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2-脱氧链霉胺类抗生素的生物合成研究进展#
吕美男，虞沂**
5 （武汉大学药学院） 摘要：2-脱氧链霉胺（2-DOS）类抗生素作为氨基糖苷类抗生素中种类最多的亚类，具有良 好的生物活性， 并被广泛应用于临床治疗各种病原微生物引起的感染。 其生物合成途径及酶 催化机理方面的研究对进一步开发和改造该类别抗生素， 以及应对日益严重的病原微生物耐 药性问题具有重要意义。本综述详细介绍了近年来与 2-DOS 类抗生素生物合成相关的研究 方法的进展， 并归纳总结了其生物合成途径中几种重要而特殊的酶催化机理， 也讨论了当前 氨基糖苷类抗生素研究所面临的机遇和挑战。 关键词：药物生物学；生物合成；抗生素；2-脱氧链霉胺 中图分类号：R915
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The research progress in the biosynthesis of 2-deoxystreptamine derived aminoglycoside antibiotics
LV Meinan, YU yi
(School of Pharmaceutical Sciences,Wuhan University) Abstract: As one of the largest groups of aminoglycoside antibiotics, 2-deoxystreptamine (2-DOS) derived antibiotics possess excellent biological activities, and have been widely used in clinical practice to treat infections caused by varieties of pathogenic microorganisms. The identification and characterization of the biosynthetic pathways and enzymatic mechanisms underlying 2-DOS derived antibiotics biosynthesis have great significance in developing and engineering aminoglycoside antibiotics, which is important in dealing with the increasingly serious multidrugresistant bacterias. This review presents the development of research techniques in recent years which facilitate the study on the biosynthesis of 2-DOS derived antibiotics, summarizes several important and special enzymatic mechanisms that direct 2-DOS antibiotics biosynthesis, and discusses the future opportunities and challenges in studying aminoglycoside antibiotics. Key words: Pharmaceitical biology; Biosynthesis; Antibiotics; 2-deoxystreptamine
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0 引言
氨基糖苷类抗生素是由氨基糖或氨基环醇与配基通过糖苷键连接所形成的一类抗生素。 自 1944 年 Waksman[1]发现第一个抗结核制剂链霉素后，新霉素、卡那霉素、庆大霉素、妥 布霉素、 丁酰苷菌素等其他氨基糖苷类抗生素被广泛挖掘， 并用于临床或作为兽药治疗细菌、 支原体、衣原体等病原菌的感染，尤其是革兰氏阴性菌的感染。氨基糖苷类抗生素根据其核
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心结构被划分为四类（图 1）[2]：1）肌醇类，包括链霉素、壮观霉素等；2）2-脱氧链霉氨 (2-DOS)类，包括卡那霉素、庆大霉素、丁酰苷菌素、新霉素等；3）C 7 N 氨基环醇类，如 防治水稻纹枯病的井冈霉素，对 II 型糖尿病有特殊疗效的阿卡波糖等；4）氨基环戊醇类， 如作为抗癌制剂应用的密旋霉素等。
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基金项目：教育部高等学校博士学科点专项科研基金（20100146120021） 作者简介：吕美男（1988），女，硕士研究生，主要研究方向是微生物天然产物生物合成 通信联系人：虞沂（1978），男，副教授，主要研究方向是天然产物生物合成. E-mail: yu_yi@https://www.doczj.com/doc/a917298330.html,
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分 类
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氨基糖苷类抗生素
肌 醇 类
2脱 氧 链 霉 氨 类
HO HO
R2 O R1 HO O HO H2N OH NH2 O O OH NH2
R2
R1 O NH2 H2N HO O O O OH NH2
HO
R1 R2 A: OH NH2 B: NH2 NH2 C: NH2 OH
NHCH3 CH3
R1 C1 : CH3 C1a : H C2 : CH3
R2 NHCH3 NH2 NH2
C7N 氨 基 环 醇 类
H 3C O N H H HO CH3 HO H C HN H3C HO H2C O CH3 O NH NH2 O CH3
氨 基 环 戊 醇 类
H3C
图1 氨基糖苷类抗生素分类 Fig. 1 Classification of aminoglycoside antibiotics
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2-DOS 类抗生素是数量最多的氨基糖苷类抗生素。依据取代位置，主要分为 4, 5-二取 代，4, 6-二取代及其他类 2-DOS 抗生素, 其主要核心结构为 2-脱氧链霉胺（2-DOS）[3]。此 类抗生素生物合成的限速步骤为 2-脱氧蟹肌醇糖（2-DOI）的合成，该步骤主要由 2-DOI 合 成酶催化。2-DOI 合成酶是从新霉素，丁酰苷菌素产生菌 Streptomyces fradiae IFO 13147 和 Bacillus circulans SANK 72073 的胞质粗蛋白中经分离纯化得到的单一酶[4,5]。该酶可选择性
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的与闭环形式的 6-磷酸葡萄糖结合，在氧化型 NAD+辅因子作用下，C4 位发生氧化，接着 脱去磷酸在 C5、C6 之间形成双键，然后在还原型 NADPH 的作用下 C4 发生还原，最后经 过两步转氨基及一步脱氢反应生成 2-DOS（如图 2）。
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图2 2-DOS的合成 Fig. 2 Biosynthesis of 2-DOS
2-DOS 类抗生素具有广谱抑菌和杀菌作用，主要作用于细菌核糖体 16S rRNA，并与其 紧密结合而导致翻译过程中 mRNA 密码子的错读，从而抑制细菌蛋白质的合成，达到抑制 细菌生长甚至杀菌的活性。 该类抗生素在临床上具有重要应用价值， 主要用于治疗由细菌和 60 一些原生动物支原体等引起的感染，某些成员还具有 RNA 和 DNA 识别能力，以及抗 HIV 病毒的生物活性[6,7]。基于其重要的应用潜力, 2-DOS 类抗生素越来越受到人们的关注, 对其 生物合成途径的全面揭示也势在必行， 但一直以来， 该领域的研究进展相比其他类别天然产 物严重滞后，原因包括：1）2-DOS 类抗生素生物合成基因簇一般比较大，难以获得包含完 整生物合成基因簇的质粒载体，异源表达难度大；2）这类抗生素的产生菌具有对多种天然 65 抗生素的耐受性，分子遗传操作比较困难；3）该类抗生素生物合成途径中的酶大多在大肠 杆菌中难以表达成具生物活性的可溶性蛋白，为体外酶促反应的表征增添了障碍。近几年， 得益于氨基糖苷类化合物检测与分析方法的进步以及体外酶促反应搭建方法的改进，针对 2-DOS 类抗生素尤其是 4, 6-二取代亚类（以卡那霉素为代表）的生物合成研究取得了突破 性进展。本文将围绕以上进展展开综述，重点归纳和总结负责 2-DOS 类抗生素生物合成途 70 径中的特殊酶反应及其催化机理， 这些研究成果不仅解释了若干年来抗生素生物合成领域悬 而未决的科学问题，而且对其它类别抗生素生物合成途径的研究具有重要的指导意义。
1 氨基糖苷类抗生素生物合成研究分析方法的发展
1.1
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检测方法
对氨基糖苷类抗生素展开生物合成研究， 首要解决的问题是如何对其及生物合成中间体
进行有效的检测。传统上，最快的检测方式是生物测定，由于此类抗生素可以抑制多种大肠 杆菌、金黄色葡萄球菌的生长，所以可根据抑菌圈的大小进行初步检测，但此方法灵敏度不 高， 无法对样本进行定性和定量分析， 也不能分析中间产物， 因此只能作为初步判断。 此外， 由于大多数氨基糖苷类抗生素缺少不饱和结构单元，没有紫外吸收，因此不能用常规的
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HPLC–UV/PDA 进行检测，而是使用柱后衍生化或荧光检测的方法分析此类化合物，如 OPA(ortho-phthalaldehyde)衍生化法[8]。这类方法比较直观，可以对样本进行定性和定量，但 样本的制备流程比较麻烦， 衍生化产物不稳定， 检测过程中经常出现多种杂峰， 不利于分析。 现在，对于紫外吸收不强的化合物多用 HPLC-MS 联用技术进行检测。由于氨基糖苷类抗生 素含有多个氨基和羟基，亲水性很强，因此，这类化合物在 C18 柱中的出峰时间非常早， 不利于检测。Je Won Park 等[9]对庆大霉素及其中间体检测时在流动相中加入了七氟全丁酸 85 （HFBA），它可与氨基结合，形成离子对，延长了氨基糖苷类抗生素在液相色谱中的保留 时间，有利于此类抗生素的检测分析。2011 年，Je Won Park 等[10]运用此方法发现卡那霉素 生物合成中新的中间体 2’-脱氨-2’-羟基巴龙霉氨，并用 HPLC-MS 联用分离制备此中间体， 从而展开了对卡那霉素生物合成途径的深入研究。 这种检测方法对分析检测新的组分也很有 效，在传统的黑暗链霉菌 Streptomyces tenebrarius 中发现了共九种氨基糖苷组分安普霉素、 90 妥布霉素、氨甲酰卡那霉素及新霉胺等[11]。HPLC-MS 联用使高效液相色谱的高分离效能与 质谱的高灵敏度、 高选择性及丰富的结构预测相结合， 为氨基糖苷类抗生素生物合成研究提 供了有利的检测保障。
1.2
95
异源表达
异源表达可分为两类， 第一类是抗生素生物合成基因簇在异源宿主中进行表达， 一些在
原始产生菌中难以进行遗传操作的生物合成途径可放在模式异源宿主中进行研究。Je Won Park[12]等通过不同的基因重组后在 S. venezuelae YJ003 异源表达，很快确定了负责合成庆大 霉素前体的基因，为庆大霉素进一步生物合成研究提供了重要基础。Je Won Park 等[13]在 S. venezuelae YJ003 也异源表达出卡那霉素生物合成新的中间体，并进一步解析卡那霉素生物 合成途径及各基因的功能， 并且通过基因工程的方法将合成卡那霉素的基因与具活性的丁酰
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苷菌素侧链 N-AHBA 的七个基因进行重组，并在 S. venezuelae YJ003 中成功表达出活性更 强的 1-N-AHBA-卡那霉素。第二类异源表达是蛋白表达，在研究生物合成途径中催化关键 步骤的合成酶时， 可将其编码基因与标签蛋白编码序列进行连接， 在合适的异源宿主如大肠 杆菌中表达出融合蛋白， 方便后期对目标酶蛋白的纯化。 但有些在原核生物如大肠杆菌中表 达，缺乏后修饰系统，得到可溶的具有生物活性的蛋白比较难，如甲基转移酶 GenK，直接
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在大肠杆菌中表达易形成包涵体， Hungwen-Liu 等[14]通过对此包涵体盐析再折叠， 并在一定 的无机盐溶液中培育，并通过 EPR（电子顺磁共振）技术检测产生[4Fe-4S]簇，验证其产生 相应的活性基团[15]；卡那霉素糖基化酶 KanM1 及妥布霉素氨甲酰化酶 TobZ 在大肠杆菌中 直接进行蛋白也容易形成包涵体， 将负责编码它们的基因分别导入到不同的链霉菌中进行异 源表达才获得可溶性有活性的蛋白[10, 16]。
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2 2-脱氧链霉胺类抗生素生物合成途径中特殊的酶及其催化机理研 究
近几年，对 2-脱氧链霉胺类抗生素的生物合成途径的研究取得极大的进展，主要是由 于对其中的酶催化路径的深入解析， 因此， 对抗生素生物合成途径中的酶研究具有重要的意 义，尤其是特殊酶及其催化机理的研究对研究各个抗生素生物合成起着关键作用。
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2.1
双功能氨基转移酶 BtrS
2-DOS 是在葡萄糖经 2-脱氧蟹肌醇糖合成酶催化形成 2-DOI 后经过两步转氨及一步脱
氢反应形成。在前期的工作中，根据生物信息学和酶学测活表征，2-DOI 第一步转氨反应形
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成 2-DOIA （2-脱氧蟹肌醇胺） 是由 BtrS 与辅因子 L-谷氨酸和磷酸吡哆醛共同参与催化的[17]。 Walker 等[18]曾证明类似的氨基转移酶不仅催化第一步转氨反应，并且第二步转氨基的逆反 120 应也可能由同一个酶参与。Kakenuma[19]等分析丁酰苷菌素生物合成基因簇中只有一个基因 btrS 编码氨基转移酶，推测 BtrS 可能催化 2-DOI 形成 2-DOS 中两步转氨基反应（图 3）。 btrS 基因中断后，丁酰苷菌素不再产生，喂养 2-DOIA 后仍然没有产生，只有喂养 2-DOS 后丁酰苷菌素才恢复产生，表明 BtrS 参与了 2-DOIA 向 2-DOS 的转氨反应。通过对 BtrS 逆 向反应产物进行化学结构鉴定也证明了这一结论，结合前期工作[17]， BtrS 被表征为一个双 125 功能氨基转移酶。 在对 2-DOIA 衍生物物理性质检测时发现， 它具有光学活性， 推测 BtrS 可 能有选择性的催化某些底物。BtrS 能够利用外消旋体 2-DOI 及其对映异构体（ent-2-DOI） 混合物为底物进行体外反应， 检测得到的产物也是外消旋体， 说明 BtrS 对 2-DOI 及 ent-2-DOI 无底物选择性；但 BtrS 能够利用 2-DOIA 为底物反应，却不能利用 2-DOIA 的对映异构体 ent-2-DOIA 为底物反应或以 2-DOS 为底物逆反应产生 ent-2-DOIA[19]。2-DOI 及 ent-2-DOI 130 差别仅在羰基的α位，说明α位取代对 BtrS 反应无影响；而 2-DOIA 与 ent-2-DOIA 差别在 于羰基的β位取代，说明β位取代对 BtrS 反应有影响。这些影响可能是由于酶与底物之间 形成氢键或静电作用力造成的，α位取代对这种作用力没有影响，而β位起决定作用。 2-DOIAβ位羟基可以与酶活性位点形成氢键相互作用，而 ent-2-DOIAβ位氨基与酶活性位 点相互排斥，决定了 2-DOS 逆反应不会产生 ent-2-DOIA，而只会特异性的产生 2-DOIA。这 135 种简单的相互作用力，却极大的决定了酶对底物识别作用。因此，BtrS 不仅是双功能氨基 转移酶，催化 2-DOI 转氨基作用形成 2-DOIA，也催化 2-DOIA 脱氢氧化后的下一步转氨基 反应形成 2-DOS，并且具有对 DOS 前手性及立体识别的功能。
140
图 3 BtrS 催化的反应 Fig. 3 The reaction catalyzed by BtrS
2.2
SAM 自由基依赖的脱氢酶 BtrN
上述所提到的 2-DOI 形成 2-DOS 的反应中，2-DOIA 需经氧化反应形成酮羰基形式的
amino-DOI，这步反应是由 BtrN 催化。F. Kudo[20]等报道 NeoA 是一个 NAD 依赖的脱氢酶， 145 催化 2-DOIA 氧化形成 amino-DOI，在丁酰苷菌素生物合成基因簇中有其同源蛋白编码基因 btrE， 但可能由于 BtrE 缺乏锌结合位点， 它和 NeoA 有不同的催化活性。 Kenichi Yokoyama [21] 等通过生物信息学分析，丁酰苷菌素生物合成途径中有一个编码功能未知酶的基因 btrN。 BtrN 属于典型的 SAM 自由基酶超家族，与其它成员[22]一样，在活性位点有一个共同的 [4Fe-4S]簇，该簇中 Fe 与三个半胱氨酸共价结合，最后一个 Fe 与 SAM 相互作用。反应时， 150 [4Fe-4S]簇通过内部电子转移，引发 SAM 中 C5’-S 键发生还原均裂，产生 5’-脱氧腺苷自 由基（5’-dAdo? ）和甲硫氨酸，5’-脱氧腺苷自由基可以进一步引发多种特殊及重要的自 由基反应， 因此 Kenichi Yokoyama 等展开了对 BtrN 功能及催化机理的深入研究。 当把 BtrN 中断后，丁酰苷菌素不再产生，喂养 2-DOIA 后，仍然没有产生，而喂养 2-DOS 后，丁酰
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苷菌素才恢复产生，结合 BtrS 负责的转氨反应，推测 BtrN 可能催化 2-DOIA 氧化形成 amino-DOI。通过酶学测活反应，在底物 SAM 和 2-DOIA 存在下，BtrN 确实能催化此反应 发生。速率及动力学分析表明，SAM 首先参与反应，并且 1 分子的 SAM 能同时产生 1 分 子的甲硫氨酸和 5’ -脱氧腺苷， 1 分子的 2-DOIA 作为第二底物被氧化。 同位素 （[3-2H]DOIA） 标记实验显示，有三种 5’-脱氧腺苷产物 5’-dA-CH3、5’-dA-CH2D、5’-dA-CHD2 的产 生，表明 5’-脱氧腺苷自由基夺去底物 2-DOIA 的 3 位羟基碳相连的氢形成 2-DOIA? ，且 160 这一步反应是可逆的，但由于去氢后的底物自由基氧化较慢，2-DOIA? 也会可逆的夺去 5’ -脱氧腺苷上的氢，产生的 5’-dA-CHD? 与甲硫氨酸重新结合形成重氢标记的 SAM 和无重 氢标记的 2-DOIA， 二种产物继续参与反应， 可产生三种 5’ -脱氧腺苷产物， 间接证明 2-DOIA ? 再形成 amino-DOI 的过程较慢，可能是反应的限速步骤。根据上述基因中断、酶学测活 反应、速率及动力学分析，以及同位素标记等，推测 BtrN 的反应机制如下：[4Fe-4S]+还原 165 裂解 SAM 产生 5’-dAdo? ，[4Fe-4S]+氧化为[4Fe-4S]2+；5’-dAdo? 夺去 2-DOIA 的 3 位羟 基碳相连的氢，产生 2-DOIA 底物自由基中间体（图 4）。由于每分子 SAM 产生 1 分子甲 硫氨酸和 5’-脱氧腺苷，表明 5’-dAdo? 每个循环只参与一次反应，因此 2-DOIA 底物自 由基中间体的电子转移给[4Fe-4S]2+，一方面使底物氧化形成酮羰基的形式即 amino-DOI， 另一方面[4Fe-4S]2+还原为[4Fe-4S]+，增加其还原电势为下一个自由基循环提供有利的能量。 170 自由基酶是厌氧的，整个反应都是在无氧状态下完成，上述反应成功的利用 SAM 作为氧化 剂而非氧气将底物氧化，并第一次解析了此类厌氧酶的反应机制，对此类酶的深度解析，如 催化丝氨酸氧化的 AstB 酶的催化机制的解析[23]，具有很大的借鉴意义。
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图 4 BtrN 催化的反应及机制 Fig. 4 The reaction catalyzed by BtrN and its mechanism
2.3
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GenK,钴胺素依赖的 SAM 自由基甲基转移酶
GenK，与上述 BtrN 一样，也属于 SAM 自由基酶超家族中的一员，包含一个高度保守
的 CXXXCXXC 基序， 其中有一类酶在 N 端有钴胺素结合位点， 一般催化甲基化反应， GenK 就属于这一类。 前期生物信息学分析及基因敲除实验证明 GenK 催化 gentamicin X2 （GenX2） 的甲基化合成中间体 G418[24,25,26]。Hung-wen Liu[14]等通过 GenK 体外反应提出了此类甲基 化反应机制。 作者通过两种不同的 HPLC 检测条件， 一方面检测反应后 SAM 消耗产生的 5’ -脱氧腺苷（5’-dAdo）和 S-腺苷同型半胱氨酸（SAH），另一方面检测 G418 的产生，得
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出以下结论：1）甲基钴胺素或羟基钴胺素都可作为辅因子参与反应，而钴胺素不行；2）5’ -dAdo 和 G418 产生速率是相同的；3）SAH 在没有 GenK 参与，而只在甲基钴胺素或羟基 钴胺素的作用下也能产生。为了证明钴胺素在 G418 甲基转移中所起的作用，作者采用氘甲 基标记的 SAM（13CD3-methl-SAM）进行同位素喂养试验，发现 G418 和钴中都有标记的
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甲基出现，从而解释了甲基是从 SAM 中转移给钴，进而转移到 gentamicin X2 中。GenK 所 参与反应中的化学计量学显示 5’-dAdo 和 SAH 产量相同，即 5’-dAdo、G418 和 SAH 的 产率相同。 根据以上实验结果， 作者提出三种反应机制 （图 5） ： a） [4Fe-4S]簇还原裂解 SAM 产生 5’-dAdo 自由基（5’-dAdo? ），5’-dAdo? 从 gentamicin X2 底物 C-6’位夺去一个 H，使底物成为自由基的形式，接着与甲基钴胺素裂解产生的甲基自由基结合形成甲基化的 底物，即 G418，产生钴（II），然后钴（II）或进一步还原成钴（I）[27]，从另一分子 SAM 195 中夺去甲基产生 SAH 回到原始状态；b）开始阶段的反应机制与 a 相同，底物 SAM 形成自 由基后，C-6’位羟基去质子化并发生自由基转移形成氧自由基，C-6’亲核攻击钴甲基，使 钴裂解成钴（I），进而从另一分子 SAM 中夺去甲基产生 SAH，氧自由基在外源质子作用 下失去形成羟基；c)与 b 机制一致，C-6’亲核攻击钴甲基，不同的是甲基钴的形成不再消 耗另一分子的 SAM，而是氧自由基从 5’-dAdo 中夺去氢形成 5’-dAdo? ，5’-dAdo? 与 200 甲硫氨酸作用重新形成 SAM，钴（I）夺去其中的甲基，形成 SAH。由于前面实验结果显示 5’-dAdo、SAH、G418 的产率是相同的，这意味着每次反应要消耗 2 分子的 SAM，a、b 机制与此相同，一分子用来产生 5’-dAdo? ，另一分子使钴重新甲基化；c 机制中 5’-dAdo 可以循环利用，而且一个循环只消耗 1 分子 SAM，与前面所述实验结果不符，因此 a、b 机 制可能符合 GenK 的催化机理，虽然目前还无法判断 a、b 到底哪种机制正确，但该研究成 205 果给予了甲基化机理研究许多启发。目前，除了 GenK，只有两个 SAM 自由基甲基转移酶 的体外功能被阐释清楚， 催化磷酸基团甲基化的 PhpK 及硫链丝菌素 A 生物合成中色氨酸甲 基化的 TsrM[28,29]；但这两个 SAM 自由基甲基转移酶的作用机制并没有阐明，GenK 功能及 作用机制的阐释，为此类酶的研究奠定了基础。
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图 5 GenK 催化的反应及机制 Fig. 5 The reaction catalyzed by GenK and its mechanism
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非血红素铁/α-酮戊二酸依赖的加双氧酶 KanJ 和 NADPH 依赖的还原酶 KanK
2-DOS 类氨基糖苷抗生素中仅有卡那霉素 A 的 2’位为羟基，其他成员的 2’位均为氨
基。 根据生物信息学比对， 卡那霉素生物合成基因簇中有两个未被阐释的基因所编码的蛋白 与其它的抗生素生物合成基因都不同，推测可能与这一特性有关。因此，Hilda Sucipto[30]等 对这两个蛋白，加双氧酶 KanJ 和 NADP（H）依赖的氧化还原酶 KanK 进行了深入研究， 220 不仅证明二者共同参与了由卡那霉素 B 合成卡那霉素 A 这一步骤，并揭示了其所参与的特 殊反应的机理。 首先作者对辅因子进行研究确定 KanJ 的辅因子为α-酮戊二酸和 FeⅡ， KanK 的辅因子为 NADPH。当体外反应体系中缺少 NADPH 或 KanK 时，反应产物中检测不到卡 那霉素 A，但卡那霉素 B 仍然被消耗，推测可能有酮基形式的中间体产生。在反应体系中 加入还原剂 NaBH4 或 NaBD4 后卡那霉素 A 能够产生，证明酮基形式的中间体确实存在， 225 只是不稳定。酮基中间体存在，那么其形成时肯定会同时发生 2’位脱氨，加入谷氨酸脱氢 酶，检测到α-酮戊二酸紫外吸收减少，即形成谷氨酸，证明了氨的产生，所以 KanJ 反应产 物为酮基中间体及氨气。KanJ 参与的氧化脱氨反应与大家所熟知的核苷酸脱氨酶反应是不 同的，核苷酸脱氨酶是胞苷或腺苷先与水作用发生水解，再脱氨形成羰基[31]。那么 KanJ 参 与酮基中间体的形成是怎样的一种反应机制呢？与 TauD[32]类似，KanJ 与 FeⅡ形成复合物， 230 α-酮戊二酸可以与 Fe 的活性中心结合，KanJ 可以转移一个氧分子到此物种中，形成 [FeIV=O]，它的反应活性会打破底物不活泼的碳氢键，夺取氢原子发生均裂形成[FeIII-OH]， 底物即卡那霉素 B 形成碳自由基后，接着[FeIII-OH]提供羟基自由基与碳自由基结合形成缩 醛氨中间体，进而脱氨形成酮基中间体；[FeIII-OH]物种脱去二氧化碳形成琥珀酸盐，最终 回到原始的酶活性形态。总结由卡那霉素 B 合成卡那霉素 A 的反应步骤为：第一步由 FeⅡ 235 /α-酮戊二酸依赖的 KanJ 参与， 催化氧化脱氨反应； 第二步是 NADPH 依赖的 KanK 参与的 还原反应，即卡那霉素 B 先氧化形成酮基中间体，再还原形成终产物卡那霉素 A（图 6）。 2011 年，Je Won Park 等[14]研究出负责合成卡那霉素 A、卡那霉素 B、卡那霉素 C 三种成分 中的糖苷转移酶，氨基转移酶等蛋白及相应的编码基因，得到卡那霉素 B 与卡那霉素 A 在 形成共同的 2-DOS 前体后由平行的不同的合成路径合成；而 KanJ 和 KanK 结合，成功的将 240 卡那霉素 B 氧化脱氨再还原，形成唯一的 2，位羟基卡那霉素 A，补充和完善了卡那霉素生 物合成途径的研究。
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图 6 KanJ 和 KanK 催化的反应及 KanJ 反应机理 Fig. 6 The reaction catalyzed by KanJ，KanK and its mechanism
2.5
磷酸化酶 GenI
庆大霉素属于 4,6-二取代 2-脱氧链霉胺类抗生素。2-DOS 与 N-乙酰葡萄氨通过 1,4-糖
苷键连接形成巴龙霉氨，再与木糖以 1,6-糖苷键连接形成类三糖[14]，接着经过一系列的酶修 饰形成关键的中间体 JI-20A，最后再经一些酶修饰而成庆大霉素。多种氨基糖苷类抗生素 250 C-3’为羟基，许多耐药菌可能通过体内产生的某些修饰酶对 C-3’羟基磷酸化、酰苷化或 乙酰化而对其产生抗性[33]，而卡那霉素半合成产物地贝卡星及庆大霉素的 C-3’、C-4’位 是双脱羟基的， 可以逃避这些酶的修饰作用而继续发挥抑菌作用。 庆大霉素的生物合成基因 簇中有一个特殊的磷酸化酶 GntI，与另外两个磷酸转移酶 Sis17、ForP 有很高的同源性，后 两个酶分别参与了西索霉素和福提霉素的生物合成。Lei Shao[34]等推测，在庆大霉素重要的 255 中间体 JI-20A 的生物合成中会发生 C-3’、C-4’位脱羟基的过程，此过程中会发生一步磷 酸化，此步反应由 GntI 参与催化。由于中间体 JI-20A 难以直接获得，因此将 GntI 在大肠杆 菌中超量表达后，采用与 JI-20A 结构相似的卡那霉素 B、阿米卡星等作为底物进行体外测 活反应，将以卡那霉素 B 为底物的反应产物分离后，经核磁鉴定确实发生了磷酸化，由于 JI-20A 与卡那霉素 B 结构差别很小，因此间接证明了 GntI 可以催化 JI-20A 磷酸化。forP 缺 260 失后回补使得福提霉素双脱羟基化步骤能够进行，而 ForP 是磷酸转移酶，GenI 与其同源性 很高，推测庆大霉素的生物合成必须先经过 GntI 磷酸化，然后再经过某些酶的作用脱去 C-3’、C-4’位羟基。倪现朴等[35,36]推测安普霉素 C-3’位羟基的脱去直接由两个脱氧酶负 责，不需要经过其他反应步骤。庆大霉素 C-3’、C-4’位脱羟基为什么要经过磷酸化步骤， 磷酸化对生物合成有什么影响以及催化反应的机制目前还不清楚。
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图 7 庆大霉素、西索霉素生物合成及 JI-20A 中间体类似物 Fig. 4 The biosynthesis of gentamycin，sisomycin and JI-20A Intermediate anologs
3 总结与展望
270 长期以来，相比其它类别的抗生素，氨基糖苷类抗生素的生物合成研究比较滞后，其中 所蕴含的特殊生化反应一直未能得到诠释。近几年来，随着分析方法的进步，尤其是以质谱 为代表的高端检测手段的发展及异源表达系统的建立， 为深入研究氨基糖苷类抗生素生物合 成机理提供了有利条件， 许多成果最终都发表在顶级杂志上， 足以证明氨基糖苷类抗生素在 天然产物生物合成研究领域中举足轻重的地位。 本文通过总结近期氨基糖苷类抗生素大家族 275 2-DOS 的生物合成研究进展，包括方法学的发展以及特殊酶催化机理的揭示，归纳出以下 要点和规律：1）前期已经研究过的酶，有可能参与其他的反应途径，弥补了之前的知识空 白。如 BtrS 不仅参与 2-DOS 合成的第一步转氨，同时也参与第二步转氨反应，而之前一直 认为后一步反应是由其它酶催化；2）同一超家族酶可能具有不同的功能。BtrN 是 SAM 自 由基依赖的脱氢酶，GenK 是 SAM 自由基依赖的加双氧酶，它们具有相同的结构域以及 280 [4Fe-4S]簇活性位点，但却催化不同的生化反应。因此，对同家族酶的功能研究以及对反应 机制的解析不能仅依赖于序列上的比对；3）从不同的角度全面思考分析问题，可推理出不 同的合成途径，从而更加完善已有的生物合成路径。Je Won Park 等[14]对可能具有功能的基 因重组后利用异源表达展开对卡那霉素生物合成途径的阐释， 分析出卡那霉素的合成由于糖 苷转移酶 KanE 对不同底物的识别有一个分支点，卡那霉素 A 和卡那霉素 B 是由两条平行 285 的不同的路径合成， 即卡那霉素 B 不是卡那霉素 A 的中间体； 但 Hilda Sucipto 等[30]分析 KanJ 和 KanK 两个酶功能时却发现加双氧酶 KanJ 可以将卡那霉素 B 的氨基脱去， 在还原酶 KanK 的作用下能够得到卡那霉素 A；4）一些研究成果对解决氨基糖苷类抗生素的耐药性问题有 启示作用。许多抗生素 C-3’位为羟基，容易受到耐药菌酰苷化、磷酸化或乙酰化修饰作用 而失去抗菌活性，对 GentI 的研究表明，可以利用合成生物学的方法将此类酶运用到很多 290 C-3’位为羟基的抗生素中，对其进行改造从而脱去羟基，如卡那霉素半合成产物地贝卡星， 脱去 C-3’羟基后，其不再易被耐药菌失活。总之，以上要点对解决 2-DOS 类抗生素甚至 更大范畴的氨基糖苷类抗生素生物合成中悬而未决的科学问题具有指导意义。 例如： 安普霉
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素中独特八碳糖结构的生物合成研究； 庆大霉素各组分的是如何合成的， 各组分之间的合成 是如卡那霉素通过共同的分支点独立合成的还是相互影响， 合成的关键酶有哪些等， 这些都 295 将是未来氨基糖苷类抗生素研究领域中的重点，是极具挑战性的课题。
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