目录
第一章引言 (1)
1.1新城疫病毒概述 (1)
1.2炎症小体 (2)
1.2.1炎症小体概述 (2)
1.2.2炎症小体类型 (4)
1.2.2.1NLRP1炎症小体 (4)
1.2.2.2常规NLRP3炎症小体 (5)
1.2.2.3非常规NLRP3炎症小体 (6)
1.2.2.4NLRC4炎症小体 (8)
1.2.2.5NLRP6和NLRP12炎症小体 (9)
1.2.2.6AIM2和IFI16炎症小体 (9)
1.2.2.7pyrin炎症小体 (11)
1.3炎性小体与病毒 (11)
1.3.1ALR与病毒 (11)
1.3.2NLRP3炎症小体与病毒 (12)
1.3.3RLR与病毒 (14)
1.3.4病毒调控炎症小体 (14)
1.3.5总结 (15)
1.4本研究的目的及意义 (16)
第二章新城疫病毒激活NLRP3炎症小体 (17)
2.1材料和方法 (18)
2.1.1病毒和细胞系 (18)
2.1.2小鼠 (18)
2.1.3抗体与试剂 (18)
2.1.4主要试剂的配制 (19)
2.1.5主要仪器 (19)
2.1.6病毒灭活 (19)
2.1.7THP-1细胞分化为巨噬细胞 (19)
2.1.8荧光定量PCR检查NDV感染后炎症小体相关分子的mRNA水平 (20)
2.1.9ELISA检查NDV感染THP-1细胞上清中IL-1β含量 (21)
2.1.10Western-blot检查炎症小体组分 (21)
2.1.11表达shRNA的慢病毒包装 (21)
2.1.12稳定表达shRNA的细胞系的构建 (23)
2.1.13诱导骨髓来源巨噬细胞 (23)
2.2结果 (23)
2.2.1THP-1细胞诱导为巨噬细胞 (23)
2.2.2THP-1干扰细胞系的构建 (24)
2.2.3荧光定量PCR检查炎症小体组分mRNA表达情况 (24)
2.2.4NDV刺激PMA诱导的THP-1细胞分泌IL-1β (25)
2.2.5WB检查NDV感染后Caspase-1和IL-1β活化情况 (26)
2.2.6Caspase-1抑制剂抑制NDV诱导的IL-1β分泌 (27)
2.2.7NDV激活NLRP3炎症小体 (27)
2.2.8NDV感染BMDM激活NLRP3炎症小体 (28)
2.3讨论 (29)
第三章NLRP3炎症小体活化对新城疫病毒复制的影响 (30)
3.1材料和方法 (31)
3.1.1病毒和细胞系 (31)
3.1.2抗体和试剂 (31)
3.1.3主要缓冲液及试剂的配制 (31)
3.1.4主要仪器 (31)
3.1.5细胞活性检测 (32)
3.1.6病毒TCID50测定 (32)
3.1.7利用CRISRP/Cas9技术构建敲除GSDMD基因的THP-1细胞系 (32)
3.2结果 (32)
3.2.1NDV感染细胞死亡情况 (32)
3.2.2shRNA干扰NLRP3炎症小体组分对病毒复制的影响 (34)
3.2.3Caspase酶抑制剂处理对NDV复制的影响 (34)
3.2.4NDV感染诱导GSDMD剪切 (35)
3.2.5病毒感染敲除GSDMD细胞系IL-1β分泌量下降 (35)
3.2.7敲除GSDMD有利于NDV复制 (36)
3.3讨论 (37)
第四章新城疫病毒蛋白与NLRP3炎症小体 (38)
4.1材料和方法 (39)
4.1.1病毒和细胞系 (39)
4.1.2抗体与试剂 (39)
4.1.3主要缓冲液及试剂的配制 (39)
4.1.4主要仪器 (39)
4.1.5在THP-1细胞中扩增人ASC，pro-IL-1β和pro-Caspase-1基因 (40)
4.1.6相关真核表达质粒构建 (40)
4.1.7稳定表达目的蛋白的THP-1和293T细胞系构建 (41)
4.1.8检查LPS+ATP激活NLRP3炎症小体，病毒蛋白对其影响 (42)
4.1.9在293T细胞中重建NLRP3炎症小体 (42)
4.1.10间接免疫荧光检查NLRP3和ASC与病毒蛋白亚细胞共定位 (42)
4.2结果 (42)
4.2.1病毒蛋白对LPS+ATP激活的NLRP3炎症小体的影响 (42)
4.2.2在293T细胞中重建NLRP3炎症小体 (43)
4.2.3NP、P、V和W对重建NLRP3炎症小体的影响 (44)
4.2.4间接免疫荧光检查NLRP3和ASC与病毒蛋白共定位 (45)
4.3讨论 (47)
第五章全文结论 (49)
参考文献 (50)
致谢 (61)
作者简历 (62)
英文缩略表
英文缩写英文全称中文名称
NDV Newcastle disease virus 新城疫病毒
PRRs pattern recognition receptors 模式识别受体
TLRs Toll-like receptors Toll样受体
RLR RIG-I like receptor RIG-I样受体
THP-1 human acute monocytic leukemia cell line 人急性单核白血病细胞IFN interferon 干扰素
PAMP Pathogen-associated Molecular patterns 病原相关分子模式BMDMs bone marrow-derived macrophages 骨髓来源巨噬细胞DAMP danger- associated Molecular patterns 危险相关分子模式
ASC apoptosis-associated speck-like protein
containing a CARD 凋亡相关斑点样蛋白
NLR NOD-like receptors NOD样受体
LRRs C-terminal leucine-rich-repeat 羧基端富亮氨酸重复结构域CARD Caspase recruitment and activation Caspase募集结构域
Caspase cysteine-dependent aspartate-directed protease 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶
PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链式反应
PMA Phorbol-12-myristate-13-acetate 佛波酯-12-肉豆蔻酸酯-13乙酸酯
DAPI 4’，6-diamidino-2-phenylindole 4’，6-二眯基-2-苯基吲哚DMSO dimethyl sulphoxide 二甲基亚砜
PYD pyrin domain 脓素结构域
ATP adenosine triphosphate 腺嘌呤核苷三磷酸
MOI Multiplicity of infection 感染复数
NLRP3 NACHT ，LRR and PYD domains-containing
protein 3 nucleotide-binding
NACHT、LRR和PYD结构域
蛋白3核酸结合寡聚化结构域
KSHV kaposi sarcoma-associated herpes virus 卡波西氏肉瘤病毒EBV epstein-Barr virus EB病毒
CPE cytopathic effect 致细胞病变效应cDNA complementary DNA 与RNA互补的DNA DMEM dulbecco’s minimal essential medium 细胞培养基
PBS phosphate-buffered saline 磷酸盐缓冲液
NP nucleocapsid protein 核衣壳蛋白
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay 酶联免疫吸附试验FBS fetal bovine serum 胎牛血清