中图分类号:S 852.611:Q503 文献标识码:A 文章编号:1673-4696(2006)02-0112-06
猪链球菌2型多重PCR 快速检测方法的建立
韩雪清,林祥梅,吴绍强,贾广乐,刘 建,梅 琳
(中国检验检疫科学研究院,北京 100029)
摘要:根据猪链球菌16S rDNA 基因的种特异性基因序列和CPS 基因的2型(1或/和2型)
型特异基因序列设计了4条引物,建立了快速检测猪链球菌2型(1或/和2型)的多重PCR 方法。利用保存的猪链球菌2型菌株和其他相关标准菌株作为参考菌株对该方法进行了敏感性和特异性试验。结果显示,所建立的多重PCR 方法特异、敏感,对组织中的猪链球菌2型(1或/和2型)的最低检出水平为30CFU/mL 。用所建立的多重PCR 方法对采自江西、北京、珠海、天津、四川等省市的猪扁桃体样品进行了检测,并通过细菌分离和玻片凝集试验对其检测结果进行了验证,结果显示,检出阳性符合率为100%,证实建立的多重PCR 方法可用于猪链球菌2型的快速检测。
关键词:猪链球菌2型;多重PCR;检测;初步应用
Establishment and preliminary application of multiplex PCR assay
for rapid detection of Streptococcus suis serotype 2
H AN Xue -qing,LIN Xiang -mei,WU Shao -qiang,JIA Guang -le,LIU Jian,MEI Lin
(Chines e A cademy of I nsp ectio n and Q uar antine ,Beij ing 100029,China)
Abstract:Four specific primers w ere desig ned based on the species -specific 16S rDNA g ene sequence
and type -specific capsular g enes sequence of S.suis serotype 2(o r 1/2type),and then a multiplex PCR as -say w as established for the rapid detectio n of S.suis serotype 2(or 1/2ty pe).T he sensitivity and the spec-i ficity tests using S.suis ser otype 2str ain and o ther related standard strains as reference strains show ed that the m ethod w as quite specific and sensitive,and as low as 30CPU /mL of serotype 2(or 1/2type)o f S.suis could be detected from tissue sam ples.T he m ethod w as also used to detect tonsil samples o f pigs from Jiang xi,Beijing,Zhuhai,Tianjin and Sichuan,and the results w as consistent w ith that of classic bacteria isolation and slide agg lutination test.T he results sug gested that the established multiplex PCR assay co uld be used for rapid detectio n of S tr ep tococcus suis serotype 2.
Key words:Str ep tococcus suis serotype 2;multiplex PCR assay ;detection;application 猪链球菌(S tr ep tococcus suis )分为35个血清型,以2型流行最广,致病性最强,可引起猪和人败血症、脑膜炎、心内膜炎等严重疾病,发病猪群的死亡率可达80%[1~5]。2005年7月25日,卫生部和农业部联合发布,6月24日以来四川省发生的导致人和猪发病并死亡的疾病是由猪链球菌2型感染引起的。截至8月6日,我国四川、重庆、广东、香港、江西、江苏等省市人感染猪链球菌病共导致43人死
亡。四川省累计报告病例214例,其中实验室确诊43例,临床诊断122例,疑似41例,死亡39例,疫情涉及11个市34个县,引起了巨大的恐慌和经济
损失。目前缺少一种用于大量的进出口活动物及其产品检疫和监测的快速、高通量方法,而国内尚无成熟方法的行业标准和国家标准,世界动物卫生组织(OIE)也没有猪链球菌2型的检疫规范,我国口岸进出口检验检疫面临着严重挑战。国内外对该病的
收稿日期:2005-10-13
基金项目:国家质量监督检验检疫总局应急专项([2005]846)
作者简介:韩雪清(1962),女(保安族),甘肃兰州人,副研究员,博士,研究方向为病原微生物分子生物学及检验检疫技
术,E -mail:hanx ueq@https://www.doczj.com/doc/a015757390.html,
中国兽医科学 2006,36(02):112-117Veter inary Science in China
研究主要集中在其防控和猪链球菌2型的毒力因子、致病机理等方面,对检测方法的研究较少,还没有商品化的试剂盒[6~8]。经典的检测方法操作复杂、耗时长,难以适应口岸检验检疫快速、大批量检疫和监测的需求[9]。尽管国内也建立了一些PCR 方法,其靶基因主要集中在胞外因子、溶血素基因、谷氨酸脱氢酶、溶菌酶释放蛋白中[10~14]。而研究发现,这些毒力因子不是存在于所有的欧洲强毒株中,有些强毒株缺少这些毒力因子蛋白但致病力很强[15,16],也就是说这些基因均为猪链球菌2型的毒力相关因子,不是所有猪链球菌2型都具有的保守基因,因此在检验检疫中存在着严重漏检的隐患。鉴于此,亟须研究一种既能快速、敏感、特异、高通量地检测猪链球菌2型,又能避免漏检的检测方法并制定相应的标准,以满足口岸检验检疫之需。
本研究针对上述问题建立了多重PCR快速检测方法。该方法选择猪链球菌16S rDNA基因的属特异基因序列和荚膜多糖(CPS)基因的2型(1或/和2型)型特异基因序列作为检测靶标,不仅能确定是否为猪链球菌而且能鉴别是否猪链球菌2型(1或/和2型),更重要的是这2个基因是猪链球菌2型的最保守基因,所建立的方法克服了漏检问题,非常适合在口岸检验检疫中把关筛查。
1材料
1.1阳性菌株和核酸
猪链球菌2型江苏株(灭活),猪链球菌2型四川株(灭活)均由中国人民解放军军事医学科学院提供;猪链球菌2型江苏株NJ-004核酸由江苏检验检疫局提供,系从江苏省暴发猪链球菌病的病猪中分离,并鉴定为猪链球菌2型。
1.2阴性对照菌
马链球菌兽疫亚种、无乳链球菌和粪链球菌等均购自中国兽医药品监察所;沙门菌、巴氏杆菌、大肠埃希氏菌均由中国检验检疫科学研究院动植物检验所动物检验室保存。
1.3主要试剂
溶菌酶、蛋白酶K、PCR扩增试剂和DL2000 DNA M arker均为北京六合同生物技术公司产品; DNA提取试剂盒为上海生工生物工程技术服务有限公司和QIAGEN公司产品。
1.4主要仪器
台式低温高速离心机,PCR扩增仪,稳压稳流电泳仪和水平电泳槽,电泳凝胶成像仪。2方法
2.1引物的设计与合成
根据GenBank中登录的猪链球菌不同菌株的16S核糖体和CPS基因全序列,利用DNAStar分子生物学软件,设计了2套分别用于扩增猪链球菌种属特异及2、1或/和2亚型特异性靶基因片段的引物。16S正向引物:5c-GCATA ACA GT ATT TA-CCGCAT GGT AGA T-3c;16S反向引物:5c-T T C-T GGT AAGA TACCGT CAAGTGAGAA-3c;CPS2J 正向引物:5c-T GT TGAGTCCTT AT ACA CCT GT-3c;CPS2J反向引物:5c-CAGAAAAT TCATA TT-GTCCACC-3c。均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
2.2样品的处理
在无菌环境下(在实验室生物安全柜中,若无条件可将样品在沸水中煮沸灭活后在工作台上进行操作),将采集的淋巴结、扁桃体等组织样本除去包膜和其他结缔组织,选取内部实质部分,置乳钵中剪碎研磨,加入灭菌生理盐水制成1B5悬液,冻存于-20e冰箱备用。
2.3基因组DNA的制备
2.3.1细菌纯培养物基因组DNA的制备参照上海生工生物工程技术服务有限公司SK1201说明书操作。
2.3.2组织样本基因组DNA的制备参照QIA-GEN公司的总DNA提取试剂盒说明书操作。
2.4PC R扩增
2.4.1细菌纯培养物的PCR将20~24h培养的细菌纯培养物(不经过离心)阳性和阴性对照DNA 各1.5L L加入含有猪链球菌2型PCR反应混合液的相应PCR反应管中,2000r/min离心10s,加入T aq DNA聚合酶0.2L L(2.5U),2000r/m in离心10s后,插入DNA热循环仪立即进行PCR扩增。反应条件:94e7m in;94.8e30s,60e30s,72 e1min,40个循环;72e10m in。反应结束后,取出置于4e保存。
2.4.2样本DNA的PCR分别将制备的各样品DNA、阳性和阴性对照DNA1.5L L加入含有猪链球菌2型PCR反应混合液的相应PCR反应管中, 2000r/min离心10s,加入Taq DNA聚合酶0.2 L L(2.5U),2000r/min离心10s后,插入DNA热循环仪立即进行PCR扩增。反应条件:94e7 m in;94.8e30s,60e30s,72e1min,40个循环;72e10min。反应结束后,进行电泳检测。
113
第2期韩雪清等:猪链球菌2型多重PCR快速检测方法的建立
2.5PCR产物的测序
将PCR产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序并分析。
2.6特异性试验
利用提取的马链球菌兽疫亚种、无乳链球菌、粪链球菌、沙门菌、巴氏杆菌、大肠埃希氏菌的核酸作为阴性对照,同时以猪链球菌2型核酸为阳性对照,用建立的多重PCR方法进行扩增,以确定其特异性。
2.7敏感性试验
2.7.1猪链球菌纯培养物的检测在P3实验室将标准猪链球菌液(5@106CFU/mL)做1B10、1B50、1B100、1B500、1B1000稀释,进行PCR 检测。
2.7.2猪链球菌样品的检测将灭活标准猪链球菌液稀释(5@106CFU/mL)后混入猪扁桃体中提取DNA,将提取的基因组DN A稀释为1B10、1B50、1B100、1B500、1B1000,进行PCR检测。
2.8田间样品的检测
对从江西、北京、珠海、天津、四川等地猪场采集的猪扁桃体样品(共380份)提取DNA并进行PCR 检测。结果判定:猪链球菌2型阳性对照的PCR产物电泳后,获得了305bp和460bp的特异性条带,阴性对照的PCR产物电泳后没有任何条带,判定检测结果成立。被测样品的PCR产物电泳后在305 bp和460bp处同时出现特异性条带者判为猪链球菌2型阳性;被测样品的PCR产物电泳后没有任何条带则判为猪链球菌2型阴性;只在305bp处出现特异性条带则判为猪链球菌,但不是2型。
2.9细菌的分离鉴定
无菌采取病料放入装有选择性增菌培养液的三角瓶中,36e培养2h,用接种环蘸取菌液划线接种于选择性普通羊血琼脂平板上,36e培养24h。圆形、微凸、表面光滑、湿润、边缘整齐、半透明、直径约0.3~0.5mm的菌落为可疑菌落。分离菌氧化酶和过氧化酶试验阴性,革兰氏染色阳性,菌体直径约1L m,可初步确定为链球菌。乳糖和海藻糖发酵试验产酸,发酵七叶苷,不发酵甘露醇和马尿酸,不水解马尿酸,即确定为猪链球菌2型。
2.10玻片凝集试验
用记号笔在载玻片内侧划2个约1cm@2cm 区域,各加1滴生理盐水。用接种环从平板上移取培养物到2个区域的生理盐水中,制成菌悬液。在2个区域的下部分别滴加1滴生理盐水和1滴猪链
球菌2型抗血清,用灭菌接种环将菌悬液和生理盐水、抗血清分别混合。前后倾斜摇动1min,在良好照明下对着黑暗背景观察。菌悬液和抗血清混合物凝集,生理盐水对照不凝集,为阳性反应;菌悬液和抗血清混合物不凝集,生理盐水对照也不凝集,为阴性;抗血清和生理盐水对照皆凝集,则试验需重做。
2.11验证试验
对用猪链球菌2型多重PCR方法检测为阳性的9份样品和随机抽取检测为阴性的9份样品进行细菌分离和玻片凝集试验,以验证其可靠性。
3结果
3.1猪链球菌2型DNA的多重PCR扩增
猪链球菌2型DNA扩增后获得的片段与预计大小完全一致,分别为305bp和460bp。见图1。
图1猪链球菌2型DNA的多重PCR扩增产物
Fig.1Gel electrophoresis analysis of multiplex PCR products from S.suis serotype2DNA
M:DNA分子质量标准;1:空白对照;2:猪链球菌2型;3:猪链球菌6型;4:健康猪淋巴结;5:健康猪肉
M:DL2000DNA M ark er;1:Negative control;2:S.suis serotype 2;3:S.suis serotype6;4:T on sil from h ealth s win e;5:M eat fr om health s win e
3.2PC R产物的测序
PCR扩增产物的测序结果显示,猪链球菌2型16S rDNA基因PCR扩增产物的序列与猪链球菌2型的同源性为99%,CPS2J基因为99%,表明扩增产物完全。
猪链球菌2型16S rDNA基因扩增产物的核苷酸序列:
猪链球菌2型CPS2J基因扩增产物的核苷酸序列:
114中国兽医科学第36卷
3.3 特异性试验
采用本研究建立的多重PCR 方法对猪链球菌2型核酸进行扩增,获得了305bp 、460bp 的2条特异性目的条带;猪链球菌6型仅扩增出1条305bp 的特异性目的条带;马链球菌兽疫亚种、无乳链球菌、粪链球菌、沙门菌、巴氏杆菌、大肠埃希氏菌的核酸以及从市场上购买的猪、羊肉样品的核酸检测结果均为阴性,未扩增出任何条带。说明该多重PCR 只能特异地扩增猪链球菌。见图2
。
图2 不同细菌样本的多重PCR 扩增产物
Fig.2 Gel electrophoresis analysis of multiplex PC R products
of dif ferent samples
M :DNA 分子质量标准;1:猪链球菌2型;2:空白对照;3:猪链球菌6型;4~6:依次为马链球菌兽疫亚种、无乳链球菌、粪链球菌;7~9:依次为沙门菌、巴氏杆菌、大肠埃希氏菌;10~13:为从市场购买的猪肉样品;14~16.为从市场购买的羊肉样品
M :DL2000DNA M ark er;1:S.su is serotype 2;2:Negative con -trol;3:S.suis s erotype 6;4-6:S.equi subs p.z ooep id emicus,S.a galactiae,S.f aec alis ,r espectively;7-9:S almone lla,Pasteure l -la,E.c oli ,resp ectively;10-13:Sw ine m eat sam ples fr om mar ket;14-16:S heep meat s amples from mar ket
3.4 敏感性试验
利用猪链球菌2型纯培养物进行的敏感性试验的结果见图3,在1B 250稀释时检测结果为阳性,多重PCR 检测猪链球菌纯培养物的敏感性为30CFU/mL;猪链球菌样品的敏感性检测见图4,在1B 250稀释时检测为阳性,多重PCR 检测猪链球菌样品的敏感性也为30CFU /m L 。3.5 田间样品的检测
利用建立的猪链球菌2型多重PCR 快速检测
方法对从江西、北京、天津等地采集的300份猪扁桃
体标本进行了猪链球菌2型的检测,结果均为阴性;而从四川采集的80份猪扁桃体中共检测出阳性样品9份,阳性检出率为11.3%。3.6 验证试验
上述9份阳性样品经细菌分离和玻片凝集试验证实,均为猪链球菌2型阳性,随机抽取检测为阴性的9份样品进行细菌分离和玻片凝集试验,均为猪链球菌2型阴性,猪链球菌2型多重PCR 快速检测
方法与经典方法的阳性检出符合率为100%。
图3 多重PCR 对不同稀释度灭活猪链球菌2型检测结果Fig.3 Multiplex PCR detection results of dif ferent dilution of
inactivated S.suis serotype 2
1:1B 500稀释的猪链球菌2型;2:1B 250稀释的猪链球菌2型;3:1B 100稀释的猪链球菌2型;4:1B 50稀释的猪链球菌2型;5:1B 25稀释的猪链球菌2型;6:1B 10稀释的猪链球菌2型1:1B 500dilution;2:1B 250dilution;3:1B 100dilution;4:1B 50dilution;5:1B 25dilu tion;6:1B 10dilu tion
图4 多重PCR 对猪扁桃体不同稀释度灭活菌液猪链球菌
2型的检测结果
Fig.4 Multiplex PCR detection results of dif ferent dilution of
S.suis serotype 2in tonsil
1:1B 500稀释的菌液;2:1B 250稀释的菌液;3:1B 100稀释的菌液;4:1B 50稀释的菌液;5:1B 25稀释的菌液;6:1B 10稀释的菌液
1:1B 500dilu tion ;2:1B 250dilution;3:1B 100dilution ;4:1B 50dilution;5:1B 25dilution;6:1B 10dilution
4 讨论
4.1 目前,国内外已经建立了一些检测猪链球菌属
115
第2期 韩雪清等:猪链球菌2型多重PCR 快速检测方法的建立
细菌的PCR方法。Sm ith等[17]和W isselink等[18]报道了2种检测猪链球菌毒力因子溶血素和菌体外因子的PCR方法,但研究发现这些毒力因子不是存在于所有欧洲强毒力株中的,毒力因子与链球菌2型致病力之间的对应关系还有争议,有些强毒株缺少这些毒力因子蛋白,但致病力很强。因此,现有方法的应用受到了限制,尤其是因有可能发生漏检,不适合在口岸检验检疫中使用。2003年Okw umabua 等[19]在编码2型猪链球菌谷氨酸脱氢酶gdh基因的基础上建立了一种多重PCR方法,虽然也非常有吸引力,但只适用于猪链球菌纯培养物的检测。我国在暴发猪链球菌病时,要求严格检疫,不可放过1例进出境可疑动物。猪链球菌2型多重PCR快速检测方法,适合于细菌分离培养物、扁桃体组织等样本的检测,不仅能够检测出所有血清型的猪链球菌感染,而且能够区分是否为2型,更重要的是这2个基因是猪链球菌2型的最保守基因,该方法解决了口岸进出境的漏检问题,是口岸检验检疫把关筛查的最好方法。
4.2在体外利用人工感染猪链球菌2型的SPF猪扁桃体对建立在16S rDNA和CPS基础上的多重PCR方法的敏感性进行评价,结果显示,其敏感度可达28CFU/m L,是细菌分离培养阳性结果的20倍(28B500),该方法也比其他PCR方法敏感[19~21]。本研究建立的多重PCR方法的敏感性达到了30CFU/m L。此外,这种检测方法对活猪(健康带菌)、死猪扁桃体等组织样本的检测与细菌分离和玻片凝集试验的阳性符合率为100%,可靠性很高。由于这种PCR方法省略了培养步骤,易于操作,也不需要复杂的仪器,且可同时分析96份样品。因此,在实践中可以从多重感染样品中特异地检测到猪链球菌2型,缩短了鉴定细菌所需的时间,在同一时间内提高了分析菌群的数量。
4.3猪链球菌2型多重PCR检测方法的建立不但可以判断是否感染了猪链球菌,还可以区分猪链球菌2型和其他所有血清型,并可直接用于猪链球菌敏感寄主猪的样品检测,简单、快速、特异性强,解决了以往方法存在的漏检问题,灵敏度达到了国外同类方法的水平。为猪链球菌的检验检疫、流行病学研究和病原传播、控制研究提供了有效方法,因此该方法对防止疫情扩散和维护国内外贸易的正常秩序有较大的现实意义和应用价值。
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Clinical M ocr obiolog,2004,42(7):3169-3175.
[21]H enk J,W iss elin k M,Jeroen J,et al.M ultiplex PCR ass ays
for simu ltaneous detection of six major serotypes and tw o vir-
ulence ass ociated phenotypes of S tr ep tococcus suis in tonsillar
specimens from pig s[J].J Clin M ic robiolog,2002,40(8):
2922-2929.
117
第2期韩雪清等:猪链球菌2型多重PCR快速检测方法的建立
猪链球菌问题集 2005年6月24日以来，四川省资阳市、内江市等地连续发生人的猪链球菌感染病例，党和政府对此十分关注，集中了大量的人力、物力和财力对该病进行了及时有效的控制。 为了普及猪链球菌、猪链球菌病及人的猪链球菌感染的相关知识，消除广大读者认识上的一些疑虑和误区，本人参阅相关资料编写了这个问题集，供广大读者参考。 1. 何为链球菌？ 链球菌最初是在1884年由Rosenbach用来描述一种从人的化脓性病灶中分离出来的长成链状的圆形球菌。自此以后，已发现了几十种不同种类的链球菌。链球菌呈革兰氏染色阳性，不能运动、无芽孢，直径大约为1微米的细菌，有些细菌可能有荚膜。大部分为兼性厌氧菌。 在这些链球菌中，有些能引起人与动物的多种疾病，它们常常寄生在动物的粘膜和肠道中，在适宜条件下趁机致病。 猪链球菌也有很多种，在临床上健康猪的扁桃体、肠道和粪便中都能分离到多种链球菌，其中有些链球菌是潜在的病原菌，也就是说，这些链球菌在一定条件下才可以使猪只发病。当然，也有些分布在肠道内的链球菌是一种有益菌，
可以帮助消化，帮助机体拮抗其它有害微生物。存在于猪肠道内的链球菌有肠链球菌、猪肠链球菌、猪链球菌、非解乳糖链球菌、牛链球菌等。存在于猪扁桃体的正常链球菌有猪链球菌、E群链球菌和停乳链球菌等。 2. 猪链球菌如何分型？ 可以根据细菌的溶血特性将链球菌分为α溶血、β溶血和非溶血群（以前称为γ型，现在已经不用这个名称），在这三型中，β型的溶血最明显。Lancefield根据血清学特性将链球菌分为A-H，K-V等群。在1956~1963年期间，曾将引起猪的败血性感染的链球菌归于R、S、RS和T群。也可以根据细菌表面的抗原蛋白（M，T和R）进行分类，其中M是非常重要的抗原蛋白，据此分为60多个不同的类型，分别称为血清1型、2型、3型……。在1963年又将S群和D群命名为猪链球菌血清1型，1975年又将R群的链球菌命名为猪链球菌血清2型。1型与仔猪的脑膜炎有关，2型菌可感染任何日龄的猪。总之，链球菌的分类还没有最后统一，交叉的情况依然存在，如A群可以分为60多个血清型，B 群可以分为4个血清型，C群可以分为13个血清型。 在1983 ~1995年期间，描述了35个菌株，增加了32个新的血清型。在这其中，血清14型来源于人，17、18、19和21型来源于健康的猪，20型和30型来源于病牛，33型来源于病羔羊。分离于病猪的多数猪链球菌属于1~8型。
附表1 布病流行病学个案调查表 国标码□□□□□□病例编码□□□□□省市县（区）乡（农场、镇、街道） 1．基本情况： 1．1患者姓名： 1．2 性别：⑴男⑵女□1．3年龄：□□1．4民族： 1．5职业： ⑴农民⑵民工⑶牧民⑷渔民⑸学生⑹医务人员⑺散居儿童⑻干部职员⑼家务及待业⑽畜产品收购、屠宰⑾皮毛加工销售⑿乳肉加工销售⒀兽医⒁其他⒂不详□1．6发病地址：县（市、区）镇（乡）村（街道）号1．7家庭住址：县（市、区）镇（乡）村（街道）号1．8发病日期：年月日 1．9住院日期：年月日 1．10报告日期：年月日 1．11所住医院名称： 2．临床表现： 2．1症状体征： 2．1．1发热⑴有⑵无□2．1．2发热持续（天）□2．1．3体温最高℃ 2．1．4多汗⑴有⑵无□2．1．5肌肉、关节酸痛⑴有⑵无□ 2．1．6乏力⑴有⑵无□2．1．7肝肿大⑴有⑵无□2．1．8脾肿大⑴有⑵无□2．1．9淋巴结肿⑴有⑵无□2．1．10睾丸肿大⑴有⑵无□2．2实验室检查： 2．2．1皮肤过敏试验（× cm） 2．2．2虎红平板凝集反应⑴＋⑵—□ 2．2．3 SAT滴度为（1：） 2．3临床诊断： 2．4治疗: 2．4．1抗生素治疗⑴有⑵无□2．4．2抗生素治疗方法 2．5转归：⑴痊愈⑵好转⑶未愈□ ⑷死亡（年月日死于） 3．流行病学调查：
3．1与动物接触史： 3．1．1畜别： 3．1．2饲养放牧⑴是⑵否□3．1．3屠宰⑴是⑵否□3．1．4配种⑴是⑵否□3．1．5兽医⑴是⑵否□3．1．6梳绒⑴是⑵否□3．1．7收购贩运⑴是⑵否□3．1．8乳肉加工⑴是⑵否□3．1．9皮毛加工⑴是⑵否□3．1．10其它 3．2防护情况： 3．2．1使用防护衣⑴是⑵否□3．2．2橡胶手套⑴是⑵否□3．2．3口罩⑴是⑵否□3．2．4帽子⑴是⑵否□3．2．5胶鞋⑴是⑵否□3．2．6防护眼镜⑴是⑵否□3．2．7使用消毒液⑴是⑵否□3．2．8工作后洗手、脸⑴是⑵否□3．2．9进食前洗手⑴是⑵否□3．2．10其它 3．3是否人畜共用食具⑴是⑵否□3．4是否人畜混居⑴有⑵无□3．5既往病史： 3．6确诊时间：年月日 3．7可能的传染源、传播途径及传播因子： 3．8其他： 3．9在本疫点病例发病时间顺序：第例。 4．调查小结： 注：国标码为各监测点国标码；病例编码中前两位为年号（如：04、05），后三位为病例流水号。 调查者单位：调查者： 审查者：调查时间：年月日
猪链球菌病的症状、诊断与防治 为了使农民朋友更全面地了解猪链球菌病，从而进行有效地防治，特做以下介绍。 一、临床症状 败血症型。一般发生在流行初期，突然发病，体温升至41～42℃，在数小时至1天内死亡。急性病例，常见精神沉郁，体温41℃左右，呈稽留热，减食或不食，心跳加快，眼结膜潮红，流泪，有浆液性鼻液，呼吸浅而快。部分病猪在发病的后期，耳尖、四肢下端、腹下可见有紫红色或出血性红斑，有跛行病程2～4天。 脑膜炎型。多发于哺乳仔猪和保育仔猪，与水肿病的症状相似。发病初期患猪体温升高，食欲废绝，便秘，有浆液性或粘液性鼻液，继而出现神经症状，转圈，空嚼，磨牙，直至后躯麻痹，共济失调，侧卧于地，四肢作游泳状，颈部强直，角弓反张，甚至昏迷死亡。部分猪出现多发性关节炎、关节肿大，病程5～10天。 关节炎型。患猪体温升高，被毛粗乱，呈现关节炎病状，表现一肢或肢关节肿胀，高度跛行，甚至不能起立。病程2～3周。小部分哺乳仔猪也可发生，常常因抢不上吃奶而逐渐消瘦。 化脓性淋巴结炎型。病猪淋巴肿胀，坚硬，有热痛感，采食、咀嚼、吞咽和呼吸较为困难，多见于颌下淋巴结化脓性炎症，咽喉、耳下、颈部等淋巴结也可发生。一般不引起死亡，病程为3～5周。病猪经治疗后肿胀部分中央变软，皮肤坏死，破溃流脓，并逐渐痊愈。 二、解剖病变特点 病猪死后血液凝固不良呈污秽色。心冠脂肪水肿，心内外膜有出血点或出血斑；心包、胸腔积液，呈黄色，有时积液中有纤维蛋白；鼻黏膜、喉头、气管、黏膜充血或出血，有泡沫状物；肺充血、水肿；肝瘀血肿大，呈暗紫色，有时呈黄色；脾瘀血肿大，呈暗黄色，病程稍长的多为黄色；膀胱皱缩，少尿或无尿，全身淋巴结出血肿大或水肿，有的淋巴结周围结缔组织水肿或呈胶冻样；胃和小肠黏膜有不同程度的出血，肠系膜水肿；神经症状严重的脑膜充血、出血，严重的甚至脑膜出血或脑膜下积液。 三、诊断 根据本病流行病学特点，临床症状及病理变化特征一般可以作出初步诊断。但由于本病的临床表现和病理剖检变化比较复杂，容易与败血性和慢性猪丹毒，急性猪瘟等一些败血性及脑膜炎等疾病混淆，故应以实验室诊断为依据。 涂片镜检：取病死猪脾脏、淋巴结制成触片或取心血制成涂片，经革兰氏染色镜检，可见单个、成双、短链球状排列的革兰氏阳性球菌。 分离培养：取心血、肝、脾等病料无菌接种于绵羊鲜血琼脂平板、肉汤、厌气肉汤培养基，染色37℃恒温培养24小时，在血斜面出现灰白、圆形小菌落。肉汤均匀混浊、管底呈絮状沉淀。培养物涂片镜检，菌落涂片可见大量成对和3～5个排列短链球菌。肉汤涂片可见3～5个、十几个乃至几十个置长链状排列球菌，均呈革兰氏阳性着色。 动物接种试验：用小鼠或小兔数只皮下注射前述病料乳剂(病料肝、脾、脑与无菌生理盐水1：10研磨而成)，每只0.2毫升，小鼠(兔)于24～72小时死亡。取死亡鼠(兔)肝、脾、心血分别制片，均见成双短链状革兰氏阳性球菌。 四、治疗及预防 1、病猪立即隔离。圈舍、用具用3%苛性钠溶液、0.3%过氧乙酸、菌毒灭交替喷雾消毒，粪便污物堆积发酵。 2、对病死猪进行深埋或焚烧。
石河子部分猪场链球菌2型的分离鉴定与毒力因子检测 霍永，李劼，张银国* (新疆石河子大学动物科技学院，石河子市832003) 摘要：为了解石河子垦区具有呼吸道病症状的病死猪感染猪链球菌2型的情况，对采集的 53份肺脏组织进行了猪链球菌的分离培养、生化鉴定、PCR鉴定以及cps2J、ef、mrp毒 力因子的检测。结果：分离出猪链球菌2型21株；其中株毒力因子为ef，株毒力因子 为cps2J/ef 结论： 关键词：猪链球菌2型；分离鉴定；毒力因子 猪链球菌2型(Streptococcus suis,SS2)是一种严重危害养猪业的重要病原之一，能引起猪的关节炎、脑膜炎、胸膜肺炎、败血症、脓肿等，并且猪链球菌2 型能引起人感染发病，是重要人畜共患病病原[1]，从事屠宰或与生猪肉打交道的 人易通过伤口感染，引致人脑膜炎、败血症、心内膜炎、并可致死[2]。 为了解石河子垦区具有呼吸道病症状的病死猪感染猪链球菌2型的情况，对 采集的55份肺脏样品进行了猪链球菌2型的分离鉴定与药敏试验，以期为垦区 预防和控制该病的流行提供重要依据。 1材料与方法 1.1材料 1.1.1病料 于12个猪场无菌采集具有明显呼吸道病症状的病死猪肺脏组织，共75份。1.1.2主要试剂及仪器 含5%血清的Todd-Hewitt肉汤(THB)，含5%血清的选择性THB，普通琼脂 绵羊血平板，选择性普通琼脂绵羊血平板；药敏纸片由本实验室自制；小白鼠由 石河子大学实验动物中心提供。 2×Taq PCR MasterMix（北京诺维森生物科技有限公司），定量Marker1、Marker2000(广东东盛生物科技有限公司)，PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统 均为Bio-Rad公司产品。 1.3.3引物合成 猪链球菌2型荚膜多糖基因(cps2J)、溶菌酶释放蛋白基因(mrp)、胞外因子(ef) 的引物参照文献[4]由上海生工生物工程有限公司合成。详见表1： 表1 PCR引物、退火温度及目的片段大小 目的基因引物序列退火温度/时间产物大小ef P1 5'-ACA AAG GCG TAG GTT CAA TC-3'55℃/30s 269bp P2 5'-CGG CAT CAA GAA TGT CTT TG-3'
病猪尸体解剖技术与常 见疾病诊断 WTD standardization office【WTD 5AB- WTDK 08- WTD 2C】
病猪尸体解剖技术与常见疾病的病理学诊断 徐海军 （六安市畜牧兽医技术服务中心实验室） 1外部检查 在进行尸体解剖之前,应先了解病死猪的流行病学情况、临床症状和治疗效果,观察其天然孔、皮肤、可视黏膜等变化，对病情有个初步诊断，以避免解剖不可解剖的尸体。猪体表病理变化和可能涉及的疾病见表1。 表1体表器官病变及可能涉及的疾病
2内部检查 皮下检查 皮下检查在剥皮过程中进行。从颈、胸及腹中线切开皮肤，在剥皮的同时检查皮下有无充血、炎症、出血、淤血、水肿以及体表淋巴结的大小、颜色和病理变化。 固定、剖开腹腔将腹腔器官摘出 尸体取背卧位。一般先切断肩胛骨内侧和髋关节周围的肌肉（仅以部分皮肤与躯体相连），将四肢向外侧摊开以保持尸体仰卧位置。从剑状软骨后方沿腹壁正中线由前向后至耻骨联合切开腹壁，再从剑状软骨沿左右两侧肋骨后缘切开至腰椎横突。这样腹壁被切成大小相等的两楔形。将其向两侧分开，腹腔脏器即可全部露出。 剖开腹腔时应结合进行皮下检查。看皮下有无出血点、黄染等。在切开皮肤时需要检查腹股沟浅淋巴结，看有无肿大、出血等异常现象。腹腔切开后，须先检查腹腔脏器的位置和有无异物、腹腔器官浆膜是否光滑，肠壁有无粘连。 依次摘出肝、脾、胃网膜、胃、十二指肠、小肠、大肠、直肠和肾脏。分离肠系膜时，要注意观察肠系膜有无出血、水肿及淋巴结变化。 剖开胸腔将胸腔器官摘出 先分离胸壁脂肪和肌肉，检查胸腔压力，切断肋骨与肋软骨结合部，切断肋间肌等软组织，暴露胸腔内器官，检查胸腔和心包有无积液及其性状，胸膜是否光滑，有无粘连。 口腔和颈部器官的采出
布鲁氏菌病暴发疫情调查及疫区处理实施方案 布鲁氏菌病（简称布病）是一种由布鲁氏菌引起的严重危害人民健康和畜牧业发展的人畜共患传染病。通过近年来对全市布病情况的监测调查，我市人间布病疫情较为稳定，但仍有发生暴发疫情的可能。为有效控制布病疫情，科学处理布病疫区，保护人民群众的身体健康，促进畜牧业良性发展，特制定本方案。 一、目的 查清布病发生的原因、范围、传染源种类和人畜间流行强度，采取切实有效的防控措施，落实科学规范的疫区处理手段，彻底控制人畜间布病暴发和流行。 二、组织机构 为实现对布病暴发疫情规范处置的统一指挥和有效协调，成立鸡西市疾病预防控制中心布病调查处理领导小组。组长由主管副主任担任，成员包括地病科、应急办以及各县区疾控中心主管领导。 三、定义 （一）病例定义 1.诊断原则 根据流行病学接触史、临床症状和体征及实验室检查结果进行综合判断。 2.诊断标准 (1)流行病学：发病前病人与家畜或畜产品，布氏菌培养物有接触史，或生活在疫区内的居民或与菌苗生产、使用和研究有密切关系者。 (2)临床表现：出现持续数日乃至数周发热（包括低热），多汗，
肌肉和关节酸痛，乏力，兼或肝、脾、淋巴结和睾丸肿大等可疑症状及体征。 (3)实验室初筛：布病玻片、虎红平板凝集反应阳性或可疑，或皮内变态反应阳性。 (4)分离细菌：从病人血液、骨髓、其他体液及排泄物中分离到布氏菌。 (5)血清学检查：标准试管凝集试验（SAT）滴度为1：100(++)及以上；对半年内有布氏菌苗接种史者，SAT滴度虽达1：100(++)及以上，过2—4周后应再检查，滴度升高4倍及以上；或用补体结合试验检查，滴度1：10(++)及以上；抗人免疫球蛋白试验滴度1：400(++)及以上。 疑似病例：具备(1)、(2)和(3)者。 确诊病例：疑似病例加(4)或(5)中任何一种方法阳性者。 (二)暴发疫情定义 在一个潜伏期内，局部地区或一个集体单位内发生3例以上病人称为暴发。 四、调查处理内容 1、初步调查分析疫情： 暴发疫情发生后，县区疾控中心必须立即向市疾控中心报告，并在最后一例病人报告后24小时内完成初步调查。要查访所有能找到的现患病例，并逐个进行个案调查，采集必要的疫情信息，掌握疫情范围、程度、性质等相关情况。根据初步调查情况对疫情性质作出分析判断，并提出对疫区的处理意见。如果经确认暴发信息不真实，则应草拟相关意见呈报当地卫生部门和上级疾控中心，向公众澄清事实，以免引起不必要的恐慌。
一、概念 猪链球菌病是由多种不同群的致病性链球菌引起的一种人畜共患的急性、热性传染病。是一种多型性疾病，主要表现为急性出血性败血症、心内膜炎、脑膜炎、关节炎、哺乳仔猪下痢和孕猪流产等 二、病原 链球菌(stroptococcus)属于G+ 球菌,种类很多，现已分离出35个菌株，分为32个荚膜型，其中9—14亚型可引起仔猪发病。 生物学性状: （一）形态染色 球形或卵圆形，直径0.6～1.0um，呈链状排列，短者4～8个细菌组成，长者有20～30个细菌组成。幼龄培养物大多可见到透明质酸形成的荚膜。无芽胞，无鞭毛，革兰氏染色阳性。（但在陈旧培养基或脓液标本中常呈阴性） （二）培养特性 需氧或兼性厌氧，有些为厌氧菌。营养要求较高，普通培养基中需加有血液、血清、葡萄糖等才能生长。最适温度37℃，最适PH7.4～7.6，血琼脂平板上形成灰白、光滑、圆形突起小菌落，不同菌株有不同溶血现象。 (三)、生化反应 能发醇简单的糖类，产酸不产气。一般不分解菊糖，不被胆汗或1%去氧胆酸钠所溶解。这两种特性用来鉴定甲型溶血型链球菌和肺炎球菌。（四）抗原结构 主要有三种： 1．核蛋白抗原:或称P抗原，无特异性，各种链球菌均同，与葡萄球菌有交叉。 2．群特异性抗原：多糖抗原或称C抗原系统族特异性抗原，是细菌壁的组成成份。对人致病的90%属于A族，其次为B族，其它族少见。 3．型特异性抗原：蛋白质抗原或称表面抗M、R、T、S等四种不同性制质的抗原组份，具有型特异性。是链球菌细胞壁的蛋白质抗原，位于C抗原外层，同族链球菌可根据表面抗原不同进行分型，如A族链状菌可据此分为60多型。 （五）分类 1．根据对红细胞的溶血能力 （1）甲型溶血性链球菌（α-Hemolytic streptococcus）,菌落周围有1～2mm宽的草绿溶血环，称甲型溶血或α溶血。这类链球菌亦称草绿色链球菌（Streptococcus viridans）。此类链球菌为条件致病菌。 （2）乙型溶血性链球菌（β-Hemolytic streptococcus）菌落周围形成一个2～4mm 宽，界限分明、完全透明的溶血环，完全溶血，称乙型溶血或β溶血。这类细菌又称溶血性链球菌(Streptoccus hemolyticus)，致病力强，引起多种疾病。 （3）丙型链球菌（γ-Streptococcus），不产生溶血素，菌落周围无溶血环，故又称不溶血性链球菌(Streptococcus non-hemolytics)，一般不致病。 2．根据抗原结构分类 按C抗原不同可分类A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T 等18个族。对人致病的大多属于A族。A族又称为化脓性链球菌（Pyogenic streptococcus）。 3．根据对氧需求分类又可分为需氧、兼性厌氧和厌氧三大类链球菌。（六）抵抗力
布病监测方案050725
附件2： 全国人间布鲁氏菌病监测方案 （试行） 一、概述 布鲁氏菌病（以下简称布病）是一种由布鲁氏菌引起的严重危害人民健康和畜牧业发展的人畜共患传染病，是《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病。染疫的家畜是人间布病的主要传染源，人由于接触患病的牲畜及其产品或其污染物而感染布病。布病不仅危害人民身体健康，同时影响畜牧业、旅游业、国际贸易及经济发展。 我国布病疫情在80年代末至90年代初期曾得到较好控制，发病率一度低至0.02/10万左右，90年代中后期，布病疫情有所回升，2003年人间疫情发病率达0.48/10万，部分省区出现暴发和流行。为此，必须加强监测工作，以及时发现疫情，掌握疫情动态，预测疫情发生趋势，为制定全国布病防治策略和措施提供依据。根据《布鲁氏菌病监测标准》（GB16885-1997），和全国布病疫情态势，制定此方案。 二、监测目的 1.掌握我国布病疫情动态、流行规律，及时发现和处理疫情； 2.为预测布病流行趋势、制定防治对策、措施提供科学依据。 三、监测定义 （一）病例定义 1.诊断原则 根据流行病学接触史、临床症状和体征及实验室检查结果进行综合判断。 2.诊断标准 (1)流行病学：发病前病人与家畜或畜产品，布氏菌培养物有接触史，或生活在疫区内的居民或与菌苗生产、使用和研究有密切关系者。 (2)临床表现：出现持续数日乃至数周发热（包括低热），多汗，肌肉和关节酸痛，乏力，兼或肝、脾、淋巴结和睾丸肿大等可疑症状及体征。 (3)实验室初筛：布病玻片、虎红平板凝集反应阳性或可疑，或皮内变态反应阳
性。 (4)分离细菌：从病人血液、骨髓、其他体液及排泄物中分离到布氏菌。 (5)血清学检查：标准试管凝集试验（SA T）滴度为1：100(++)及以上；对半年内有布氏菌苗接种史者，SA T滴度虽达1：100(++)及以上，过2—4周后应再检查，滴度升高4倍及以上；或用补体结合试验检查，滴度1：10(++)及以上；抗人免疫球蛋白试验滴度1：400(++)及以上。 疑似病例：具备(1)、(2)和(3)者。 确诊病例：疑似病例加(4)或(5)中任何一种方法阳性者。 (二)暴发疫情定义 在一个潜伏期内，局部地区或一个集体单位内发生3例以上病人称为暴发。 四、监测内容和方法 （一）全国常规监测 1．人间疫情发现和报告 按照《中华人民共和国传染病防治法》和《传染病疫情报告管理规范》，各级各类医疗机构、疾病预防控制机构、卫生检疫机构执行职务的医务人员发现疑似、临床诊断或实验室确诊的布病病例应在诊断后12小时内填写报告卡进行网络直报。不具备网络直报条件的应在诊断后12小时内向相应单位送（寄）出传染病报告卡，县级疾病预防控制机构和具备条件的乡镇卫生院收到传染病报告卡后立即进行网络直报。 2.暴发疫情监测 （1）发现与报告 按照《中国人民共和国传染病防治法》和《传染病疫情报告管理规范》，各级各类医疗机构、疾病预防控制机构、卫生检验机构执行职务的医务人员发现暴发、流行疫情时，应当立即报告当地卫生行政部门和逐级上报疾病预防控制机构。当地卫生行政部门立即报告当地人民政府，同时逐级上报上级卫生行政部门。如果暴发疫情达到《全国突发公共卫生事件应急预案》规定的级别，则按相应要求同时报告。 在调查处理过程中，要对疫情发展和控制进程进行及时报告。 暴发疫情处理结束后，要及时收集、整理、统计、分析调查资料，写出详细的报告，逐级上报上级疾病预防控制机构，在疫情控制工作结束后7天内报至中国疾病预防控制中心，报告主要内容包括：疫情概况、流行基本特征、暴发原因、实验室检测结果和病原分型、控制措施和效果评估等。 暴发疫情发生时，要对所有病例进行个案调查，并将个案调查表录入数据库，在
病猪尸体解剖技术与常见疾病的病理学诊断 1外部检查 在进行尸体解剖之前,应先了解病死猪的流行病学情况、临床症状和治疗效果,观察其天然孔、皮肤、可视黏膜等变化，对病情有个初步诊断，以避免解剖不可解剖的尸体。猪体表病理变化和可能涉及的疾病见表1。 2.1皮下检查 皮下检查在剥皮过程中进行。从颈、胸及腹中线切开皮肤，在剥皮的同时检查皮下有无充血、炎症、出血、淤血、水肿以及体表淋巴结的大小、颜色和病理变化。 2.2固定、剖开腹腔将腹腔器官摘出
尸体取背卧位。一般先切断肩胛骨内侧和髋关节周围的肌肉（仅以部分皮肤与躯体相连），将四肢向外侧摊开以保持尸体仰卧位置。从剑状软骨后方沿腹壁正中线由前向后至耻骨联合切开腹壁，再从剑状软骨沿左右两侧肋骨后缘切开至腰椎横突。这样腹壁被切成大小相等的两楔形。将其向两侧分开，腹腔脏器即可全部露出。 剖开腹腔时应结合进行皮下检查。看皮下有无出血点、黄染等。在切开皮肤时需要检查腹股沟浅淋巴结，看有无肿大、出血等异常现象。腹腔切开后，须先检查腹腔脏器的位置和有无异物、腹腔器官浆膜是否光滑，肠壁有无粘连。 依次摘出肝、脾、胃网膜、胃、十二指肠、小肠、大肠、直肠和肾脏。分离肠系膜时，要注意观察肠系膜有无出血、水肿及淋巴结变化。 2.3剖开胸腔将胸腔器官摘出 先分离胸壁脂肪和肌肉，检查胸腔压力，切断肋骨与肋软骨结合部，切断肋间肌等软组织，暴露胸腔内器官，检查胸腔和心包有无积液及其性状，胸膜是否光滑，有无粘连。 2.4 口腔和颈部器官的采出 剥去颈部和下颌部皮肤后，用刀切断两下颌支内侧和舌连接的肌肉。左手指伸入下颌间隙，将舌牵出，剪断舌骨，将舌、咽喉、气管一并采出。看气管有无粘液、出血点等。扁桃体有无肿大、出血点等。 2.5 颅腔剖开（略） 清除头部皮肤和肌肉。先在两侧眶上突后缘作一横锯线，从此锯线两端经额骨、顶骨侧面至枕嵴外缘作二平行的锯线，再从枕骨大孔两侧作一“V”形锯线与二纵线相连。此时将头的鼻端向下立起，用槌敲击枕嵴，即可揭开颅顶，露出颅腔。看有无出血点、萎缩、坏死现象。 2.6器官检查 逐一对器官进行检查，应用解剖学和病理学知识，详细观察器官的病理变化，并认真做好记录。器官的病理变化及可能涉及的疾病见表2。
龙源期刊网 https://www.doczj.com/doc/a015757390.html, 猪链球菌2型感染的临床特征和治疗作用观察 作者：雷喜春 来源：《农民致富之友》2016年第16期 [摘要] 猪群体中，会产生一种细菌，这种细菌存在于猪的体内，即猪链球菌。猪链球菌 常见于猪的鼻腔和咽部，在猪免疫状态改变情况下，出现猪链球菌感染，不利于畜牧养殖发展。探究分析猪链球菌2型感染病株的临床特征和治疗效果，目的在于提出该类病症的防治建议，减少该类病菌对于猪群体的危害。针对猪链球菌2型感染的病猪进行观察，发现猪链球菌2型感染有不同的分型，其治疗效果也表现不一。笔者对此进行深入分析。 [关键词] 猪链球菌 2型感染临床特征治疗作用 [中图分类号] S828 [文献标识码] A [文章编号] 1003-1650 （2016）08-0271-01 猪链链菌感染，属于全身性感染性疾病，因猪链球菌导致。这类疾病对猪产生极大的影响，引起猪发病和死亡。其常见的感染类型有四种，分别是败血症休克、脑膜炎、心内膜炎、骨关节炎及支气管肺炎。猪链球菌一般情况下发生在夏季高温季节，也常见于猪的免疫状态发生改变时。猪链链菌存在2、3、4、5、8和1/2型这几种主要分型，但是，其中猪链球菌2型比较常见，原因在于该类型菌株侵袭能力较强。较强的侵袭能力促使感染者发生严重的后果，轻则引起不可逆的休克，重则引发脏器功能衰竭，致使感染者死亡。基于此，观察猪链球菌2型感染的临床特征和治疗作用极为必要。 1 猪链球菌流行表现 关于猪链球菌 2型感染的流行，可追溯到上个世纪70 年代。当时，该病的病例还未形成规模，以分散病例为主。在发展一段时间后，猪链球菌 2型感染发生率较之前有了些许提升[1]。直到此时，关于猪链球菌 2型感染的研究报道才渐渐增多。猪链球菌 2型感染的主要传播途径有三种，一是接触传播；二是消化道传播；三是呼吸道传播。通常，猪链球菌 2型感染流行的时间并无明确的界限，但是，经研究调查统计，5至11 月期间较为常见，且北方区域猪 链球菌 2型感染病毒分布范围较小。猪链球菌一旦发生在猪群中，不仅会侵害猪群的健康，还会对人类生命健康造成侵害。因此，如若不深入研究猪链球菌 2型感染的临床特征和治疗作用，将难以有效控制此病发生与传播，更不利于提升畜牧养殖者的亲身利益。 2 猪链球菌2型感染的临床特征 感染猪链球菌 2型的病猪，其感染程度上有深有浅，一般的临床表现为体温异常，精神萎靡，贪睡，食欲不振等。更有甚者还表现出呕吐、腹泻、关节疼痛等症状[2]。由于感染猪链
布鲁氏菌病突发疫情应急处理预案(试行) 布鲁氏菌病（以下简称布病）是由布鲁氏菌引起的人畜共患的传染变态反应性疾病。我省从1981年起全面开展了人间布病防治工作，1995年全省达到布病控制区标准。由于近年来北方布病疫情大幅回升，我省引进牧区牛羊等动物，使人畜间布病疫情有所抬头，有逐年增高趋势，并出现人间局部爆发疫情。为有效控制布病流行，加强对布病突发疫情的快速反应和应急处理能力，特制定本预案。 1、总则 1.1目的 确保一旦发生布病突发疫情，及时采取有效措施，迅速控制和扑灭疫情。 1.2工作原则 统一领导，分级管理，条块结合，以块为主，职责明确，规范有序。 1.3编制依据 依据《中华人民共和国职业病防治法》、《中华人民共和国传染病防治法》、《布鲁氏菌病诊断标准处理原则（GB15988-1995）》编制。 1.4适用范围 适用于浙江省布病突发疫情的应急处理工作。 2 布病突发疫情的判定标准与分级 2.1 人间布病突发疫情判定标准 2.1.1近3年有人间布病病例发生的县、区，1个月内同一牲畜饲养场、牧场或交易场、屠宰场等发现10例及以上布病病例，或发现1例及以上布病死亡病例。 2.1.2近3年无人间布病病例发生的县、区，1个月内同一牲畜饲养场、牧场或交易场、屠宰场等发现5例及以上布病病例。 2.2.疫情分级 根据人间布病疫情流行范围、趋势和和病例人数，分级实施紧急控制措施。 2.2.1 Ⅳ级疫情 在一个县(市、区)范围内出现人间布病突发疫情。 2.2.2. Ⅲ级疫情 本省范围内在2个及以上毗邻的县(市、区)出现人间布病突发疫情，且有蔓延趋势。
2.2. 3.Ⅱ级疫情 本省范围内2个及以上毗邻市出现3起人间布病突发疫情，疫情波及2个以上县（市、区），且有扩大蔓延趋势。 2.2.4.Ⅰ级疫情 在2个及以上相邻省份的毗邻地区出现5起人间布病突发疫情，疫情波及本省2个及以上的市(地)，且有大范围蔓延趋势。 3．疫情的应急响应 3.1突发疫情报告 各级各类医疗机构和疾病预防控制机构发现布病突发疫情时，应当在２小时内向所在地县级人民政府卫生行政部门报告，接到报告的卫生行政部门应当在２小时内向本级人民政府及市卫生行政部门报告，市卫生行政部门接报告后，在2小时内向省卫生行政部门报告。县疾病预防控制机构在2小时内通报市疾病预防控制机构及省布病防治中心，并通过突发公共卫生事件报告管理信息系统向卫生部报告。任何单位和个人不得瞒报、漏报、缓报。 3.2突发疫情分级响应程序 Ⅰ级：由卫生部组织有关专家进行分析论证，提出启动布病应急处理预案的建议，报国务院批准后实施。 Ⅱ级：省人民政府卫生行政部门组织有关专家进行分析论证，提出启动应急处理预案的建议，报省人民政府批准后实施，并向国务院卫生行政部门报告。 Ⅲ级：市级人民政府卫生行政部门组织有关专家进行分析论证，提出启动应急处理预案的建议，并报市级人民政府批准后实施，并向省人民政府卫生行政部门报告。 Ⅳ级：县级人民政府卫生行政部门组织有关专家进行分析论证，提出启动应急处理预案的建议，并报县级人民政府批准后实施，并向市级和省人民政府卫生行政部门报告。 3.3应急组织 布病突发疫情发生后，根据分级响应程序，在当地人民政府的统一领导下，成立由各相关部门组成的布病突发疫情应急处理工作领导小组，负责本行政区域内布病突发疫情应急处理工作的组织管理、指挥和协调；卫生行政部门成立突发疫情应急处理技术指导小组，负责制定本行政区域内医疗救治、疫情控制和调查评估等相关工作。 4、疫情现场控制
猪链球菌 形态染色 球形或卵圆形，直径0.6～1.0um，呈链状排列，短者4～8个细菌组成，长者有20～30个细菌组成。幼龄培养物大多可见到透明质酸形成的荚膜。无芽胞，无鞭毛，革兰氏染色阳性。(但在陈旧培养基或脓液标本中常呈阴性) 流行病 链球菌种类多，属条件性致病菌，在自然界和猪群中广泛分布，常存在于健康的哺乳动物和人体内。猪、野猪、马属动物、牛、羊、狗、猫、鸟类、兔、水貂和鱼等对猪链球菌均有易感性。对猪则不分年龄，品种和性别均易感，但大多数在3周龄～12周龄的仔猪暴发流行，尤其在断奶及混群时易出现发病高峰。其传播方式主要通过口或呼吸道传播，也可垂直传播(有些新生仔猪可在分娩时感染)。猪链球菌定植在猪的上呼吸道(尤其是鼻腔和扁桃体)、生殖道和消化道，4周龄～6月龄的猪扁桃体带菌率为32%～50%。病猪和病死猪是主要的传染源，亚临床健康的带菌猪可排出病菌成为传染源，对青年猪的感染起重要的作用。猪群携带该病原的比率在0%～100%之间，然而，病原的携带率和疾病的发病没有明显的相关性。 猪链球菌病的流行无明显的季节性，一年四季均可发生，但7月～10月份易出现大面积流行。猪链球菌感染人没有明显的季节性，同时该病的暴发具有地域性。从外地引入带菌猪，混群、免疫接种、高温高湿、气候变化、圈舍卫生条件差等应激因子使动物的抵抗力降低时，均可诱发猪链球菌病。昆虫媒介在疾病的传播中起重要作用，通过在猪场间的飞行传播病原菌。在猪链球菌众多血清型中，2型是猪的最主要病原，致病性最强。从表征健康的猪体扁桃体内分离的所有猪链球菌中，2型多达50.6%，同时其对人的致病性也最强。 病原体 猪链球菌呈圆形或椭圆形，常呈链状排列，长短不一，革兰氏染色阳性。猪链球菌的细胞壁内含有多种氨基酸糖，由于氨基酸糖的种类不同，可将链球菌分成A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U和V 20个血清群。猪链球菌属于兰氏血清学分类的D群，可引起2～6周龄仔猪发生脑膜炎、关节炎及败血症。E群链球菌引起猪颈淋巴结脓肿，C、L、M、P、R、S与T群链球菌对猪有不同程度的致病作用，引起猪只发生败血症、脑膜炎、心内膜炎与肺炎等。 兰氏R、S、R/S群链球菌1型、2型及1/2型，1983年Perch已鉴定了另外6个血清型，至1990年总共鉴定了猪链球菌30个血清型，其中2型猪链球菌是各国最常见的菌型，是致病力最强的血清型。通常认为其致病因子主要有荚膜多糖、溶菌酶释放蛋白（MRP）、细胞外因子、猪溶素（Suilysin）和粘附素等。 致病性链球菌生长条件要求较高，在普通培养基上生长不良，在加有血液或血清的培养基中生长良好。在血液琼脂平板上培养24小时，可见微小圆形，透明而带灰白色小水滴状菌落。有荚膜的链球菌形成黏液型菌落，无光泽或光滑型菌落。多数致病性链球菌具有溶血能力。在血清肉汤中生长成长链时而形成沉淀，上清透明。有的血清型在培养中产生橙色或黄色色素。 链球菌的抵抗力不强。对热敏感，60℃30分钟可杀死，煮沸立即死亡。一般消毒药杀灭有效，但近年出现链球菌耐药性问题严重，应引起注意。 所致疾病
ＩＩ型猪链球菌检测方法介绍 自1968年国际上首次报道猪2型链球菌引起人类严重感染病例后，至1989年，国外共报告了108例猪2型链球菌所致人类感染的病例，1994年、1997年及1999年国外又相继有该菌引致人类严重感染及死亡病例的报道。 我国1990年在广东省首次发现猪群中有类似II型链球菌病，但未见人间感染发病。1998年~1999年，在江苏省和浙江省部分县(市)，先后两次爆发了猪急性败血症。共有上万头猪发病，同时还传染给从业人员几十人，发生脑膜炎、关节炎及中毒性出血性休克征病例，病人出现多脏器功能损害，并先后从病人和病猪中分离出猪链球菌菌株，经鉴定为猪II型链球菌，人源株与猪源株为同源性。2005年6月下旬，四川省资阳、内江等地区有近80例患者急性发病，出现中毒性休克、DIC、脑膜炎，有12例重症患者死亡，经鉴定为猪II型链球菌感染。目前，该菌已成为我国当前引起人兽共患病的一种重要的新病原菌。 猪链球菌归类于链球菌属，菌体呈卵圆形，短链状排列，革兰染色阳性，兼性厌氧，在羊血平板上呈α溶血，部分在马血平板上呈β溶血，菌落细小。引起人和猪发病的猪链球菌以Lancefield血清群R群血清型2型为主，溶菌酶释放蛋白（MRP）和细胞外蛋白因子（EF）是两种重要的毒力因子。 猪链球菌病是一种人畜共患的急性、热性传染病。人与病猪密切接触或食用未煮熟的病猪肉制品时猪链球菌可通过人体伤口、消化道等途径传染给人，出现脑膜炎、关节炎、持久性听力缺失，严重者可导致中毒休克综合征并引起死亡。早期临床诊断疑为：炭疽病、流行性出血热、钩体病、链球菌引起的猪肺疫及O157:H7出血性大肠杆菌等细菌性病原体引起的疾病。因此病原体的分离和鉴定对疾病的确诊、预防和控制十分重要，本文简单介绍猪链球菌II型的检验程序。 一、病原分离 1、可采集病人的血，腹水，脑脊液或者是尸检标本；病、死猪的肝脏、脾脏、腹水、心血，4℃保存。 2、制作肝脏、脾脏的触片，或用腹水、血液、脑脊液涂片，火焰固定后进行革兰染色，油镜下观察是否有成对或短链状革兰阳性球菌。 3、将标本接种于选择增菌培养液（含15 μg /ml多粘菌素B，30 μg /ml萘啶酮酸的脑心培养基），或直接划线接种于含两种抗生素的羊血琼脂平板，置于5％CO2培养箱或蜡烛缸中37℃培养。 二、生化反应 1、普通实验室可以重点做V-P试验,七叶苷水解试验，6.5%的氯化钠生长试验，45℃﹑10℃生长试验，胆汁耐受试验（麦康凯培养基）。如结果依次为阴性、阳性、阴性、阴性、阴性、阴性，可初步判定为猪链球菌。同时送相关实验室做进一步鉴定。 具有参考价值的鉴定项目有： 1）生长特性 10℃45℃ 6.5%NaCl PH9.6 麦康凯培养基 不生长不生长不生长不生长不生长
猪解剖流程及诊断图 猪的解剖操作方法 病名主要病变 仔猪红痢空肠、回肠有节段状出血性坏死 仔猪黄痢主要在十二指肠有卡他性炎症 轮状病毒性胃内有乳凝块，大、小肠粘膜呈弥漫性出血，肠管菲薄肠炎 传染性胃肠主要病变在胃和小肠，呈现充血、出血并含有未消化的小凝乳块，炎肠壁变薄 流行性腹泻病变在小肠，肠壁变薄，肠腔内充满黄色液体，肠系膜淋巴结水肿，胃内空虚 仔猪白痢胃肠粘膜充血，含有稀薄的食糜和气体，肠系膜淋巴结水肿沙门氏菌病盲肠、结肠粘膜呈弥漫性坏死，肝、脾郁血并有坏死点，淋巴结肿胀、出血 猪痢疾盲肠、结肠粘膜发生卡他性、出血性炎症，肠系膜充血、出血猪瘟皮肤、浆膜、粘膜及肾、喉、膀胱等器官表面有出血点，淋巴结 充血、出血、水肿，回盲瓣口呈扣状溃疡 猪丹毒体表有充血疹块，肾充血，有出血点，脾充血，心内膜有菜花状 增生物，关节炎 猪肺疫全身皮下、粘膜、浆膜有明显出血，咽喉部水肿，出血性淋巴结 炎，胸膜与心包粘连，肺肉变 猪水肿病胃壁、结肠系膜和下颌淋巴结水肿，下眼睑、颜面及头颈皮下有水肿 气喘病肺的心叶、尖叶、中间叶及部分隔叶的下端出现肉变，肺门及纵
隔淋巴结肿大 首先是外表的观察:耳部是否有红点或红斑，皮肤是否有红点红斑，关节是否肿大，蹄部是否有病变，肛门处粪便情况，是否喘气，是否消瘦等猪的大致情况。 后半区严重败血
尾部坏死、股部皮肤和脚部皮肤有红斑 耳尖坏死解剖大致分三刀: 一、第一刀从腋下开始上至下颌中至中线下至股部髋臼窝，剥开皮肤暴露下颌淋巴结，唾液腺，腹股沟淋巴结 1、下颌淋巴结:一般猪有炎症该淋巴结都会有病变。
下颌淋巴结严重出血 2、腹股沟淋巴结:生殖系统、腹腔各器官病变，也包括全身性疾病。 腹股沟淋巴结出血 3、唾液腺:颜色。 二、第二刀从最后肋骨剪开，暴露腹腔观察腹水(颜色，量的多少)
海南省布鲁氏菌病应急处置技术方案 布鲁氏菌病（以下简称布病）是由布鲁氏菌属引起的人兽共患的传染-变态反应性疾病，是《中华人民共和国传染病防治法》规定报告的乙类传染病。布病包括畜间布病和人间布病，布病往往先在家畜或野生动物中传播，随后波及人类，人间布病在我国绝大多数省（市、区）都有不同程度的发生和流行，2009、2010年我省先后出现2例布病病例。为提高我省布病突发疫情的应急处理能力，及时控制疫情蔓延，特制定本技术方案。 一、目的 确保出现布病病例或发生布病暴发流行时，能及时有效地采取措施，迅速控制和扑灭疫情。 二、疫情调查 （一）疫情报告 医疗卫生机构发现布病疑似病例时，于24小时内向当地疾病预防控制机构报告；疾病预防控制机构接到疫情报告后，经初步核实诊断后，向省级疾病预防控制中心和同级卫生行政部门报告，卫生行政部门及时向当地政府报告。 （二）现场调查 当地市县级疾病预防控制机构立即派员赶赴现场，对病例开展流行病学调查，确定是否是布病，查明发病原因，提出治疗方案和预防方法，防止疫情扩大。
（三）调查方法 1、个案病例的流行病学调查 （1）询问患者病史，除了询问患者现病史和既往史之外，要特别注意与家畜、野生动物及其产品接触史，饮食生奶、生肉史、接触和操作布氏菌史。 （2）填写《布病流行病学个案调查表》。 （3）检查体征。 （4）采血作布病特异性血清学试验。必要时作血液、关节液、滑囊液的布氏菌分离培养；还可作皮内变态反应等试验，以明确诊断。 （5）除了对患者本人作调查外，也应了解当地有无类似病人。 （6）确实是布病，核实发病日期，确定临床类型，作疫情报告。 （7）追查传染源 （8）判断传播因子和传播途径。 （9）分析传染可能发生的范围和蔓延条件 （10）找出发病原因，提出切实可行的防治方法。 2、暴发点调查 布病的暴发疫情一般是指在一个潜伏期内，局部地区或一个单位内发生了3例以上病人，称为暴发。 （1）首先向当地卫生和兽医部门了解暴发开始时间和经过。 （2）访问、检查最先发生的病例，查明发病时间、地点、性别、年龄、职业、临床表现、发病原因、与牲畜及其产品接触关系。 （3）填写《布病流行病学个案调查表》（附表1）。
疑似预防接种异常反应个案调查表 一、基本情况 1 县国标码□□□□□□ 2 发生年份□□□□ 3 编号□□□□ 4 姓名 5 性别1男 2女□ 6 出生日期年月日□□/□□/□□ 7 年龄周岁月龄□□/□□ 8 职业□□ 9 现住址 10 联系电话 11 监护人姓名 二、就诊与报告情况 1 发生时间年月日时分□□/□□/□□□□/□□ 2 就诊时间年月日时分□□/□□/□□□□/□□ 3 就诊单位 4 报告时间年月日时分□□/□□/□□□□/□□ 5 报告单位 6 报告人 三、临床资料 1 临床经过(包括症状、体征、实验室检查、辅助检查和治疗等) 2 初步临床诊断 3 是否住院1是 2否□ 如果是，医院名称 病历号 住院日期年月日□□/□□/□□ 出院日期年月日□□/□□/□□
4 病人转归1治愈 2好转 3后遗 4死亡 5 不详□如死亡，死亡时间年月日时分□□/□□/□□□□/□□病理解剖1是 2否□ 解剖结论 四、既往病史和家族病史 1 接种前患病史1有 2无 3不详□ 如有，疾病名称 2 接种前精神状况1活泼 2萎靡 3忧郁 4紧张 □ 5恐惧 6其它 3 接种前过敏史1有 2无□ 如有，过敏物名称 4 家庭成员中有无遗传病/传染病/精神病/癫痫/过敏/惊厥等 1有 2无 3不详□如有，疾病名称 五、既往接种史和异常反应史 1 既往接种疫苗名称 2 既往发生异常反应1有 2无□ 3 如有异常反应， 反应发生日期年月日□□/□□/□□接种疫苗名称 临床诊断 诊断单位 六、可疑疫苗接种情况（按最可疑的疫苗顺序填写） (一) 可疑疫苗疫苗1 疫苗2 疫苗3 疫苗4
病猪尸体解剖技术与常见疾病的病理学诊断 徐海军 （六安市畜牧兽医技术服务中心实验室） 1外部检查 在进行尸体解剖之前,应先了解病死猪的流行病学情况、临床症状和治疗效果,观察其天然孔、皮肤、可视黏膜等变化，对病情有个初步诊断，以避免解剖不可解剖的尸体。猪体表病理变化和可能涉及的疾病见表1。 表1 体表器官病变及可能涉及的疾病 器官病变可能涉及的疾病 眼眼角有泪痕或眼屎流感、猪瘟 眼结膜充血、苍白、黄染慢性传染病、贫血、黄疸（附红 细胞体） 眼睑水肿、眼结膜炎猪蓝耳病、猪水肿病 口鼻鼻孔有液性渗出物流出流感、气喘病、萎缩性鼻炎鼻歪斜、颜面部变形萎缩性鼻炎 上唇吻突及鼻孔有水泡、糜烂口蹄疫、水泡病 齿龈、口角有点状出血猪瘟 唇、齿龈、颊部粘膜溃疡猪瘟 齿龈水肿猪水肿病 皮肤胸腹、四肢内侧有大小不一的出 血斑点 猪瘟、湿疹 方形、菱形或圆形红色疹块亚急性猪丹毒 耳尖、鼻端、四蹄呈紫色副伤寒（沙门氏菌病） 下腹、四肢内侧有痘疹猪痘 后肢、背部、腹部皮肤有圆形或 不规则形红斑，中央黑色 圆环病毒引起的皮炎肾病 蹄部皮肤出现水泡、糜烂、溃疡口蹄疫、水泡病 皮肤粗糙、有皮屑、背毛脱落、 皮肤潮红、甚至出血有痂皮 猪疥螨病 咽喉明显肿大咽型炭疽、链球菌病、猪肺疫 肛门肛门及尾部有粪污染腹泻等消化系统疾病 2内部检查 2.1 皮下检查 皮下检查在剥皮过程中进行。从颈、胸及腹中线切开皮肤，在剥皮的同时检查皮下有无充血、炎症、出血、淤血、水肿以及体表淋巴结的大小、颜色和病理变化。 2.2 固定、剖开腹腔将腹腔器官摘出 尸体取背卧位。一般先切断肩胛骨内侧和髋关节周围的肌肉（仅以部分皮肤与躯体相连），将四肢向外侧摊开以保持尸体仰卧位置。从剑状软骨后方沿腹壁正中线由前向后至耻骨联合切开腹壁，再从剑状软骨沿左右两侧肋骨后缘切开至腰椎横突。这样腹壁被切成大小相等的两楔形。将其向两侧分开，腹腔脏器即可全部露出。 剖开腹腔时应结合进行皮下检查。看皮下有无出血点、黄染等。在切开皮肤时需要检查腹股沟浅淋巴结，看有无肿大、出血等异常现象。腹腔切开后，须先检查腹腔脏器的位置和有无异物、腹腔器官浆膜是否光滑，肠壁有无粘连。 依次摘出肝、脾、胃网膜、胃、十二指肠、小肠、大肠、直肠和肾脏。分离肠系膜时，要注意观察