的情况出现。 谈一下我学这个引物设计的过程吧：
计算机常用软件使用技巧
《常用工具软件使用技巧》论文 班级：学号：姓名 【摘要】本文主要介绍了一些常用的计算机软件使用方法和技巧。重点介绍了系统维护软件，虚拟设备软件，网络基本知识,网络资源查找与下载，多媒体软件，IM软件，办公软件多媒体播放器等等。这些对我们日常使用和维护电脑有很大的帮助。 【关键字】软件使用技巧系统维护工具虚拟设备网络应用工具文件阅读器多媒体设备 1 课程所涉及的软件 1.1 系统维护软件 管理信息系统在完成系统实施、投入正常运行之后，就进入了系统运行与维护阶段。一般信息系统的使用寿命短则4-5年，长则可达10年以上，在信息系统的整个使用寿命中，都将伴随着系统维护工作的进行。系统维护的目的是要保证管理信息系统正常而可靠地运行，并能使系统不断得到改善和提高，以充分发挥作用。因此，系统维护的任务就是要有计划、有组织地对系统进行必要的改动，以保证系统中的各个要素随着环境的变化始终处于最新的、正确的工作状态。
在的硬盘“1”，如果您只有一块硬盘，可以直接按回车。 3、选择要制作镜像文件的分区（即源分区），这里用上下键选择分区“1”（即C分区），再按Tab键切换到“OK“按钮，再按回车。 4、选择镜像文件保存的位置，此时按下“Shift+Tab”键可以切回到选择分区的下拉菜单，按上下键选择分区，例如“1:2”的意思就是第一块硬盘的第二个分区，也就是“D”盘，选好分区后，再按Tab键切到文件选择区域，用上下键选择文件夹，可以再按Tab键，切到“Filename”文本框键入镜像文件名称，如“xp”或“C_BAK.GHO”，然后按回车键即可。 1.2 虚拟设备软件 虚拟机（Virtual Machine），在计算机科学中的体系结构里，是指一种特殊的软件，他可以在计算机平台和终端用户之间创建一种环境，而终端用户则是基于这个软件所创建的环境来操作软件，相互独立操作、互不干扰。在计算机科学中，虚拟机是指可以像真实机器一样运行程序的计算机的软件实现。 1.3 网络基本知识
常用办公软件测试题 一、综合部分 1．对于Office XP应用程序中的“保存”和“另存为”命令，正确的是___。 A．文档首次存盘时，只能使用“保存”命令 B．文档首次存档时，只能使用“另存为”命令 C．首次存盘时，无论使用“保存”或“另存为”命令，都出现“另存为”对话框 D．再次存盘时，无论使用“保存”或“另存为”命令，会出现“另存为”对话框 2．对于Office XP应用程序中的“常用”工具栏上的“新建”命令按钮和“文件”菜单下的“新建”命令项，不正确的是___。 A．都可以建立新文档 B．作用完全相同 C．“新建”命令按钮操作没有“模板”对话框，使用空白模板 D．“文件”后“新建”命令可打开“模板”对话框，可以选择不同的模板 3．不能在“另存为”对话框中修改文档的___。 A．位置B。名称 C．内容D。类型 4．Office XP应用程序中的“文件”菜单底端列出的几个文件名表示___。 A．用于切换的文件B。已打开的文件 C．正在打印的文件D。最近被该Office XP应用程序处理过的文件 5．在文本编辑状态，执行“编辑”到“复制”命令后，___。
A．被选定的内容复制到插入点 B．被选定的内容复制到剪贴板 C．被选定内容的格式复制到剪贴板 D．剪贴板的内容复制到插入点 6．当“编辑”菜单中的“剪切”和“复制”命令呈浅灰色而不能被选择时，表示___。A．选定的内容太长，剪贴板放不了 B．剪贴板里已经有信息了 C．在文档中没有选定任何信息 D．选定的内容三图形对象 7．Office XP应用程序中的工具栏可以___。 A．放在程序窗口的上边或下边 B．放在程序窗口的左边或右边 C．作为一个窗口放在文本编辑区 D．以上都可以 8．可以从___中选择Office XP应用程序中的命令。 A．菜单B。工具栏 C．快捷菜单D。以上都可以 9．Office XP应用程序中使用鼠标进行复制操作应___。 A．直接拖动B。按住
引物设计的11条黄金法则
PCR引物设计的11条黄金法则 1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值
5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T 时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 6.碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端
第119贴【2004－10－12】：常见测试术语一 Acceptance Testing－－可接受性测试 一般由用户/客户进行的确认是否可以接受一个产品的验证性测试。 actual outcome－－实际结果 被测对象在特定的条件下实际产生的结果。 Ad Hoc Testing－－随机测试 测试人员通过随机的尝试系统的功能，试图使系统中断。algorithm－－算法 （1）一个定义好的有限规则集，用于在有限步骤内解决一个问题；（2）执行一个特定任务的任何操作序列。 algorithm analysis－－算法分析 一个软件的验证确认任务，用于保证选择的算法是正确的、合适的和稳定的，并且满足所有精确性、规模和时间 方面的要求。 Alpha Testing－－Alpha测试 由选定的用户进行的产品早期性测试。这个测试一般在可控制的环境下进行的。 analysis－－分析 （1）分解到一些原子部分或基本原则，以便确定整体的特性；（2）一个推理的过程，显示一个特定的结果是假 设前提的结果；（3）一个问题的方法研究，并且问题被分解为一些小的相关单元作进一步详细研究。 anomaly－－异常 在文档或软件操作中观察到的任何与期望违背的结果。
application software－－应用软件 满足特定需要的软件。 architecture－－构架 一个系统或组件的组织结构。 ASQ－－自动化软件质量（Automated Software Quality） 使用软件工具来提高软件的质量。 assertion－－断言 指定一个程序必须已经存在的状态的一个逻辑表达式，或者一组程序变量在程序执行期间的某个点上必须满足的 条件。 assertion checking－－断言检查 用户在程序中嵌入的断言的检查。 audit－－审计 一个或一组工作产品的独立检查以评价与规格、标准、契约或其它准则的符合程度。 audit trail－－审计跟踪 系统审计活动的一个时间记录。 Automated Testing－－自动化测试 使用自动化测试工具来进行测试，这类测试一般不需要人干预，通常在GUI、性能等测试中用得较多。 第120贴【2004－10－13】：常见测试术语二 Backus-Naur Form－－BNF范式 一种分析语言，用于形式化描述语言的语法 baseline－－基线
引物设计的原理与方法 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020
PCR引物设计的原理及方法 阎振鑫S111666(四川大学生命科学学院细胞生物学成都 610014) 摘要：自20世纪后期发展了PCR技术以来，PCR已经改变了整个生物学研究的进程。而PCR反应的第一步就是设计引物，引物设计的好坏直接关系到PCR的成败。PCR引物设计有许多的原则必须要遵循：引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板的序列要紧密互补。引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应等。另外，引物的设计方法也越来越多，出现了许多专门的设计软件和网站，如：PrimerPremier5.0等。 关键词：PCR 引物原理方法 NCBI PrimerPremier5.0 PCR primer design principle and method YanZhenxin (sichuan Univercity, Life science college cell biology chengdu 610014 ) Abstract: When PCR technology was find, PCR has changed all of the program in research of biology. The design of primer is the frist step of PCR. It is relation to the fate of PCR. There are some principals must be obey: dipolymer and hairpin structure must be avoid between different primers. The DNA polymerization reaction should not be triggered at the wrong site. Therefore, there are more and more methods of design primer, include the professional softwares and professional web site. Key word: PCR primer principle NCBI PrimerPremier5.0 聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction。PCR)是20世纪后期发展起来的 一种体外扩增特异DNA片断的技术。具有快速、简便及高度敏感等优点，能极大地缩短目的基因扩增时间[1]。因此，其一直是生物学者们致力于构建cDNA文库、基因克隆以及表达调控研究的必要前提和基础[2]。PCR的第一步就是引物设计。引物设计的好坏，直接影响了PCR的结果，因此这一步很关键。成功的PCR反应既要高效，又要特异性扩增产物，因此对引物设计提出了较高的要求。引物设计需要注意的地方很多，在大多数情况下，我们都是在知道已知模板序列时进行PCR扩增的。在某些情况比如构建文库的时候也会在不知道模板序列的情况下进行设计。这个时候随机核苷酸序列
常用通讯测试工具 鉴于很多MCGS用户和技术人员对通讯测试工具并不很熟悉，本文档将针对实际的测试情况，对串口、以太网通讯调试过程中所涉及到的常用的测试软件进行相关的讲解。 1. 串口测试工具： 串口调试工具：用来模拟上下位机收发数据的串口工具，占用串口资源。如：串口调试助手，串口精灵，Comm等。 串口监听工具：用来监听上下位机串口相关操作，并截获收发数据的串口工具。不占用串口资源。如：PortMon，ComSky等。 串口模拟工具：用来模拟物理串口的操作，其模拟生成的串口为成对出现，并可被大多数串口调试和监听软件正常识别，是串口测试的绝好工具。如：Visual Serial Port等。 下面将分别介绍串口调试助手、Comm、PortMon和Visual Serial Port的使用。
1.1. 串口调试助手： 为最常用的串口收发测试工具，其各区域说明及操作过程如下： 串口状态 打开/关闭串口 十六进制/ASCII 切换 串口数据 接收区 串口参数 设置区 串口数据 发送区 串口收发计数区 发送数据功能区 保存数据功能区 操作流程如下： ? 设置串口参数（之前先关闭串口）。 ? 设置接收字符类型（十六进制/ASCII 码） ? 设置保存数据的目录路径。 ? 打开串口。 ? 输入发送数据（类型应与接收相同）。 ? 手动或自动发送数据。 ? 点击“保存显示数据”保存接收数据区数据到文件RecXX.txt。 ? 关闭串口。 注：如果没有相应串口或串口被占用时，软件会弹出“没有发现此串口”的提示。
1.2. PortMon 串口监听工具： 用来监听上下位机串口相关操作，并截获收发数据的串口工具。不占用串口资源， 但在进行监听前，要保证相应串口不被占用，否则无法正常监听数据。 连接状态 菜单栏 工具栏 截获数据显示区 PortMon 设置及使用： 1). 确保要监听的串口未被占用。 如果串口被占用，请关闭相应串口的应用程序。比如：要监视MCGS 软件与串口1设备通讯，应该先关闭MCGS 软件。 说明：PortMon 虽不占用串口资源，但在使用前必须确保要监听的串口未被占用，否则无法进行监视。 2). 运行PortMon，并进行相应设置。 ? 连接设置： 在菜单栏选择“计算机(M)”->“连接本地(L)”。如果连接成功，则连接状态显示为“PortMon 于\\计算机名(本地)”。如下图：
引物设计step by step 1、在NCBI上搜索到目的基因，找到该基因的mRNA，在CDS选项中，找到编码区所在位置，在下面的origin中，Copy该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 2、用Primer Premier5搜索引物 ①打开Primer Premier5，点击File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口，Copy目的序列在输入框内（选择As），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击Primer，进入引物窗口。 ②此窗口可以链接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项，点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp. ③点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 ④对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况：3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm 应该在55～70度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo来完成，Oligo自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索出的引物质量感觉不如Primer5. ⑤在Primer5窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单栏，选择File-Print-Current pair，使用PDF虚拟打印机，即可转换为Pdf文档，里面有该引物的详细信息。 3、用Oligo验证评估引物 ①在Oligo软件界面，File菜单下，选择Open，定位到目的cDNA序列（在primer中，该序列已经被保存为Seq文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower按钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用Analyze 菜单中各种强大的引物分析功能了。
字处理软件常用使用技巧和习题 1.字处理软件（WPS 、Word）能够处理：文字、图片、表格等信息 （注意：利用字处理软件加工信息，所有操作都要先选择被操作对象） 例1.要制作一个图文并茂的电子报刊，以下软件中哪些是比较合适的？（）A．WORD、WPS B．WORD、写字板 C．WORD 记事本D．写字板、记事本 2.在字处理软件中，键盘上主要按钮的作用：
例2.在字处理软件中，键盘上
microRNA（miRNA）引物设计及过程原理说明microRNAs的平均长度23nt左右，所以miRNA引物设计与常规引物设计存在很大差别，以下讲解一下整个miRNA引物设计的过程加上实验流程，以帮助大家对各方面的学习。 首先，引物设计之前先介绍miRNA反转录合成cDNA的过程。我们拿经典颈环序列GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAT ACGAC作介绍。打开DNAstar软件的PrimerSelect；file打开下拉菜单；打开Enter New Primer…；粘贴颈环序列；点击OK。
颈环结构已经输入，下面查看颈环结构回形成的那些发夹结构。选择颈环结构（鼠标点一下）；点击Report下拉菜单；选择Primer Hairpins。 第一个发夹结构是实验所需的结构(dG=-20.4kc/m)。 下面结合has-miR-122-5P合成cDNA的具体过程讲解 has-miR-122-5P：UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU 将U转T，方便后面使用：TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGT
miRNAs的颈环结构引物：是将miRNAs的3’端后6位碱基反向互补添加到经典颈环结构的3’端形成的结构。(自己根据后面图片想一下原因，加6个碱基为经验所授) has-miR-122-5P的后6位：GTTTGT has-miR-122-5P的后6位的反向互补序列：ACAAAC 颈环引物序列： 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGG ATACGACACAAAC -3’ 查看形成的发夹结构（方法前面有讲） 看一下miRNA和颈环引物在一起会是怎么样子： 在含反转录酶及适当的条件下，miRNA和其颈环引物将会合成cDNA链：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAT ACGACACAAACACCATTGTCACACTCCA
本文叙述了一种用于甲基化分析的探针法定量PCR的引物和探针设计方法，目前用于甲基化检测的引物探针设计工具非常多，都有使用成功的案例，经过初步多方尝试，本文中叙述的为本人认为较为靠谱的方法。Oligo7的优势在于专业，参数详尽且可自由设置，模块化设计，学会后使用便利。专业的活就是要专业的用专业的工具干。
首先是进行序列转换，有较多的在线工具和联机软件都可实现，这里使用https://www.doczj.com/doc/af13940585.html,/methprimer/，较为简单直观。
直接将目标序列放入如上图的编辑框中，此也可直接用于相关引物的设计，不过本人没使用过，因为不能设计探针。submit后就有转化后的序列信息，如下图： 以上详细标记了CpG位置和非CpG位置的C，可直接复制到Word标注使用，下面就可以使用Oligo7利用上边的序列设计引物和探针了，如果是设计非甲基化引物探针，则使用原始序列。
关于引物和探针的一些主要参数，主要参考invtrogen的建议： Primer设计的基本原则： a)引物长度一般在18-35mer。 b)G-C含量控制在40-60%左右。 c)避免近3’端有酶切位点或发夹结构。 d)如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。 e)如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。 f)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 g)退火温度Tm控制在58-60C左右。 h)如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。 T aqMan 探针设计的基本原则： a)T aqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。 b)长度一般为18-40mer 。 c)G-C含量控制在40-80%左右。 d)避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 e)在引物的5’端避免使用G。 f)选用比较多的碱基C。 g)退火温度Tm控制在68-70℃左右。 另：目标变异碱基最好在3’末端或3’末端-1位置，保证扩增特异性，对于甲基化，则最好是C。
一、判断题 1. Realone Player不支持多节目连续播放。（N） 2. 网际快车可以上传和下载文件。（N） 3. 天网防火墙的拦截功能是指数据包无法进入或出去。（Y） 4. SnagIt可以捕获DOS屏幕，RM电影和游戏等画面。（Y） 5. Adobe Acrobat Reader可以解压缩文件。（N） 6. 金山词霸2002支持Windows XP,但不支持office XP系统。（N） 7. 在用Ner-Burning Room刻录CD音乐时，若误将数据文件从本地资源管理器中拖入刻录机虚拟资源管理器中时，该文件将被添加到音乐CD中。（N） 8. Symantec Ghost 可以实现数据修复。（N） 9. Easy Recovery 可以恢复任何被从硬盘上删除的文件。（N） 10. Ctrem软件具有防发呆功能。（Y） 二．选择题（每小题2分，共40分） 1、下列不属于金山词霸所具有的功能的是：（C ） A、屏幕取词 B、词典查词 C、全文翻译 D、用户词典 2、东方快车提供了（C ）种语言翻译。 A、1种 B、2种 C、3种 D、4种 3、:Vintual CD 中的Creat按钮的功能为（B ） A、编辑映像文件 B、创建光盘的映像文件 C、映像文件的显示方式 D、将映像文件插入虚拟光驱 4、下列哪一个软件属于光盘刻录软件（A ） A、Nero-Buring Room B:Virtual CD C: DAEMON Tools D:Iparmor 5、下列不属于媒体播放工具的是（D ） A、Winamp B、超级解霸 C、Realone Player D:WinRAR 6、下列媒体播放器可以自由截取单个画面或整段电影的是非曲直（B ） A、Winamp B、超级解霸 C、Realone Player D、音频解霸 7、下列哪一个不是网际快车为已下载的文件设置的缺省创建类别（ D） A、软件 B、游戏和mp3 C、驱动程序 D、电影 8、CuteFTP具有网际快车不具备的功能是（ A） A、上传文件 B、下载文件 C、断点续传 D、支持多线程下载 9、如果在天网防火墙的ICMP规则中输入（ B）则表示任何类型代码都符合本规则。 A、254 B、255 C、256 D、253 10、Norton Antivirus的安全扫描功能包括（D ） ①自动防护②电子邮件扫描③禁止脚本④全面系统扫描 A、①②③ B、①②④ C、①③④ D、①②③④ 11、ACDSee不能对图片进行下列哪种操作（C ） A、浏览和编辑图像 B、图片格式转换 C、抓取图片 D、设置墙纸和幻灯片放映 12、SnagIt捕获的图片可被存为下列哪些格式（D ） ①BMP ②PCX ③TGA ④RSB A、①②③ B、①②④ C、①②③④ D、①② 13、WinRAR不可以解压下列哪些格式的文件（ D）
1 引物的设计以及初步筛选 引物的设计与初步筛选基本上通过一些分子生物学软件和相关网站来完成的，目前运用软件Primer Premier 5 或美国 whitehead 生物医学研究所基因组研究中心在因特网上提供的一款免费在线PCR引物设计程序 Primer 3来设计引物，再用软件Oligo 6进行引物评估，就可以初步获得一组比较满意的引物。但是对于初学者来说，运用软件和程序来设计引物好象无从着手，其实只要我们掌握了引物设计的基本原则和注意事项，所有问题便迎刃而解。因为无论是软件还是程序，都是以这些基本原则和注意事项为默认标准来进行引物设计的。所以，我们在进行引物设计的时候大可不必在软件和程序的参数上花费过多的时间来思考，如果没有特殊要求我们完全可以把一些参数设为默认值。下面我们主要讨论一下引物设计的原则和注意事项。 ①引物的长度一般为15-30 bp，最好在18~24 bp，因为太短易形成错配(False pr iming) 降低特异性，而太长也会降低特异性，并且降低产量[21。 ②引物在模板内最好具有单一性，也就是说在模板内部没有错配。特别是3’端，一定要避免连续4个以上的碱基互补错配。 ③引物序列的GC 含量最好在40％一60％，且上下游引物序列GC含量的差异不要太大，3’端最后5个碱基最好不要富含GC，特别是连续3个的G或C。 ④DNA双链形成所需的自由能AG，应该以5’端向3’端递减，3’端AG最好不要高于9．0 keaf mol[31。 ⑤避免形成稳定的引物二聚体(Dimer and Cross DimeO 和发夹结构(Hairpin)，AG 高于4．5 keal／mol时易引发上述两种结构的产生。 ⑥引物所在的模板区域应该位于外显子区，最好跨越一个内含子区，这样便于对扩增出来的片段进行功能鉴定和表型分析。 ⑦如果以DNA为模板设计引物，产物长度在100—600 bp比较理想。而以mRNA为模板设计引物时，产物长度在150—300 bp比较理想。 ⑧5’ 端对PCR影响不太大，可以引进修饰位点和标记物[2]。只要掌握了以上原则和注意事项，我们可以在软件和程序设计的一组引物中筛选出几对我们需要的目标引物。Primer Premier 5和Oligo 6可以在https://www.doczj.com/doc/af13940585.html,/soft/下载，primer3的主页位置在h ttp://https://www.doczj.com/doc/af13940585.html,。 2 引物的二次筛选 引物的二次筛选是指在初次筛选出的几对引物中进一步筛选出适合我们进行特异、高效PCR扩增的那对引物。本步应注意以下两点，一是得到的一系列引物分别在Genebank 中进行回检。也就是把每条引物在比对工具(https://www.doczj.com/doc/af13940585.html,/blast/) 的bl astnr中进行同源性检索，弃掉与基因组其它部分同源性比较高的引物，也就是有可能形成错配的引物。一般连续10 bp以上的同源有可能形成比较稳定的错配，特别是引物的3’端应避免连续5-6 bp的同源。二是以mRNA为模板设计引物时要先利用生物信息学的知识大致判断外显子与内含子的剪接位点(例如https://www.doczj.com/doc/af13940585.html,/GENESCAN.html的GENESCA N工具或者GeneParser软，然后弃掉正好位于剪接位点的引物。
、判断题 1. Realo ne Player不支持多节目连续播放。 (N ) 2. 网际快车可以上传和下载文件。(N ) 3. 天网防火墙的拦截功能是指数据包无法进入或出去。(Y ) 4. Snagit可以捕获DOS屏幕,RM电影和游戏等画面。(Y ) 5. Adobe Acrobat Reader 可以解压缩文件。 (N ) 6.金山词霸2002支持Windows XP,但不支持office XP 系统。 (N ) 7. 在用Ner-Burning Room 刻录CD 音乐时,若误将数据文件从本地资源管理器中拖入刻录机虚拟资源管理器中时,该文件将被添加到音乐CD 中。(N ) 8. Symantec Ghost 可以实现数据修复。 (N ) 9. Easy Recovery 可以恢复任何被从硬盘上删除的文件。(N ) 10. Ctrem 软件具有防发呆功能。 (Y ) 二.选择题(每小题2分,共40 分) 1、下列不属于金山词霸所具有的功能的是:(C ) A、屏幕取词 B、词典查词 C、全文翻译 D、用户词典 2、东方快车提供了(C )种语言翻 译。 1种B、2种C、3种D、4种 3、:Vintual CD 中的Creat 按钮的功能为 (B ) 编辑映像文件B、创建光盘的映像文件 映像文件的显示方式D、将映像文件插入虚拟光驱 4、下列哪一个软件属于光盘刻录软件(A ) A 、Nero-Buring Room B:Virtual CD C: DAEMON Tools D:iparmor 5、下列不属于媒体播放工具的是(D ) A、Winamp B、超级解霸 C、Realone Player D:WinRAR
PCR引物设计原理及原则 PCR引物设计原理 PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可以在这一区域设计引物。 现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。 让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域设计引物。 同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。 引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 PCR引物的设计原则： ①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ②产物不能形成二级结构。 ③引物长度一般在15~30碱基之间。 ④G+C含量在40%~60%之间。 ⑤碱基要随机分布。 ⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ⑧引物5′端可以修饰。 ⑨引物3′端不可修饰。 ⑩引物3′端要避开密码子的第3位。 PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。 1.引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。 2.避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。实验表明，待扩区域自由能（△G°）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 3.长度 寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74℃),不能保证产物的特异性。 4.G+C含量
50个工作中最常用excel技巧 1、excel判断分数成绩是否及格，怎么做? 答：excel判断分数成绩是否及格可以用IF进行区间判断。 =IF(A1>60,"及格","不及格") 2、excel频率统计用什么函数? 答：FREQUENCY以一列垂直数组返回某个区域中数据的频率分布，具体用法回复frequency或频率查看示例。 3、excel什么时候要用$符号呢? 答：复制公式时，单元格的引用位置不想发生变化时，就在行号或列标前加$，了解详情回复“绝对引用”查看教程 4、合并单元格后里面的数据或文字我都想保留如何处理? 答：多个单元格都含有内容，如果要在合并后保留所有单元格的内容，可以用下面的方法。 1.选取单元格区域，并把列宽拉到可以容下所有单元格合并后的宽度。 2.开始选项卡- 编辑- 两端对齐。把多个单元格的内容合并到一个单元格中 3.在分隔的空隔处按alt+enter键添加强制换行符，换行。 4.再合并单元格 5、插入表格后发现行数不够，怎样才能再次快速插入更多行? 答：需要插入多少行就选取多少行，然后就会一次插入多少空行 6、合并单元格后里面的数据或文字我都想保留如何处理 答：多个单元格都含有内容，如果要在合并后保留所有单元格的内容，可以用下面的方法。 1.选取单元格区域，并把列宽拉到可以容下所有单元格合并后的宽度。 2.开始选项卡- 编辑- 两端对齐。把多个单元格的内容合并到一个单元格中 3.在分隔的空隔处按alt+enter键添加强制换行符，换行。 4.再合并单元格 7、如何复制粘贴行宽 答：粘贴后的粘贴选项中，会有保留源列宽的选项。如下图所示
8、excel如何把数值批量转换成文本 答：数据- 分列- 第三步选文本 9、excel如何把空值全部填写为“0“ 答：定位- 条件- 空值- 在编辑栏中输入0，按ctrl+enter完成输入 10、excel2010的插入特殊符号在哪里? excel2010版本的特殊符号, 很多同学在搜这个问题，可以肯定的说excel2010版本里没有这个命令的。大家不用再费心找了，如果要插入符号，可以从插入选项卡- 符号里找找。在微信平台回复“特殊符号”可以查看更多符号输入方法 11、excel如何去掉地址栏的名称 excel如何去掉地址栏的名称，excel2003版，插入菜单- 名称- 定义- 在弹出的窗口找到该名称点删除按钮，2010版，公式选项卡- 名称管理器-找到名称点删除 12、如何按日期显示星期? 问：excel如何按日期显示成星期 答：公式 =TEXT(A2,"aaaa") =WEEKDAY(A2,2) 也可以通过格式设置把日期显示成星期 13、excel如何隐藏公式? 在excel里，如何隐藏公式，让公式别人看不到呢? 答：在excel里隐藏公式是通过设置单元格格式设置的。 选取公式所在单元格，右键菜单中点设置单元格格式，然后在弹出的单元格格式窗口点保护选项卡，勾选隐藏公式选项。 最后通过工具- 保护-保护工作表(excel2010里是通过审阅- 保护工作表)。然后在单元格或编辑栏里就看不到公式了。 14、excel表格中下拉复制数字时，为什么不变大呢?怎么才能递增?