实验四电镜切片制作与观察
实验目的
?了解扫描电镜生物样品的常规制备技术，重点掌握样品的表面处理方法，临界点干燥仪和离子溅射仪的结构与工作原理。
?了解生物样品超薄切片的一般制备技术，重点掌握包埋与聚合、玻璃刀的制作、修块、铜网及其支持膜、切片厚度判断等。
?了解H-7000透射电镜的结构及其工作原理，重点是镜筒系统。
实验原理
1、电子束的特点
穿透能力有限，不超过100nm。
2、电子成像机制
电子成像的反差主要源于样品散射电子能力的
差异。
3、生物样品的特点
含水量高、质地柔软、对热和电子束敏感，散射
电子的能力弱且差异小。
4、扫描电镜及常规扫描电镜生物样品制备技术
（1）扫描电镜
扫描电镜是一种利用电子束扫描样品表面从而
获得样品信息的电子显微镜。扫描电镜由三大部分组成：真空系统，电子束系统以及成像系统。
（2）扫描电镜样品制备要求
扫描电镜以观察样品的表面形态为主。
扫描电镜样品的制备，必须满足以下要求：保持完好的组织和细胞形态；充分暴露欲观察的部位；良好的导电性和较高的二次电子产额；保持充分干燥的状态。
（3）扫描电镜样品制备流程
某些含水量低且不易变形的生物材料，可以不经固定和干燥而在较低加速电压下直接观察，如动物毛
发、昆虫、植物种子、花粉等。
对大多数的生物材料，则应首先采用化学或物理方法固定、脱水和干燥，然后喷镀碳与金属以提高材料的导电性和二次电子产额。具体步骤包括：取材、清洗、固定、脱水、干燥（置换）、粘托、导电处理等。
5、透射电镜及超薄切片制备技术
（1）透射电镜
透射电镜是利用透射电子成像的电子显微镜。
透射式电子显微镜的总体结构包括镜体和辅助系统两大部分，镜体部分包含：照明系统（电子枪和聚光镜）、成像放大系统（样品室、物镜、中间镜和投影镜）、观察记录系统（观察室、照相室）。辅助系统包含：真空系统（机械泵、扩散泵和真空阀）、电路系统（电源变换和调整控制）、水冷系统。
（2）透射电镜样品制备要求
样品彻底干燥、要提高样品反差、样品要薄。
（3）超薄切片制备技术
由于一般透射电镜的电子束穿透能力较弱，必须把标本切成厚度小于100nm的薄片，这种薄片称为超薄切片，超薄切片的厚度通常为50-70nm。
超薄切片的制作流程与石蜡切片类似，包括取材、固定、脱水、渗透、包埋、聚合、修块、切片、染色等步骤。
实验步骤
1、常规扫描电镜样品制备技术
（1）基本方法
（2）样品观察面的处理方法
?一般表面处理方法
?样品断裂面处理方法
（3）干燥的干燥方法
?自然干燥法
?真空干燥法
?冷冻真空干燥法
?临界点干燥法（临界点干燥仪）
（4）样品的导电处理
?真空镀膜法
?离子溅射镀膜法（离子溅射仪）
?组织导电技术
2、超薄切片制备技术
（1）、基本方法
取材→漂洗（生理盐水→前固定（ 2.5% 戊二醛，4o C 冰箱2 小时以上）→漂洗（0.1M 磷酸缓冲液/ 3 次/ 45 分钟）→后固定(1% 锇酸1 小时左右) →漂洗（0.1M 磷酸缓冲液/3 次/45 分钟）→梯度脱水→浸透、包埋聚合→超薄切片→饱和醋酸铀染色30分钟，柠檬酸铅染色5-8分钟。
透射电镜样品制作操作流程图
（2）半薄切片
?玻璃刀
?半薄切片机
?修块
（3）超薄切片
?工具：超薄切片机、钻石刀、水槽
?超薄切片流程：切片→捞片→拨片→载网
?切片厚度（切片干涉色）
?载网
样品
?支持膜
（4）电子染色
?醋酸双氧铀染色及铀污染
?柠檬酸铅染色及铅污染
3、H-7000型透射电子显微镜的主要结构
（1）镜筒结构
（2）电子光学系统
在这个系统中，主要包括共用电源、高压电源、透镜电源、
束偏转电源、控制电路、相机电源以及CRT显示电路。
（3）真空系统和冷却系统
H-7000透射电镜的真空系统是有两套真空线路构成的，因此，它拥有两套抽真空设备，即两三台油旋转泵和两台油扩散泵；其他组成部分包括：真空管道、预抽管道、预抽室(胶片干储装置)、潘宁规(PE)、普拉宁规(PL)、抽真空指令装置和保险装置。
冷却系统包括：冷却水循环装置和整机冷却管道。
4、上机操作
观察到的视野
电子控制系统真空系统
实验结论
思考题：
1、对比石蜡切片制作，描述常规扫描电镜生物样品制备流程、透射电镜超薄切片制作流程。
扫描电镜生物样品主要分两大类，一类为含水量少的硬组织，如毛发、牙齿及植物的花粉、孢子、种子等。此类样品一般含硅质、钙质，角质，砝琅质和纤维素等成份，所以通常只经过表面清洁、装台(粘胶)、导电处理等简单过程即可进行观察。如要观察其断面或内部结构时，经断裂、解剖或酶消化、蚀刻等再装台、镀膜处理，即可进行观察拍照。另-类为含水分较多的软组织，如大多数的动植物器官、组织及细菌等均属此类。对于此类样品，在金属镀膜前，一般都需经过固定、脱水、干燥等处理，如不经处理或处理不当，就会造成样品损伤和变形，出现各种假像，因此对每一处理步骤都应给予重视。
超薄切片技术由于电镜产生的电子束穿透能力很弱，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步骤。
2、生物样品超薄切片制备过程中的难点操作有哪些？
(1)取材:
快;组织块要小,使电子束可以穿透;低温操作,减缓自溶性改变;避免损伤.
(2)固定
固定是生物电镜术中最重要的一步,又有许多因素需要注意,如固定液的pH/浓度/渗透压/固定方式/温度/组织块大小等.固定的好坏又影响细胞精细结构的保存,只有良好的固定才能获得真实的形态学图像.
(3)脱水
少量多次使样品完全干燥。
(4)渗透与包埋
包埋剂要有适当粘度，能迅速而均匀地渗入标本，便于操作；能与脱水剂完全混溶；聚合要充分、均匀且聚合前后体积变化极小，以保证细胞精细结构不受损害；有良好的切割性能，便于操作；耐受高速电子束轰击，性能稳定；电镜下不显示细微结构，保证电镜图像的真实性。
(5)支持膜的制作
耐高温、无磁性；平整；网孔要多，孔间距要小；廉价。
(6)超薄切片机的正确使用。
3、叙述透射电镜H-7000的工作原理。
通过电子显微镜与光学显微镜比较，便于理解其工作原理。
4、利用临界点干燥仪干燥样品时，样品盒放置滤纸的目的是什么？
滤纸的干湿状态可显示溶解置换是否充分完成。如置换不充分，重复一个浸泡和净化步骤。
5、离子溅射仪如何控制样品镀膜的厚度？
溅射是入射粒子和靶的碰撞过程。入射粒子在靶中经历复杂的散射过程，和靶原子碰撞，把部分动量传给靶原子，此靶原子又和其他靶原子碰撞，形成级联过程。在这种级联过程中某些表面附近的靶原子获得向外运动的足够动量，离开靶被溅射出来。
溅射的特点是：(1)溅射粒子(主要是原子，还有少量离子等)的平均能量达几个电子伏，比蒸发粒子的平均动能kT高得多(3000K蒸发时平均动能仅0.26eV)，溅射粒子的角分布与入射离子的方向有关。(2)入射离子能量增大(在几千电子伏范围内)，溅射率(溅射出来的粒子数与入射离子数之比)增大。入射离子能量再增大，溅射率达到极值；能量增大到几万电子伏，离子注入效应增强，溅射率下降。(3)入射离子质量增大，溅射率增大。(4)入射离子方向与靶面法线方向的夹角增大，溅射率增大(倾斜入射比垂直入射时溅射率大)。
(5)单晶靶由于焦距碰撞(级联过程中传递的动量愈来愈接近原子列方向)，在密排方向上发生优先溅射。(6)不同靶材的溅射率很不相同。
6、描述通过透射电镜荧光屏看到的的海参上皮细胞。
细胞质
细胞核
细胞膜
（海参上皮细胞×6000）
海参上皮细胞细胞形状不规则，略呈圆形。细胞核大较为松散；细胞质中细胞器含量较多，如线粒体和淀粉粒。内有脂类空泡，细胞连接不明显。
注意事项：
1.机枪必须检查各辅助设备是否正常，包括检查空气压缩机、循环冷却器、稳压电源、共有电源。特别应注意检查共用电源上的开关。
2.开机前须先打开循环冷却书器和稳压电源开关，确认仪器工作正常。
3.开机前确认全部阀门控制开关均处于EV AC的位置。
4.真空度知识低于10-5Torr时，不得开机。
5.更换样品（铜网）时，切记关闭灯丝电流。
6.开机程序切记：①关闭灯丝电流；②关闭高压；④退出样品；⑤关闭稳压电源及循环冷却水开关。
7.上机人员必须经严格训练或在管理人员指导下工作。