分子生物学前沿技术 The Standardization Office was revised on the afternoon of December 13, 2020
激光捕获显微切割Laser capture microdissection (LCM) technology是在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞，通常用于从中精确地分离一个单一的细胞。 背景：机体组织包含有上百种不同的细胞，这些细胞各自与周围的细胞、基质、血管、腺体、炎症细胞或相互粘附。在正常或发育中的组织器官内，细胞内信号、相邻细胞的信号以及体液刺激作用于特定的细胞，使这些细胞表达不同的基因并且发生复杂的分子变化。在状态下，如果同一类型的细胞发生了相同的分子改变，则这种分子改变对于疾病的发生可能起着关键性的作用。然而，发生相同分子改变的细胞可能只占组织总体积的很小一部分；同时，研究的目标细胞往往被其它组织成分所环绕。为了对疾病发生过程中的组织损害进行分子水平分析，分离出纯净的目标细胞就显得非常必要。1996年，美国国立卫生院（NIH）国家肿瘤研究所的[2]开发出激光捕获显微切割技术（Laser capture microdissection ， LCM ），次年，美国Arcturus Engineering公司成功研制激光捕获显微切割系统，并实现商品化销售。应用该技术可以在显微镜直视下快速、准确获取所需的单一细胞亚群，甚至单个细胞，从而成功解决了组织中细胞异质性问题。这项技术现已成为美国“肿瘤基因组解剖计划”的一项支撑技术[1]。 原理：LCM的基本原理是通过一低能脉冲激活热塑膜———乙烯乙酸乙烯酯（ethylene vinylacetate，EVA）膜（其最大吸收峰接近
分子生物学的应用及发展 摘要：本文在文献检索的基础上，对分子生物学的发展简史，基本原理，研究领域等作了简单介绍，阐述了分子生物学在人们日常生活中的应用并结合药学专业着重讨论了其在药学及中药开发发面的应用，并进一步对分子生物学未来的研究技术、方向和前景做了展望。 一前言 生物以能够复制自己而区别于非生物。生命现象最基本的特征是进行“自我更新”。进行“自我更新”体现了一种最高级和最复杂的运动状态。这种运动就是生物机体从环境中摄取物质和能量，以更新本身的物质组成，而山现生长、繁殖，在这样的过程中保证了将自身的特征传给历代；同时也不断地向环境输送一些物质和释放能量。在生物机体的组成物质中，防水分外，有各种无机盐类和各种有机化合物。其中生物大分子——核酸和蛋白质在进行自我更新运动中，以其功能的重要性占第一位。为探索生命现象的本质问题，产生了分子生物学这一学科[1]。 分子生物学(molecular biology)是从分子水平研究生命本质为目的的一门新兴边缘学科，它是研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域[2]。 分子生物学的最终目标是远大的，从产生基本细胞行为类型的各种分子的角度，来理解这五类行为类型：生长、分裂、分化、运动和相互作用。即分子生物学力图完整地描述细胞大分子的结构、功能和相互联系，从而理解细胞为什么要采取这种方式[3]。 分子生物学作为一门新兴的边缘学科。它的迅速发展及其在整个生命科学领域的广泛渗透和应用，促使人们对生物学等生命科学的认识从细胞水平进入分子水平。在农业、畜牧、林业、微生物学等领域发展十分迅速，如转基因动植物等。在医学领域，为医学诊断、治疗及新的疫苗、新药物研制等开辟了新的途径，使医学科学中原有的学科发生分化组合，医学分子生物学等新的学科分支不断产生，使医学科学发生了深刻的变革，不认识到这一点就很难跟上科学发展的步伐。 分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。 二分子生物学发展简史 分子生物学的发展大致可分为三个阶段[4-7]：
四标准与规范四 ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．０５２９?５８０７．２０１７．０３．００１ 基金项目：科技部卫生行业科研专项基金（２０１４０２００１） 执笔人：叶丰（四川大学华西医院病理研究室）；吴焕文（中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院病理科） 通信作者：梁智勇（中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院病理科，Ｅ?ｍａｉｌ：ｌｉａｎｇｚｈｉｙｏｎｇ１２２０＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ）；步宏（四川大学华西医院病理研究室／病理科，Ｅ?ｍａｉｌ：ｈｏｎｇｂｕ＠ｓｃｕ．ｅｄｕ．ｃｎ） 临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识 ‘临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识“编写组 近年二代基因测序（ｎｅｘｔ?ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ）技术快速发展，其应用已进展至临床检测，如遗传疾病二实体肿瘤二血液肿瘤二感染性疾病二人类白细胞抗原分析及非侵袭性产前筛查等三国内外有关学会已出台相关共识与指南以推动其在临床中的应用［１?４］三中华医学会病理学分会和中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会前期组织病理二临床二生物信息等专家进行了充分讨论，拟在ＮＧＳ的操作流程二数据处理二结果解读等方面作规范和建议，以规范ＮＧＳ在分子病理领域的应用三 临床分子病理实验室ＮＧＳ样本可采用甲醛固定石蜡包埋（ｆｏｒｍａｌｉｎ?ｆｉｘｅｄｐａｒａｆｆｉｎ?ｅｍｂｅｄｄｅｄ，ＦＦＰＥ）组织二新鲜组织二各种体液及其上清液二体液离心细胞蜡块二血浆／血液标本等三本共识特色是基于病理评估的组织样本（ＦＦＰＥ组织二新鲜组织）而形成的规范三测序分析范围基于目前临床需求，本共识着重于目标区域测序（ｐａｎｅｌ）分析的实践三随着技术的更新和应用的成熟，本共识将持续更新以满足临床需求三 一二实验室总体要求 ＮＧＳ检测实验室的总体设计与要求应参考‘分 子病理诊断实验室建设指南（试行）“二‘医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则“二‘个体化医学检测质量保证指南“二‘肿瘤个体化治疗检测技术指南“二‘个体化医学检测实验室管理办法“二‘测序技术的个体化医学检测应用技术指南（试行）“进行［５?７］三 １．ＮＧＳ检测人员的资质要求：ＮＧＳ检测技术人 员应具备临床病理学二分子生物学的相关专业大专 以上学历，并经过ＮＧＳ技术的理论与技能培训合格，同时具有临检中心‘临床基因扩增实验室技术人员培训合格证“三数据分析人员应具有临床医学二分子生物学或遗传学知识背景并经生物信息学培训三最终报告应由中级或硕士以上具有病理学背景二经培训合格的本单位执业医师或者授权签字人（高级职称或医学博士学位）审核三 ２.ＮＧＳ检测实验室的区域设置要求：原则上 ＮＧＳ实验室应当有以下分区：样本前处理区二试剂储存和准备区二样本制备区二文库制备区二杂交捕获区／多重ＰＣＲ区域（第一扩增区）二文库扩增区（第二扩增区）二文库检测与质控区二测序区二数据存贮区三各工作区空气及人员流向需要严格按照‘医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则“配置三分区可根据实际情况合并，但是在前处理和建库时，血液样本与组织样本分开三 ３．ＮＧＳ检测试剂及项目要求：试剂和测序平台 应选择中国食品药品监督管理总局（ＣＦＤＡ）认可产品三涉及实验室自配试剂，应该有严格的试剂制备标准操作规程（ＳＯＰ），需经过临床实验室自建项目（ＬＤＴ）验证合格才可使用三每个ＮＧＳ检测项目在验证时需要根据建库方法二测序平台和分析工具以及不同的突变类型，包括单碱基突变（ｓｉｎｇｌｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｖａｒｉａｎｔ，ＳＮＶ）二小片段插入或者缺失（Ｉｎｄｅｌ）二基因拷贝数变异（ｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒｖａｒｉａｔｉｏｎｓ，ＣＮＶ）二染色体结构变异（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｖａｒｉａｔｉｏｎ，ＳＶ）以及不同的样本类型（如ＦＦＰＥ组织二新鲜组织二全血二 胸水等）对特定ｐａｎｅｌ的准确性二精确性二敏感性二特异性等性能参数进行ＬＤＴ验证三应该有经过标准品测试的在不同的变异频率（ｍｕｔａｎｔａｌｌｅｌｅｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ，ＭＡＦ）下，不同测序深度的灵敏度及特异度数据，确定不同样本的可信的测序深度三经验证后，ＳＯＰ发生的任何改动，包括试剂二仪器二基因项目等都需要重新做验证三验证实验结果签名留底备案三 ４．ＮＧＳ检测实验室的质量管理要求：ＮＧＳ检测 万方数据
第十五期分子生物学常用技术与研究进展学习班 分子生物学实验技术是当今生命科学领域应用最广泛和最重要的手段之一，为推广分子生物学实验技术，满足临床医技人员、教学科研人员、在读研究生及其它有需要人员的要求，北京市理化分析测试中心已举办了十四期“分子生物学常用技术与研究进展学习班”，并得到了全体学员的一致好评。应广大学员的强烈要求，理化中心将于2016年11月19日至11月22日在北京开办本年度唯一一期分子生物学常用技术学习班，欢迎各位学员前来参加。本期学习班包括理论讲座与实验操作两部分内容，力求使每位学员在4天时间内都能学有所值、学有所用。 一、培训单位： 主办单位：北京市理化分析测试中心 协办单位：华斯泰生物医学科技有限公司 二、培训日程：
三、培训安排 时间：2016年11月19日-22日 地点：北京市海淀区永丰产业基地丰贤中路7号孵化楼B座四层 报到：北京康复瑞假日酒店西山店2016年11月18日14:00-18:00
四、住宿安排 1、交通、住宿、午餐及晚餐费用自理。如需会务组预定午餐，请各位学员在回执表内注明（午餐均为快餐，发票均为手撕发票）。 2、酒店预订：会务组协助提供协议酒店，但培训人员需自行预定，预定时请说明“百欧美生公司预定”即可享受协议价。 协议酒店：北京康福瑞假日酒店西山店（北京市海淀区北青路与永丰路交叉口往南800米路东），房间优惠价：单人间298元/天/间，双人标准间380元/天/间，均含早餐，电话：。 五、注册方式 1、报名时间 报名从即日起至2016年11月14日截止。为了保证教学质量，本次培训班限额40人，招满为止。 2、注册费 共计3200元/人，同一单位两人以上参会优惠至3000元/人。 3、缴费方式（电子汇款） 账户名称：北京市理化分析测试中心 账户号： 开户行：工商行紫竹院支行 汇款用途处务必请标明：学员姓名+分子培训班 4、联系人 姓名：马老师联系电话： E-mail：网站： 报名者请填写以下回执，并于2016年11月14日前E-mail至联系人邮箱。如有其它需要，请在备注中说明。
分子生物学主要研究内容 1. 核酸的分子生物学。 核酸的分子生物学研究 核酸的结构及其功能。由于 核酸的主要作用是携带和传 递遗传信息，因此分子遗传 学是其主要组成部分。由于 50年代以来的迅速发展，该 领域已形成了比较完整的理 论体系和研究技术，是目前分子生物学内容最丰富的一个领域。研究内容包括核酸/基因组的结构、遗传信息的复制、转录与翻译，核酸存储的信息修复与突变，基因表达调控和基因工程技术的发展和应用等。遗传信息传递的中心法则是其理论体系的核心。 2. 蛋白质的分子生物学。 蛋白质的分子生物学研究执行各种生命功能的主要大分子──蛋白质的结构与功能。尽管人类对蛋白质的研究比对核酸研究的历史要长得多，但由于其研究难度较大，与核酸分子生物学相比发展较慢。近年来虽然在认识蛋白质的结构及其与功能关系方面取得了一些进展，但是对其基本规律的认识尚缺乏突破性的进展。 3.细胞信号转导的分子生物学。 细胞信号转导的分子生物学研究细胞内、细胞间信息传递的分子基础。构成生物体的每一个细胞的分裂与分化及其它各种功能的完成均依赖于外界环境所赋予的各种指示信号。在这些外源信号的刺激下，细胞可以将这些信号转变为一系列的生物化学变化，例如蛋白质构象的转变、蛋白质分子的磷酸化以及蛋白与蛋白相互作用的变化等，从而使其增殖、分化及分泌状态等发生改变以适应内外环境的需要。信号转导研究的目标是阐明这些变化的分子机理，明确每一种信号转导与传递的途径及参与该途径的所有分子的作用和调节方式以及认识各种途径间的网络控制系统。信号转导机理的研究在理论和技术方面与上述核酸及蛋白质分子有着紧密的联系，是当前分子生物学发展最迅速的领域之一。 4.癌基因与抑癌基因、肽类生长因子、细胞周期及其调控的分子机理等。 从基因调控的角度研究细胞癌变也已经取得不少进展。分子生物学将为人类最终征服癌症做出重要的贡献。
病理技术的发展与现状 病理学是研究疾病发生的原因、发病原理和疾病过程中发生的细胞、组织和器官的结构、功能和代谢方面的改变及其规律。 研究方法 病理学的研究方法多种多样，研究材料主要来自自患病人体（人体病理材料）和实验动物以及其他实验材料如组织培养、细胞培养等（实验病理材料）。 （一）尸体剖检 对死亡者的遗体进行病理剖检（尸检）是病理学的基本研究方法之一。尸体剖检（autopsy）不仅可以直接观察疾病的病理改变，从而明确对疾病的诊断，查明死亡原因，帮助临床探讨、验证诊断和治疗是否正确、恰当，以总结经验，提高临床工作的质量，而且还能及时发现和确诊某些传染病、地方病、流行病、为防治措施提供依据，同时还可通过大量尸检积累常见病、多发病、以及其他疾病的人体病理材料，为研究这些疾病的病理和防治措施，为发展病理学作贡献。显然，尸检是研究疾病的极其重要的方法和手段，人体病理材料则是研究疾病的最为宝贵的材料。 （二）活体组织检查 用局部切除、钳取、穿刺针吸以及搔刮、摘除等手术方法，由患者活体采取病变组织进行病理检查，以确定诊断，称为活体组织检查（biopsy），简称活检。这是被广泛采用的检查诊断方法。这种方法的优点在于组织新鲜，能基本保持病变的真像，有利于进行组织学、组织化学、细胞化学及超微结构和组织培养等研究。对临床工作而言，这种检查方法有助于及时准确地对疾病作出诊断和进行疗效判断。特别是对于诸如性质不明的肿瘤等疾患，准确而及时的诊断，对治疗和预后都具有十分重要的意义。 （三）动物实验 运用动物实验的方法，可以在适宜动物身上复制某些人类疾病的模型，以便研究者可以根据需要，对之进行任何方式的观察研究，例如可以分阶段地进行连续取材检查，以了解该疾病或某一病理过程的发生发展经过等。此外，还可利用动物实验研究某些疾病的病因、发病机制以及药物或其他因素对疾病的疗效和影响等。这种方法的优点是可以弥补人体观察之受限和不足，但动物与人体之间毕竟存在种种差异，不能将动物实验的结果直接套用于人体，这是必须注意的。
激光捕获显微切割Laser capture microdissection (LCM) technology是在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞，通常用于从组织中精确地分离一个单一的细胞。 背景：机体组织包含有上百种不同的细胞，这些细胞各自与周围的细胞、基质、血管、腺体、炎症细胞或免疫细胞相互粘附。在正常或发育中的组织器官内，细胞内信号、相邻细胞的信号以及体液刺激作用于特定的细胞，使这些细胞表达不同的基因并且发生复杂的分子变化。在病理状态下，如果同一类型的细胞发生了相同的分子改变，则这种分子改变对于疾病的发生可能起着关键性的作用。然而，发生相同分子改变的细胞可能只占组织总体积的很小一部分；同时，研究的目标细胞往往被其它组织成分所环绕。为了对疾病发生过程中的组织损害进行分子水平分析，分离出纯净的目标细胞就显得非常必要。1996年，美国国立卫生院（NIH）国家肿瘤研究所的[2]开发出激光捕获显微切割技术（Laser capture microdissection ，LCM ），次年，美国Arcturus Engineering公司成功研制激光捕获显微切割系统，并实现商品化销售。应用该技术可以在显微镜直视下快速、准确获取所需的单一细胞亚群，甚至单个细胞，从而成功解决了组织中细胞异质性问题。这项技术现已成为美国“肿瘤基因组解剖计划”的一项支撑技术[1]。 原理：LCM的基本原理是通过一低能红外激光脉冲激活热塑膜———乙烯乙酸乙烯酯（ethylene vinylacetate，EVA）膜（其最大吸收峰
接近红外激光波长），在直视下选择性地将目标细胞或组织碎片粘到该膜上[2]。LCM 系统包括倒置显微镜、固态红外激光二极管、激光控制装置、控制显微镜载物台（固定载玻片）的操纵杆、电耦合相机及彩色显示器。用于捕获目标细胞的热塑膜直径通常为6mm，覆在透明的塑料帽上，后者恰与后继实验所用的标准 0.5ml离心管相匹配。 机械臂悬挂控制覆有热塑膜的塑料帽，放到脱水组织切片上的目标部位。显微镜直视下选择目标细胞，发射激光脉冲，瞬间升温使EVA膜局部熔化。熔化的EVA膜渗透到切片上极微小的组织间隙中，并在几毫秒内迅速凝固。组织与膜的粘合力超过了其与载玻片间的粘合力，从而可以选择性地转移目标细胞。激光脉冲通常持续0.5~5.0毫秒，并且可在整个塑料帽表面进行多次重复，从而可以迅速分离大量的目标细胞。将塑料帽盖在装有缓冲液的离心管上，将所选择的细胞转移至离心管中，从而可以分离出感兴趣的分子进行实验[3]。 EVA膜约100~200μm厚，能够吸收激光产生的绝大部分能量，在瞬间将激光束照射区域的温度提高到90°C，保持数毫秒后又迅速冷却，保证了生物大分子不受损害。采用低能量红外激光的同时也可避免损伤性光化学反应的发生。 优缺点：LCM最显著的优点在于其迅速、准确和多用途的特性。结合组织结构特点以及所需的切割精确度，通过选择激光束的直径大小，可以迅速获取大量的目标细胞。LCM与以显微操作仪为基础的显微切割技术相比[4]，具有以下优点：(1)分离细胞速度快，无需精巧的操作技能；(2)捕获细胞和剩余组织的形态学特征均保持完好，可以较
分子生物学技术的发展对现代生命科学的影响 浅谈PCR技术和克隆技术在遗传疾病诊断中的应用 姓名：李建飞 专业：植物学 学号：S110916 指导教师：周宜君
分子生物学技术的发展对现代生物科学发展的影响 分子生物学（molecular biology）是从分子水平上研究生命现象物质基础的学科。研究细胞成分的物理、化学的性质和变化以及这些性质和变化与生命现象的关系，如遗传信息的传递，基因的结构、复制、转录、翻译、表达调控和表达产物的生理功能，以及细胞信号的转导等。[1]分子生物学技术就是以分子生物学为基本知识基础，结合现代技术以研究分子水平变化的新技术，其中包括基因克隆，real-timePCR，转基因技术，SNP分析技术，RSLP分析技术，RACE技术，双向电泳技术（IEF和SDS-PAGE），质谱分析技术，western blotting，原位杂交技术，基因芯片，蛋白质组芯片，酵母单杂交、酵母双杂交技术，以及近几年来发展起来的生物信息学分析和RNAi技术。分子生物学技术发展日新月异，该技术的发展已经在整个生物学领域占据了主导作用，相关技术的应用已经成为推动相关学科发展的必要手段。分子生物学技术能有今天的地位也是取决于它研究对象的基础性和根本性。下面将谈谈分子生物学技术在现代生物科学发展的具体影响。 遗传疾病从分子水平解释,究其根源是由于与正常个体的遗传分子相比,患有遗传疾病个体的遗传物质发生了DNA序列或染色体片段上的改变。这种遗传物质上的异常在向后代传递时遵循孟德尔遗传规律而可遗传给下一代。具体讲,较常见的突变情况有如下几种:(1)染色体某个区域的缺失；(2)某个基因的部分外显子或内含子的缺失；(3)基因的单碱基突变；(4)三核苷酸重复突变；(5)基因的一部分重复转录,而导致基因产物大小的改变；(6)插入突变,从基因组其他部位的DNA片段插入到目的DNA序列内；(7)线粒体基因组的突变[2～5]。 应用分子生物学技术检测遗传疾病,又称遗传疾病基因诊断,是在分子水平上对核苷酸序列的突变进行检测,以在遗传物质的分子水平揭示疾病的发病机理和发病根源。分子生物学技术在人类遗传疾病诊断中的应用是近年来分子生物学理论和技术手段不断发展和成熟并在社会生活中逐步运用、普及的结果。一般来讲,遗传疾病的分子突变机制都比较复杂,往往包括上述的两种或两种以上的情况,如导致新生儿失盐症的212羟化酶缺乏症,可由于212羟化酶基因(P450c21) 发生缺失或基因易位插入所致[6]；杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD)是由于抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因的部分缺失和重复造成
临床分子病理实验室二代基因测序检测专家共识 近年二代基因测序（，）技术快速发展，其应用已进展至临床检测，如遗传疾病、实体肿瘤、血液肿瘤、感染性疾病、人类白细胞抗原分析及非侵袭性产前筛查等。国内外有关学会已出台相关共识与指南以推动其在临床中的应用。中华医学会病理学分会和中国抗癌协会肿瘤病理专委会前期组织病理、临床、生物信息等专家进行了充分讨论，拟在的操作流程、数据处理、结果解读等方面作规范和建议，以规范在分子病理领域的应用。 临床分子病理实验室样本可采用甲醛固定石蜡包埋组织（，）、新鲜组织、各种体液上清液、体液离心细胞块、石蜡包埋标本和血浆/血液标本等。本共识特色是基于病理评估的组织样本（、新鲜）的规范。测序分析范围基于目前临床需求，本共识着重在于目标区域测序（）分析的实践。随着技术的更新和应用的成熟，本共识将持续更新以满足临床需求。 一、实验室总体要求 检测实验室的总体设计与要求应参考《分子病理诊断实验室建设指南（试行）》、《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》、《个体化医学检测质量保证指南》、《肿瘤个体化治疗检测技术指南》、《个体化医学检测实验室管理办法》、《测
序技术的个体化医学检测应用技术指南（试行）》进行。 1检测人员的资质要求：检测技术人员应具备临床病理学、分子生物学的相关专业大专以上学历，并经过技术的理论与技能培训合格。数据分析人员应具有临床医学或分子生物学或遗传学知识背景并经生物信息学培训。最终报告应由中级或硕士以上具有病理学背景、经培训合格的本单位执业医师或者授权签字人（医学博士学位或高级职称）审核。 2检测实验室的区域设置要求：原则上实验室应当有以下分区：样本前处理区、试剂储存和准备区、样本制备区、文库制备区、杂交捕获区/多重区域（第一扩增区）、文库扩增区（第二扩增区）、文库检测与质控区、测序区、数据存贮区。各工作区空气及人员流向需要严格按照《医疗机构临床基因扩增检验实验室工作导则》。分区可根据实际情况合并，但是在前处理和建库时，血液样本应与组织样本分开。 3检测试剂及项目要求：试剂和测序平台均应选择中国食品药品监督管理总局（）认可产品。涉及到实验室自配试剂，应该有严格的试剂制备标准操作规程（），需经过临床实验室自建项目（）验证合格才可使用。每个检测项目在验证时需要根据建库方法、测序平台和分析工具以及不同的突变类型包括，单碱基突变，、小片段插入或者缺失（）、基因拷贝数变异（）、染色体结构变异，（）以及不同的样本类型（如组织、新鲜组织、全血、胸水等）对特定的准确性、精
分子生物学前沿技术
激光捕获显微切割Laser capture microdissection (LCM) technology是在不破坏组织结构，保存要捕获的细胞和其周围组织形态完整的前提下，直接从冰冻或石蜡包埋组织切片中获取目标细胞，通常用于从组织中精确地分离一个单一的细胞。 背景：机体组织包含有上百种不同的细胞，这些细胞各自与周围的细胞、基质、血管、腺体、炎症细胞或免疫细胞相互粘附。在正常或发育中的组织器官内，细胞内信号、相邻细胞的信号以及体液刺激作用于特定的细胞，使这些细胞表达不同的基因并且发生复杂的分子变化。在病理状态下，如果同一类型的细胞发生了相同的分子改变，则这种分子改变对于疾病的发生可能起着关键性的作用。然而，发生相同分子改变的细胞可能只占组织总体积的很小一部分；同时，研究的目标细胞往往被其它组织成分所环绕。为了对疾病发生过程中的组织损害进行分子水平分析，分离出纯净的目标细胞就显得非常必要。1996年，美国国立卫生院（NIH）国家肿瘤研究所的[2]开发出激光捕获显微切割技术（Laser capture microdissection ，LCM ），次年，美国Arcturus Engineering公司成功研制激光捕获显微切割系统，并实现商品化销售。应用该技术可以在显微镜直视下快速、准确获取所需的单一细胞亚群，甚至单个细胞，从而成功解决了组织中细胞异质性问题。这项技术现已成为美国“肿瘤基因组解剖计划”的一项支撑技术[1]。 原理：LCM的基本原理是通过一低能红外激光脉冲激活热塑膜———乙烯乙酸乙烯酯（ethylene vinylacetate，EVA）膜（其最大吸
分子病理诊断实验室建设指南(试行
分子病理诊断实验室建设指南（试行） 2015-09-07 来源：中华病理学杂志编辑：hanhongwei 导读 随着疾病个体化治疗的发展，分子病理诊断已越来越多地应用于临床。 中华医学会病理学分会中国医师协会病理科医师分会中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会国家卫生和计划生育委员会病理质量控制与评价中心全国分 子病理指导委员会 随着疾病个体化治疗的发展，分子病理诊断已越来越多地应用于临床。分子病理诊断主要是指基于疾病组织和细胞等标本的分子遗传学检测，用于协助病理诊断和分型、指导靶向治疗、预测治疗反应及判断预后等。分子病理诊断实验室的规范化建设包括实验室的设置和管理、人员、项目和试剂的准入、质量保证和质量控制体系的建立等多个方面，是准确实施分子病理诊断的关键环节，目前国内这一领域尚处于起步阶段，缺乏相应的准入要求。为保证我国临床分子病理诊断的质量，中华医学会病理学分会、中国医师协会病理科医师分会、中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会、国家卫生和计划生育委员会病理质量控制与评价中心、全国分子病理指导委员会联合制订分子病理诊断实验室建设指南。 一、总则 １畅本指南根据枟医疗机构管理条例枠枟医疗机构临床实验室管理办法枠枟医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法枠枟医疗技术临床应用管理办法枠和卫生部枟病理科建设与管理指南（试行）枠等［１-６］文件制定。 ２畅医疗机构应当统一管理分子病理检测项目，在规范的分子病理诊断实验室进行检测。 ３畅以科研为目的的检测项目不得向临床出具检测报告，不得向患者收取任何费用，不得作为临床诊治的依据。 二、医院准入 三级甲等医院病理科应设置分子病理诊断实验室，符合条件的其他医院也可设置。 三、人员准入
分子生物学技术在食品工业中的最新研究进展 0引言 了解食品中的微生物群落组成以及不同微生物种群之间的相互作用，对于生产出安全和高品质的食品是非常重要的。食品生产过程中相关微生物的研究通常采用培养的方法，但这种方法存在很大的局限性：①富集培养大多具有选择作用，导致不能分离出具有重要生态学作用、数量相对较少的种群，不能定量研究微生物种群的动态变化；②受到食品环境胁迫或受损的微生物细胞，通常需要特殊的培养条件才能恢复生长，导致其难以被分离。大量的研究表明，传统的微生物学培养分析方法，获得的可培养微生物种群只占微生物总量的0.1%-5%。尽管对于微生物群落结构相对简单的食品来说（如发酵食品），可培养的微生物一般占有优势，但Ampeul认为，至少有25%～50%的微生物种群不能被培养。这种缺陷促进了以聚合酶链反应(PGR)技术为基础的分子免培养方法和核酸检测技术在食品微生物研究中的应用和发展。与常规培养方法相比，分子生物学技术具有快捷、灵敏、准确等优点，而且具有更高的特异性，能够更加精确地研究生态系统中的微生物多样性及其群落组成。 微生物学家已经认识到研究微生物生态学概念和理论，对于了解食品中微生物的繁殖与生长非常重要。譬如研究微生物群落组成能够更好地了解奶酪、酸奶、香肠、葡萄酒、面包等食品的风味组成以及微生物对其储藏品质的影响；密切监测食品生产过程中微生物群落的动态变化，能够更好地了解和控制食品加工和后熟过程中的微生物作用；可以快速、准确地监测食品中可能存在病原微生物，以加强食品生产过程中的安全性等。因此，在种、菌株水平上，对食品环境中微生
物的准确监测和可靠鉴定以及微生物群落组成、动态变化的生态学研究，有助于保证食品的质量安全。与土壤、水环境等生态系统的研究相比，到目前为止，用于食品加工过程中微生物研究的分子生态学的方法还相对较少，目前使用最多的是变性梯度凝胶电泳技术。尽管如此，这些方法在食品工业中（尤其在发酵食品中）正逐渐被使用。中国的传统发酵食品行业历史悠久，品种多样，如食醋、酱油、白酒、黄酒、豆豉、腐乳、酸菜、乳酪以及发酵肉制品等。传统发酵食品工艺多为天然发酵，其微生物群落结构比较复杂，产品风味具有明显的地域性。传统的发酵行业对酿造工艺过程中的微生物群落动态变化、风味及功能性物质的形成和累积机制的研究明显滞后，对传统发酵工艺的机制缺乏深入了解。以天然的复杂菌种混合发酵工艺为主的绝大多数企业，其生产质量控制主要靠工程技术人员长期工作积累的经验来判断，难以对发酵产品品质进行稳定的控制。分子生态学技术能够对发酵过程进行定量监控，通过检测发酵过程中微生物群落的组成结构、种群动态变化情况，有助于从整体上进行全面的分析，深入认识微生物的发酵机制，并为监控和调整发酵过程奠定基础。 1 目标基因的选择 自20世纪80年代中期以来，PCR技术已成为科学家们用来研究微生物群落结构及多样性的最主要工具。一般而言，以DNA为模板，利用通用引物通过PCR 反应扩增目标基因，产生的基因序列大小相同，因此需要依据基因序列的差异来区分不同的微生物。所以，分子生态学研究的关键步骤就是选择合适的目标基因。合适的目标基因既要有保守区段，又要有可变区段。可变区段可以在不同的分类水平上区别微生物，保守区段位于可变区段两侧，用来作为引物复性结合的位点进行PCR。如果没有高度保守区域，较低保守程度的区段也可作为简单引物退火
随着疾病个体化治疗的发展，分子病理诊断已越来越多地应用于临床。分子病理诊断主要是指基于疾病组织和细胞等标本的分子遗传学检测，用于协助病理诊断和分型、指导靶向治疗、预测治疗反应及判断预后等。分子病理诊断实验室的规范化建设包括实验室的设置和管理、人员、项目和试剂的准入、质量保证和质量控制体系的建立等多个方面，是准确实施分子病理诊断的关键环节，目前国内这一领域尚处于起步阶段，缺乏相应的准入要求。为保证我国临床分子病理诊断的质量，中华医学会病理学分会、中国医师协会病理科医师分会、中国抗癌协会肿瘤病理专业委员会、国家卫生和计划生育委员会病理质量控制与评价中心、全国分子病理指导委员会联合制订分子病理诊断实验室建设指南。 一总则 １、本指南根据《医疗机构管理条例》《医疗机构临床实验室管理办法》《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》《医疗技术临床应用管理办法》和卫生部《病理科建设与管理指南（试行）》等文件制定。 ２、医疗机构应当统一管理分子病理检测项目，在规范的分子病理诊断实验室进行检测。 ３、以科研为目的的检测项目不得向临床出具检测报告，不得向患者收取任何费用，不得作为临床诊治的依据。 二医院准入三级甲等医院病理科应设置分子病理诊断实验室，符合条件的其他医院也可设置。 三人员准入 １、分子病理诊断实验室工作人员均应经过有资质的培训机构培训合格，并取得上岗证后方可上岗。 ２、实验室不得使用非本单位技术人员从事相关检测工作。 ３、实验室负责人应具有临床医学和病理专业背景、具有分子生物学相关工作经历、具有副主任医师以上专业技术职称、从事本专业的本单位在职医师，主要职责是监督实验室运行、实施质量控制、开展新项目等。 ４、授权签字人应是取得临床病理学或遗传学《执业医师资格证书》、具有中级或以上专业技术职称、从事本专业的本单位在职医师或技术人员。 ５、分子病理技术员应具备病理学、分子生物学的基本知识，大专以上学历，并进行过相关专业技术的技能培训或进修学习，获得相应的上岗资格证书。 ６、对实验室工作人员应制定工作能力评审的内容和方法，每年评审，对新进工作人员在最初6个月内应至少进行2次能力评审，保存评审记录。当职责变更时，或离岗6个月以上再上岗时，或政策、程序、技术有变更时，应对相关工作人员进行再培训和再评审。合格后才可继续上岗，并记录。 四实验室的设置要求分子病理诊断实验室应根据开展的项目进行相应实验室或实 验区的设置，实验室设置能满足检测要求。最常用的设置如下：
第0 章绪论 一、名词解释 1 .分子生物学 2 .单克隆抗体 二、填空 1．分子生物学的研究内容主要包含（）、（ ）、 （）三部分。 三、是非题 1、20 世纪60 年代，Nirenberg 建立了大肠杆菌无细胞蛋白合成体系。研究结果 发现poly（U）指导了多聚苯丙氨酸的合成，poly（G）指导甘氨酸的合成。（×） 四、简答题 1. 分子生物学的概念是什么？ 2. 你对现代分子生物学的含义和包括的研究范围是怎么理解的？ 3. 分子生物学研究内容有哪些方面？ 4. 分子生物学发展前景如何？ 5. 人类基因组计划完成的社会意义和科学意义是什么？ 6．简述分子生物学发展史中的三大理论发现和三大技术发明。 7. 简述分子生物学的发展历程。 8. 二十一世纪生物学的新热点及领域是什么？ 9. 21 世纪是生命科学的世纪。20 世纪后叶分子生物学的突破性成就，使生命科 学在自然科学中的位置起了革命性的变化。试阐述分子生物学研究领域的三大基 本原则，三大支撑学科和研究的三大主要领域？
答案： 一、名词解释 1 .分子生物学：分子生物学就是研究生物大分子之间相互关系和作用的一门学 科，而生物大分子主要是指基因和蛋白质两大类；分子生物学以遗传学、生物化 学、细胞生物学等学科为基础，从分子水平上对生物体的多种生命现象进行研究。 2 .单克隆抗体：只针对单一抗原决定簇起作用的抗体。 二、填空 1. 结构分子生物学，基因表达与调控，DNA 重组技术 三、是非题 四、简答题 1. 分子生物学的概念是什么？ 答案： 有人把它定义得很广：从分子的形式来研究生物现象的学科。但是这个定义 使分子生物学难以和生物化学区分开来。另一个定义要严格一些，因此更加有用： 从分子水平来研究基因结构和功能。从分子角度来解释基因的结构和活性是本书 的主要内容。 2. 你对现代分子生物学的含义和包括的研究范围是怎么理解的？ 分子生物学是从分子水平研究生命本质的一门新兴边缘学科，它以核酸和蛋白质 等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象，是当 前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿
分子生物学在医药中的研究进展及应用 ——韩静静 摘要 分子生物学是对生物在分子层次上的研究。这是一门生物学和化学之间跨学科的研究，其研究领域涵盖了遗传学、生物化学和生物物理学等学科。分子生物学主要致力于对细胞中不同系统之间相互作用的理解，包括DNA，RNA和蛋白质生物合成之间的关系以及了解它们之间的相互作用是如何被调控的。分子生物学主要研究遗传物质的复制、转录和翻译进程中的分子基础。分子生物学的中心法则认为“DNA 制造 RNA，RNA 制造蛋白质，蛋白质反过来协助前两项流程，并协助 DNA 自我复制”。 分子生物技术也称之为生物工程，是现代生物技术的主要标志，它是以基因重组技术和细胞融合技术为基础，利用生物体或者生物组织、细胞及其组分的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品种．以便与工程原理相结台进行生产加工．为社会提供商品和服务的一个综合性技术体系，其内容包括基因工程技术、细胞工程技术、DNA测序技术、DNA芯片技术、酶工程技术等。现代分子生物技术的诞生以70年代DNA重组技术和淋巴细胞杂交瘤技术的发明和应用为标志．迄今已走过了30多年的发展历程。实践证明在解决人类面临的粮食、健康、环境和能源等重大问题方面开辟了无限广阔的前景。受到了各国政府和企业界的广泛关注。是21世纪高新技术产业的先导。 二十世纪生物医学发展的主要特点之一是对生命现象和疾病本质的认识逐渐向分子水平深入。DNA双螺旋结构的发现为分子医学和基因医学的发展奠定了基础。人们逐渐认识到，无论健康或疾病状态都是生物分子及其相互作用的结果，生物分子中起关键性作用者为基因及其表达产物蛋白质，因此从本质上说，所有的疾病都可以被认为是“基因病”。近十年来，分子生物技术已成为医学领域最有力的研究工具，以下从基因工程技术、人类基因组计划与核酸序列测定技术、基因诊断与基因体外扩增技术、生物芯片技术在医学研究中为了解疾病的发生发展机制，诊断和药物研制、开发中的应用。 关键词：分子生物学分子生物技术医药基因芯片蛋白质组学
云南省医学会病理学分会各位常委、委员，各有关单位： 为满足临床需求，提升我省病理诊断水平，有条件的病理科应开展临床分子病理检查。我分会经研究，委托成都军区昆明总医院病理科分子病理室对临床分子病理检查所需人员、设施、设备、试剂进行整理，提供给各位，供今后开展相关分子病理检查参考。 附：《临床分子病理检查所需人员、设施、设备、试剂》 云南省医学会病理学分会 2014-2-7
临床分子病理检查所需人员、设施、设备、试剂 一． 显色原位杂交 （一）可应用范围 （1）EBER病毒EBER1/EBER2原位杂交检测； （2）人乳头瘤病毒HPV低危6/11型、高危16/18型原位杂交检测。 （二）人员基本要求 1. 签发报告医师：取得《医师资格证书》，执业范围为病理专业的本院在职医师。有2年以上病理诊断的工作经验，具有主治医师及以上专业技术职务任职资格，进行过相关技术的诊断培训或进修学习。 2. 配备专职分子病理技术员：大专以上学历，具备病理学、分子生物学的基础知识。 （三）场地要求：独立的分子病理室。 （四）所需仪器设备及试剂 1．仪器设备 （1）原位杂交仪（目前本实验室使用的型号为ThermoBrite S 500.24，下同）（2）室温离心机（eppendorf 5415D） （3）移液器，10 ul、50 ul、1000ul量程（eppendorf、大龙、美国伯乐等）（4）原位杂交加热器（福建泰普生物科学有限公司M10061） （5）37℃温箱 （6）切片机（HM325） （7）光学显微镜（OLYMPUS BX41） （8）4℃冰箱（海尔BYC-326A） （9）-20℃冰箱（三洋MDF-U333） 2．试剂 （1）EBER原位杂交推荐试剂：福建泰普生物科学（中国）有限公司EBER1/EBER2原位杂交试剂盒。 （2）HPV原位杂交推荐试剂：北京中杉金桥生物技术有限公司HPV6/11、16/18原位杂交试剂盒。
中国科协第251次青年科学家论坛简报 2013年01月11日 分子植物病理学的研究热点与发展趋势 ——中国科协举办第251次青年科学家论坛 由中国科协主办，中国植物病理学会、中国农业大学、华中农业大学承办的第251次青年科学家论坛于11月19～22日在华中农业大学举行。 一、论坛基本情况 本次论坛邀请了来自中国农业大学、南京农业大学、华中农业大学、西北农林科技大学、华南农业大学、四川农业大学、山东农业大学、吉林大学、上海交通大学、青岛农业大学、吉林农业大学、西南大学、浙江师范大学、中国科学院遗传与发育研究所、中国科学院微生物研究所、中国科学院植物逆境生物学研究中心、中国农业科学院植物保护研究所、棉花研究所、江苏省农业科学院、浙江省农业科学院、福建省农业科学院、河北省农林科学院等22个单位的80余位青年科学家参会。论坛执行主席由中国农业大学孙文献教授、西北农林科技大学单卫星教授、南京农业大学王源超教授、华中农业大学姜道宏教授共同担任。 二、论坛主要议题 论坛围绕“分子植物病理学的研究热点与发展趋势”这一主题展开。并就“功能基因组学与比较基因组学在植物病原致病机理的解析以及致病基因的大规模分离与鉴定中的应用”、
“与抗性基因调控网络研究的最新进展及其对未来分子植物病理学发展的影响”、“三大粮食作物及重要的经济作物主要病原的效应蛋白在寄主中靶标的研究及其在分子设计育种中的潜在价值”、“重要植物病原菌致病性的调控机理及分泌途径研究”、“病原菌重要致病因子晶体结构的解析与药物靶标的选择”、“重要作物病害防控的新策略与新思路”等6个方面的问题进行了广泛而又深刻的学术讨论。 1、功能基因组学与比较基因组学在植物病原致病机理的解析以及致病基因的大规模分离与鉴定中的应用 随着生物信息技术的高速发展和广泛应用使得基因组学尤其是功能基因组学成为研究病原物致病机理和致病相关基因克隆及其调控网络研究等快捷而有效的途径。中国农业大学彭友良教授长期从事稻瘟病菌的基因组学研究。在这次论坛上，他通过稻瘟菌致病因子的大规模筛选、分离与鉴定的实例，阐明了植物病原真菌基因组学的快速发展与广阔的应用前景；同时，他还介绍了通过比较基因组学，研究稻瘟菌的遗传变异的规律与特点，揭示水稻抗病性易被克服的分子基础，为水稻持久、广谱抗性研究提供了新思路。福建农林大学王宗华教授也在稻瘟菌的功能基因组学方面有很深的造诣。他对实验室近期的有关稻瘟病菌小酶的功能研究系列进展进行了交流并对学科的研究方向进行了讨论与预测。 近年来，水稻稻曲病与小麦赤霉病在我国主要的粮食产区大面积发生，已经严重地影响到我国粮食的安全生产；这两种病菌还有一个共同点，能在侵染寄主的过程中产生大量对人畜有害的毒素。中国农业大学孙文献教授对稻曲菌进行了基因组测序，在基因组水平上分析其可能存在的致病因子及侵染特性；分析了可能参与稻曲菌毒素合成的蛋白，从基因组水平上寻找合成稻曲毒素途径中的关键基因；另外，基因组学研究也为揭示稻曲菌的致病机理及其侵染循环等提供了大量的重要信息。浙江大学马忠华教授介绍了比较基因组学在赤霉菌的基因功能鉴定中的应用。通过赤霉菌与酵母基因组之间的比较，鉴定出两个物种保守的与特有的信号传导途径，并在此基础上研究了赤霉菌对敏感的机理。 华中农业大学的罗朝喜教授与郑露博士分别就病原真菌中线粒体细胞色素b（b）基因的进化特点和基于测序文库的全基因组序列拼接与基因预测的技术进行了汇报。通过对所有已发表的真菌基因组进行比较，发现b应源于一个共同的祖先基因，不同物种间b基因大小的差异是因为其内含子的位置与序列发生显著的变化。郑露博士总结了一套利用测序数据进行拼接的方法，获得了与测序几乎一致的拼接效果。该方法具有成本低，效果好的特点，为未来基因组学的发展与应用提供了技术基础。 2、与抗性基因调控网络研究的最新进展及其对未来分子植物病理学发展的影响 重要粮食作物和经济作物抗病基因的发掘、克隆与应用一直是植物病理学关注和研究的焦点，这方面的研究对我国的粮食安全生产有着直接的影响。虽然，在模式植物拟南芥上，
2010分子生物学技术考试答题要点
深圳大学研究生试题答案 学院生命科学学院专业细胞生物学 课程名称分子、生物学研究方法拟题人田生礼唐玉林 审题人 1. 何谓载体？载体的必备条件有哪些？（9分） 携带外源基因进入宿主细胞的工具。体外重组DNA实验中，将外源DNA片段运送进宿主细胞进行扩增或表达的运载工具称为载体(vector)，这也是一个DNA 分子。 1）克隆载体上要有复制起点，表达载体还需有启动子；2）载体上要有选择标记基因或报道基因；3）除了置换型的载体外，载体上具有多个限制性内切核酸酶的酶切位点，对一种限制酶来说只能有一个。 2. 采用末端标记DNA探针是常用的分子生物学技术，请你先解释分子生物学中核酸探针的概念，请你采用至少两种方法来标记DNA探针。（10分） 答题要点： 核酸探针：是指利用杂交技术检测特异核酸序列必须使用探针。一个探针可以是能检测互补核酸序列的简单的DNA或RNA分子。 末端标记DNA探针可以有如下方法 1）.利用T7DNA聚合酶在没有底物时，发挥它的3’→5’外切酶活性，随后加入α-32p-dGTP，发挥它的聚合酶活性标记3’端；
2）.利用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）处理，再用磷酸激酶在底物 -32p-dATP存在的情况下标记DNA5’端； 3）.利用DNA末端转移酶在底物α-32p-dGTP存在的情况下标记DNA的3’端。 3. 一个未知序列的真核cDNA片段，3’和5’端均为平末端，欲把其克隆到一个原核表达载体中，并且可以获得表达。采用哪些克隆策略可以成功克隆该基因（至少两种方法）？如何证明克隆和表达成功？（提示：先克隆测序、再克隆、鉴定、表达、证明表达成功）（12分） 答题要点： 由于是一个未知序列的基因可以采用先克隆到测序载体的方法：1在载体上涌Smal I切割载体直接插入；2采用同聚物加尾克隆；3加人工接头；4加衔接物。克隆后测序。再根据成熟肽的序列设计引物，利用PCR扩增目的基因，通过酶切后克隆到表达载体；通过酶切鉴定和测序确定克隆成功，通过诱导表达后的SDS-PAGE电泳及western blot或质谱鉴定和证明表达成功。 4. 核酸分子杂交技术主要包括Southern Blot 和 Northern Blot，简述这两个技术的原理和主要过程（步骤）。为什么Northern Blot检测时还要杂交一个看家基因？（15分） 答题要点：