普通固体制剂2015版微生物限度方法适用性试验报告
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微生物限度方法适用性试验报告
文件编号：XXX
XXXX制药有限公司
微生物限度方法适用性试验报告
起草人_____________ 部门____________ 日期___________ 审核人_____________ 部门____________ 日期___________ 批准人_____________ 日期__________ _
1、概述
本公司主要产品之一，本产品已进行批量生产并已进行工艺验证,微生物检验相对稳定，由于《中华人民共和国药典》2015年版对微生物限度检查方法改变，其产品的微生物检验方法和培养基发生改变，可能影响检验结果的准确性。为确保检测方法的准确性及适应性，测定方法的可靠性进行验证，根据样品特性制定检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。
2、验证依据：《中华人民共和国药典》2015版四部通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法、1106非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法、1107非无菌药品微生物限度标准。
3、验证目的
建立该产品的微生物限度检查方法，并对其有效性进行评价，确保试验方法的完整性，保证检验结果的可靠性。
4 、验证小组成员及职责
5、主要验证用仪器仪表的校验
结果：
确认人：日期：
6、验证用菌种及培养基
微生物限度检测方法验证操作规程 1 目的 确认所采用的方法适合于该产品的微生物限度检测。 2 依据 《中国药典》2015版。 3 范围 所有需进行微生物限度检测的产品。 4 责任 4.1验证小组负责检验方法验证/确认方案的起草、验证/确认方案的实施。 4.2验证委员会负责验证/确认方案的审批，验证/确认结论的审核。 5 程序 5.1 由验证小组提出验证申请，验证方案编制完成后，填写《确认和验证方案审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证方案编制人对验证小组其余人员进行培训后，方可按验证方案试验。 5.2 试验完成后及时编制验证报告，并填写《验证报告审批表》，经验证小组会签，报验证委员会审核，由生产负责人和质量负责人批准后，验证报告结论才可实施。 6 内容 6.1 概述 通过验证以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定及控制菌的检查。根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方案进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行产品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。 6.2 需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数方法的验证 6.2.1 验证用菌株
铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104] 金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003] 枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501] 黑曲霉[CMCC（F）98 003] 白色念珠菌[CMCC（F）98 001] 6.2.2 验证用菌液制备 6.2.2.1接种铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌至胰酪大豆胨液体培养基中，于30～35℃培养18～24小时。取上述培养物各1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。 6.2.2.2 接种白色念珠菌至沙氏葡萄糖液体培养基中，于20～25℃培养2～3天。取上述培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液，备用。 6.2.2.3接种黑曲霉至沙氏葡萄糖琼脂培养基上，于20～25℃培养5～7天，加入含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH 7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨脂80的0.9%无菌氯化钠溶液或pH7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的孢子悬液，备用。 6.2.3 供试液的制备 6.2.3.1 水溶性供试试品 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 6.2.3.2 水不溶性非油脂类供试品 取供试品，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1：10供试液。分散力较差的供试品，可在稀释液中加入表面活性剂如0.1﹪的聚山梨酯80，使供试品分散均匀。若需要，调节供试液pH值至6～8。必要时，用一稀释液将
精心整理 微生物限度检查方法验证方案 1.目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 2.3. 4.0.22um 121营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL ）、改良马丁琼脂培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG ）等脱水培养基，按照相应的配制说明，用纯化水配制、分装后，在2小时内，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌15 min ，在3周内使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期内的试剂，按照相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、0.05%（ml/ml ）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等，用纯化水配制，加热使溶，过滤，分装，在121℃，灭菌15 min ，在3周内使用。
4.4.2 试验菌的制备和稀释： 4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液： 4.4 4.4 4.4 4.4.2.2控制菌检查方法验证用菌液： 1ml 含菌10 3g单 45℃pH7.0 液。 3 4.4.4.2试验组： 4.4.4.2.1 平皿法：分1：20的供试液1ml和试验菌液（含菌50～100CFU）1ml，注入同一直径90mm的灭菌平皿中，每株试验菌平行制备2个平皿。 4.4 4.4
4.4.4.4.1 平皿法：取1：20供试液1ml，注入直径90mm的灭菌平皿中，每种培养基平行制备2个平皿。 4.4 4.4.4.5稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心等特殊处理时，需增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。 4.4 养48 培养72 稀释剂对照组回收率＝ 结果判定：在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的回收率应均不低于％。试 菌回收率低于70％，则应采用薄膜过滤法、培养基稀释法、离心沉淀集菌法、中和法等方法或联合使用上述方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法学验证。 4.4.4.11细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果：
微生物限度检查方法验证方案 1.目的： 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查，包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查，特制定本验证方案，通过比较试验菌的恢复生长结果，来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性，以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计，所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的容进行，若因特殊原因确需变更时，应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2.围： 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3.规性引用文件： 根据《中国药典》2010年版二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求，由于某些供试品具有抗菌活性，在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时，可能影响检验结果的准确性，必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4.验证实施： 4.4.1 试验前的准备: 4.4.1.1 试验用具的准备：将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、 滤膜（孔径0.22um、直径50mm）、平皿、空三角瓶、称量纸等，用牛皮纸包扎 好后，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭菌30 min，在3天使用。 4.4.1.2试验用培养基的制备：取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫 瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基（BL）、改良马丁琼脂 培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基（MUG）等脱水培养基，按照相应的配制 说明，用纯化水配制、分装后，在2小时，放于湿热灭菌器中，在121℃，灭 菌15 min，在3周使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备：取在有效期的试剂，按照 相应的配制方法，配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、0.9%无菌氯化钠溶液、
制药GMP管理文件 一、引用标准：中华人民共和国S药典（2005年版）一部。 二、目的：本标准规定了微生物限度检查法标准操作规程。 三、适用范围：适用于微生物限度的检查。 四、责任者：质检人员。 正文： 1、简述微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。 微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。 供试品检查时，如果使用了表面活性、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物的生长和存活无影响。 除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃；霉菌、酵
母菌培养温度为23～28℃；控制菌培养温度为35～37℃。 检验结果以1g、1ml、10g、10ml或10㎝2为单位报告。 检验量：检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml、㎝2）。除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门氏菌的供试品，其检验量应增加10g或10ml。 检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品。一般应随机抽取不少于检验用量（两个以上最小包装单位）的3倍量供试品。2、供试液的制备 根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需用水浴加温时，温度不应超过45℃供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。 除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。 （1），液体供试品取供试品10ml，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1：10的供试液了。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 （2）固体、半固体或黏稠性供试品取供试品10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液对至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1：10的供试液，必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。 （3）用特殊供试液制备方法的供试品
微生物检验规程 1.实验注意事项 1.1无菌操作要求 1.1.1 接种细菌时必须穿工作服、戴工作帽。 1.1.2专用的工作服、帽及拖鞋，应放在无菌室缓冲间，工作前经紫外线消毒后使用。 1.1.3 接种样品时，应在进无菌室前用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净。 1.1.4 进行接种所用的吸管，平皿及培养基等必须经消毒灭菌，打开包装未使用完的器皿，不能放置后再使用，金属用具应高压灭菌或用95%酒精点燃烧灼三次后使用。 1.1.5 从包装中取出吸管时，吸管尖部不能触及外露部位，使用吸管接种于试管或平皿时，吸管尖不得触及试管或平皿边。 1.1.6 接种样品、转种细菌必须在酒精灯旁操作，接种细菌或样品时，吸管从包装中取出后及打开试管塞（即硅氟胶塞）都要通过火焰消毒。 1.1.7 接种环和针在接种细菌前应经火焰烧灼全部金属丝，必要时还要烧到环和针与杆的连接处。 1.1.8 吸管吸取菌液或样品时，应用相应的橡皮头吸取，不得直接用口吸。1.2无菌间使用要求 1.2.1 无菌间内应保持清洁，工作后用消毒溶液消毒，擦拭工作台面，不得存放与实验无关的物品。 1.2.2无菌间使用前后应将门关紧，打开紫外灯，照射时间不少于30min，使用紫外灯，应注意不得直接在紫外线下操作，以免引起损伤，灯管每隔两周需用酒精棉球轻轻擦拭，除去上面灰尘和油垢，以减少紫外线穿透的影响。 1.2.3处理和接种样品时，进入无菌间操作，不得随意出入，如需要传递物品，可通过小窗传递。 1.3消毒灭菌要求 1.3.1灭菌前准备 （1）所有需要灭菌的物品首先应清洗晾干，玻璃器皿用纸包装严密，如用金属筒应将上面通气孔打开。 （2）装培养基的三角瓶，内容物不应超过总体积的2/3（例如500mL的三角瓶最好装300～350mL培养基，以防再次加热融化时爆沸）。 （3）无菌室内使用的毛巾、脱脂棉球用纸包裹，进行湿热灭菌。
微生物限度检查 方法学验证 一、检验方法 依据微生物计数法（中国药典2015年版四部1105）；控制菌检查法（中国药典2015年版四部1106）；非无菌药品微生物限度标准（中国药典2015年版四部1107）；抑菌效力检查法（中国药典2015年版四部1121）检查。 二、菌种、培养基及稀释液 表1菌种
表2培养基
表3对照用培养基
表4试剂
稀释液： （1）pH6.8缓冲液 取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml,加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml,用水稀释至1000ml，摇匀，既得。 （2）0.9%无菌氯化钠溶液 取氯化钠9.0g，加水溶解使成1000ml，过滤，分装、灭菌。 （3）0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液 取聚山梨酯80 0.5ml，用0.9％无菌氯化钠溶液溶解并稀释至1000ml，滤过，分装，灭菌，备用。 （4）靛基质试液
取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入95%乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。 三、菌液的制备 1细菌、霉菌、酵母菌 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基上，培养48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，培养7天，加入5ml含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,将孢子洗脱，然后吸出孢子悬液（用带有无菌棉花的能过滤菌丝的无菌毛细吸管）用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。 2控制菌 接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，培养24小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为10～ 100cfu的菌悬液。菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。 四、验证内容 1、计数方法验证
附录Ⅺ J 微生物限度检查法 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。 微生物限度检查应在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。 供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性。 除另有规定外，本检查法中细菌及控制菌培养温度为30℃～35℃；霉菌、酵母菌培养温度为23℃～28℃。 检验结果以1g、1ml、10g、10ml、10cm2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。 检验量 检验量即一次试验所用的供试品量(g、ml或cm2)。 除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。要求检查沙门菌的供试品，其检验量应增加20g或20ml(其中10g用于阳性对照试验)。 检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，膜剂还不得少于4片。 一般应随机抽取不少于检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量供试品。 供试液的制备 根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。 除另有规定外，常用的供试液制备方法如下。 1.液体供试品 取供试品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，作为1∶10的供试液。油剂可加入适量的无菌聚山梨酯80使供试品分散均匀。水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。 2.固体、半固体或黏稠性供试品 取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1∶10的供试液。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。 3.需用特殊供试液制备方法的供试品 (1)非水溶性供试品 方法1取供试品5g(或5ml)，加至含溶化的(温度不超过45℃)5g司盘80、3g单硬脂酸甘油酯、10g聚山梨酯80无菌混合物的烧杯中，用无菌玻棒搅拌成团后，慢慢加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，边加边搅拌，使供试品充分乳化，作为1∶20的供试液。 方法2取供试品10g，加至含20ml无菌十四烷酸异丙酯(制法见附录ⅩⅢB 无菌检查法中供试品的无菌检查项下)和无菌玻璃珠的适宜容器中，必要时可增加十四烷酸异丙酯的用量，充分振摇，使供试品溶解。然后加入45℃的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml，振摇5～10分钟，萃取，静置使油水明显分层，取其水层作为1∶10的供试液。 (2)膜剂供试品 取供试品100cm2，剪碎，加100ml的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(必要时可增加稀释液)，浸泡，振摇，作为1∶10的供试液。 (3)肠溶及结肠溶制剂供试品 取供试品10g，加pH6.8无菌磷酸盐缓冲液(用于肠溶制剂)或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液(用于结肠溶制剂)至100ml，置
微生物限度检查法应用指导原则 为更好应用微生物限度检查法（附录ⅪJ），特制定本指导原则。 微生物限度检查法可用于判断非规定灭菌制剂及原料、辅料是否符合药典的规定，也可用于指导制剂、原料、辅料的微生物质量标准的制定，及指导生产过程中间产品微生物质量的监控。本指导原则将对标准和方法中的特定内容及标准的应用做进一步的说明。 1.微生物限度检查过程中，如需要使用表面活性剂、灭活剂及中和剂，在确定其能否适用于所检样品及其用量时，除应证明该试剂对所检样品的处理有效外，还须确认该试剂不影响样品中可能污染的微生物的检出（即无毒性），因此无毒性确认试验的菌株不能仅局限于验证试验菌株，而应当包括产品中可能污染的微生物。 2.供试液制备方法、抑菌成分的消除方法及细菌、霉菌及酵母菌计数方法应尽量选择微生物限度检查法中操作简便、快速的方法，且应避免损伤供试品中污染的微生物。对于抑菌作用较强的供试品，在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法进行试验。 3. 微生物限度检查法（附录ⅪJ）收载的离心沉淀法仅适用于制备细菌计数或控制菌（细菌）检查用的供试液，规定的500转/分钟、不超过3分钟只用于去除供试液中的沉淀物。采用该方法时，供试液中的样品颗粒大小、粘稠度及污染的微生物大小，转速等直接影响着样品中微生物的回收，易造成检验结果不能真实反映供试品的污染情况。因此，供试液制备时尽量避免使用该方法，更不宜采用高速离心沉降集菌。 4.对照培养基系指按培养基处方特别制备、质量优良的培养基，用于培养基适应性检查。由中国药品生物制品检定所研制及分发。 5. 进行验证试验时，若因没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用而导致微生物回收的失败，应采用能使微生物生长的更高稀释级供试液进行方法验证试验。此时更高稀释级供试液的确认要从低往高的稀释级进行，但最高稀释级供试液选择应根据供试品应符合的微生物限度标准和菌数报告规则，如供试品应符合的微生物限度标准是1克细菌数不得过1000cfu，那么最高稀释级是1：10-3。
微生物限度检查方法（平皿法） 验证方案 目录 一、验证方案的制定 二、验证方案的起草与审批 三、微生物限度检查方法（平皿法）验证方案 1．验证目的和原理 2．验证方法步骤 3．试验实施 3.1试验前的准备 3.2验证试验操作 3.3试验结果 4．验证结果评价分析
5．附件 微生物限度检查方法（平皿法）验证文件一、验证方案的制定 二、验证方案的起草与审批 1验证方案的起草
2．验证方案的审核与批准 验证方案审核人：审核日期：年月日验证方案批准人：批准日期：年月日三、微生物限度检查方法（平皿法）验证方案 1．验证目的和原理 1.1 验证目的 为确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌、酵母菌数的测定，特制定本方案。验证过程应严格按照本方案规定的内容进行，若因特殊原因确需要变更时，应报验证委员会批准。 1.2 原理 通过比较试验4组中试验菌的恢复生长结果来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性。 2．验证方法步骤 2.1验证前的准备进行微生物限度检查方法（平皿法）验证前，所有的平皿和稀释剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。试验菌应包括G-、G+、酵母菌和霉菌类微生物以基本覆盖样品中可能存在的微生物。 2.2验证试验的操作计划用3个不同批号产品按照微生物限度检测方法进行平行试验，通过计算回收率来判断微生物限度检查方法是否对产品有影响。 2.3试验结果可接受标准用标准菌株评价方法“尿素维生素E乳膏的微生物限度检查”对检品中微生物的抑制性，试验结果应显示3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应不小于70%，试验组的回收率也不低于70%。 3．试验实施 3.1试验前的准备 3.1.1主要仪器设备：高压蒸汽灭菌器、恒温烘干箱、净化工作台、生物安全柜、
药品微生物限度检验方法标准操作规 程
标准操作规程 目的：建立一个药品微生物限度检验标准操作规程。 范围：适用于本企业生产的所有品种，本企业所有洁净生产区域，QC微生物限度检查室，洁净工作室等。 责任者：QC主任、化验员。 规程： 本规程引至《中国药典》。 1. 概述：微生物限度检查系指非规定灭菌制剂及其原辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。我公司QC设无菌操作室，用于微生物限度检查。无菌操作室的管理及使用制度见本文附录一。 2. 抽样：供试品应按批号随即抽样，一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍。抽样时，凡发现有异常可疑的样品，应缺陷选用疑问的样品，但因机构损伤明显破裂的包装不得作为样品，凡已能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出长螨、长霉、虫蛀及变质的药
品，可直接判为不合格，无需要再抽样检验。 3. 供试品的保存：供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，以防供试品中的污染菌因保藏条件所引起致死、损伤或繁殖。供试品在检验之前，应该保持原有包装状态，严禁开启，包装已开启的样品不得作为供试品。 4. 检查： 4.1. 使用设备：电热恒温培养箱、电热恒温水温箱、试管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培养皿、试管架、注射器、针头、注射器盒、研钵、75％酒精棉球、紫外灯（365nm波长）。 4.2. 检查的全过程应严格遵守无菌操作，严防再污染。使用设备、仪器、人员及无菌操作室常见的消毒、灭菌方法见本文附录二。除另有规定外，供试品制备成供试液后，均在均匀状态取样。制成供试液后，应该在60分钟内注皿操作完毕。 标准操作规程 4.3. 培养：除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30－35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25－28℃，控制菌培养温度为36±1℃，检验结果的报告以1g、1ml或10cm2为单位。 4.4. 复检
检验员培训考试试题(微生物) 部门职位姓名分数 一、填空(40分,每空1分) 1. 微生物限度检查应在不低于D级背景下的B级单向流空气区域内进行。 2. 微生物限度检查法中需氧菌检查所用培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基,培 养温度为30-35 ℃;霉菌,酵母菌检查所用培养基为沙氏葡萄糖琼脂培养基培养温 度为20-25 ℃。 3. 具抑菌活性的供试品,常用消除抑菌活性的方法有:增加稀释液或培养基体积,加入适宜的中和剂或灭活剂,薄膜过滤法。 4. 采用薄膜过滤法,滤膜孔径应不大0.45μm,直径一般为50mm。 5. 供试液制备若需加温时,温度不应超过45℃。供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1小时。 6. 制备的菌液若在室温下放置,应在 2 小时内使用,若保存在2~8℃, 可在24小时内使用。 7.计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验,需氧菌总数计数所用试验菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉;霉菌和酵母菌总数计数所用试验菌株为白色念珠菌、黑曲霉。 11.计数方法适用性试验中,采用平皿法或薄膜过滤法时,试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5-2 。 12. 检查大肠埃希菌时,应做阴性对照试验和阳性对照试验。
13. 配制培养基时,要填写培养基配制记录,记录内容包括:名称、配制量、配方、灭菌条件、配制日期、配制批号、配制者、PH值 14.在收到检定菌后,保管员要在保存菌种容器外加贴标签,内容为名称、编号、购买日期,同时还要填写菌种接收记录。 二、判断题(5分,每题1分) 1.平皿法操作时应先注入培养基,再加入1ml供试液。(×) 2.以稀释液代替供试液进行阴性对照试验,阴性对照试验应无菌生长。如果阴性对照有菌生长,应进行偏差调查(√) 3.从菌种保藏中心获得的干燥菌种为0代,试验用菌株的传代次数不得超过5 代(√) 4.控制菌检查用培养基促生长能力检查、抑制能力检查接种不大于100cfu试验菌于被检培养基和对照培养基中。(×) 5.纯化水的微生物限度质量标准为每lml供试品中需氧菌总数不得过lOOcfu。(√) 三、选择题(5分,每题1分) 1. 进行供试品控制菌检查时,阳性对照试验的加菌量为( C ) A、不大于50cfu B、50~100cfu C、不大于100cfu
文件编号：SVP YF-0-01-00
验证文件
******微生物限度 检查法验证方案
********有限责任公司
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验 证 文 件
目 录
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适用范围 目的 概述 验证所需要的仪器设备及文件 可接受的限度范围标准 测试方法 异常情况处理 测试结果 结论
10 再验证周期 11 附表
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验 证 文 件
1 适用范围 本验证方案适用于******微生物限度检查法的验证。 2 目的 建立该产品的微生物限度检查方法，并对其有效性进行评价，确保试验方法的 完整性，保证检验结果的可靠性。 3 概述 3.1******处方中含有盐酸氨基葡萄糖以及常用辅料等成分，文献报道盐酸氨基葡 萄糖有抑菌活性。根据以上特点，按《中国药典》2010 年版附录Ⅺ J《微生物限度 检查法方法》的“供试品的制备”项下需用特殊方法制备供试液中（6）制备供试 液。“细菌，霉菌，酵母菌计数”项下检查法 2 薄膜过滤法进行细菌，霉菌及酵母 菌的计数方法验证，控制菌检查项下控制菌的检查法验证。 3.2 验证时间：************批平行三次试验。 4 验证所需要的仪器设备及文件 4.1 验证需用仪器设备 器具名称 电热恒温培养箱 多用生化培养箱 蒸汽灭菌器 规格型号 HG101-3 SP-80 ZDX-35B 检定日期 检定单位 有效期
4.2 验证所需要的文件及存放地方 资料名称 《HG101-3 电热恒温培养箱操作维护保养 SOP》 《SP-80 型生化培养箱操作维护保养 SOP》 《ZDX-35B 蒸汽灭菌器操作维护保养 SOP》 《微生物限度检查法 SOP》 5 可接受的限度范围标准 5.1******微生物限度检查质量标准 项目 细菌总数 霉菌、酵母菌 标准规定 ≤1000 个/g ≤100 个/g 存放地点
2015 版微生物限度检验操作规程 目的建立微生物限度检查操作规程，规范操作，保证结果的准确性。范围成品、辅料、内包装袋及纯化水的检验。 内容概述：本检验操作规程依据中国药典2015 年版四部《通则1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法》和《通则1106 非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法》进行检查。 微生物计数法 一、计数方法 1．微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。 2、计数方法本法包括平皿法、薄膜过滤法。 3、计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性检查供试品微生物计数中所使用的 培养基应进行适用性检查。供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确定采用的方法适合于该产品的微生物计数。 4、菌种及菌液的制备试验用菌株的传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0 袋)，并采用适宜的菌种保藏技术进行保藏。计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验见表 1。 菌液制备按表 1 规定培养各试验菌株。取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用无菌氯化钠- 蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加入3-5ml含％(ml/ml )聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含%(ml/ml )聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉抱子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2-8 C,可在24小时内使用。黑曲霉抱子悬液可保存在2-8 C,在验证过的贮存期内使用。 表 1 试验菌液的制备和使用 阴性对照为确认试验条件是否符合要求,应进行对照试验,阴性对照试验应无菌生长。培养基适用 性检查按照表1规定,接种不大于100cfu 的菌液至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板,置规定的条件下培养。每一试验菌株平行制备 2 管或 2 个平皿。同时用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在范围内,且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。被检 液体培养基管与对照培养基管比较,试验菌应生长良好。 5、计数方法适用性检查
1. 目的：建立非无菌药品微生物限度检查检验标准操作规程，规范检验操作，确保检验结果准确。 2. 适用范围：适用于本公司所有采用非无菌药品微生物限度检查法测定的供试品。 3. 责任者：QC检验员、QC经理。 4. 正文： 4.1 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法 4.1.1 简述 微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。 当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，本法不
适用于活菌制剂的检查。 本检查法可采用替代的微生物检查法，包括自动检测方法，但必须证明替代方法等效于药典规定的检查方法。 微生物计数试验应在受控洁净环境下的局部洁净度不低于B 级的单向流空气区域内进行。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。 如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。供试品检查时, 若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。 供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。 4.1.2 计数方法 计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-NumberMethod，简称MPN 法）。MPN 法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN 法可能是更适合的方法。 供试品检查时, 应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，所选的方法必须具备检测充足样品量的能力，以保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。所选方法的适用性须经确认。 4.1.3 计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验 供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。 供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。 若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试
微生物限度检查方法适用性试验方案
验证方案组织与实施 微生物限度检查方法适用性试验工作应由质量管理部门负责组织，质量管理部门有关人员组成验证小组，参与实施。 方案起草 方案审核 方案批准
目录 一、概述 二、验证目的和风险评估 三、验证内容 四、方法判定 五、再验证周期 六、参考文献 七、结果评价及结论
1、概述： 微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括需氧菌数、霉菌数和酵母菌数及控制菌检查。当建立产品的微生物限度检查法时，应进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法的适用性试验和控制菌检查方法的适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌、霉菌和酵母菌数的测定和控制菌检查。 由于依照中国药典2010版的检查方法验证,需氧菌、霉菌和酵母菌、控制菌均采用平皿法。故现升级为中国药典2015版，需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌均采用平皿法进行方法适用性试验。 2、试验目的和风险评估： 验证目的：确认所采用的需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法及控制菌检查方法适合我公司所生产产品的微生物限度检查。 风险评估： 3、验证内容： 3.1、培养基来源： 确认人：确认日期：
3.2、检查用培养基配制方法： 确认人：确认日期： 3.3、使用仪器 确认人: 确认日期： 3.4、验证试验用菌种： 确认人：确认日期： 3.5试验方法： 取供试品 10 g加PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml→1:10供试液。需氧菌、霉菌和酵母菌、控制菌采用常规法。 3.6菌液的制备： 3.6.1取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨琼脂斜面培物一铂金
人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 下表用于记录修订/变更主要内容及历史。
目录 1. 概述 2. 验证目的和范围 3. 组织及职责 4. 验证进度计划表 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 7.验证项目和验证方法 7.1试验菌株 7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备 7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 8.偏差与漏项控制 9.验证报告会审
1. 概述 我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。 人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。 本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。 2. 验证目的和范围 验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。 3.组织及职责 3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准 验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。验证方案实施完成后，由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。 3.2验证方案的培训 验证方案在经质量负责人批准后，，由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作，并将该次的培训记录归档。 3.3验证方案实施过程中的变更和偏差 验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施。 3.4 验证工作小组成员表 4. 验证进度计划表 本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是2015年12月至2016年1月。 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 5.1.主要检验仪器设备确认表
版药典微生物限度检查 方法验证方案 Document number：WTWYT-WYWY-BTGTT-YTTYU-2018GT
人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案 下表用于记录修订/变更主要内容及历史。
目录 1. 概述 2. 验证目的和范围 3. 组织及职责 4. 验证进度计划表 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 7.验证项目和验证方法 试验菌株 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 8.偏差与漏项控制 9.验证报告会审
1. 概述 我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。 人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。 本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。 2. 验证目的和范围 验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。本验证方案采用3批按GMP要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。 3.组织及职责 验证方案和验证报告的起草、审核、批准 验证方案由质量部QC组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。验证方案实施完成后，由QC组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。 验证方案的培训 验证方案在经质量负责人批准后，，由QC组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作，
微生物限度检查方法验证方案 1.目的: 为确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度检查, 包括细菌、霉菌及酵母菌计数和控制菌检查, 特制定本验证方案, 经过比较试验菌的恢复生长结果, 来评价整个检验方法的准确性、有效性和重现性, 以确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可忽略不计, 所采用的方法适用于该品种的微生物限度检查。 验证过程应严格按照本方案规定的内容进行, 若因特殊原因确需变更时, 应填写验证方案修改申请并报验证领导小组批准 2.范围: 本验证方案适用于微生物限度检查方法的验证。 3.规范性引用文件: 根据《中国药典》二部附录ⅪJ 微生物限度检查法的要求, 由于某些供试品具有抗菌活性, 在建立微生物检查方法或产品的组分发生改变或原检查法的检验条件发生改变时, 可能影响检验结果的准确性, 必须对供试品的抑菌活性及测定方法的可靠性进行验证。 4.验证实施: 4.4.1 试验前的准备:
4.4.1.1 试验用具的准备: 将试验需用的试管、刻度吸管、薄膜过滤器、滤膜( 孔径0.22um、直径50mm) 、平皿、空三角瓶、称量纸等, 用牛皮纸包扎好后, 放于湿热灭菌器中, 在121℃, 灭菌30 min, 在3天内使用。 4.4.1.2试验用培养基的制备: 取适用性检查合格的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基( BL) 、改良马丁琼脂培养基、 4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基( MUG) 等脱水培养基, 按照相应的配制说明, 用纯化水配制、分装后, 在2小时内, 放于湿热灭菌器中, 在121℃, 灭菌15 min, 在3周内使用。 4.4.1.3试验用稀释剂/缓冲液、冲洗液的制备: 取在有效期内的试剂, 按照相应的配制方法, 配制pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、 0.9%无菌氯化钠溶液、 0.05%( ml/ml) 聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液等, 用纯化水配制, 加热使溶, 过滤, 分装, 在121℃, 灭菌15 min, 在3周内使用。 4.4.2 试验菌的制备和稀释: 4.4.2.1细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证用菌液: 4.4.2.1.1取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物少许接种至10ml营养肉汤中, 在30～35℃培养18～24小时; 取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中, 在23～28℃培养24～48小时; 取黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上, 23～28℃培养5～7天。
微生物限度检验方法验证方案 1.适用范围 本方案适用于本公司各品种微生物限度检验方法的验证。 2.目的 通过验证确认所采用的方法适合于该药品的微生物限度的测定。 3.职责 项目责任人：负责验证方案的起草及具体实施。 验证管理员：负责验证工作的组织、协调及管理。 QA现场监控员：负责验证实施过程中的监督检查，取样，确保结果的可靠性。 QC负责人：负责验证方案中检验方法的审核及按照规定的取样计划对标准检验操作程序的准确执行，负责组织实施。 QC检验员：负责验证方案的起草与参与实施，并对所测数据准确性负责。 质量部经理：负责验证方案及报告的审核和批准。 4.内容 4.1.概述 通过验证以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定；确认所采用的方法适合于该药品的控制菌的检查。根据样品特性制订检验方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。若符合，按验证的方法和条件进行药品的微生物限度检查；若不符合，重新建立制订检验方法和检验条件，再进行验证，直至验证结果符合设立的验证标准。 4.2细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证 当建立药品的微生物限度检查时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定。.验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。 4.2.1.验证用菌株及菌种要求 大肠埃希菌【CMCC（B）44102】、金黄色葡萄球菌【CMCC（B）26003】、枯草芽孢杆菌【CMCC（B）63501】、黑曲霉【CMCC（F）98003】、白色念珠菌【CMCC（F）98001】。大肠埃希菌为革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，枯草芽孢杆菌为产芽孢杆菌，前述菌株作为细菌计数验证用菌株；黑曲霉为霉菌，白色念珠菌为酵母菌，作为霉菌及酵母菌计数验证用菌株。 验证实验所用的菌株传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0 代），