60Coγ射线辐照剂量对牛血清白蛋白结构的影响
摘要：为研究60Coγ射线辐照剂量对牛血清蛋白结构的影响，以单一组分牛血清白蛋白（BSA）为模型，研究BSA 水溶液辐照0～50 kGy剂量后的含量、结构和微观形态变化。结果表明，BSA主要由25～214 kDa约10种分子量的蛋白质组成，其中55 kDa的蛋白质含量最大，各组分含量随辐照剂量的增加而下降，辐照50 kGy时几乎全部降解；BSA在210、280 nm处各有1个紫外吸收峰，峰高均随着剂量的增加而下降，辐照30 kGy时280 nm处的峰消失；BSA二级结构中α-螺旋、β-折叠和β-转角、无规卷曲含量分别为40.8%、37.3%和21.9%，α-螺旋含量随辐照剂量增加而下降，其他结构含量呈上升趋势；辐照前后BSA的酰胺Ⅰ带红外吸收峰从1 650.8 cm-1红移至1 655.5 cm-1处；BSA辐照后微观表面由平滑变为褶皱，形成松散的片状。辐照后牛血清白蛋白二级结构发生变化，辐照剂量越大，反应程度越大。
关键词：60Coγ射线；牛血清白蛋白；剂量；结构改变中图分类号：TS201.6；TL99 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）21-5378-04
DOI：10.14088/https://www.doczj.com/doc/a713805897.html,ki.issn0439-8114.2015.21.045
Effect of 60CoγRays Irradiation Dose on Bovine Serum
Albumin Structure
GENG Sheng-rong1，LI Xin1，LI Cha-de2，ZU Xiao-yan1，LIAO Tao1，XIA He-zhou1，YIE Li-xiu1，CHENG Wei1 （1.Institute for Farm Products Processing and
Nuclear-Agricultural Technology，Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Innovation Center of Agricultural Science and Technology，Wuhan 430064，China；2.School of Chemistry ，Chemical Engineering and Life Sciences，Wuhan University of Technology，Wuhan 430070，China）
Abstract：To study the influence of 60Co γray irradiation dose on bovine serum component，as a single component model，BSA solution was irradiated by 0～50 kGy respectively and the protein content，secondary structure molecular and morphology were determined. The results showed that the BSA was mainly composed of 10 proteins and the molecular weights were 25～214 kDa，of which the protein content of 55 kDa was the largest one. The protein content was decreased with the increasing of irradiation dose and the content of 10 proteins were degraded after irradiated 50 kGy. The UV-Vis（UV-Visible Spectrophotometer）of BSA appeared two absorption peaks at 210 nm and 280 nm，respectively. The height of two peaks were decreased with the dose increasing and 1 280 nm-peak
disappeared after the BSA was irradiated by 30 kGy. The secondary structure content of α-helix，β-fold & β-corner and random coil from BSA were 40.8%，37.3% and 21.9%. The α-helix content decreased with the dose increasing and the other structural content increased with the dose increading. Amide I band of infrared absorption peak of bovine serum albumin shifted from 1 650.8 cm-1 to 1 655.5 cm-1. The BSA had a smooth surface microstructure before irradiation and changed into a loose sheet after irradiaton. Thus，the main effect region of the radical irradiation was α-helix of BSA，subsequently led the increasing of β-fold，β-turn and random coil increases，finally the protein turned from the ordered state into a disordered state，the greater the dose，the greater the degree of reaction. Key words：60Coγrays；bovine serum albumin；dose；structure change
牛血清是细胞培养的最重要的组分，它具有促进细胞增殖和诱导细胞分化等生物学功能，与现代生物技术包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程的发展有密切关系[1]。由于原料来源和生产环节引入的外源病毒会影响牛血清的
品质以及下游生物制品的品质[2]，关于60Coγ射线灭活病原菌和破坏细胞的效果早期有大量研究[3，4]，但对于牛血清中蛋白组分的生理指标变化未曾涉及，牛血清生物功能的破
坏，根本原因在于蛋白质结构和构象的改变，研究辐照对蛋白质结构的影响有利于建立高效的辐照工艺。
牛血清中的蛋白质可分为纤维蛋白原、白蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β1球蛋白、β2球蛋白和γ-球蛋白等多种成分[5]，其中BSA是生物体血浆中含量最丰富的一种载体蛋白质，约占血浆中总蛋白质的52%～62%，因其能够与多种小分子化合物进行可逆的结合而起到体内转运作用，是常用的蛋白质模型。BSA是由607个氨基酸残基组成的一种球蛋白，含有17个二硫键，一个自由半胱氨酸基团，为较大的螺旋形结构。本试验利用紫外光谱（UV-Vis）、红外光谱（FT-IR spectrometer，FT-IR）、圆二色谱（Circular dichroism，CD）和扫描电镜（Scanning electron microscope，SEM），研究辐照后BSA结构的变化，为建立剂量与蛋白质结构变化之间的关系提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
BSA，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；蛋白标样（MBP-β-半乳糖苷酶，分子量175 kDa；MBP-截短型-β-半乳糖苷酶，分子量80 kDa；MBP-CBD，分子量58 kDa；CBD-Mxe intein-2CBD，分子量46 kDa；CBD- Mxe intein，分子量30 kDa），Thermo公司。
γ射线辐照源（60Co源，装源量25.5万居里），湖北省
辐照实验中心；扫描电镜（Quanta 200型），荷兰FEI公司；示差扫描量热仪（DSC200F3型），德国Netzsch公司；红外光谱仪（NICOLET 5700型，红外显微镜），美国热电公司；紫外可见分光光度计（T6新世纪），北京普析通用仪器有限责任公司；1515型高效液相色谱泵、2690D型分离模块、2410型折射率检测器、Waters ultrahy drogel 2000型和Waters ultrahy drogel 250型色谱柱，美国Waters公司；圆二色谱（J-810型），日本分光公司（JASCO）。
1.2 试验设计
BSA的100 mg/mL水溶液采用有氧包装后，在常温下（约25 ℃）分别辐照0、10、20、30、40、50 kGy剂量，另外一个处理在低温下（约10 ℃）辐照10 kGy剂量。辐照方式采用动态照射法，平均剂量率约为30 Gy/min。硫酸亚铁剂量计跟踪剂量，照完后样品采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）方法分析蛋白含量和组分变化；采用UV-Vis、CD、FT-IR、SEM表征结构变化，其中CD测定直接取样稀释，其他指标测定取辐照后BSA的冻干样。
1.3 检测方法
SDS-PAGE：样品浓度1 mg/mL，微孔滤膜过滤，上样量10 μL。分离胶浓度9%，分离胶段电泳电压100 V，浓缩胶浓度4%，浓缩胶段电泳电压60 V，电泳时间2.5 h。
UV-Vis：样品浓度5 mg/mL，蒸馏水溶剂，微孔滤膜过
滤，波长扫描范围190～410 nm。
CD：将浓度为0.5 mg/mL的样品注入1.0 cm的石英比色皿中，以去离子水为对照。控制程序为Spectra manager，气体流量为4～5 L/min，检测波长范围190～260 nm，1次数据采集，采集频率200 nm/min。二级结构含量根据仪器自带程序杨氏公式给出。
FT-IR：取冻干样品与KBr混合压片，扫描范围400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1。
SEM：取冻干样品少量黏在金属台上，喷金，电镜扫描。
2 结果与分析
2.1 BSA辐照后蛋白组分及分子量的变化
BSA溶液分别辐照0～50 kGy后作SDS-PAGE分析，见图1。未辐照BSA有10条带，1～3条分子量大于175 kDa，第4～5条在175～80 kDa范围，第6条在58 kDa处，浓度相当大，第7～9条在46～30 kDa之间，第10条小于46 kDa。低温辐照10 kGy BSA与常温10 kGy相比条带颜色略深，尤其是在58 kDa处。从20 kGy开始，大于58 kDa的蛋白条带消失，形成均匀的连续分子量的混合物。58 kDa处蛋白条带也逐渐变浅。
根据迁移距离和标样蛋白质的分子量计算，各剂量对应的条带分子量见表1。未辐照BSA主要由214、204、189、172、135、55、38、34、29、25 kDa这10种分子量蛋白质
组成，其中55 kDa分子量蛋白含量最大。经10～50 kGy剂量辐照后，各分子量蛋白逐渐降解消失，形成混合物。
2.2 BSA辐照后UV-Vis光谱吸收变化
BSA溶液分别辐照0～50 kGy后的UV-Vis图如图2所示，未辐照BSA水溶解部分的紫外吸收光谱在210 nm处和280 nm处各有1个峰，吸光度分别为2.74和0.318 L/g?cm，随着剂量的增加峰高逐渐下降，剂量大于30 kGy时，280 nm 处的峰消失（图2）。280 nm的吸收峰是分子中的2个色氨酸和19个酪氨酸的芳杂环的Π-Π*和n-Π*跃迁引起的，而210 nm处的吸收峰是由肽键上的C=O的n=Π*跃迁引起的，与BSA的α-螺旋含量有关[6]。辐照引起蛋白质构象发生变化，主要为肽键上的C=O的n=Π*跃迁能量减小和α-螺旋含量减少，且与剂量呈正相关，大于20 kGy辐照后样品的210 nm和280 nm两个紫外吸收峰高下降尤其明显。 2.3 BSA辐照后CD变化
肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基以及二硫键是主要的光活性生色基团，生色基团对左右圆偏振光吸收不同，造成偏振矢量的振幅差，从而得到蛋白质和多肽分子的二级结构，圆二色谱仪是研究蛋白质构象变化的有效手段。BSA溶液显示（图3）出α-螺旋结构的3个特征峰，192 nm处1
个正峰，208、222 nm处2个负峰，吸收强度反映蛋白α-
螺旋的含量[7]。
BSA溶液分别经0～50 kGy辐照后，测定样品的CD光谱（图3）。随着辐照剂量的增加，192、208和222 nm处的3个峰值均下降，剂量大于30 kGy时，在192 nm处的峰型发生变化。用杨氏法计算得到BSA二级结构中4种结构的含量，详见表2。随着辐照剂量的增加，α-螺旋含量从40.8%（0 kGy）下降至10.0%（50 kGy），β-折叠和β转角的总含量从37.3%增加至51.3%，无规卷曲从21.9%增加至38.7%。
2.4 BSA辐照后FT-IR变化
牛血清酰胺Ⅰ带主要是氨基酸残基的C=O伸缩振动吸收，是α-螺旋、β-折叠、转角和无规卷曲等不同结构振动峰的
加合带，各吸收峰范围在1 600～1 685 cm-1之间，其中1 600～1 640 cm-1归属β-折叠，1 640～1 650 cm-1归属无规
卷曲，1 650～1 670 cm-1归属α-螺旋，1 680～1 685 cm-1
归属转角结构，1 651 cm-1归属α-螺旋[8]。酰胺Ⅱ带吸收峰范围1 500～1 600 cm-1，包含C-N的伸缩振动和N-H的变形振动[9]。
未辐照和50 kGy辐照BSA溶液红外吸收图谱见图4。未辐照BSA的酰胺Ⅰ带的红外最大吸收位于1 650.8 cm-1附近，表明BSA以α-螺旋结构为主。辐照BSA吸收峰红移至1 655.5 cm-1处，辐照BSA样品酰胺Ⅱ带移至1 536.6 cm-1附近，与未辐照相比，峰高变高并尖锐。红外吸收变化说明辐照使蛋白质的构象发生了变化。
2.5 BSA辐照后SEM结构变化
图5为BSA水溶液或凝胶经冻干后的SEM图。由图5
可知，未辐照BSA表面光滑，经30 kGy辐照后表面有小量褶皱和小突起，40、50 kGy辐照处理后表面褶皱增加，小突起变为大片状突起。本研究结果与耿胜荣等[10]明胶溶液辐照后因交联反应微观表面变得粗糙相似。
3 讨论
在0～50 kGy辐照范围内，随着辐射剂量的增加，牛血清白蛋白的主要蛋白组分含量逐渐减少，当大于20 kGy辐照后，仅有4种主要蛋白组分（135、55、34、29 kDa）存在，辐照后BSA蛋白质溶解性变差，微观表面呈现松散的片状结构，这与明胶水溶液辐照的特性相似[11]，明胶水溶液辐照后蛋白质组分电泳后发生降解反应，蛋白质含量下降，微观表面形成更为紧密的网状结构。
本试验中，α-螺旋含量下降，而β-折叠和β转角、无规卷曲含量升高，α-螺旋含量在辐照剂量0～10 kGy间下降幅度最大，20 kGy后变缓和，这说明辐照自由基主要作用BSA 的α-螺旋结构区域。熊泽云等[12]报道的镧（Ⅲ）-芸香甙配合物与人血清白蛋白反应后α-螺旋含量下降，其他结构含量升高，认为二者结合导致人血清白蛋白的构象变化。吴锦绣等[13]报道壳聚糖与牛血清蛋白相互作用导致的208和222 nm圆二色谱峰向低波数移动，以及振幅下降，说明BSA发
生降解，从而引起组成和结构的变化。
本试验结果表明，大于30 kGy辐照的BSA溶液在210、280 nm处的紫外光谱吸收峰大幅度下降。薛春霞等[6]认为，抗生素头孢地尼结构中的羧基解离后，离子诱导BSA肽链伸展，内部的色氨酸和酪氨酸残基芳杂环疏水基团裸露，使278 nm处吸收增强；罗红霉素分子中的羟基与BSA肽链中的氨基酸残基中的含氧或含氮基团形成氢键，从而使氨基酸残基中含氧或含氮基团原有的键强减弱，278 nm处吸收峰下降。本试验中辐射引起的BSA紫外减色效应，与罗红霉素的作用效果相同，但结合圆二色谱和扫描电镜结论分析，辐照后的BSA紫外吸收下降，与BSA的疏水基团增加，导致溶解性下降，发色基团含量减少有关，并不是形成了氢键。
50 kGy辐照的BSA酰胺Ⅰ带发生红移，酰胺Ⅱ带峰型变尖锐，说明α-螺旋含量、C-N、N-H键合力发生改变。这与安秀林等[8]的研究报道相同，也与本试验中圆二色谱变化一致。
4 小结
1）未辐照牛血清白蛋白有10种主要蛋白组分，分子量分别为25、29、34、38、55、135、172、189、204、214 kDa，其中55 kDa含量最多。常温高于20 kGy的牛血清辐照灭菌剂量明显造成蛋白的分子量降解，低温有一定的抑制作用。
2）辐照后BSA紫外吸收峰型和圆二色谱峰型均随着辐
照剂量的增加而下降；随着辐照剂量增加，BSA的α-螺旋结构含量下降，同时β-折叠、β转角和无规卷曲的含量增加。
3）辐照引起BSA微观表面由光滑渐变为片状突起，辐照引起BSA变性，导致蛋白溶解性变差。
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５９８食品与生物技术学报第２９卷 的产物，经ＥｃｏＲＩ和ＮｏｔＩ双酶切得到长约２．２ｋｂ 的插入片断和长约９．３ｋｂ的载体片断，表明融合基 因已经成功插入到载体ｐＰＩＣｇｋ中。质粒测序结果 显示，全部序列没有发生突变，与预期一致。 １．ＧｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＩＬ２ｍｌ２．ＧｅｌｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｐＢｌｕｅ／ ＨＳＡ，３．ＤｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＢＨＩｍｗｉｔｈＥｅｏＲＩ＃４．Ｄｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓ— ｔｉｏｎｏｆｐＢＨＩｍｗｉｔｈＥｃｏＲｌ／Ｎｏｔｌ；Ｍ．ＸＤＮＡ／ＨｉｎｄⅢＭａｒｋｅｒ 圈１重组质粒ｐＢＨｌｍ的酶切分析 Ｆｉｇ．１Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄ ｐＢＨｌｍ ３．３阳性转化子的筛选及诱导产物的Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定 质粒ｐＰＨＩｍ经ＳａｌＩ酶切，回收线性化片断，电 击转化Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳｌｌ５感受态细胞。涂布ＭＤ 平板，３０℃培养４ｄ后共长出了约４００个转化子，挑 选其中２００个菌落进行初筛，选其中表达量较高的 １０株重组菌进行复筛验证，得到一株产量最高的重 组菌Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳｌｌ５／ｐＰＨＩｍ，诱导３ｄ后上清液 的ＳＤ§ＰＡＧＥ分析和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果如图３ 所示。 ３’ＡＩＬ２ｍ １．ＤｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＰＩＣ９ＫｗｉｔｈＥｃｏＲｌ；２．ＤｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＰＨＩｍｗｉｔｈ ＥｃｏＲＩ；３．ＤｏｕｂｌｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＰＨＩｍｗｉｔｈＥｃｏ—Ｒｌ／ＮｏｔＩ；Ｍ．）．ＤＮＡ／ＨｉｎｄⅢＭａｒｋｅｒ 图２重组质粒ｐＰＨＩｍ的物理图谱（Ａ）和酶切分析 （Ｂ） Ｆｉｇ．２ＰｈｙｓｉｃａｌｍａｐＩＡ）ａｎｄｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ（Ｂ）ｏｆ ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＰＨｌｍ 研究发现，表达的蛋白质的相对分子质量约为８２０００，与理论计算ＨＳＡ－ＩＬ２ｍ的相对分子质量相 符，且这一位置的蛋白与１１．－２、ＨＳＡ的抗体都能发 生免疫反应，进一步证实酵母经诱导表达ＨＳＡ— ＩＬ２ｍ。但７００００和４５０００这两处的降解条带又都 可以与ＨＳＡ的抗体发生免疫反应，认为是融合蛋 白降解所产生的条带。经白蛋白测定试剂盒测得 其中白蛋白融合蛋白的量约为６０．２ｍｇ／Ｌ（以 ＨＳＡ—ＩＬ２ｍ计）。 ３．４诱导产物的活性测定 发酵液经脱盐处理后，冻干保存。取０．１ｍｇ冻干粉用２ｍＬＰＢＳ复溶后，离心取上清，测得其中 融合蛋白的量约为３００／－ｇ／ｍＬ。采用ＩＬ－２依赖细 胞株ＣＴＬＬ一２以标准品ＩＬ－２为对照，对上清液中的 融合蛋白的生物学活性进行了测定。标准品的活 性为２×１０５ＩＵ／ｍＬ，用ＲＰＭｌｌ６４０稀释到浓度为 ２００ＩＵ／ｍＬ。测定结果表明，上清液中的融合蛋白 可以有效的刺激ＣＴＬＬ－２细胞增殖。以标准品的 最高浓度ＯＤ啪值为１００ｏ／６，计算标准品、样品梯度 百分率。将百分率换算为概率单位，以概率单位为 纵坐标，以稀释度Ｘ的对数为横坐标，绘制直线回 归图（图４），通过计算得出融合蛋白粗蛋白的比活 性为１．５１×１０６ ＩＵ／ｍｇ。
血清前白蛋白测定标准操作规程 1 检验申请 单独检验项目申请：血清前白蛋白（缩写PAB)测定，组合项目申请：血生化中肝功能项目测定。临床医生根据需要提出检验申请。 2 标本采集与处理 2.1标本采集 2.1.1常规静脉采血约2 ml，不抗凝，置普通试管中。或采用含分离胶的真空采血管。检查体液乳酸脱氢酶的体液标本应用肝素抗凝。 2.1.2检验申请单和血标本试管标上统一且唯一的标识符。 2.1.3急诊标本采集后，在检验申请单上填写标本采集时间。 2.1.4标本采集后与检验申请单一起及时运送至检验科。专人负责标本的接收并记录标本的状态，对不合格标本予以拒收。 2.1.5下列标本为不合格标本 2.1.5.1标本量不足：少于0.3ml的全血标本，或少于0.1ml的血清或血浆。 2.1.5.2对反应吸光度有干扰的标本，包括严重溶血、严重浑浊的标本。 2.1.5.3无法确认标本与申请单对应关系的。 2.1.5.4其他如标识涂改、标本试管破裂等。 2.2标本保存 2.2.1接收标本后在30min内将标本离心分离出血清。 2.2.2标本保存时间：室温（15～25℃）下可稳定8h，普通冰箱中（2～8℃）稳定24h。-20℃保存稳定30天。为避免标本中水分挥发使血清浓缩，对保存时间超过1天的标本均加塞密闭或覆盖湿巾。2.2.3已完成测试的标本保持完整的识别号，置4～8℃冰箱内保存7天。
2.3标本采集的注意事项 2.3.1采血前使受检者保持平静、松弛、避免剧烈活动，24h不饮酒和12h以上禁食空腹状态。 2.3.2注意有无应用影响测试项目的药物。 2.3.3可以使用肝素抗凝的血液标本。 3 方法原理 人血清PA与其相应抗体在液相中相遇，立即形成抗原-抗体复合物，并形成一定浊度。该浊度的高低在一定量抗体存在时与抗原的含量成正比。通过与同样处理的校准比较，计算未知样品的PA含量 4 试剂及其他用品 4.1试剂：前白蛋白试剂盒，由北京利德曼生化技术有限公司出品。 4.2试剂盒保存：未开瓶的试剂储存在2～8℃可稳定至有效期。试剂开瓶后，在仪器冰箱试剂仓中可保存28天。开盖后避免污染。当试剂变混浊，或者未开盖的液体有沉淀，或起始吸光率>0.8时，表明试剂已变质，不能继续使用。 4.3试剂盒准备：液态双试剂型，即开即用，无特殊准备。 4.4试剂盒主要成分：
人血白蛋白是临床常用的一种天然血液制品。按照《中国生物制品规程》标准制造和检定的产品，是 由乙型肝炎疫苗免疫健康人的血浆或血清，经低温乙醇法分离纯化，并经60℃10小时加温灭活病毒后制成，白蛋白含量在96%以上，含适宜稳定剂，不含防腐剂和抗生素，供静脉输注。随着我们对危重病人病理生理过程的进一步深入了解，临床中使用白蛋白引起越来越多的争议。白蛋白具有很多生理学功能，在临床中应用的范围很广。在1998年世界范围内白蛋白的用量为300－400吨，很多医院白蛋白的用量占药房营业额的30％强。现在随着药物经济学的发展，对这种昂贵药物不加限制的使用引起了广泛的争议。 1. 蛋白的代谢血浆蛋白是血浆中主要固体物质，约占血浆总量的6－8％。可以分为白蛋白和球蛋白二大类。白蛋白含584个氨基酸，平均分子量69000道尔顿，易溶于水，表面带负电荷。血浆中白蛋白总量约为120g，浓度为40－50g/L。除了分布在血浆中，白蛋白还存在于组织液中，组织液中的白蛋白约为160g，浓度比血浆中的要低，为血浆中白蛋白浓度的一半。正常人体肝脏每天生成9-12g 白蛋白，其生成的速度受血浆胶体渗透压、组织液胶体渗透压的影响。严重的蛋白缺乏症会降低白蛋白的生成。另外一些药物如胰岛素，可的松等会刺激白蛋白的生成，但生长激素对白蛋白的合成没有影响。正常情况下，白蛋白在体内还存在一个循环过程，在血浆中白蛋白通过毛细血管壁间隙进入 组织液中，然后通过淋巴系统重新进入血浆中，白蛋白的循环半衰期为16小时。外源性白蛋白进入人体后，有一个快分布期，从血浆中迅速消失进入组织间隙，分布半衰期约为15小时，之后是一个缓慢的消除过程，消除半衰期约为19天。白蛋白的分解代谢主要发生在血管内皮中，代谢速率为9-12g/天，约为总量的4%。影响白蛋白代谢的主要因素为血浆中白蛋白浓度，人体热量和蛋白的不 足也会加速白蛋白的代谢。感染，外伤，或手术引起炎性级联反应进会释放出许多炎性介质活化白细胞，这一过程引起了血管内表皮细胞的损伤，使毛细血管通透性增加，血管中的成分包括白蛋白渗透到组织中去，这加速了白蛋白的泄漏，炎性介质还会抑制了白蛋白的合成，促进了白蛋白的分解，因此从总体上降低了白蛋白的含量。 2. 白蛋白的生理作用 2.1 扩血容作用 每克白蛋白可结合18ml水，能阻止液体从血管内向血管外扩散。但是白蛋白的扩血容作用并不一定 与理论值相等，还与患者的血容量，蛋白水平，毛细血管的通透性等有关。白蛋白还能聚集到血管水肿孔隙较大的地方，阻止液体的扩散。需要特别指出的是对于毛细血管通透性明显增大的病人，白蛋
关于重组人血白蛋白的系统性表述 人血白蛋白（HSA）作为一种重要的临床急救药物及重要的药物辅料，在医药，科研及化妆品生产等领域应用广泛。随着国内医疗水平及居民收入水平的提升和对血液制品认知度的提高，血液制品的临床使用量不断增加，市场容量不断增长，行业快速发展。根据国家医药管理局的报告，2010年全国16城市医院血液系统用药金额约62亿元，其中白蛋白类药物占据了血液制品的主要份额（大于50%）。但作为一种血液制品，HSA同时也面临原料短缺及病毒污染等缺陷的影响。 用基因工程重组人血清白蛋白（rHSA）替代HSA是国际上公认的最有前途的高新技术途径。 一．什么是重组人血白蛋白 1.定义 通过基因重组的技术将目的蛋白的基因克隆后，将该基因插入到某种生物（如细菌、酵母、植物，哺乳动物细胞等）中进行复制，然后收集的白蛋白称为重组人血白蛋白。 2.rHSA的等级分类 按不同的质量标准分为了培养基级、药用辅料级和药用注射级（药用级）三类，三类级别的重组人血白蛋白生产工艺相同，但最终控制参数不同，药用级白蛋白质量标准最高。 3.rHSA的表达系统分类 白蛋白(Human Serum Albumin,HSA)是一组复杂的大分子蛋白质，必须经过正确的折叠、组装和翻译后修饰，才能赋予其特定的结构和功能，表达系统是重组人血白蛋白生产过程中极其重要的环节。 （1）原核表达系统 HSA基因最早就是在原核生物大肠杆菌(E.coli)中表达成功的，Lawn等于1981
年首次报道了rHSA的cDNA序列并首次构建了第一个表达rHSA的表达载体pHSA，然后在E.coli中表达成功，表达量为细胞总蛋白的7%，但E.coli表达系统体外很难正确折叠和组装结构复杂的HAS，缺乏翻译后的修饰和加工，表达的蛋白多形成包涵体，且纯化较难，所以未能得到有生物功能的蛋白，细菌细胞壁脂多糖还会造成热反应。因为HSA在原核生物中表达量不高且分泌效果不够理想，所以研究的重点转向其在真核生物细胞中的表达。 （2）酵母表达系统 酵母作为单细胞真核生物，既具有原核生物的容易培养、生长繁殖快、相对易于进行基因工程操作等优点，还具有原核生物缺少的其他优点，如蛋白质翻译后修饰和加工以获得有生物活性的重组蛋白，表达量和分泌量较大，易于产业化培养，非常适合白蛋白及其他非糖基化血浆蛋白的大规模制备。 研究者们用到的酵母表达系统有毕赤酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)等。在酿酒酵母中，Okabayashi等通过构建在染色体LEU2和HIS4位点上整合的质粒获得能连续分泌rHSA的稳定转化株，每升培养基达到85mg rHSA。 毕赤酵母表达量和分泌量高且稳定，自身分泌蛋白量小，作为基因表达系统研究和使用的最多，已基本掌握其生长规律及大规模高密度发酵技术，被认为是最有发展前景的蛋白质生产工具之一。毕赤酵母非常适合人血白蛋白等非糖基化血浆蛋白的大规模制备，成为目前rHSA的主要表达系统。 （3）其他表达系统 作为“生物反应器”的转基因动物自1987年以来就引起学者们广泛的关注。就生产rHSA来说，最理想的表达场所是乳腺，因为乳腺是外分泌器官从而不会影响转基因动物本身的生理，表达的蛋白能经过充分的翻译后修饰加工，组织细胞密度高从而分泌水平高，目标蛋白纯化相对容易。2000年黄淑帧等通过
毕业设计（综述） 药物小分子与血清白蛋白的相互作用 申请学位：学士学位 院系：药学院 专业：药学 姓名：梅艳飞 学号：122120213 指导老师：闫苗苗 二〇一三年六月一日
目录 摘要 ................................................................. I Abstract ............................................................. II 前言 . (1) 1蛋白质与小分子物质 (2) 1.1蛋白质的定义及概述 (2) 1.2蛋白质的结构与功能 (2) 1.3血清白蛋白 (3) 1.3.1血清白蛋白的结构 (3) 1.3.2血清白蛋白的生理功能 (4) 1.4小分子物质 (5) 2药物小分子与血清白蛋白相互作用的研究方法 (7) 2.1紫外可见吸收光谱(UV-Vis)法 (7) 2.2荧光光谱法 (7) 2.3圆二色光谱(CD)法 (9) 2.4傅里叶转换红外光谱(FT-IR)法 (9) 2.5其他研究方法 (10) 3药物小分子与血清白蛋白相互作用研究的主要内容 (11) 3.1结合常数和结合位点数的确定 (11) 3.2结合位点的确定 (12) 3.3作用力类型 (12) 3.4药物小分子对蛋白质二级结构的影响 (13) 4研究意义及展望 (14) 参考文献 (15) 致谢 (18)
药物小分子与血清白蛋白的相互作用 梅艳飞 摘要:蛋白质是一切生物体内最基本的生命物质，在生物体内发挥着各种与生命活动有关的重要作用。蛋白质是遗传性状的直接表达者。因此，对蛋白质的各种研究是当前生命科学、医药学、化学等领域的前沿和热点。蛋白质是药物的一种非常重要的运输载体。药物与蛋白质的相互作用不仅影响药物在体内的分布，而且还影响药物在体内的代谢与排泄方式，研究药物与蛋白质的结合为药物分子结构与药效之间的关系提供了有利的信息。基于研究生物大分子与药物小分子相互作用的重要意义，本文对前人就这方面的研究成果进行了系统的总结，以期从中找出未来研究的突破口，从而进一步丰富生物大分子与药物小分子相互作用的研究。 关键词：药物小分子；血清白蛋白；相互作用；研究方法；研究内容
白蛋白及生理作用 □公司医学顾问李南华 众所周知，蛋白质是构成人体的基本材料，包括毛发的角蛋白、血液中的白蛋白，血红蛋白、球蛋白、骨组织中的骨胶原蛋白等，约占人体干重的一半。在这个庞大的蛋白质家族中有一种蛋白质尤为重要，常被说成是蛋白质家族中的老大，这就是血清白蛋白。 白蛋白，亦称清蛋白，广泛存在于人体的血液、淋巴、肌肉中。人体白蛋白是由氨基酸在肝细胞内合成并被分泌进入血液循环的，血浆白蛋白是血浆中数量最多、功能最复杂的一种蛋白质，它的生理作用主要体现在以下几个方面： 一、维持血浆胶体渗透压、血容量、酸碱度的恒定。 由于血清白蛋白是血浆中含量最多，分子最小、溶解度大、功能较多的一种蛋白质。因此它所提供的胶体渗透压约占血浆总胶体渗透压的80%，此外，血清白蛋白表面有大量负电荷可吸引大分子聚集于表面，对保持血容量有极其重要的作用；同时也具有组成弱酸及其相应的盐，形成缓冲对的作用，所以也有直接维持血浆和间接维持身体各部酸碱度相对稳定的作用。因而，当人体血清白蛋白降低时，就可引起组织水肿，血容量下降，血压下降，循环障碍、酸碱紊乱等系列病症。 二、运载功能 由于白蛋白分子表面带有较多的负电荷，使它可依靠静电引力与带正电荷的物质相结合，也可依靠非共价键，如氢键、疏水键等与带负电荷的物质相结合，成为这些物质在血液循环中的运输形式，如钙、锌、铜、胆红素、尿酸、脂肪酸等代谢产物；组胺、甲状腺素以及青霉素、链霉素、阿斯匹林、磺胺等药物。从而间接地起到消除黄疸，减轻痛风，降低血脂及防治动脉硬化，抗过敏，减轻甲亢症状及充分提高药效等作用。 三、营养功能
白蛋白是人体一种重要的营养物质，它在血浆中也不断地进行着代谢更新，血清白蛋白分解产生的氨基酸，可用于合成组织蛋白、氧化分解供应能量或转变成其它含氮物质。许多急慢性疾病都可引起血清白蛋白浓度降低，如果不是应急需要，可采用口服型白蛋白营养液代替输注品，其中最佳首选是紫薇星白蛋白营养液。 紫薇星白蛋白营养液 紫薇星白蛋白营养液是由广东汕头紫薇星保健品厂与北京、上海、广州等地高等医药院校、研究机构、医疗单位等多方协作研制成功的白蛋白（活力生命肽）。经数年广泛的临床使用和市场供应，大量反馈信息表明：紫薇星白蛋白营养液具有激发调动人体自身合成血清白蛋白和其它组织蛋白，酶类等功能，因而能起到改善血清白蛋白运输多种物质（营养物、代谢物、药物等）至靶器官，促进机体新陈代谢，提高细胞活力，增强体质及抗病能力的作用。 紫薇星白蛋白营养液是国家卫生部批准为“健”字号的营养保健食品。（批文：卫食健字[1997]第447号）曾于1998年10月获得“改革开放二十年中国医药卫生科技成果展”的百项成果奖，并于10月18日进入人民大会堂进行了新闻发布会，中央电视台的“中国新闻”栏目、健康报、中国中医药报等多家媒体相继给予了报导，于99年12月26日在香港荣获第二届全球华人医学大会“华佗创新发明金奖”。紫薇星白蛋白营养液何以能获得以上殊荣？其最主要的特点是： 一、细分子化，容易吸收。 日常蛋白质的来源无非是鸡、鸭、鱼、肉、蛋类食物，进入消化系统后须转变为肽及氨基酸等小分子物质后才能进入血液循环被人体利用，许多年老体弱、幼儿及患者，由于消化功能障碍，对这些食物中的蛋白质吸收率较低，而紫薇星白蛋白营养液是根据卵清白蛋白与血清白蛋白氨基酸相同、含量相近，利用高科技酶解而成，富含18种氨基酸和多种活性多肽，吸收率近达100%。特别适宜消化功能障碍者服用。 二、安全无毒，使用方便。
四经验交流四肝硬化患者血小板与血清前白蛋白联合检测的分析 戴宏华 ?摘要?一目的一分析肝硬化患者血小板与血清前白蛋白检测的意义三方法一采用日本光电MEX- 7222K全自动五分类血液分析仪检测82例来自我院2010年9月至2012年9月传染科肝硬化患者血小板 4项参数(PLT二MPV二PDW二PCT),用透射免疫比浊法检测血清白蛋白(PA)并与70名正常对照组进行比 较三结果一肝硬化患者的PLT二PCT和PA较正常对照明显降低,差异具有统计意义(P<0.01?;MPV及 PDW明显升高与正常对照差异有统计意义(P<0.01?三并且随着Child-Pugh分级的增加PLT,PCT及PA 降低程度更加明显三结论一血小板4项参数对评估肝硬化的严重程度及出血倾向有重要意义,血清前白 蛋白PA异常变化可反映肝脏损伤程度对肝硬化患者的临床诊断二治疗具有一定的参考价值三 ?关键词?一肝硬化;一血小板;一血清前白蛋白 Clinical significance of the platelet test and the elevated serum PA forpatients with Liver cirrhosis一DAI Hong-hua.一Department of clinical laboratory,Hospital of traditional Chinese medicine,Jurong,Jiangsu,212400, China ?Abstract?一Objective一To analyse the clinical significance of platelet and PA test for patients with liver cirrhosis.Methods一Levels of platelet(PLT),mean platelet volum(MPV),platelet distribution width(PDW), plateletcrit(PCT)for82patients with liver cirrhosis,those whowere selected as the research objectfrom June2010 to June2012in our hospital,were tested by using Japanese photoelectric MEK-7222K automatic five classification blood analyzer.The level of serum prealbumin was detected by transmissionimmunoturbidimetry method.And compared the levels with the control group.Results一The levels of PLT,PCT,PA of patients with liver cirrhosis were significantly reduced and the levels of MPV,PDW of patients with liver cirrhosiswere significantly increased compared with control group(P<0.01).The levels of PLT,PCT,PA of patients with liver cirrhosisdecreased significantly as the Child-pugh degreeraised.Conclusions一The detection of PLT,PCT,PA had great significance for evaluation of cirrhosis severity and bleeding tendency.And levels of PA in serum could reflect the condition of liver damnification,and helpful for clinical diagnosis and treat for patients with liver cirrhosis. ?Key words?一Liver cirrhosis;一Platelet;一PA 一一肝硬化是一种常见的由不同原因引起的以肝组织弥漫性纤维化二假小叶和再生结节形成的慢性肝病三该病后期会出现不同程度的门静脉高压和肝功能障碍,直至出现消化道出血及肝性脑病而导致死亡三我国肝硬化发病率占同期住院患者总数的1%左右,严重影响患者的生命健康三血小板参数为临床肝硬化患者出现不良进展如出血及预后的主要指标[1]三本研究通过Child-Pugh各级与PLT四项参数及血清前白蛋白(PA)关系的研究,探讨在不同程度肝脏功能的肝硬化患者血小板减少及血清前白蛋白下降的情况三对防止可能出现的出血二指导治疗及其预后都具有预后都具有十分重要的意义,同时也可作为肝功能损害程度评估的一项参考指标三现报道如下三 一二资料与方法 1.一般资料:选取我院2010年9月至2012年9月传染科门诊及住院的肝硬化患者82例,男性51例,女性31例三全部患者均符2009年版‘传染病诊断标准汇编“的诊断标准三全部病例排除自身免疫病二血液病二血小板疾患二重要脏器病变二未使用对血小板有影响的药物三将患者分为三组:肝硬化A级组(41例),肝硬化B级组(25例),肝硬化C级组(16例)三另选取同期进行体检者70例作为对照组,无肝病 一一作者单位:212400江苏,句容市中医院检验科及血液系统疾病,均为体检健康者为研究对象,其中男41例,女29例,年龄18~72岁,平均年龄为45岁三 2.方法:PLT参数采用日本光电MEK-7222K全自动五分类血液分析仪及配套试剂,清晨空腹静脉血1~2ml,加入EDTA-K2抗凝管内,混匀按仪器操作要求进行测定,得到PLT二PCT二MPV二PDW相应的结果三血清前白蛋白(PA)采用免疫比浊法仪器为VITALAB selectra E全自动生化分析仪,试剂由上海生物制品研究所提供三所有标本于2h内测试完毕三 3.统计学处理:用SPSS13.0统计软件三计量资料以(?x?s)表示,组间用t检验比较,以P<0.05为差异有统计学意义三二二结果 肝硬化组PLT二PCT两项指标和PA值降低,MPV二PDW 两项指标升高与健康成人组比较差异有统计学意义(P <0.01)三如表1随着Child-Pugh分级的增加PLT及PA下降程度越来越加重(P<0.01)三见表2三 一一讨论一本研究结果显示82例肝硬化患者的血小板功能均存在不同程度的改变,而且随病情的进展和加重及严重出血,血小板的4项指标都会发生明显变化三血小板4项指标的变化表明肝硬化患者血小板不但数量减少,而且功能也存在异常三肝硬化患者变化更为显著,特别是PLT和PCT二者 万方数据
血清白蛋白测定标准操作规程 1 检验申请 单独检验项目申请:血清白蛋白测定（缩写AＬB）;组合项目申请：血生化中肝功能测定项目组合。临床医生根据需要提出检验申请。 2 标本采集与处理 2、１标本采集 2、1、1常规静脉采血约2ml，不抗凝,置普通试管中。或采用含分离胶得真空采血管. 2、1、2检验申请单与血标本试管标上统一且唯一得标识符。 2、1、３急诊标本采集后,在检验申请单上填写标本采集时间。 2、1、４标本采集后与检验申请单一起及时运送至检验科。专人负责标本得接收并记录标本得状态，对不合格标本予以拒收。 2、1、5下列标本为不合格标本 2、1、5、1标本量不足：少于０、３ｍl得全血标本，或少于0、１ml得血清或血浆。 2、1、5、2对反应吸光度有干扰得标本，包括严重溶血、严重浑浊得标本。 2、1、５、3无法确认标本与申请单对应关系得。 2、1、5、4其她如标识涂改、标本试管破裂等。 2、2标本保存 ２、2、１接收标本后在30min内将标本离心分离出血清。 ２、2、2标本保存时间：室温(15～２5℃)下可稳定一周,普通冰箱中(2~8℃)稳定一个月。为避免标本中水分挥发使血清浓缩,对保存时间超过1天得标本均加塞密闭或覆盖湿巾。 2、2、３已完成测试得标本保持完整得识别号，置4~8℃冰箱内保存7天。 ２、3标本采集得注意事项 ２、3、1采血前使受检者保持平静、松弛与空腹状态。
2、３、2不建议采集抗凝血标本，如果必须使用血浆，推荐得抗凝剂就是肝素。 3 方法原理 血清中得白蛋白与溴甲酚绿在PＨ=４、２得条件下结合生成绿色复合物，溶液由黄色变为绿色,其颜色深浅与白蛋白浓度成正比，通过在630nｍ处测定其吸光度可得出白蛋白得含量。 ＰＨ=4、２ 白蛋白 + 溴甲酚绿－—---——-－-－－－-- 绿色复合物 ４试剂及其她用品 4、1试剂：溴甲酚绿法测定白蛋白试剂盒，由北京利德曼生化技术有限公司出品. ４、２试剂盒保存：保存于2～８℃,不开盖情况下至标签得失效期.开盖后放于仪器得冰箱中至少稳定14天。开盖后避免污染。变质指示：当试剂有浊度时，表明有细菌污染,不能继续使用。 4、３试剂盒准备：液态单试剂型，即开即用,无特殊准备 4、4试剂盒主要成分:缓冲液(pH 4、2）50 mmol/L,溴甲酚绿0、25 ｍｍol/L,其中含有稳定剂与保护剂〈0、1%. 5 校准品与校准模式 ５、1校准品: Bｅcｋman—Ｃouｌｔeｒ SＹNCHRＯN LX ＭULTI 校准液（P/N ４４2６０0)，其白蛋白浓度值可溯源至美国国家标准技术研究所（NIST)标准参考材料。 5、2校准类型与校准点数目:线性模式，1个校准点。 5、3校准周期:校准间隔时间不限。但在：①更换试剂批号或出现质控漂移时；②仪器进行全面保养后；③仪器得重要零件更换后；均须进行一次校准。 5、４校准液重建方法:Ｂeckｍan-Coulｔer SYＮCHRON LX MULTI 校准液即开即用,无需特殊准备. 6 质控品与室内质控规则
(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910276004.5 (22)申请日 2019.04.08 (71)申请人 北京蛋白质组研究中心 地址 102206 北京市海淀区中关村生命科 学园生命园路38号 (72)发明人 钱小红 张养军 余谦 张普民 高方圆 焦丰龙 夏朝双 张汉卿 (74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人 关畅 (51)Int.Cl. C07K 14/765(2006.01) C07K 1/36(2006.01) C07K 1/18(2006.01) C07K 1/20(2006.01) C07K 1/30(2006.01) (54)发明名称 一种重组人血清白蛋白的分离纯化方法 (57)摘要 本发明公开了一种重组人血清白蛋白的分 离纯化方法。该方法首先采用热乙醇沉淀法从转 基因猪血浆中对重组人白蛋白进行粗提纯，再利 用两种色谱方法以串联方式进一步精纯化，即先 用阴离子交换色谱法进行第一步精纯化，再采用 反相色谱法或者凝胶色谱法进行二次精纯化。结 果表明，本发明能从转基因猪血浆中分离纯化出 高纯度的重组人血清白蛋白，并有望替代人血清 白蛋白用于临床用药和生化研究中。权利要求书2页 说明书5页 附图3页CN 109810185 A 2019.05.28 C N 109810185 A
权 利 要 求 书1/2页CN 109810185 A 1.一种对含有重组人血清白蛋白的血浆中的重组人血清白蛋白进行分离纯化方法，包括： 1)去除含有重组人血清白蛋白的血浆中的凝血因子和纤维蛋白原后，将所得血浆上清液用热乙醇沉淀法进行粗提纯，得到rHSA粗提取液； 2)将所述rHSA粗提取液脱盐浓缩后，用阴离子交换色谱柱洗脱，收集洗脱液即为第一步精纯化rHSA溶液； 3)将所述第一步精纯化rHSA溶液脱盐浓缩后，用反相色谱柱或凝胶色谱柱进行二次精纯化，即得到rHSA溶液，完成所述重组人血清白蛋白的分离纯化。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述含有重组人血清白蛋白的血浆按照如下步骤制得：对含有重组人血清白蛋白的血进行血浆抗凝处理后离心，收集上清液而得； 具体的，所述血浆抗凝处理步骤中，所用抗凝剂为柠檬酸钠水溶液；所述含有重组人血清白蛋白的血与抗凝剂的体积比为15:1～20:1；所述抗凝剂的浓度为70g/L～90g/L； 所述离心步骤中，离心力为1500-2500×g；具体为2000×g；时间为20-40min；具体为30min。 3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)去除含有重组人血清白蛋白的血浆中的凝血因子和纤维蛋白原的方法包括：将所述含有重组人血清白蛋白的血浆冷冻沉淀，解冻后离心，收集上清液，即为所述血浆上清液； 具体的，所述冷冻沉淀步骤中，温度为-30--10℃；具体为-20℃； 所述解冻步骤中，温度为0-10℃；具体为4℃； 所述离心步骤中，离心力为4500-5500×g；具体为5000×g；时间为10-20min；具体为15min。 4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤1)热乙醇沉淀法包括：将所述血浆上清液与由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液混匀后，调节pH至 5.0～7.0，在55℃～80℃，恒温保持20～60min，冷却至室温后调节pH至4.0～5.0，静置，一次离心，收集上清，淋洗所得沉淀，再进行二次离心，收集上清，合并两次上清，即为所述rHSA粗提取液。 5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述蛋白保护剂为辛酸钠；所述辛酸钠在由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液中的浓度为5～10g/L； 所述变性剂为有机溶剂；具体为乙醇；所述氯化钠在由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液中的浓度为5～9g/L；所述由蛋白保护剂、变性剂、氯化钠和水组成的混合液的体积用量与所述血浆上清液相同； 所述变性剂的用量为所述血浆上清液体积的8％～12％； 所述静置步骤中，温度为室温；时间为1-3h；具体为2h； 所述淋洗步骤中，所用淋洗液为pH值为4.8的蒸馏水； 所述一次离心和二次离心步骤中，离心力为4500-5000×g；具体为5000×g；时间为50-70min；具体为60min。 6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所用流动相A为0.02mol/L Tris-HCl，流动相B为0.02mol/L Tris-HCl+0.3mol/L NaCl； 所用阴离子交换色谱柱为DEAE弱阴离子交换色谱柱；流速为1mL/min；柱温为室温；检 2
前白蛋白测定试剂盒(免疫比浊法)标准化操作规程 1 目的 规范实验室操作，保证检验工作顺利有效进行特制定此规程。 2 授权操作人经培训且考核通过的实验室检验人员。 3 适用范围本试剂适用于体外定量检测人血清中前白蛋白的浓度。 4 检验方法 本试剂盒采用免疫透射比浊法测定人血清中前白蛋白的浓度。 5 检验原理 样本中前白蛋白与抗体结合产生免疫复合物的浊度，根据浊度的高低与样本中前白蛋白的含量成正比。在340nm处测定吸光度的变化值，即可计算出样本中前白蛋白的含量。 6 标本要求 6.1标本类型: 新鲜血清标本，避免溶血。 6.2标本运输: 室温条件下运输。 6.3标本保存: 若不能及时测定，请尽快置于-20℃保存，避免反复冻融。 7 试剂及配套品 7.1试剂来源 长春迪瑞医疗科技股份有限公司前白蛋白测定试剂盒 7.2试剂组成 7.3试剂的稳定性与贮存 在2℃～8℃条件下，干燥、避光、密封贮存，有效期12个月；启用后在2～8?C可稳定30天，试剂不可冰冻。 8 实验仪器及性能指标 8.1 实验仪器 迪瑞CS系列全自动生化分析仪 8.2试剂性能指标 8.2.1 空白吸光度：A≤0.30。 8.2.2分析灵敏度：测试30 mg/dL被测物时，吸光度变化△A≥0.015。 8.2.3 线性范围：11mg/dL～56mg/dL，线性相关系数r值≥0.9900；[11，19] mg/dL
区间内，线性绝对偏差应不超过±3.36mg/dL；（19，56] mg/dL区间内，相对偏差不超过±15％。 8.2.4 准确度：相对偏差应在±20%范围内。 8.2.5 测量精密度： 重复性：CV≤7.0%。 批间差：R≤8.0%。 8.2.6空白限≤11.00mg/dL。 9 校准 9.1校准品 前白蛋白校准品 9.2校准品存贮及使用注意事项 参见前白蛋白校准品使用说明书。 9.3 校准程序 建议使用试剂盒配套的校准品：进行5点校准测定，测定后仪器自动拟合成校准曲线。当试剂批号更换或质控失控时，需要重新校准。 10 质量控制 10.1质控品 前白蛋白质控品 10.2质控品存贮及使用注意事项 参见前白蛋白质控品使用说明书。 10.3质量控制 建议使用迪瑞公司质控品，进行质量控制。实验室应自行建立质控区间和限值，若质控值失控，应采取纠正措施。 11操作程序 11.1试剂配制 试剂1和试剂2均为液体试剂，可直接使用。 11.2 项目参数： 11.3 样本测试步骤：
转基因水稻大规模生产重组人血清白蛋白 由武汉大学生命科学院教授、武汉禾元生物科技有限公司董事长杨代常领衔的研发团队从2006年开始进行植物源替代血浆来源的医药蛋白的 研究与开发，现已取得突破性进展并已跨入规模化生产的阶段，填补了国际上此项技术空白。相关论文于2011年10月31日在线发表于《美国 科学院院报》。该论文在线之际，受到国外Scientist ，Nature news, The Australian, Thomson Reuters, Fox News, Agence France Presse (AFP法新社)等美国、英国、俄罗斯、德国、巴西、印度各专业杂志及媒体的广泛关注和报道。 该研究表明由转基因水稻种子生产的重组人血清白蛋白(OsrHSA)在生理生化性质、物理结构，生物学功能、免疫原性与血浆来源的人血清白 蛋白一致；并建立了大规模生产重组人血清白蛋白的生产工艺，获得了高纯度和高产量重组人血清白蛋白产品。利用大量数据证明了转基因 水稻种子可取代现有基于发酵的表达技术来生产重组蛋白质是经济有效的。正如PNAS 审稿人对该文章的评价：“这篇文章解决了在科学上振 奋人心、在经济上都非常重要的议题－－即用转基因植物生产血浆产品或其他蛋白产品的技术平台，可代替其他基于发酵的表达技术，其重 要性也不言而喻……这篇文章近乎完美地证实了植物生产的医药蛋白和批准临床使用的血浆来源医药蛋白是完全相同的，并提供了翔实数据 证明植物系统规模化容易和成本优势。” 目前，人血清白蛋白(human serum albumin)广泛应用于临床治疗和细胞培养领域。常见的人血清白蛋白大多数从人的血浆中提取，这样的生 产方式不仅受到血浆供应的限制，而且还具有携带病毒传播的高风险性。国际上以重组人血白蛋白替代血源产品的应用已成为趋势，国内市 场需求也逐年扩大，2010年已达150吨。尽管市场广阔，但高纯度重组人血白蛋白的规模化生产技术和质量控制技术却是世界性难题。武汉禾 元历经多年的技术攻关，利用水稻胚乳表达技术平台，研发出国际先进水平的重组人血白蛋白产品生产技术，并成功实现重组人血白蛋白规 模化和产业化，完全摆脱了相关制约，具有纯度更高、无动物组分、安全、高效、绿色环保、廉价、无限量供应等优势。随着植物源重组人 血清白蛋白的发展，我国人血清白蛋白日益紧张的局面必将得到缓解。
人前白蛋白(PA)检测试剂盒(透射比浊法) 简介： 前白蛋白(prealbumin ，PA)相对分子量54000万，由肝细胞合成，电泳时迁移在白蛋白之前，故得此名。测定血清前白蛋白(prealbumin ，PA)大多采用免疫化学技术，常用的方法有免疫单扩散法、散射比浊法、透射比浊法。免疫单扩散法虽然简便易行不需要特殊设备，但费时，精密度和准确性不佳。散射比浊法灵敏度高，但需要特殊蛋白分析仪。 Leagene 人前白蛋白(PA)检测试剂盒(透射比浊法)其检测原理是PA 与抗PA 抗体在液相中反应生成PA 抗原抗体复合物，使反应液呈一定浊度。当一定量抗体存在时，浊度与PA 的含量呈正比，利用透射浊度法与相同处理的PA 标准比较，求得样本中PA 的含量。本试剂盒专门用于人血清、血浆、组织样本中的前白蛋白含量测定，特别适用血清和血浆样本。本试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。 组成： 自备材料： 1、 分光光度计或酶标仪 2、 离心管、小试管或96孔板 3、 恒温箱 操作步骤(仅供参考)： 1、 TP 测定操作：分光光度计手工或半自动生化分析仪检测，按下表依次加入试剂： 2、 混匀,孵育。 3、 分光光度计测定吸光度。以空白管调零，读取标准管和各待测管的吸光度。 编号 名称 TC068550T Storage 试剂(A): PA 标准液(400mg/L) 0.2ml -20℃ 试剂(B): PA 抗体工作液 50ml -20℃ 试剂(C): PA 生理盐水 1ml RT 使用说明书 1份 空白管 标准管 待测管 PA 生理盐水(μl) 20 PA 标准液(400mg/L)(μl) 20 待测样本(μl) 20 PA 抗体工作液(ml) 1.0 1.0 1.0
人血清白蛋白(HSA)酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用 产品编号：CSB-E08970h 检测范围：78 μg/ml - 5000 μg/ml 最低检测限：19.5 μg/ml 特异性：本试剂盒可同时检测天然或重组的人HSA，且与其他相关蛋白无交叉反应。 有效期：6个月 预期应用：ELISA法定量测定人血清、血浆、细胞培养上清或其它相关生物液体中HSA含量。 说明 1．试剂盒保存：-20℃（较长时间不用时）；2-8℃（频繁使用时）。 2．浓洗涤液低温保存会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。 3．中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。 4．刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。 实验原理 用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被抗HSA抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗HSA抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的HSA呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。 试剂盒组成及试剂配制 1.酶联板(Assay plate )：一块（96孔）。 2.标准品（Standard）：2瓶(冻干品)。 3.样品稀释液(Sample Diluent)：1×20ml/瓶。 4.生物素标记抗体稀释液（Biotin-antibody Diluent）：1×10ml/瓶。 5.辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液（HRP-avidin Diluent）：1×10ml/瓶。 6.生物素标记抗体（Biotin-antibody）：1×120μl/瓶（1：100） 7.辣根过氧化物酶标记亲和素（HRP-avidin）：1×120μl/瓶（1：100） 8.底物溶液（TMB Substrate）：1×10ml/瓶。 9.浓洗涤液（Wash Buffer）：1×20ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 10.终止液（Stop Solution）：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 需要而未提供的试剂和器材 1.标准规格酶标仪 2.高速离心机 3.电热恒温培养箱 4.干净的试管和Eppendof管 5.系列可调节移液器及吸头，一次检测样品较多时，最好用多通道移液器 6. 蒸馏水，容量瓶等 标本的采集及保存 1.血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可
1 测定方法 免疫比浊法。 2 测定原理 血清前白蛋白（Prealbumn，PA）与试剂中包被有抗PA抗体的胶乳颗粒相结合，与之发生凝集形成不溶性免疫复合物，使反应液产生混浊，PA的浓度与胶乳颗粒的凝集形成的浊度成正比。 3 标本 血清及肝素-Li,Na,K/EDTA-K抗凝血浆，处理方法见标本准备。 稳定性：2 - 8℃ 3天 -20℃ 6个月 4 试剂 4.1试剂 来源：ROCHE配套试剂（详见试剂说明书）。 贮存条件及稳定性：未打开试剂盒：2－8℃储存至效期末 R1：打开后机上稳定90天 R2：打开后机上稳定90天 准备：直接使用。 4.2 校准物 来源：ROCHE配套校准物,符合WHO标准，具体如下： S1:0.9%NaCl S2:C.f.a.s 批特异的定标液的靶值乘以下列的转换因子，用来计算定标曲线。 S2:0.125 S5:1.000 S3:0.250 S6:2.276 S4:0.500 定标频率：A 试剂批号更换后 B 由质控结果决定 4.3 质控物 来源：Precinorm protein (罗氏蛋白正常值质控) Precipath protein (罗氏蛋白病理值质控) 其它适合的质控品 贮存条件：置2-8℃冰箱至有效期。 准备：质控品应该进行1+7倍稀释后使用。 5 仪器 ROCHE MODULAR P生化分析仪。 6 上机操作 见仪器作业指导书。 7 参考范围 20-40mg/ml 8 性能指标 本法线性范围为3-80mg/dl ，灵敏度为1.5mg/dl。 9临床意义 前白蛋白是一种富含色氨酸的蛋白质，它在肝脏细胞中合成，分子量约为55 000道尔顿。当PH为8.6时，虽然相对于Albumin的含量只有2.5%,,但是因为其阳极扩散率较高，