【实验目的】
1.掌握细胞培养的基本概念
2.了解细胞培养的基本条件
3. 掌握清洗和消毒的基本方法
4. 学习细胞培养使用液的配制及准备方法
【实验原理】
1.体外培养（in vitro culture) 的基本概念
将活体结构成分（甚至个体）从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。按照体外培养的结构成分，可将体外培养人为地分为：组织培养（tissue culture）、器官培养（organ culture）、细胞培养（cell culture)
（1）器官培养（Organ Culture）培养的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生存、生长和保持一定功能的方法。
（2）组织培养(Tissue Culture)是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在模拟体内生理环境下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。
（3）细胞培养(Cell Culture)是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。
2. 组织细胞培养的优点
能够长时间观察细胞的生命活动
容易控制实验条件，有利于生物学研究
容易直接采集细胞及亚细胞结构的图象
便于各种细胞染色处理和标记
培养细胞的单一性，有利于排除干扰因素
3. 体外培养技术的应用：
基础研究：细胞生物学乃至整个生命科学研究中最基本的实验技术之一。被培养的组织或细胞是良好的实验材料。细胞培养广泛应用于现代医学和生物科学研究之中
生产实践：疫苗生产、药物研制与肿瘤防治等医学实践提供了全新的手段
4. 组织细胞培养的基本条件
（1）无污染的环境条件
（2）适当的温度:由酶和蛋白质所需要的最适温度决定
35－37℃(人和哺乳动物细胞)
（3）气体环境与pH环境： (人和哺乳动物细胞)
（4）营养条件
（5）其它条件：等渗条件、附着底物
5.无污染的环境条件
凡混入细胞培养环境中对细胞生存有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染。（1）污染的种类
A．物理污染:
温度: 解决对策：孵箱放在温度较恒定的房间中, 培养液从冰箱取出后在室温放置. 放射线与辐射:解决对策：试剂周围不能放同位素,尽量不放在带有玻璃门的冰箱中.
振动:解决对策：孵箱周围不能放引起振动的设备.
其他：尘土、玻璃残渣等.解决对策：严格清洗.
B. 化学污染
水: 解决对策：用双蒸和三蒸水配液和清洗容器（现在用纯水仪millipore超纯水）
容器: 生产过程中有毒物质残留（铅、砷）;消毒剂和清洗剂的
残留;铝箔和包裹纸残留
解决对策：培养用各种器皿的严格清洗（泡酸）
培养箱:co2混有有毒气体; 消毒剂和清洗剂的残留
解决对策：购置高质量的CO2
C.生物污染
细菌、霉菌和酵母:易被发现,易造成隐性污染
病毒: 最难发现和清除,严格的宿主性,自限性
支原体：污染严重,难发现 ,难清除
原虫、昆虫：
其它细胞系：
解决对策：实验用品严格灭菌，无菌操作同一时间只传同
一种细胞,每种细胞要有单独的液体
建立细胞库，每三个月更换一次细胞
6.清洗与灭菌
除去各种玻璃或塑料器皿上对细胞生长有影响的各种杂质以及消除附着在其上的各种微生物及化学物质，改善玻璃表面性质，有利于细胞的粘着和生长。
清洗和消毒是否彻底直接关系到体外培养的成败。
（1）清洗
玻璃器皿：培养瓶、吸管、滴管、试管等
浸泡在清水中，刷洗→烘干→浸酸→冲洗（15遍自来水后3遍蒸馏水→倒置烤干→包装→干热消毒
胶塞（旧）：用加入适量洗涤灵的水溶液煮沸30分钟，自来水冲洗→蒸馏水漂洗3次→晾干→包装→湿热灭菌→烘干备用
胶塞（新）：水中浸泡→ 2%NaOH煮10-20min →自来水冲洗10次→ 1%HCl浸泡30min →自来水冲10次，蒸馏水洗3次→晾干→包装→湿热灭菌→烘干备用。
金属器械：自来水洗→ 75%酒精擦→湿热灭菌、包装→烘干备用或者自来水冲10次，蒸馏水3次→晾干→包装→湿热灭菌→烘干备用
（2）细胞及组织培养用品的包装
1．局部包装：滤器，培养瓶口
2. 全包装：胶塞、瓶盖、金属器械、注射器、小的瓶皿等
（3）细胞及组织培养用品的消毒与灭菌
射线消毒: 用钴60等发出的射线消毒灭菌。适宜用于量大或不适做高压、干热或过滤处理的培养用品，如塑料制品等。
紫外线消毒: DNA损伤，臭氧，双氧水。适用于空气、主要用于培养室空气、操作台、塑料、培养皿和培养板等表面消毒.
【注意事项】：空气消毒时灯管应距地面 m以内；台面的消毒应在80 cm以内；培养器皿的消毒在30 cm以内。不要让紫外线照射人的皮肤。
干热灭菌: 高温变性， 160℃保温90－120 min适用于玻璃器皿
【注意事项】温度降至100℃之下才能开烤箱门。
湿热灭菌:高温变性。 121度，15磅30分或115度，10磅20分。适用于胶塞、瓶盖、玻璃器皿、滤器、枪头塑料物品、PBS、LB等不易产生沉淀的液体
过滤除菌：适用于培养基、胰酶、TdR、秋水仙素、谷氨酰胺、抗生素等对热不稳定的试剂及药物
化学消毒: 来苏%)、新洁尔灭（%）、乙醇（70- 75%）、乳酸、过氧乙酸%)
火焰消毒：仅限于无菌操作过程，在火焰近处并经过烧灼进行。用于培养瓶、滴管、试管、吸管等。
注意：等用品冷却后放可接触活的组织和细胞。
抗生素的抑菌作用：青霉素、链霉素各100单位/ mL 培养基
7. 平衡盐D–Hanks缓冲液的配制
平衡盐溶液（balanced salt solution,BSS）主要是由无机盐、葡萄糖组成。它的作用是维持细胞渗透压平衡，保持pH稳定及提供简单的营养。主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。
D-Hank‘s与Hank’s的一个主要区别是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank‘s常用于配制胰酶溶液。
D–Hanks的配制
配方（1000 mL）：KCl ；KH2PO4 g； NaCL 8 g； g；NaHCO3 g；酚红（2%，1 mL）————可不加
【实验仪器、材料、试剂及用品】
1.细胞培养用品：玻璃器皿；滤器；塑料及橡胶制品; 滤膜；棉花；酒精灯等
2. 药品及试剂： KCl ; KH2PO4 ; NaCl ; Na2HPO4;NaHCO3酒精;新洁尔灭
【实验步骤】
1.无菌室及互动显微镜室、仪器的使用规则
2.针头滤器的安装与灭菌：安装滤膜（μm光滑面朝上），高压灭菌。
–Hanks缓冲液的配制及灭菌处理。
4.练习清洗培养瓶。
5.练习包瓶子、塞子、插枪头、切盖玻片，移液管塞棉花等。
%酒精配置、酒精棉球制作以及酒精灯内酒精添加。
7.配新洁尔灭消毒水。
8.练习培养基瓶盖的开启与盖上。
9.无菌室的打扫：自来水拖地、擦桌子及超净台，然后%新洁尔灭擦。 CO2培养箱灭菌：新洁尔灭擦，然后75%乙醇擦。
【思考题】
1.干燥箱灭菌的温度是多少？灭菌结束后要注意什么？
答：干热灭菌: 高温变性， 160℃保温90－120 min适用于玻璃器皿
【注意事项】温度降至100℃之下才能开烤箱门。
湿热灭菌:高温变性。 121度，15磅30分或115度，10磅20分。适用于胶塞、瓶盖、玻璃器皿、滤器、枪头塑料物品、PBS、LB等不易产生沉淀的液体
2.二氧化碳培养箱的使用注意事项是什么？
培养箱:co2混有有毒气体; 消毒剂和清洗剂的残留
解决对策：购置高质量的CO2
3.哪些物品适合于高压灭菌？
适用于普通培养基、生理盐水、手术器械、玻璃容器及注射器、敷料等物品的灭菌。
4.紫外线消毒的适用范围和目的是什么?
答：紫外线消毒: DNA损伤，臭氧，双氧水。适用于空气、主要用于培养室空气、操作台、塑料、培养皿和培养板等表面消毒.
【注意事项】：空气消毒时灯管应距地面 m以内；台面的消毒应在80 cm以内；培养器皿的消毒在30 cm以内。不要让紫外线照射人的皮肤。
无菌操作规程 1.目的 建立无菌检查标准操作规程，确保检查结果准确、可靠。 2.适用范围 本公司无菌产品的无菌检查 3.职责 质量部QC 4.依据 2015版《中国药典》通则1101 5.内容 5.1无菌检查环境保障 5.1.1无菌检查的所有操作均需在严格控制微生物污染的环境下进行，即无菌检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行。 5.1.2操作环境的无菌保障程度将直接影响无菌检查结果，为了保证无菌检查用洁净室（区）环境的稳定性，确保检查结果的可靠性，对洁净室（区）的环境定期检测并采取合理的措施保证洁净环境符合要求。 5.1.3无菌检查全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。 5.1.4洁净区的温度、湿度等参数必须符合相应洁净级别的要求 5.1.5无菌检查操作还需要对环境进行监控， 5.2培养基、稀硫酸、缓冲液 5.2.1硫乙醇酸盐流体培养基，市售培养基干粉。除另有规定，接种后应置30-35℃培养。 5.2.2胰酪大豆胨液体培养基，市售培养基干粉。接种后应置20-35℃培养。 5.2.3中和或灭活用培养基，按上述硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法实用性试验。 5.2.4胰酪大豆胨琼脂培养基，市售培养基干粉。 5.2.5沙氏葡萄糖液体培养基，市售培养基干粉。 5.2.6沙氏葡萄糖琼脂培养基，市售培养基干粉。 5.2.7PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，市售培养基干粉。 5.2.80.9%无菌氯化钠溶液。 5.2.9培养基使用性检查 无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查或与供试品的无菌检查同时进行5.2.9.1无菌性检查：每批培养基随机取5支（瓶），按各培养基规定的温度下培养14天，用无菌生长。 5.2.9.2灵敏度检查 5.2.9.2.1菌种：培养基灵敏度检查所用的菌株传代数不得超过5代（从菌钟存中心获得的干菌种第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以证试验菌株的生物学特性。 金黄色葡萄球菌【CMCC(B)26 003】 铜绿假单胞菌[CMCC(B)10 104] 枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501] 生孢梭菌[CMCC(F)64 941] 白色念球菌[CMCC(F)98 001] 黑曲霉[CMCC(F)98 003]
无菌技术操作流程 开始：各位老师下午好，我操作的项目是无菌技术操作。 1.无菌技术操作的目的：保持无菌物品无菌区域不被污染，防止一切微生物侵入机体，避免给患者带来不应有的损失和危害 2.环境评估：操作前30分钟停止清扫，操作中减少人员走动，开窗、通风、换气，操作台宽敞、平坦、整洁、干燥。 3.用物准备：治疗盘无菌包：包内置无菌巾若干无菌容器内置无菌持物钳棉签无菌包：内置治疗碗一个，镊子两把，弯盘一个无菌纱布罐无菌棉球罐无菌生理盐水一次性无菌手套 铺无菌盘 1.洗手戴口罩。 2.治疗盘清洁，干燥。铺无菌换药盘。 3.开无菌包：化学指示胶带有变色，在有效期内，无潮湿、无破损。斜角打开（打开无菌包内角时，手不可触及包布内面，不得跨越无菌区域）看化学指示卡，有变色。用无菌持物钳夹取一块无菌巾放入治疗盘内，将无菌包按原折痕“一字”包好后，看时间：记录日期、时间、并签名、24小时内有效。 4.铺无菌巾：双手捏住无菌巾一侧两角外面轻轻抖开，由近及远的将治疗巾一半铺于治疗盘上，将上下对齐后上层扇形折三次，开口外边向外，使治疗巾内面构成一无菌区。 5.开无菌包，前述指示胶带变色，在有效期内，侧孔、底孔闭合 1）打开无菌包，看化学指示卡变色 2）用无菌钳分别取治疗碗（内含两把镊子）、弯盘入无菌盘内。 3）打开无菌纱布罐夹取纱布置无菌盘内；同法夹取无菌棉球置治疗碗内（手不可触及容器边缘或内侧），无菌容器盖内面朝下直接盖上。 6.倒无菌溶液：（拿起溶液瓶，看瓶签）述：瓶身干净，标签完整、字迹清楚，0.9%Nacl500ml，在有效使用期内，瓶盖无松动，瓶身瓶底无无裂缝，对光检查：溶液澄清、无杂质。除盖：查棉签（无漏气，在有效试用期内）写好开包日期，消毒瓶盖、手指，开瓶盖。倒溶液于治疗碗内，再次消毒瓶口，盖回瓶盖看时间：记录日期、时间、签名，24小时有效。 7.铺完盘，看时间口述：记录名称、时间并签名（小标签贴于盘缘）、4小时内有效。述：已铺好换药盘，可以给病人进行换药护理。一份无菌物品只供一位病人使用，以防交叉感染。 8.注意事项：在操作中应注意：无菌容器盖放于稳妥处时，应内面朝上。到远处夹取无菌物品，应同时搬移无菌持物钳和容器。无菌持物钳和浸泡容器每周灭菌2次，同时更换消毒液，干燥保存4小时更换一次 带无菌手套 1．目的：用于进行无菌操作，防止患者受到感染，用于接触某些无菌物品或区域，保持无菌物
无菌技术操作规程 一、无菌技术操作原则 1、环境要清洁。进行无菌技术操作前半小时，必须停止清扫地面等工作，避免不必要的人群流动，防止尘埃飞扬。治疗是每日用紫外线照射消毒一次。 2、进行无菌操作时，衣帽穿戴要整洁。帽子要把全部头发遮盖，口罩须遮住口鼻，并修剪指甲，洗手。 3、无菌物品与非无菌物品应分别放置，无菌物品不可暴露在空气中，必须存放于无菌包或无菌容器内，无菌包应注明无菌名称，消毒灭菌日期，并按日期先后顺序排放，以便取用，放在固定的地方。无菌包在未被污染的情况下，可保存7 天，过期应重新灭菌。 4、工作人员面向无菌区域，用无菌取无菌物品，手臂须保持在腰部水平以上，不可触及无菌物或跨越无菌区，从无菌容器中取出的物品，虽未使用，也不可放回无菌容器内。 5 进行无菌操作时不可面对无菌区讲话、打喷嚏。怀疑无菌物品被污染，不可使用。 6 进行无菌操作时如器械、用物疑有污染或已被污染，即不可使用可，应更换或重新灭菌。 7、一套无菌物品，只能供一个病人用，以免发生交叉感染
二、准备质量标准 1、工作人员着装整洁，洗手、戴口罩、修剪指甲。 2、备齐用物。 3、治疗盘、无菌持物钳或镊，浸泡于消毒液溶液内，无菌溶液、无菌包布、无菌容器及物品、无菌手套、弯盘、75％酒精、无菌棉签。 4、查对无菌物品、灭菌日期及手套好。 5 用物排放有序，符合无菌操作要求。 三、操作流程质量标准 1、选择清洁、干燥、宽阔的场所进行操作。 2 无菌持物钳使用法： 无菌持物钳须置于无菌容器内，有效期限 4 小时；取、放无菌持物钳时，应将盖打开，钳端闭合，不可在盖孔中取、放；如需取远处物品时，应连同容器一起搬移，就地取出无菌物品。 3、无菌包使用法： 1）、查看无菌包的名称、灭菌日期，查看化学指示胶带粘贴。 2）、将无菌包放在清洁、干燥处，撕开粘贴。 3）、用拇指和食指先揭开左右两角，最后揭开内角，注意手不可触及包布的内
无菌技术操作考试标准
铺无菌盘法之无菌巾一铺一盖法操作考核评分标准 项目考核内容 分 值 扣分及标准 操作准备护士准备：衣帽整洁、修剪指甲、洗手、戴口罩。 2 操作准备： [用物] 治疗盘2个、无菌持物钳、无菌物品、无菌包（内有无菌治疗巾 数块，灭菌指示卡；包外贴化学指示胶带）记录卡2张、弯盘、清洁抹布。 [环境] 1.无菌操作的环境：清洁干燥、通风，操作台面宽敞、高度适宜， 操作前30分钟内不进行环境卫生的打扫，无人员走动； 2.无菌操作用物齐全，台面整洁。 5 用物缺一项或不符合要求扣1 分 操作要点1.操作步骤：88 （1）备齐用物（2分）。 2 （2）备清洁干燥的治疗盘和治疗台（2分），放治疗盘于适当处（1分）。 3 （3）洗手（1分），戴口罩（1分）。 2 （4）检查无菌包灭菌指示胶带有无变色（2分），并核对其名称（2分）、灭菌 日期（2分），有无松散、潮湿、破损等（2分）。 8 （5）开无菌包，解开无菌包系带，挽活结（2分）。 2 （6）用手依次打开无菌包外层包布的外、左、右角（3分）。取无菌钳（2分）， 用手打开外层包布内角（2分），用无菌钳依次打开内层包布的外、左、右、内 角（4分）。 11 （7）检查灭菌指示卡有无变色（2分）。 2 （8）用无菌钳取一块无菌巾置于内层包布左侧缘（2分），以一手一钳将无菌 巾轻轻打开（3分），由远至近铺于治疗盘上（2分）。 7 （9）初步还原无菌包，用无菌钳依次还原内层包布的内、右、左、外角（4 分）。用手还原无菌包外层包布内角（2分）。 6 （10）备无菌盘内物品（投递无菌物品）（3分）。 3 （11）开无菌包。用手打开无菌包外层包布内角（2分）。用无菌钳依次打开内 层包布的外、左、右及内角（4分）。 6 （12）用无菌钳取一块无菌巾依法由近至远盖于无菌物品上（5分），并注意上 下无菌巾对齐（错位不超过2cm）（2分）。7 （13）还原无菌包。用无菌钳依次还原内层包布的内、右、左、外角（4分）， 将无菌持物钳放回容器内（2分） 6 （14）用手还原外层包布内、右、左、外角（4分）。按“一”字形包好无菌包 （2分）。 6
无菌操作流程 目的：保持无菌物品无菌溶液无菌盘的无菌状态 洗手：修剪指甲按七步洗手法洗手每步不少于10秒戴口罩 评估环境；操作前30分钟停止轻扫以免尘埃飞扬，环境清洁 宽敞，光线明亮符合无菌操作要求 用物准备齐全，请问各位评委老师是否可以开始 无菌持物钳包布无潮湿无破损在有效期可以使用，无菌治疗巾包布无潮湿无破损在有效期可以使用，无菌治疗碗包布无潮湿无破损可以使用0.9的氯化钠250ml在有效期可以使用擦治疗盘灰2打开无菌持物钳指示卡以变色达标符合灭菌要求可以使用3打开无菌治疗巾，指示卡以变色达标符合灭菌要求可以使用，铺治疗巾上层折成扇形，4打开无菌治疗碗取出指示卡以变色达标符合灭菌要求可以使用，把治疗碗放到治疗盘内5看无菌纱布缸在有效期内可以使用用持物钳取出两块纱布6检查0.9的氯化钠250ml对光照射无沉淀无浑浊无絮状物瓶口无松动瓶身无裂痕可以使用6强力碘在开启有效期内可以使用75%的酒精在开启有效期内可以使用（两碘一酒消毒瓶口到瓶身）拇指食指中指强力碘消毒冲洗瓶口倒入治疗碗内8将上层盖于物品上，上下层边缘对齐，开口向上翻折两次，两侧边缘下翻折一次。9检查无菌手套无漏气在有效期内可以使用打开无菌手套向后退一步擦滑石粉戴手套脱手套按七步洗手法洗手每部不少于10秒操作完毕。
注意事项：1无菌持物钳不能夹取未灭菌的物品，也不能夹取油纱布2打开包布的干镊子罐、持物钳有效期4小时 3戴手套后如发现有破损或污染时，应立即更换脱手套时应翻转脱下 4使用无菌容器时，不可污染盖内面，容器边缘及内面 5无菌容器打开后，记录开启的日期时间，有效期为24小时 6铺无菌盘区域及治疗盘必须清洁干燥，无菌巾避免潮湿 7非无菌物品不可触及无菌面 8注明铺无菌盘的日期时间，无菌盘有效期为4小时。
无菌检查用培养基的适用性检查标准操作规程 目的：建立无菌检查用培养基适用性检查标准操作规程。 范围：适用于无菌检查使用培养基的适用性检查。 依据：中国药典》2015年版 《药品生产质量管理规范》2010年修订 《中国药品检验标准操作规程》2010年版 责任：QC化验员对实施本规程负责。 内容: 1、概要：无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌检查及灵敏度检查要求。本检查可在供试品的检查前或与供试品的检查同时进行。 2、材料及设备 2.1 生化培养箱 2.2 生物安全柜 2.3 中国浊度标准管（由中国药品生物制品检定所提供） 2.4 灭菌试管、灭菌注射器 2.5 0.9%无菌氯化钠溶液 2.6 0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液：取聚山梨酯80 0.05ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%氯化钠至100ml，混匀，灭菌即可。3、无菌检查培养基的适用性检查 3.1无菌性检查 取新鲜配制灭菌的培养基各5瓶，硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃，胰酪大豆胨液体培养基置20～25℃，培养14天，应无菌生长。 3.2灵敏度检查 3.2.1菌种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的干燥菌种为第0代），
并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 金黄色葡萄球菌[Staphylococcus aureus CMCC(B) 26003] 铜绿假单胞菌[Pseudomonas aeruginosa CMCC(B) 10104] 枯草芽孢杆菌[Bacillus subtilis CMCC(B) 63501] 生孢梭菌[Clostridium sporogenes CMCC(B) 64941] 白色念珠菌[Candida albicans CMCC(F) 98001] 黑曲霉[Aspergillus niger CMCC(F) 98003] 3.2.2菌液制备 3.2.2.1 金黄色葡萄球菌菌悬液制备 3.2.2.1.1 取金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体或胰酪大豆胨琼脂培养基上，30～35℃培养18～24小时，取新鲜传代菌种一支待用。取一支灭菌中试管，加入3ml 0.9%无菌氯化钠溶液，把新鲜传代菌种培养物用接种环轻轻刮取，在加入pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液的试管壁上研磨，使之成为均匀悬液。 3.2.2.1.2 取菌悬液1ml于比浊管中，用0.9%无菌氯化钠溶液逐步稀释至与标准管的浊度一致。记录下所加入的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液的量，余下的2ml菌液盖上试管塞以备用。 3.2.2.1.3 打开试管塞，取1ml菌液于中试管中，加入比浊时所需的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液的量一致的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，此时试管中的细菌浓度与标准比浊管相一致。根据细菌浊度标准菌数表的菌数，将菌悬液用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9％无菌氯化钠溶液系列稀释至不大于100cfu/ml。 3.2.2.1.4 铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的菌悬液制备方法同金黄色葡萄球菌。 3.2.2.2 生孢梭菌菌悬液的制备 3.2.2.2.1取生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基上，30～35℃培养18～24小时，取一支灭菌中试管，用灭菌注射器吸取硫乙醇酸盐流体培养基中底部三分之二处的新鲜菌液1ml，加入
无菌技术操作规范要求 1、环境要清洁。进行无菌技术操作前半小时，必须停止清扫地面等工作，避免 不必要的人群流动，防止尘埃飞扬。治疗室应每日用紫外线照射消毒1次。 2、进行无菌操作时，衣帽穿戴要整洁，帽子要把全部头发盖住，口罩须遮住口、 鼻，并要剪指甲、洗手。 3、无菌物和非无菌物应分别放置；无菌物品不可暴露在空气中，须存放于无菌 包或无菌容器内；无菌物品一经使用后，必须经灭菌处理后方可使用；从无菌容器内取出的物品，虽未使用，也不可放入无菌容器内。 4、无菌容器或无菌包外应注明物品名称，消毒灭菌日期，并按日期的先后顺序 排列，放在固定的地方，以便取用。无菌包在未污染的情况下，可保存7—14天，过期后应重新灭菌。 5、取无菌物品时，必须用无菌钳（镊）。未经消毒的手和物品，不可触及无菌 物品或跨越无菌区。 6、进行无菌操作时，如器械、用物疑有污染或已被污染即不可使用，应予以更 换或重新灭菌。 7、一套无菌物品，只能供一个病人使用，以免发生交叉感染。 检验科及实验室的消毒管理制度 1、静脉采血必须一人一针一管一巾一带，微量采血应做到一人一针一管一片， 对每个病人操作前洗手或手消毒。 2、开启的无菌物品，如棉签、棉球在24小时内使用，过期不得再用，使用后 的废弃物，进行无害化处理。 3、试管架应每周定期以2%“84”浸泡消毒；各种废弃标本，分类处理（焚烧 或倒入2%“84”消毒液消毒后倒入污水池内）。 4、细菌室报告单用微波消毒后发放。 5、检验人员结束操作后，及时洗手，毛巾专用，每天消毒处理。 6、室内保持清洁，每天紫外线消毒60分钟，物体表面用0.5%“84”擦拭。在 进行特殊传染病检验后，如有场地工作服或体表被污染时，应立即以4%“84” 液进行处理防止扩散。 7、菌种、毒种按《中华人民共和国传染病防治法》有关规定处理。
无菌操作技术规范 无菌技术是在医疗护理操作过程中，保持无菌物品、无菌区域不被污 染、防止病原微生物侵入人体的一系列操作技术。无菌技术作为预防医院感染的一项重要而基础的技术，医护人员必须正确熟练地掌握，在技术操作中严守操作规程，以确保病人安全，防止医源性感染的发生。 、无菌技术的操作原则 1、进行无菌操作的环境应清洁、宽敞。操作前半小时须停止扫地、更换床单等工作，空气清新，无尘埃。 2、无菌操作前，操作人员要穿戴整洁，帽子须遮盖全部头发，口罩须盖住口鼻，并认真彻底洗手（七步洗手法） 洗手方法：1）手掌对手掌; J3）两手指缝相对互擦
摩擦手腕，然后彻底流水冲净指尖对手掌擦洗 4)双手并扣互擦指背；J (7)
认真揉搓双手至少15s,范围为双手、手腕及腕上10cm ,注意指尖、指 缝、拇指、指关节等处清洗干净。 3、实施无菌技术操作必须使用无菌物品。一次性使用的无菌医疗器械、用 品不得重复使用。 4、无菌物品与非无菌物品应分柜放置，并有明显标志。无菌包需标明物品 名称、灭菌日期，按失效期先后顺序摆放。无菌包的有效期按7天计算，过期 或受潮应重新灭菌。无菌柜应定期整理、清洁。 5、在无菌技术操作时，必须明确无菌区和非无菌区。 6、使用无菌物品前必须认真检查无菌包包装完整性、标识有效性、即 无菌包的名称、灭菌时间或失效期、签名等，检查包内外化学指示胶带变色情 况等。 湿包或有明显水渍，密封容器的筛孔被打开，灭菌包掉落在地或误放不洁之处，包装破损或发霉，外包装指示带或包内指示卡变色没有达到标准或有疑问等情况，应视为污染，不能再使用。不得使用过期无菌物品 7、进行无菌操作时，操作者应面向无菌区 域并与无菌区保持一定距离；手 臂应保持在腰部或操作台面以上，操作过 程中不可跨越无菌区，手不可触及无菌 物。操作时不可面对无菌区谈笑、咳嗽、打 喷嚏。 &无菌物品必须一人一用一灭菌。取用无菌物品时应用无菌持物钳/ 镊近距 离夹取。无菌持物镊/钳可用消毒液浸泡或干性保持。湿式无菌持物钳、筒及 筒内消毒液每周更换一次，干式无菌持物筒和钳每4h更换一次，一旦污染随 时更换。 9、无菌物品取出后不可放回无菌容器内。应用无菌巾包（盖）好，超过 4h不得使用。开启的无菌药液须注明时间。开启的无菌溶液须在4h内使用， 其他溶液不得> 24h。注射治疗时，应用无菌盘，抽出的药液不得 > 2h。 10、用于无菌技术操作的棉球、棉签、纱布。根据一次用量的标准，独 立包装。用无菌容器盛放的无菌物品，一经打开，使用时间最长不得>24 h。 11、消毒皮肤用的碘伏、酒清应密闭保存。病区盛放消毒溶液的容器每
无菌检查法标准操作规程 目的： 建立无菌检查的基本操作，为无菌检查人员提供正确的操作规程。 2.依据： 《中华人民共和国药典》2000年版二部。 3.范围： 本标准适用于QC无菌检查的操作。 4. 职责： QC无菌检查人员对本标准的实施负责。 5.程序： 5.1. 定义： 无菌检查法：系指检查药品、无菌器具及适用于药典要求无菌检查的其它品种是否无菌的一种方法。 5.2. 无菌操作室应具有空气除菌过滤的层流装置，局部洁净度100级或放置同等级别的超净工作台，室内温控（18~26）℃及除湿装置，操作室或工作台应保持空气正压。 5.2.1. 无菌室的清洁与消毒应符合QC洁净室清洁、消毒规程（SOP ZL0014）。 5.2.1.无菌室无菌程度的检查应符合规定：见沉降菌监测规程（SOP ZL0006）、悬浮粒 子监测规程（SOP ZL0005）。 实验设备及用具： 5.3.1.电热干燥箱、电热手提式压力蒸汽灭菌器、电热恒温培养箱、试管、注射器、针头、试管架、刻度吸管、手术剪、手术镊、砂轮、注射器盒、搪瓷托盘、双碟、75%酒精棉球、无菌工作服（衣、裤、帽、口罩等）。 5.3.2.微孔滤膜：直径50mm、孔径0.45μm，应符合规定。 5.3.3.除菌滤器： 除菌滤器采用的是HTY-2000型全封闭式薄膜过滤器。 5.3.4. 所有进入无菌室的物品必须经过消毒或灭菌，应严格按照进入QC无菌室物品清洁、消毒、灭菌规程（SOP ZL0015）进行操作。
5.4. 稀释剂：灭菌注射用水。 5.5. 培养基： 5.5.1.需气菌、厌气菌培养基（流体硫乙醇酸盐培养基）；真菌培养基。 5.5.2. 培养基的使用，配制、管理及灵敏度检查应按照培养基管理规程（SMP ZL0036）、培养基灵敏度检查规程（SOP ZL0019）、培养基配制规程（SOP ZL0016）进行操作。 5.6. 对照用菌液： 5.6.1. 金黄色葡萄球菌（Staphyoccus sureus）菌液：取金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]的营养琼脂斜面新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基内，在30~35℃培养16~18小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10~100个菌。 5.6.2. 生孢梭菌（Clostridum sporgenes）菌液：取生孢梭菌[CMCC（B）64 941]的需气菌、厌气菌培养基新鲜培养物1白金耳，接种至相同培养基内，在30~35℃培养18~24小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1ml中含10~100个菌。 5.6.3. 白色念珠菌（Candida albicans）菌液：取白色念珠菌[CMCC（F）98 001]的 真菌琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳，接种至真菌培养基内，在20~25℃培养24小时后，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每1ml中含10~100个菌。 5.7. 操作法： 5.7.1. 供试品、培养基在移入缓冲间之前应先编号，并用75%酒精棉球擦拭瓶（管）外壁，然后连同其它用具（包括无菌衣、帽、口罩等）移入缓冲间，打开无菌间紫外光 灯和空气过滤装置开关，并使其工作在30分钟以上。 5.7.2. 将所需物品移入无菌室，每次试验中所用物品，必须计划好，并有备用物。操作人员进入无菌室应严格遵守QC洁净室进出规程（SOP ZL0013）。 5.7.3. 供试品外部消毒： 5.7.3.1. 橡皮塞、铝盖、压封小瓶：先用75%酒精棉球擦拭外壁及瓶塞，待干，用消毒镊子剔去铝盖上的铝质小圆片，用酒精棉球擦拭瓶盖及橡皮塞，并将酒精棉球盖于橡皮塞上待取样。 5.7.3.2. 安瓶：先用酒精棉球将安瓶外部擦拭消毒待干，用砂轮轻轻割安瓶颈部，便于折开安瓶。 5.7.4. 供试品溶液的制备：取供试品加入该药品项下规定的稀释剂用量，制成该药品项下规定浓度的供试品溶液。 5.7.5. 根据供试品的抑真菌和抑细菌试验，判定该供试品有无抑菌性，而决定采用直接
无菌操作规程 （一）无菌技术操作原则 1、环境要清洁。进行无菌技术操作前半小时，须停止清扫地面等工作，避免不必要的人群流动，防止尘埃飞扬。治疗室每日用紫外线照射消毒一次。 2、进行无菌操作时，衣帽穿戴要整洁。帽子要把全部头发遮盖，口罩须遮住口鼻，并修剪指甲，洗手。 3、无菌物品与非无菌物品应分别放置，无菌物品不可暴露在空气中，必须存放于无菌包或无菌容器内，无菌物品一经使用后，必须再经无菌处理后方可使用，从无菌容器中取出的物品，虽未使用，也不可放回无菌容器内。 4、无菌包应注明无菌名称，消毒灭菌日期，并按日期先后顺序排放，以便取用，放在固定的地方。无菌包在未被污染的情况下，可保存7-14天，过期应重新灭菌。 5、取无菌物品时，必须用无菌钳（镊）。未经消毒的物品不可触及无菌物或跨越无菌区。 6、进行无菌操作时如器械、用物疑有污染或已被污染，即不可使用，应更换或重新灭菌。 7、一套无菌物品，只能供一个病员使用，以免发生交叉感染。（二）准备质量标准 1、工作人员着装整洁，洗手、戴口罩、修剪指甲。 2、备齐用物。
3、治疗盘、无菌持物钳或镊，浸泡于消毒溶液内，无菌溶液、无菌包布、无菌容器及物品、无菌手套、弯盘、75%酒精、无菌棉签。 4、查对无菌物品、灭菌日期及手套号。 5、用物排放有序，符合无菌操作要求。 （三）操作流程质量标准 1、选择清洁、干燥、宽阔的场所进行操作。 2、解开无菌包系带卷放在包布下边。 3、用拇指和食指先揭左右两角，最后揭开内角，注意手不可触及包布的内面。用无菌钳（镊）取出一块无菌巾放于治疗盘内，剩余部分按原折痕包起扎好，并注明开包时间。 4、铺无菌盘： 单巾铺盘：双手拇、食指捏住治疗巾两上角外面，轻轻抖开，双折铺于治疗盘上，内面为无菌区，盖的半幅成扇形折到对面无菌盘上，开口边向外，放入无菌物品后，边缘对齐盖好。将开口处向上翻折两次，两侧边缘向下翻一次，以保持无菌。 双巾铺盘：双手捏住无菌巾的左右两上角的外面，轻轻抖开，由远向近铺于治疗盘上，无菌面向上，放入无菌物品。依上法夹取另一块无菌巾，由近侧向对侧覆盖于治疗盘内上，边缘多余部分反折，不应暴露无菌区。 5、打开无菌容器盖，必须把盖的无菌面（内面）向上，放在稳妥处，夹取所需物品放入无菌盘内后立即盖严。 6、倒无菌溶液，仔细检查核对溶液后，面对瓶签两拇指将橡皮
一、目的：建立注射剂检验标准操作规程，防止错检、漏检的发生。 二、范围：适用于注射剂的检验操作方法。 三、责任：质量部、化验室相关操作人员。 四、内容： 注射剂 注射剂（《中国药典》2010年版二部附录IB）系指药物与适宜的溶剂或分散介质制成的供注入体内的溶液、乳状液或混悬液，以及供临用前配制或稀释成溶液或混悬液的粉末或浓溶液的无菌制剂。 注射剂可分注射液（其中供静脉滴注用的大体积注射液也称静脉输液）、注射用无菌粉末与注射用浓溶液。 注射剂除应按药典品种项下规定的检验项目外，还应检查“装量”或“装量差异”、“可见异物”和“无菌”。静脉用注射剂应加查“热原”或“细菌内毒素”；溶液型静脉用注射液、溶液型静脉注射用粉末及注射用浓溶液应加查“不溶性微粒”；静脉输液及插管注射用注射液应加查“渗透压摩尔浓度”。 混悬型注射液，除另有规定外，药物粒度应控制在l5um以下，含15～20um(间有个别20～50um)者，不应超过10%，若有可见沉淀，振摇时应容易分散均匀；乳状液型注射液不得有相分离现象；静脉用乳状液型注射液分散相球粒的粒度90%应在lum以下，并不得有大于5um的乳滴。 “装量”检查法 1 简述 1.1本法适用于50ml及50ml以下的单剂量注射液的装量检查，其目的在于保证单剂量注射液的注射用量不少于标示量，以达到临床用药剂量要求。 1.2标示装量为50ml以上的注射液和注射用浓溶液，按最低装量检查法标准操作规范检查，应符合规定。
1.3 凡规定检查含量均匀度的注射液（如塞替派注射液）．可不进行“装量”检查。 2 仪器与用具 2.1注射器及注射针头。 2.2量筒（量入型）规格l、2、5、1O、20及50ml的量筒，均应预经标化。 3 操作方法 3.1 按下表规定取用量抽取供试品。 标示装量供试品取用量（支） 2ml或2ml以下 5 2ml以上至50ml 3 3.2取供试品，擦净瓶外壁，轻弹瓶颈部使液体全部下落，小心开启，将每支内容物分别用相应体积的干燥注射器（包括注射器针头）抽尽，注入预经标化的量筒内，在室温下检视，读出每支装量。 3.3如供试品为油溶液或混悬液时，检查前应先微温摇匀，立即按3.2项下方法操作，并冷至室温后检视。 4 注意事项 4.1所用注射器及量筒必须洁净、干燥并经定期校正；其最大容量应与供试品的标示装量相一致，量筒的体积应使待测体积至少占其额定体积的40%。 4.2 注射器应配上适宜号数的注射针头，其大小与临床使用情况相近为宜。 5 记录与计算主要记录室温，抽取供试品支数，供试品的标示装量，每支供试品的实测装量。 6 结果与判定 每支注射液的装量均不得少于其标示装量；如有少于其标示装量者，即判为不符合规定。 “装量差异”检查法 l 简述 1.1本法适用于注射用无菌粉末的装量差异检查。 1.2本项检查的目的在于控制各瓶间装量的一致性，以保证使用剂量的准确。 1.3凡规定检查含量均匀度的注射用无菌粉末，可不进行“装量差异”检查。 2 仪器与用具 分析天平感量0. 1mg（适用于平均装量为0.15g及其以下的粉针剂）或感量1mg
医疗器械产品无菌检验操作规程 1目的 通过无菌检验,确保灭菌后产品能够达到无菌的要求。 2适用围 适用于灭菌后医疗器械产品的无菌检验。 3检验依据 《中国药典》 (2005年版 GB14233.2-2005医用输液、输血、注射器具检验方法第二部分:生物试验方法GB15980-1995一次性使用医疗用品卫生标准 4仪器、设备 超净工作台、电热干燥箱、电热恒温培养箱、霉菌培养箱、压力蒸汽灭菌器、集菌仪(器、电子天平、 PH 计、冰箱、恒温水浴锅、酒精灯、三角烧瓶,接种环、无菌棉签、镊子,试管架,大试管若干等。 5无菌检验室的环境要求 5.1无菌检验应在环境洁净度 10000级下的局部百级的单向流空气区域进行。 5.2缓冲区与外界环境、无菌检验室与缓冲区之间空气应保持正压,阳性对照室与缓冲区之间空气应保持负压。无菌检验室与室外大气之间静压差应大于 10Pa 。无菌检验室的室温应保持 18~26℃,相对湿度:45~65%。 5.3无菌检验室的单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的监测。每年至少检测一次。
5.4无菌检验过程中应同时检查超净工作台单向流空气中的菌落数:每次操作时在层流空气所及台面的左中右置 3个营养琼脂平板,暴露 30min ,于 30~35℃培养 48小时,菌落数平均应不超过 1CFU/平板。 6无菌检验前的准备 6.1器具灭菌、消毒 6.1.1灭菌:试验过程中与供试品接触的所有器具必须采用可靠方法灭菌。可经电热干燥箱 160℃以上干烤 2小时,或置压力蒸汽灭菌器 121℃蒸汽灭菌 30分钟后使用(根据灭菌效果验证决定灭菌参数。所有的灭菌物品不应超过 2周即用毕, 否则应重新灭菌。 6.1.2消毒:凡检验中使用的器材无法灭菌处理的,使用前必须经消毒处理。如无菌检验室的试管架、电子天平、工作台面、工作人员的手、橡胶吸头等。可采用消毒剂浸泡或擦拭。消毒剂应每月更换,以防止产生耐药菌株。 6.1.3标识:器具的灭菌、消毒后必须做好标识,标明灭菌、消毒时间和使用有效期。 6.2人员、物料进入无菌检验室 6.2.1开启紫外线灯或臭氧发生器进行空间灭菌处理,消毒时间不得少于 30min 。 6.2.2物料进入无菌检验室流程 6.2.2.1脱包:进入无菌检验室的物品若有双重包装的,需将外包装在传递窗 /缓冲间拆除后,传入试验室。 6.2.2.2消毒:进入无菌操作室的所有培养基、供试品等的外表都应采用适用的方法进行消毒处理,以避免将外包装污染的微生物带入无菌检验室。 6.2.2.3传递:查看所有进入无菌检验室的器具上的灭菌、消毒标识, 是否在有效期。符合要求的经传递窗传入无菌检验室。
无菌检查操作规程 1.目的 建立无菌检查标准操作规程，确保检查结果准确、可靠。 2.使用范围 本公司无菌产品的无菌检查 3.职责 质量部QC 4.依据 2015版《中国药典》通则1101 GB/T 19973.2-2005（ISO11737-2:1998） 《疗器械的灭菌微生物学方法第2部分：确认灭菌过程的无菌试验》 GB/T 14233.2-2005 《医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法》 5.内容 5.1.无菌检查环境保障 5.1.1.无菌检査的所有操作均需在严格控制微生物污染的环境下进行，即无菌检 査应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行。 5.1.2.操作环境的无菌保障程度将直接影响无菌检查结果，为了保证无菌检查用 洁净室（区）环境的稳定性，确保检查结果的可靠性，对洁净室（区）的环境定期监测并采取合理的措施保证洁净环境符合要求。 5.1.3.无菌检查全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。 5.1.4.洁净区的温度、湿度等参数必须符合相应洁净级别的要求。 5.1.5.无菌检查操作还需要对检查环境进行监控， 5.2.培养基、稀释液、缓冲液 5.2.1.硫乙醇酸盐流体培养基，市售培养基干粉。除另有规定，接种后应置 30~35℃培养。 5.2.2.胰酪大豆胨液体培养基，市售培养基干粉。接种后应置20~35℃培养。 5.2.3.中和或灭活用培养基，按上述硫乙醇酸盐流体培养基或胰酪大豆胨液体培
养基的处方及制法，在培养基灭菌或使用前加入适宜的中和剂、灭活剂或表面活性剂，其用量同方法适用性试验。 5.2.4.胰酪大豆胨琼脂培养基，市售培养基干粉。 5.2.5.沙氏葡萄糖液体培养基，市售培养基干粉。 5.2. 6.沙式葡萄糖琼脂培养基，市售培养基干粉。 5.2.7.PH7.0氯化钠蛋白胨缓冲液，市售培养基干粉。 5.2.8.0.9%无菌氯化钠溶液。 5.2.9.培养基使用性检查 无菌检査用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符培养基的无菌性检査及灵敏度检査的要求。本检查可在供试品的无菌检査或与供试品的无菌检査同时进行。 5.2.9.1.无菌性检查：每批培养基随机取5支（瓶），按各培养基规定的温度下 培养14天，应无菌生长。 5.2.9.2.灵敏度检查 5.2.9.2.1.菌种：培养基灵敏度检查所用的菌株传代数不得超过5代(从菌种存中 心获得的干菌种第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以 证试验菌株的生物学特性。 金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26 003] 铜绿假单胞菌[CMCC(B)10 104] 枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63 501] 生孢梭菌[CMCC(B)64 941] 白色念珠菌[CMCC(F)98 001] 黑曲霉[CMCC(F)98 003] 5.2.9.2.2.菌液制备：接种金色葡萄球菌、铜绿假胞菌、枯草芽孢杆菌的培养物 至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭 菌的培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30?35℃培养18?24小时； 接种白色念珠菌的培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖琼 脂培养基上，20?25℃培养24?48小时，上述培养后的新鲜培养物用 PH7.0无菌化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌化钠溶液制成每lml菌数小
无菌操作技术经验操作 规范 Document serial number【KK89K-LLS98YT-SS8CB-SSUT-SST108】
无菌技术操作流程 1、尊敬的各位评委老师大家好，我今天操作的项目是：无菌操作技术 2、整理着装、手消毒液已开启在有效期——七步洗手法——戴口罩 3、我准备的用物是：清洁治疗盘——无菌持物钳——镊子筒——无菌治疗巾——无菌治疗包——无菌手 套——无菌生理盐水——无菌治疗缸——碘伏——棉签——弯盘2个——抹布2块——物品已备齐，操作开始 4、评估环境：治疗室环境宽敞、光线充足，治疗车、治疗台清洁干燥符合无菌操作 5、拿盘、擦盘——快速洗手——无菌持物钳及镊子筒在有效期、包布无潮湿、无破损、3m胶带变色均 匀，灭菌合格——去3m胶带贴桌上——打包——镊子筒放好夹出化学指示卡（化学指示卡变色均匀，灭菌合格）——写开启时间于3m胶带上——贴标签于缸缘下2cm处（已开启的持物筒有效期为4个小时）——无菌治疗巾在有效期、包布无潮湿、无破损、3m胶带变色均匀——打开治疗巾——镊子夹出化学指示卡（化学指示卡变色均匀，灭菌合格）——镊子夹治疗巾放入治疗盘中——打开——铺巾——检查无菌治疗包——打包（化学指示卡变色均匀，灭菌合格）—夹治疗碗放于无菌治疗巾上——无菌治疗缸已开启在有效期—夹取纱布——0.9%氯化钠注射液250ml在有效期——清洁瓶身——快速洗手——检查溶液——打开铝盖——消毒瓶盖（棉签、碘伏已开启在有效期——消毒瓶盖，打开瓶盖——瓶签在掌心，冲洗瓶口——向碗内倒入生理盐水，盖好瓶盖，消毒瓶周2遍，记录开启时间（已开启的生理盐水有效期为24小时）——铺好无菌盘——记录铺盘人及时间，已铺好的无菌盘，有效期为4个小时——七步洗手法——选择合适的无菌手套，检查手套（无菌手套在有效期，包装完好，挤压无漏气）——取出无菌手套——戴手套（按照规范方法戴手套）——手套戴好后双手交叉（调整手套位置），双手放于胸前——脱手套（按规范方法脱手套）——放入黄色垃圾袋中——医疗垃圾分类处理——七步洗手法——操作结束。 无菌技术是指在医疗护理操作过程中，保持无菌物品不被污染，防止一切微生物侵入或传播给他人的一系列操作技术和管理方法，是预防医院内感染的一项重要的基本措施。 无菌操作原则 1.环境清洁进行无菌技术操作前30分钟，停止清扫工作，减少走动，防止尘埃飞扬。 2.工作人员要求修剪指甲、戴好口罩、帽子。必要时穿无菌衣，戴无菌手套。 3.物品保管无菌物品和非无菌物品应分别放置，并有明显标志。无菌物品必须存放在无菌容器或无菌包内，不可暴露在空气中，无菌包或无菌容器外要注明物品名称、灭菌日期，物品按有效期先后顺序摆放。 4.操作时要求工作人员面向无菌区，用无菌持物钳取无菌物品，手臂须保持在腰部水平或治疗台以上，注意不可跨越无菌区。操作时不可面向无菌区讲话、咳嗽、打喷嚏。无菌物品怀疑被污染时，给予更换。 5.一人一物一份无菌物品，仅供一位患者使用，防止交叉感染。 一无菌持物钳的使用 目的：用于取放或传递无菌物品 注意事项：1无菌持钳使用时，取出和放入时必须垂直提起和放入，不可触碰到筒壁和边缘。夹取物品时也是垂直夹取。不可倒置和横置。 2取远处物品时，应当连同容器一起移至物品旁进行操作。 3无菌持物钳不能夹取未灭菌的物品，也不能夹取油纱布（条、球）。 4无菌钳使用时不能低于腰部。 5打开包后的干持物筒、持物钳使用的有效期，≤4小时。 6不可直接从盖孔中取、放无菌持物钳。 7避免无菌持物钳在空气中暴露过久。 二无菌容器的使用 目的：无菌容器是用于盛放无菌物品并保持其无菌状态的容器。 注意事项：1.夹取无菌容器内物品时，无菌持物钳及无菌物品不可触及容器的边缘 2.移动无菌容器时，应托住底部，手不可触及无菌容器边缘 3.从无菌容器内取出的无菌物品，虽未使用，也不得在放回无菌容器内。
起草人：起草日期： 审核人：审核日期： 批准人：批准日期： 武汉仝干生物科技有限公司 Wuhan Togo Biotechnology Co.,Ltd
1、目的 建立无菌检测的基本操作，为无菌检测人员提供正确的操作规程。通过无菌检验后，确保产品能够达到无菌的要求。 2、适用范围 适用于我公司进行细胞质量检验的技术人员。 3、内容 3.1 简述：无菌检测系用于检查细胞是否无菌的一种方法。检查项目包括需氧菌、厌氧菌及真菌检查。若供试品符合该项检查方法的有关规定，仅表明在该检验条件下未发现微生物污染。 3.2 环境要求：该项检查应在环境洁净度万级背景下的局部百级的单向流区域内或隔离系统中进行。其过程必须严格遵守无菌操作，日常检验需对试验环境进行监控。 3.3人员要求：无菌检测人员应具备微生物及检验专业知识，并经过无菌检验培训。 4、无菌检验前的准备 4.1器具灭菌、消毒 试验过程中与供试品接触的所有器具必须采用可靠方法灭菌，可置高压灭菌锅内121℃蒸汽灭菌30分钟后使用（根据灭菌效果验证决定灭菌参数）。所有的灭菌物品不应超过2周即用毕，否则应重新灭菌。凡检验中使用的器材无法灭菌处理的，使用前必须经消毒处理，如无菌检验室的电子天平，工作台面等，可采用消毒剂浸泡或擦拭。 器具的灭菌、消毒后必须做好标识，标明灭菌、消毒时间和使用有效期。 4.2人员、物料进入无菌检验室
开启紫外灯或臭氧发生器进行空间灭菌处理，消毒时间不得少于30分钟。人员进入无菌检验室需在一更区脱去一般区工作鞋，换无菌检验室工作鞋，并在二更区穿戴无菌服、口罩和手套，口罩掩住口鼻，帽子包裹所有头发。 进入无菌检验室的所有培养基、供试品等需将外包装在传递窗拆除后，查看所有进入无菌检验室的器具上的灭菌、消毒标识，是否在有效期内，符合要求的于传递窗进行表面紫外消毒，传入无菌检验室。 5、无菌检验室操作要求 1）人员进入后，首先进一步消毒擦拭工作台面。 2）全过程必须严格执行无菌操作，防止微生物污染。 3）使用玻璃器皿应轻取轻放，避免破损，以防培养物扩散。 4）所有操作均应在近火焰区进行，且不得有大幅度或快速动作，以免搅动空气中的尘埃微粒。 5）使用金属接种器具时，用前、用后均需灼烧灭菌。 6）在接种培养物时，动作应轻、准，防止培养物溅出，产生汽溶胶，造成污染。 7）操作过程中所有的带菌物品，用后均应作消毒、灭菌处理。可在检验过程中随用随时放入消毒液缸内浸泡或消毒桶内，或在检验完成后经传递窗传至一般区，立即用压力蒸汽灭菌锅121℃灭菌30分钟。 6、培养基制备 6.1需氧菌、厌氧菌培养基（硫乙醇酸盐流体培养基）的制备 所用试剂： 酪胨（胰酶水解） 15.0g 葡萄糖 5.0g L-胱氨酸 0.5g 硫乙醇酸钠 0.5g （或硫乙醇酸）（0.3ml） 酵母浸出粉 5.0g 氯化钠 2.5g 新配制的0.1%刃天青溶液 1.0ml 琼脂 0.75g 水 1000ml
护理技能无菌操作技术 规范 标准化管理处编码[BBX968T-XBB8968-NNJ668-MM9N]
护理技能无菌操作技术规范 [目的] 保持无菌物品及无菌区域不被污染 [操作步骤] 一、洗手戴口罩二、准备用物：无菌持物钳 , 无菌包 , 无菌敷料 , 无菌盘，无菌溶液 , 启瓶器， 2% 碘酒、 75% 酒精，弯盘，无菌容器 , 无菌物品 , 无菌手套 保持无菌物品及无菌区域不被污染 [操作步骤] 一、洗手戴口罩 二、准备用物：无菌持物钳 , 无菌包 , 无菌敷料 , 无菌盘，无菌溶液 , 启瓶器， 2% 碘酒、 75% 酒精，弯盘，无菌容器 , 无菌物品 , 无菌手套 三、无菌持物钳使用 取放无菌持物钳时 , 钳端闭合 手放在镊子上 1/3 不可触及容器口液面以上的容器内壁 使用时钳端向下 只能在持物者的胸部水平移动 , 不可甩动 只能夹取无菌物品，不可触及非无菌物品及非无菌区 用后立即放回容器中，松开钳轴 取油纱时应用专用无菌持物钳 到远处取物时 , 应将持物钳和容器一起移至操作处就地使用 四、无菌容器的使用
打开无菌容器盖要内面朝上，放在稳妥处或拿在手上 手不可触及容器盖内面及边缘 用无菌持物钳取无菌容器内的物品 钳、物品不可触及容器的边缘 用毕将容器盖严，盖子应由后向前覆盖整个容器口 手持无菌容器应托住底部，手指不可触及容器边缘或内面 五、无菌包 核对无菌包日期 , 名称，查看化学指示胶带颜色改变情况 将无菌包搁在清洁干燥平坦的操作台上 解开系带卷放在包布角下边 逐层打开 ( 先外角 - 左右角 - 内角 ) ，手不可触及包皮内面 用无菌持物钳打开内层 ( 先外角 - 左右角 - 内角 ) 用无菌持物钳取物品 , 放在无菌区内 未用完的包按原痕包好，内层用无菌持物钳包好 ( 先内角 - 左右角 - 外角 ) ，外层用手包好 ( 先内角 - 左右角 - 外角 ) 注明开包日期时间 24h 内可使用 , 如已污染 , 重新消毒 六、无菌盘 双手捏住无菌巾上层两角的外面轻轻抖开 , 放在治疗盘上 将上层折成扇形 , 边缘向上 放入无菌物品后 , 将上层盖上