基因工程综合实验
马正文
生物13班 130434109
摘要：20世纪80年代以来,基因工程技术在农业上的应用取得了斐然成果,植物基因工程已成为农业绿色革命的最重要技术手段。为此对植物基因工程中目的基因的克隆，植物表达载体构建与目的基因的转化以及转基因植株的检测的研究进展作了综合评述。
1.目的基因克隆
1.1实验目的
1.11 通过PCR法分离克隆目的基因。
1.12 熟悉掌握PCR、凝胶电泳、DNA回收纯化、PCR产物与T载体链接、大肠杆菌感受态细胞制备、连接产物转化、重组子筛选等一系列克隆相关技术
1.2实验原理
基于已知序列或已知同源基因序列，设计基因特异引物或简并引物，以DNA或cDNA为模板进行PCR扩增，扩增产物电泳后回收纯化，与T载体连接，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，经抗性筛选和PCR检测、质粒酶切鉴定获得重组子。
1.3实验试剂药品及仪器设备
1.3．1试剂药品
PCR反应试剂(Taq DNA polymerase, 10×PCR Buffer (Mg2+)，2.5mM dNTPs, Primers(合成))
1×TAE, CaCl2，无水乙醇、LB培养基
DNA 回收试剂盒，质粒DNA提取试剂盒，DNA marker
T-Vector, T4-DNA ligase,
质粒DNA提取试剂盒
常用限制性核酸内切酶
1.3.2仪器设备
PCR仪、电泳装置、离心机、恒温箱、摇床、凝胶成像仪、移液器等
耗材：PCR管、离心管、吸头、培养皿等
1.4实验步骤
1．4.1PCR
1.4.1．1PCR原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
1.4..1.2PCR反应体系
DNA模板 1 l
上游引物(10pmol/ l) 1 l
下游引物(10pmol/ l) 1 l
10×PCR Buffer 5 l
25mM MgCl2 4 l
2.5mM dNTPs 4 l
Taq(4,5units/ l) 0.5 l
ddH2O 33.5 l
total 50 l
或
DNA模板 1 l
上游引物(10pmol/ l) 3 l
下游引物(10pmol/ l) 3 l
10×PCR Buffer 5 l
10mM dNTP (each) 1 l
Pfu(2,3units/ l) 0.5 l
ddH2O 36.5 l
total 50 l
1.4.1.3模板DNA可以是基因组DNA、DNA片段、cDNA、质粒DNA或含目标DNA的细菌及病毒等，浓度一般小于100ng。
1.4.1.4引物设计应遵循下列原则：
(1) 长度一般在20-24碱基;
(2) 与模板DNA的配对同源性在80%以上;
(3) 上游引物与基因编码链序列一致, 下游引物则与之互补;
(4) 3’未端与模板配对能力较好(最好未端5个碱基能配对);
(5) 两引物G+C百分含量相近;
(6) 3’未端不出现3个连续的G/C;
(7) 引物自身或两引物间不存在连续5个或5个以上碱基的互补能力;
(8) 两引物3’未端序列不应相近;
(9) 目标PCR产物的长度应能预测;
(10) 经GenBank同源性检索, 目标基因与引物的配对能力应远强于其它基因。
1.4.1.5循环条件：
一般情况下Taq采用94℃, 5min → (94℃, 40s → 退火温度, 40s →72℃, 60-120s)30 → 72℃, 10min。Pfu采用95℃, 2min → (95℃, 40s → 退火温度, 30s →73℃, 60-240s)35 → 73℃, 5min。退火温度是PCR成败的关键，虽然根据引物的特性可估计退火温度，但更多情况下是通过试验确定退火温度，一般为45-60℃。退火温度大致可按下式推算：
Tm=4(G+C)+2(A+T)-5n， n代表错配的碱基数。延伸时间Taq是每kb 1min, Pfu则每kb 2min。1．4.2琼脂糖凝胶电泳
1．4.2.1胶的浓度因DNA长度而异：
基因组DNA， DNA 0.4-0.5%
质粒(3-5kb) 0.7%
3-1kb 0.7-1.0%
1-0.5kb 1.0-1.5%
<0.5kb 2.0%
1.4.
2.2 电泳缓冲液可选用0.5×TBE或1×TAE，前者缓冲能力较后者强，但不适用于从胶中回收DNA，建议只采用1×TAE用于琼脂糖凝胶电泳。琼脂糖用电泳缓冲液配制。
1.4.
2.3电泳电压以5V/cm为宜, 即电泳槽的长度×5。
1.4.
2.4电泳胶中添加0.5g/ml EB。
1.4.
2.5DNA样品与6×上样缓冲液混合后点样，为使DNA条带肉眼可见，条带DNA必须达2ng。
1.4.
2.6采用合适的DNA Marker。
1.4.3PCR产物与T－载体连接
反应体系：0.1μg载体DNA，2-5μl PCR纯化产物，1μl连接缓冲液，1μl(3units/l) T4 DNA连接酶，加ddH2O至10μl，12-16℃连接过夜。
1.4.4大肠杆菌感受态细胞制备及DNA转化感受态细胞
1.4.4．1挑取TG1单菌落在LB培养基中37℃过夜培养；
1.4.4．2过夜培养的TG1菌按1：50或1：100稀释培养1.5-2hr;
1.4.4．3冰上冷却10min;
1.4.4．4 4000rpm × 3min, 4℃离心；
1.4.4．5沉淀用1ml 100mM CaCl2悬浮，冰上放置10min;
1.4.4．6 4000rpm × 3min, 4℃离心；
1.4.4．7沉淀用0.2ml 100mM CaCl2悬浮，冰上放置30min-24hr后使用;
1.4.4．8将连接产物与感受态细胞混合，冰上放置30min；
1.4.4．9于42℃热激90s后迅速放冰上2min;
1.4.4．10加入1ml LB(不含氨苄青霉素)，混合后于37℃保温1hr;
1.4.4．11在含100 g/ml氨苄青霉素的LB固体培养基平板(直径7cm)表面涂30 l x-gal (20mg/ml, 用二甲基甲酰胺配制)和3 l IPT G (200mg/ml), 然后涂布转化后的细菌;
1.4.4．12 37℃倒置培养10-14hr，待菌落长成后将平板置于4℃中保存。
1.4.5．大肠杆菌感受态细胞的快速制备及转化
1.4.5．1取1ml过夜培养的细菌, 置冰上10min, 离心收集细菌后加入100 l TSS悬浮, 置冰上10min后可用;
1.4.5．2加入要转化的DNA, 置冰上10min;
1.4.5．3 加入0.9ml 含20mM 葡萄糖的TSS, 37℃培养1小时即可涂板。
注：此感受态细胞可于－70℃保存4个月。
1.4.6农杆菌感受态细胞制备及冻融转化
1.4.6．1农杆菌稀释100倍过夜培养；
1.4.6．2吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；
1.4.6．3 5000rpm离心5min，弃去上清液；
1.4.7质粒提取――常规法
1.4.7．1取1ml细菌，12000rpm, 15s；
1.4.7．2用200 l Solution I重悬浮细菌，室温放置5min;
1.4.7．3 加入200 l Solution II，轻轻颠倒混匀，冰上放置5min；
1.4.7．4 加入200 l Solution III，轻轻颠倒混匀，冰上放置5min；
1.4.7．512000rpm, 10min;
1.4.7．6上清液移入新离心管，加等体积异丙醇, 颠倒混匀, 室温放置2min;
1.4.7．712000rpm, 5min，吸干残液；
1.4.7．8溶于50 l 含10 g/ml RNase的TE，37℃保温20min；(到此步骤的质粒可供电泳检查)
1.4.7．9 补加TE至100 l,加等体积酚/氯仿，剧烈颠倒混匀1min；
1.4.7．1012000rpm, 5min;
1.4.7．11上清液(上层)移入新离心管，加等体积氯仿，剧烈颠倒混匀30s；
1.4.7．12 12000rpm, 2min;
1.4.7．13 上清液(上层)移入新离心管，加1/10体积3M NaAc (pH5.2)和2倍体积乙醇,室温放置2min;
1.4.7．14 12000rpm, 2min;
1.4.7．15用1ml 70%乙醇洗涤沉淀后, 沉淀于室温或37℃干燥;
1.4.7．16 溶于50 l TE, -20℃保存。
注: 提取少量质粒用于检查时，也可直接取200 l细菌，接着做步骤3，步骤4中在溶液Ⅲ加入5min后加等体积氯仿/异戊醇，混匀，接着做下面步骤。
1．4.8低蛋白低DNase质粒的提取(该法无需酚/氯仿抽提)
1．4.8．1取1ml细菌，12000rpm, 15s；
1．4.8．2用150 l SET重悬浮细菌，室温放置5min;
1．4.8．3加入350 μl Solution II，轻轻颠倒混匀，冰上放置5min；
1．4.8．4加入250 μl Solution III，轻轻颠倒混匀，冰上放置5min；
1．4.8．5 12000rpm, 10min;
1．4.8．6 上清液移入新离心管，加等体积异丙醇, 颠倒混匀, 室温放置2min;
1．4.8．7 12000rpm, 5min，吸干残液；
1．4.8．8溶于50 μl 含10 g/ml RNase的TE，37℃保温20min，然后-20℃保存。2.植物表达载体构建与目的基因的转化（以烟草为例）
2.1实验目的
2.1.1进行分子设计构建植物表达载体。
2.1.2通过农杆菌介导等基因转化方法获得转基因烟草植株。
2.2实验原理
根癌农杆菌介导的外源基因转移，整合型的根癌农杆菌Ti质粒是最常用的一种载体。研究最多的是章鱼碱型和胭脂碱型Ti质粒。在Ti质粒上有一段T区，T-DNA能从该质粒转移到敏感植物的核基因组中。T-DNA边界有25bp正向序列可能接受某种酶识别切割，进而形成环状中间体。此外，Ti质粒上还有一个约50bp的Virlence区，简称Vir区，约有十几个基因，Vir区不在T-DNA内，Vir基因产物是一种跨膜蛋白。可以接受植物信号的诱导而发生构象的改变，成为活性蛋白。其中VirA基因可能是决定Ti宿主范围的基因。根据Vir质粒的基本构造，通常认为由根癌农杆菌介导的外源DNA转移和转化要具备三个因素：①位于农杆菌染色体上的Chra和Chrb基因，这两个基因细菌细胞对植物细胞的识别和吸附有关；②T-DNA边界序列对于T-DNA整合到植物染色体的过程是必要的；③Vir基因的活化可以启动DNA向植物细胞的转移。农杆菌介导的基因转移是双子叶植物中最为广泛而有效的遗传转化体系。
2．3药品试剂
——MS母液（大量元素，微量元素，铁盐，有机母液）
——6-BA，IBA（0.1mg/ml）
——LB（蛋白胨，酵母提取物，氯化钠）
——卡那霉素（50mg/ml）、头孢霉素（250mg/ml）、羧苄青霉素母液（50mg/ml）——琼脂（5g/L）
——砂糖（20-30g/L）
——定性滤纸
——限制性内切酶
——T4 DNA连接酶
——凝胶DNA回收试剂盒
2.4仪器设备
——-20℃冰箱
——培养皿
——剪刀镊子
——三角瓶
——接种针
——枪头
——PCR仪
——天平
——研钵和杵子
——37、65水浴
——移液枪
——移液管
——离心机（转速至少可达5000g）
——4℃冰箱
——水浴锅等
2.5植物材料：
——室外烟草或烟草无菌苗
2.6质粒与菌株
——pBI121, pBS, pUC19，或外源目的基因质粒等。
——大肠杆菌TG1、DH5α等，农杆菌LBA4404、GV3101等
2.7实验程序：
2.7.1表达载体的构建：
①将含外源目的基因的质粒与pBS或pUC19用相同的内切酶进行双酶切，
②双酶切产物进行电泳，
③用试剂盒回收目的条带
④目的条带用T4 DNA连接酶，在16℃下进行连接。连接体系如下:
目的基因片段5μL
pBS或pUC19 3.5μL
T4 DNA ligase buffer(×10) 1μL
T4 DNA ligase 0.5μL
Total volume 10μL
①连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，通过PCR筛选出阳性重组质粒。
②阳性重组质粒与pBI121用相同的内切酶进行双酶切；
③电泳回收相应的目的片段；
④目的条带用T4 DNA连接酶，在16℃下进行连接。连接体系同上。
⑤连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，通过PCR筛选出阳性重组质粒。
⑥提取重组质粒DNA，转化农杆菌感受态细胞(液氮冻融直接转入法)，PCR检测获得重组子。
⑦重组子可直接用于基因转化研究，也可加入30%~40%无菌甘油于-76℃保存备用
2.7.2无菌材料的准备：叶片、茎段等均可作受体材料，有两种来源。
①取自无菌试管苗(本实验采用无菌苗)
②取自田间或温室栽培植株(需消毒处理，同组织培养)
2.7.3受体材料的预培养：
①再生培养基的配制: 烟草叶片再生培养基的配制MS+6-BA1.0mg/l+IBA 0.1mg，铺板。准备灭过菌的培养皿、剪刀镊子等。
②预培养：取烟草无菌苗的幼嫩叶片用剪刀间隔0.5 cm结果叶片中脉(保持剪后叶片不断裂以便下一步侵染)，在再生培养基中预培养1-2天，待切口处刚刚开始膨大时即可进行能杆菌侵染。
2.7.4 农杆菌培养：
①农杆菌的活化：从-20度冰箱里取出保存的农杆菌，在无菌操作台上吸取少量放入LB液体培养基中或者划线培养，挑取单菌落接种到液体LB培养基中，加入50mg/l的Kan，200rpm，28℃摇菌过夜。需准备的物品及试剂：LB液体培养基、灭菌的三角瓶(50-100ml)、灭菌的枪头。
②农杆菌的稀释及二次摇菌：农杆菌培养物稀释到液体MS培养基中；二次摇菌需6-10小时, OD600为0.2~0.5时可用于转化。需准备的物品及试剂：灭菌的三角瓶、枪头、2ml的离心管。
2.7.5 侵染：
于超净台上将经预培养的烟草叶片在农杆菌稀释液中浸3 min, 用灭菌的滤纸吸去多余菌液后, 继续放置在原来的培养基中。
2.7.6共培养(暗培养)：
9 25℃条件下暗培养，共培养2-4天，待叶片周围有白色菌产生.。
2.7.7选择培养：
将共培养的叶片转移至烟草再生培养基并附加500 mg/L羧苄青霉素或者250mg/L头孢霉素、50 mg/L卡那霉素。转移至光下在16 h白天、8 h黑夜的光周期和25℃条件下选择培养。(观
察拍照)
2.7.8继代培养:
选择培养2~3周后，将分化的抗性不定芽转入相应的选择培养基中进行继代扩繁培养。
2.7.9生根培养：
将生长至长1 cm以上的小苗转移到含300 mg/L羧苄青霉素、30 mg/L卡那霉素的固体MS培养
基上诱导生根. 约2-3周后可见根的形成, 从而得到再生完整植株.筛选。生根培养基为
1/2MS无激素培养基附加500mg/l的头孢霉素+ 100mg/l 卡那霉素。(观察拍照)
2．7.10移栽：
待这些完整植株生长到大约5 cm时，并具有完整的根系后，移栽到花盆中，使之在温室中
继续生长。
Part III 转基因植株的检测
一、gus(β- 葡萄糖苷酸酶基因)的检测(组织化学定位染色法)
实验目的：
通过组织化学定位染色对转基因植株进行GUS活性检测。
实验原理：
gus来源于大肠杆菌染色体的uidA位点。在一定条件下与X-glucuionic acid (5-bromo
-4chloro-3indoyl-β-D-glucuronic acid)底物发生作用，发生蓝色沉淀反应，可以直接观
察到植物组织由沉淀形成的蓝色斑点。
试剂:
X-Gluc染色液的配制：
母液浓度加入体积终浓度
0.2M Na2HPO4/NaH2PO4(pH7.0) 50ml 100mM
0.5M EDTA(pH7.0) 0.2ml 1mM
铁氰化钾0.0164g 0.05mM
亚铁氰化钾0.0212g 0.05mM
Triton X-100 0.1ml 0.1%
无菌水49.7ml
总体积100ml
注：121℃灭菌，母液两周内使用有效，最好现用现配
X-Gluc反应液：
1mg X-Gluc用20μl DMSO（二甲基亚砜）或N，N-二甲酰氨（DMF）溶解后，加4ml染色液母液，所得X-Gluc的浓度为2mM
一般固定液：
1％甲醛，50mM磷酸钠缓冲液，0.05％Triton X-100(Tween-20)
原生质体固定液
1％甲醛，0.3~0.6M甘露醇，10mM MES(甲基乙烷磺酸)pH5.6
FAA固定液：
5%甲醛，5%乙酸，5%乙醇
二、实验程序：
2.1材料的准备：
瞬时表达检测取侵染后1～5 d的材料，稳定表达检测取转化后处理6周后的材料
叶片、幼根等制成徒手切片(小块、小片)
悬浮细胞、原生质体低速离心收集，用无菌水等渗液洗涤
清洁的愈伤组织可直接使用
2.2染色：
直接染色法：
①将准备好的试材浸泡在染液中，于25～37 C 保温1hr至过夜；
②叶片等绿色材料转入70％乙醇中脱色2～3次，至阴性对照材料呈白色；
③肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为GUS表达位点。实验结果拍照记录。
固定染色法：
①将材料浸入固定液，必要时抽真空1min, 室温下轻摇30～60min;
②取出材料，用磷酸钠缓冲液漂洗3～4次；
③将试材放入1.5ml无菌离心管中，加入染色液，浸没材料，盖上管盖，于37 C 水浴中保温几分钟至过夜;
④取出材料，用75％的乙醇漂洗，或放入FAA固定液中处理20min;
⑤先后用20％、50％乙醇各浸泡20min以上；
⑥显微镜下观察，白色背景上的蓝色斑点即为GUS表
⑥显微镜下观察，白色背景上的蓝色斑点即为GUS表达位点；实验结果拍照记录。
⑦染色后的材料可浸入含80％乙醇的FAA固定液中保存。
2.3注意事项：
①实验要设阴性对照，阴性对照应无蓝色出现，如产生蓝色即为本底。其原因可能有：a.试材或试剂的污染，尤其是材料的内生菌；b染色时间过长，时间越长，假阳性率增加。
②在需要进行较长时间染色时染色液中应加入0.02％NaN3或100 g/ml的氯霉素，以便抑制细菌生长，减少本底。
③叶绿素含量高的试材染色后一定要进行脱色
④含多酚、木质素多的试材染色过程中会发生褐化，样品呈现褐色而掩盖GUS着色。可将染色后的材料放到75％乳酸水溶液中，在1磅压力下加热15min，此法对烟草、马铃薯有效。
三、转基因植株的PCR检测
3.1实验目的：
3.1.1快速提取转基因植株的基因组DNA。
3.1.2通过PCR反应对基因转化植株进行快速检测。
实验原理:
依据PCR原理，通过基因特异引物对转基因植株中外源目的基因进行特异扩增，从而判断是否为转基因植株。
实验试剂、药品:
——液氮
——1×CTAB缓冲液：50mmol/L Tris-HCl pH8,0.7mol/L NaCl,10mmol/L EDTA pH8 ,1% CTAB,20mmol/L 2 巯基乙醇（用前加入）
——氯仿/异戊醇（24：1）
——RNase A ：2000 U/ml，用0.15mol/L NaCl，0.015mol/L 柠檬酸三钠配成10mg/ml；使用前100℃热处理15min除去残留的DNase活性
——异丙醇
——无水乙醇，3mol/L乙酸钠
——70%乙醇
——TE缓冲液：10mmol/LTris-HCl，1mmol/L EDTA pH8
——PCR引物及反应试剂等。
仪器设备：
——PCR仪
——电泳设备
——离心机
——凝胶摄像仪
——水浴锅
——天平
——研钵和杵子
——37、65水浴
——移液枪
——离心管、枪头等各种耗材
植物材料：
——转基因植株、对照植株
实验程序：
1.转化植株的DNA的分离(CTAB法)
①取0.5g材料于液氮中研成粉末，移至预热的500μl 2×CTAB缓冲液中(2%CTAB, 100 mmol/L Tris-Cl, 20 mmol/L EDTA, 1.4 mmol/L NaCl, pH=8.0)，轻轻转动离心管，混匀，然后置于65℃水浴放置60min。
②混合物冷至室温后加入等体积的氯仿/异戊醇。轻轻颠倒离心管几次使管内混合物成乳浊液。室温下10000rpm离心10min 分相。
③将上清液（水相）移至一干净离心管中，加入1/100体积的RNaseA贮液，颠倒混匀，37℃保温30min。
④2/3体积异丙醇沉淀，混匀，室温下10000rpm离心10min，沉淀DNA。
⑤70%乙醇清洗沉淀。
⑥将DNA空气干燥15min，溶于TE缓冲液中。4℃保存备用。
2. PCR反应
引物序列
GUS基因：
GUSF:5-AGTCGAC ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCA –3(SalI)
GUSR:5-ACTGCAG TCATTGTTTGCCTCCCTGCT –3(PstI)
GFP基因：
GFPF: 5-AGAGCTCATGGTAGATCTGACTAGTAAA –3(SacI)
GFPR: 5-AGGTACCTCACACGTGGTGGTGGTG –3(KpnI)
反应体系
成分体积
DNA 模板1μL
上游引物(10 pmol/ μL) 0.4μL
下游引物(10 pmol/ μL) 0.4μL
10×PCR buffer 2μL
25 mM MgCl2 1.6μL
2.5 mMdNTP 1.6μL
Taq酶(4,5units/ μL) 0.3μL
ddH2O 12.7μL
Total volume 20μL
反应条件
用转化植株的总DNA为模板，未转化植株作阴性对照，重组质粒作阳性对照，进行PCR扩增反应，
反应条件为：94℃预变性5 min后, 94℃变性30 sec，46~60℃退火40 sec，72℃延伸1 min，进行30个循环, 最后72℃延伸10 min，4℃保存。
电泳检测
PCR产物在1%~1.5% 的agarose胶上电泳，拍照。
一、大肠杆菌质粒DNA的提取 质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法：碱裂解法。此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。方法如下： 1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养 基。 2、37℃振荡培养过夜。 3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3 min，弃上清液。 4、加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-H Cl pH8.0)充分混合。 5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，p H4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。 7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另 一新Ep管 8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0℃静置1 0min。 9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。 10、用70％乙醇0．5ml洗涤一次，抽干所有 液体。 11、待沉淀干燥后，溶于0．05mlTE缓冲液中 二、质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，应选用电泳纯的，琼脂糖此级产品筛除了抑制物和核酸酶，而且用溴化乙锭染色后荧光背景最小。 (1)琼脂糖凝胶电泳装置
由于琼脂糖凝胶电泳既要求不高，而适应性又强，在过去15年里已成功地设计了形形色色及大大小小的电泳槽。对这些装置的选择主要是依据个人的喜恶。使用最普遍的装置是Walt er Schaffner发明的水平板凝胶。 水平板凝胶通常在一块可安放于电泳槽平台的玻璃板或塑料盘上灌制。在有些装置中，则可将凝胶直接铺在平台上。凝胶恰好浸在缓冲液液面下进行电泳。凝胶的电阻几乎与缓冲液的电阻相同，所以有相当一部分的电流将通过凝胶的全长。 （2）琼脂糖凝胶的制备 琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化成清澈、透明的溶液。然后将熔化液倒入胶模中，令其固化。凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。通贯凝胶的电场接通后，在中性pH值下带负电荷的DNA向阳极迁移。 （3）琼脂糖凝胶的染色 电泳完毕，将琼脂糖凝胶转移入含EB的染液中，染色10分钟，取出紫外灯下观察。 三、质粒DNA热激法转化大肠杆菌 感受态的细胞可以摄入外部溶液中的DNA，而常态的细胞却不能，所以要转化质粒DNA进入大肠杆菌必须首先制备感受态的大肠杆菌细胞。 1、取1%大肠杆菌E.coli接种于含2ml LB培 养基的试管中，37℃振荡培养过夜 2、取0.1ml过夜培养物转种于含10ml LB培 养基的三角瓶中，37℃振荡培养3h至OD600=0. 3 3、然后把培养物倒入1.5ml离心管中，冰浴1 0min。 4、在4℃下以4000rpm离心5min，去上清液 5、把菌体悬浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液 中，置冰上30min 6、然后再在4℃下以4000rpm离心10min，去 上清液
基因工程实验 教学方案 湖南人文科技学院生命科学系生物技术教研室 指导教师：吴娟
实验一重组质粒的提取及转化表达型菌株 Ⅰ质粒DNA的提取 实验目的 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的技术与方法。 实验原理 1．碱变性法基本原理是，在Ph12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态。将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片，染色体DNA，RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿或硅基质膜柱子进一步纯化DNA。 2．设计构建体外重组DNA分子 构建体外重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱。选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有识别位点，也就是说用一种或两种限制性内切酶就能切割得到完整的外源DNA基因。构建体外重组DNA分子，最简单的重组方式就是在目的基因DNA的两端用两种不同的限制性内切酶进行酶解，产生两个不同的粘性末端。再用这两种限制性内切酶去选择合适的载体进行酶切，也产生这两个不同的粘性末端，这样构建的重组DNA分子，目的基因DNA片段是从一个方向插入质粒载体中的，重组的效率高，也易于筛选处重组子。 附表达载体pGEX-6P-1-mreB的构建图：
仪器材料与试剂 （一）仪器 1．恒温摇床 2．台式离心机 3．漩涡混合仪 （二）材料与试剂 1．含pGEX-mreB质粒的大肠杆菌DH5α 2．含pGEX质粒的大肠杆菌DH5α 3．液体LB培养基 4．100mg/mL氨苄青霉素Amp 5．新捷质粒提取试剂盒 实验步骤 分为两组：一组提取质粒pGEX-mreB，另一组提取质粒pGEX。 1）12000rmp 离心30秒收集1-5ml过夜培养的细菌，弃尽培养基。加入250ul 已加入Rnase A的Buffer Ⅰ, 充分悬浮细菌沉淀。 2）加入250ul Buffer Ⅱ, 温和并充分地翻转离心管4-6次。 3）加入350ul Buffer Ⅲ,温和并充分地翻转离心管4-6次。 4）13000 rmp 离心10分钟。 5）将核酸纯化柱置于2ml 离心管中，转移步骤4中的上清液到核酸纯化柱中，盖上管盖，12000rmp离心30秒。 6）弃2ml 离心管中的滤液，将核酸纯化柱置回到2ml离心管中，在核酸纯化柱中加入700ul Buffer W2,盖上管盖，12000rmp离心30秒。 7）弃2ml离心管中的滤液，将核酸纯化住置回到2ml离心管中，14000 rmp离心1分钟。 8）弃2ml离心管，将核酸纯化住置于一个洁净的1.5ml离心管中，在纯化柱的膜中央加入50-100ul Buffer TE ,盖上管盖，室温静置1分钟，12000rmp离心30秒。 9）弃纯化柱，洗脱的质粒可立即用于各种生物学实验，或储存于-20℃。 实验结果 实验安排 3个小时
基因工程实验报告 、
小麦GAPDH截短体的重组与表达 摘要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。 关键字：小麦基因；载体；感受态 前言 基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 （一）实验过程
1.实验部分流程：
2．小麦总RNA提取（Trizol法） 2.1 材料 小麦幼苗 2.2 试剂配制及器具处理 ① 0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯） ②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在 0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。 ③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 ④Trizol ⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 ⑥氯仿(最好用新的)。 ⑦异丙醇(最好用新的)。 2.3 操作步骤： ①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。 ②室温放置5min，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。 ③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm 离心10min。 ④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。 ⑤重复步骤④。 ⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30μL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 3. RT-PCR扩增目的基因cDNA 3.1 试剂 ① RNA模板 ②Olig（dT）18 ③反转录缓冲液 ④dNTP ⑤ M-MULV反转录酶 ⑥ RNA抑制剂（RNasin） ⑦Premix EX Taq DNA聚合酶 ⑧ PCR特异引物 3.2操作步骤： 3.2.1 RNA的反转录 采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Total RNA 6μL（需加入RNA约1μg） OligodT primer 1μL H2O（nuclease-free）5μL 12μL 65℃ 5min，补加下列试剂： 5× Reaction buffer 4μL RibolockRNase Inhibitor 1μL 10mM dNTP Mix 2μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL 20μL 42℃ 60min 70℃，5min，﹣20℃保存
《基因工程》课程实验指导书 生物技术专业 黄淑坚黄良宗编写 佛山科学技术学院 2005年12月
目录 前言 (Ⅱ) 实验一反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR） (1) 实验二DNA目的片段的回收与DNA的体外连接 (7) 实验三重组DNA的转化 (10) 实验四重组DNA的鉴定 (13) 实验五外源基因在大肠杆菌中的诱导表达 (16) 实验六表达产物的检测与分析——SDS-PAGE (18) 附录 (22) 参考文献 (34)
前言 基因工程学是以生物化学、分子生物学和分子遗传学等学科为基础而发展起来的一门新兴技术学科，自DNA重组技术于1972年诞生以来，作为现代生物技术核心的基因工程技术得到飞速的发展，并广泛应用于医学、农业、工业、水产、环保等行业。本实验指导书在在方法上，力求可行性、实用性，内容涵盖基因工程操作的基本过程，整个实验基本上是一个连续的过程，通过学习，要求学生能在原有的相关理论知识基础上，较全面和深入理解基因工程原理、基本掌握基因工程常用的实验方法，以求为以后的学习和科研工作打下良好和扎实的基础。 由于基因工程的发展异常迅速，加之编写人员水平有限，难免有疏漏与错误，敬请各位师生批评指正。 编者 2005年12月
实验一反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR） 一、目的和要求 了解反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）基本原理和实验应用，掌握RT-PCR 反应的基本技术。 二、实验内容 RT-PCR扩增猪流感病毒M2基因部分片段。 三、仪器、设备和实验准备 1、仪器 恒温水浴槽、移液枪、EP管、PCR管、超净工作台、PCR仪、电泳仪。 2、试剂 反转录酶、RNA酶抑制剂（RNase Inhibitor）、流感病毒RNA、随机引物、流感病毒M2基因PCR引物、dNTP、Taq酶。 3、实验准备 用RNA抽提试剂盒抽提猪流感病毒RNA。 四、实验原理 RT-PCR是将RNA模板的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广，可用于检测产生的转录产物，分析表达的水平，不需构建和筛选cDNA文库而能直接克隆cDNA产物。 反转录反应是在反转录酶作用下，以RNA为模板指导合成互补的DNA链的过程。反转录反应可以使用反转录酶，以随机引物、oligo(dT)或基因特异性的引物（GSP）起始。 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA 片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下,以目的DNA为模板进行合成，由这三个基本步骤组成多轮循环。
——凯1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？（实验题目的总结） 答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器？（自己写的） 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？ 答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。（题目有歧义） 答：①取0.5g琼脂粉置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂溶解； ②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线；④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75） 答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？ 答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？ 答：冷的无水乙醇，冷的异丙醇，终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。 答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。 10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq
植物基因工程实验技术
编者: 赵 燕
主审: 张学文
湖南农业大学植物科学实验教学中心
2007 年 4 月
前
言
基因工程是现代生物技术的核心, 也是现代分子生物学研究的重 要手段. 掌握基因工程技术对于生物技术专业及其它生物学相关专业 学生都很重要. 基因工程本身是由一系列分子生物学操作技术组成的系统性技 术体系,本实验指导侧重于 DNA 重组操作,将基因工程操作的常用 和核心技术组织起来, 以为我校生物技术本科生及有关专业研究生基 因工程实验提供简单而明确的指导. 为适应基因工程的飞速发展,一些生物技术公司匠心独运,开发 出专门的试剂盒,使一些复杂的实验操作简单化了.这对于实验者来 说自然是好事,但也使实验者动手胜于用脑.对于实验人员来说,一 定应知其然并知其所以然, 才会在实验中运用自己的知识予以创新性 的发展.期望本实验指导不成为实验中的教条.
编
者
2007 年 4 月
1
目
实验一 实验二 实验三 实验四 实验五 实验六 实验七 实验八 实验九 实验十 附录:
录
大肠杆菌的对照培养,单菌落的分离及菌种保存 ...............3 强碱法小量制备质粒 DNA.....................................................5 琼脂糖凝胶电泳......................................................................7 植物总 DNA 的提取,纯化和检测 ........................................9 DNA 的 PCR 扩增................................................................. 11 植物总 RNA 的分离 .............................................................15 RT-PCR..................................................................................17 体外重组分子的构建,筛选及检测.....................................21 植物表达载体的构建,筛选及检测.....................................22 植物遗传转化技术 ................................................................23 实验中常用的仪器与器皿 .....................................................24
2
基因工程实验指导书
缩略词表
实验一植物总DNA 的抽提及电泳检测 一【实验目的】 1、了解植物DNA抽提的主要方法； 2、掌握快速抽提DNA的方法。 3、了解掌握检测DNA质量的方法以及DNA定量的方法； 4、了解影响DNA在琼脂糖凝胶中泳动速率的因素； 5、训练DNA的琼脂糖凝胶电泳操作。 二【实验原理】 该方法简便、快速，DNA产量高(纯度稍次，适用于一般分子生物学操作) 。CTAB (十六烷基三乙基溴化铵)是一种非离子去污剂，植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经离心弃上清后，CTAB-核酸复合物再用70－75%酒精浸泡可洗脱掉CTAB。再经过氯仿/异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等DNA沉淀剂将DNA沉淀分离出来。CTAB能溶解于乙醇。 改进的CTAB植物DNA抽提液迅速裂解细胞和灭火细胞内核酸酶，氯仿抽提后通过离心清除多糖、多酚和蛋白质，上清加入异丙醇离心沉淀基因组DNA，进一步去除其它各种杂质，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗-离心步骤，进一步将多糖，多酚和细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将基因组DNA从硅基质膜上洗脱。 琼脂糖凝胶电泳技术是DNA分子片段的分子量测定和分子构象研究以及DNA分离纯化的重要实验手段。DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中泳动时受到电场驱动力和凝胶的摩擦阻力。一般情况下，单位长度双链DNA带有几乎相等的电荷，故在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于凝胶的摩擦阻力，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子量的对数值成反比关系，具有不同长度的DNA 片段由于其泳动速度不同而得到分离。具有相同一级结构但构型不同的DNA分子也可以通过这种方法进行分离。
1.简述本学期从基因组DNA提取到重组质粒鉴定的实验流程？ 答：①基因组DNA的提取；②PCR扩增目的基因；③凝胶电泳分离纯化PCR扩增的DNA片段以及DNA的体外连接；④重组质粒的转化及转化子的筛选；⑤重组质粒的抽提；⑥重组质粒的酶切鉴定。 2.如何正确使用微量移液器？ 答：①选取合适量程的移液器；②根据取液量设定量程；③安装（吸液）枪头；④按至第一档，将枪头垂直伸入液面下适当位置吸液；⑤按至第二档将液体打入容器；⑥弃掉枪头；⑦将量程调至最大，放回原处。 3.在琼脂糖凝胶电泳点样时，DNA通常和什么试剂混匀，其主要成分和作用是什么？ 答：loading Buffer。主要成分为溴酚蓝，二甲苯青和甘油。 溴酚蓝和二甲苯青起指示作用；甘油加大样品密度，从而沉降于点样孔中，以免浮出。 4.简述制作1%的琼脂糖凝胶电泳的操作步骤。 答：①取0.5g琼脂糖置于锥形瓶，量取50ml 1×TBE溶液于瓶中，微波炉加热至琼脂糖溶解；②将移胶板放入胶室中，选取合适梳子垂直安插在移胶板上方，待琼脂降温至55℃下后，缓慢导入该胶室里；③量取合适量1×TBE溶液导入洗净的电泳槽，并正确插好电泳线； ④等凝胶凝固后，将梳子垂直拔出；⑤点样；⑥轻放移胶板至电泳槽的合适位置；⑦打开电泳仪的开关，调好参数，开始电泳；⑧一定时间后，停止电泳，取出凝胶板，然后经BE染色放入成像系统显色、观察。 5.琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素的影响？（实验书P75） 答：①样品DNA的大小和构象；②琼脂糖浓度；③电泳电场；④温度；⑤缓冲液；⑥嵌入染料的存在与否； 6.在使用苯酚进行DNA抽提时应注意什么？（实验书P31） 答：注意不要吸取中间的变性蛋白质层。 7.在基因组DNA提取过程中常用酚、氯仿、异戊醇试剂，它们各有什么作用？ 答：酚——是蛋白质变性，抑制DNA酶的降解作用；氯仿——除去脂类，同时加速有机相与水相的分层；异戊醇——降低表面张力，从而减少气泡的产生。 8.提取DNA实验中，通常可选用哪些试剂沉淀DNA？ 答：冷的无水乙醇、冷的异丙醇、终浓度为0.1～0.25mol/L 的NaCl 9.简述在DNA提取实验中个试剂的作用（SDS，EDTA，酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇，70%乙醇）。 答：SDS——破坏细胞膜，解聚核蛋白；EDTA——整合金属离子，抑制DNase活性；酚/氯仿/异戊醇——见第7题；无水乙醇——沉淀DNA；70%乙醇——洗涤DNA沉淀。 10.简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg2+，dNTP，引物，DNA，缓冲液，Taq DNA聚合酶）。 答:(1)利用半保留复制的原理，以待扩增的DNA为模板，通过一系列酶在体外引物介导下，
基因工程测试题 一、选择题： 1.人的糖蛋白必须经内质网和高尔基体进一步加工合成。通过转基因技术可以使人的糖蛋白基因得以表达的受体细胞是( ) A.大肠杆菌 B.酵母菌 C.肺炎双球菌 D.乳酸菌 2.下列有关基因工程的叙述，正确的是( ) A．DNA连接酶将碱基对之间的氢键连接起来B．目的基因导入受体细胞后，受体细胞即发生基因突变C．限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA 中出现的几率就越大 D．常用的载体有大肠杆菌、噬菌体和动植物病毒等 3.我国科学家运用基因工程技术，将苏云金芽孢杆菌的抗虫基因导入棉花细胞并成功表达，培育出了抗虫棉。下列叙述不正确的是( ) A.抗虫基因的提取和运输需要专用的工具酶和载体 B.重组DNA 分子中替换一个碱基对，不一定导致毒蛋白的毒性丧失 C.抗虫棉的抗虫基因可通过花粉传递到近缘作物，从而造成基因污染 D.转基因抗虫棉是否具有抗虫特性是通过检测棉花对抗生素抗性来确定的
4.如图是获得抗虫棉的技术流程示意图。卡那霉素抗性基因(kan r)常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基 生长。下列叙述正确的是( ) A.构建重组质粒过程中需要限制性核酸内切酶和DNA 连接酶 B.愈伤组织的分化产生了不同基因型的植株 C.卡那霉素抗性基因(kan r)中有该过程所利用的限制性核酸内切酶的识别位点 D.抗虫棉有性生殖后代能保持抗虫性状的稳定遗传 5.上海医学研究所成功培育出第一头携带人白蛋白基因的转基因牛。他们还研究出一种可大大提高基因表达水平的新方法，使转基因动物乳汁中的药物蛋白含量提高30 多倍，以下与此有关的叙述中正确的是( ) A.“转基因动物”是指体细胞中出现了新基因的动物 B.“提高基因表达水平”是指设法使牛的乳腺细胞中含有更多的人白蛋白基因 C.只有从转基因牛乳汁中才能获取人白蛋白，是因为人白蛋白基因只在牛乳腺细胞中含有
农杆菌介导的植物转基因技术 一、实验目的 1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。 2 学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。 二、实验原理 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将 T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 实验一培养基配制 一、仪器和试剂 1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台 2、药品：Beef extract （牛肉浸膏） 5g/L ，Yeast extract （酵母提取物） 1g/L ，Peptone （蛋白胨） 5g/L ，Sucrose （蔗糖） 5g/L ，MgSO4.7H2O 0.4g/100ml ，Agar （琼脂）1.5g/100ml，MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA（萘乙酸），6-BA （6-苄氨基腺嘌呤），卡那霉素（kan），利福平（rif ），链霉素（str ）。 二、实验方法 第一组配制YEB固体培养基 1、配制250mlYEB固体培养基：先称取1.25g Beef extract （牛肉浸膏）； 1.25g Peptone （蛋白胨）；0.25g Yeast extract （酵母提取物）；1.25g Sucrose
（蔗糖）;1g MgS04.7H2O琼脂粉3.75g ;将上述药品置于250ml三角瓶中，用量筒称取 200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml,用NaOH调pH=7.4。 2、灭菌：将盛有250ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。 3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60 C时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100用/ml kan+50⑷/ml Str+ 50旧/ml rif ）,以免温度过高导致抗生素失效。 4 、倒板：将抗生素与培养基混匀，每个平皿倒15ml 培养基，可以倒16个平皿，倒完后打开平皿盖，在紫外灯下照10min,等待培养基凝固，盖上平皿盖，封口备用。 第二组配制YEB液体培养基 1、配制500mlYEB液体培养基：先称取2.5g Beef extract （牛肉浸膏）;2.5g Peptone （蛋白胨）; 0.5g Yeast extract （酵母提取物）; 2.5g Sucrose （蔗糖）; 2g MgSO4.7H2O将上述药品置于500ml三角瓶中，用量筒称取450ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至500ml，用NaOH调pH=7.4。 2、灭菌：将盛有500ml 培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。 3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60 C时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100用/ml kan+50⑷/ml Str+ 50旧/ml rif ），以免温度过高导致抗生素失效。 4 、分装：将培养基分别分装到试管和三角瓶中，每个试管中分装5ml，分 装12个试管。每个三角瓶中倒入35ml，共12个三角瓶。 5、分装好后，封口备用。 第三组配制MS液体培养基 1、配制500mlMS液体培养基：先在500ml三角瓶中加入400ml蒸馏水，称取2.15gMS 粉置于蒸馏水中，搅拌均匀；再向其中加入5ml 100倍Fe盐浓缩液；5ml100倍肌醇浓缩液；5ml有机溶液的混合液，然后混匀定容至500ml,用NaOH 调pH=5.8。
《基因工程》实验指导 湖南师范大学生命科学学院 遗传与发育生物学系 2009年5月
基因工程课程综合实验---转基因斑马鱼的构建 一、实验目的 本课程的教学目的是让学生对基因工程技术所涉及的主要环节的基本原理、完整流程和基本技术进行系统地学习和掌握，培养学生具有通过这些原理进行基因工程实验和研究方面的设计能力。在基因工程理论课程的讲授和实践课程的实际操作过程中对学生进行基因操作与社会伦理方面的训练和教育，重在素质和能力的培养。 二、实验原理 转基因动物（transgenic animal）是指动物所有细胞基因组中整合有外源基因的一类动物，具有将外源基因遗传给子代的能力，整入动物基因的外源基因被称为转基因（transgene）。转基因动物技术是常规分子生物学技术的延伸和拓展，是基因工程技术的核心内容之一，它不仅为人们研究生命科学提供了一个更有效的工具，转基因技术是生物学领域最新重大进展之一，已能渗透到生物学、医学、畜牧学等学科的广泛领域。转基因动物已成为探讨基因调控机理、致癌基因作用和免疫系统反应的有力工具。同时人类遗传病的转基因动物模型的建立，为遗传病的基因治疗打下坚实的理论和实验基础。转基因技术涉及外源基因的获取、重组载体的构建与检测鉴定、受体系统的准备、显微注射基因导入、供转基因胚胎发育的体外培养系统和宿主动物的饲养等方面的内容。 三、材料
限制性内切酶：Eco R I、Sal I、Age I、Not I、Bam H I；T4 DNA聚合酶；LA DNA聚合酶混合物均为大连TaKaRa公司产品； 3. 2菌株及细胞系 DH5α感受态细胞：由本实验室自行制备并存于-20℃； 3. 3 质粒与表达载体系统 3. 3.1 pEGFP-N1载体 pEGFP- N1载体是一种把异源性的蛋白质融合至EGFP的N端的哺乳动物表达载体，为Clontech公司的产品。含有人类巨细胞病毒（CMV）启 图1 含有绿色荧光蛋白基因的卡那霉素抗性的pEGFP-N1质粒 动子，SV40 Poly A尾，pUC复制起始点（原核）和SV40复制起始点（真核），20个多克隆位点，具有筛选标志卡那霉素（原核）和新霉素（真核）的抗性基因，见图1。异源性蛋白与EGFP阅读框一致地克隆入pEGFP-N1，形成的表达重组体在CMV启动子启动下，表达EGFP和目标蛋白的融合蛋白。该融合蛋白保持了EGFP的荧光特性，可对融合蛋白进行活细胞内
《遗传学实验》简介 课程名称：遗传学实验 课程性质：随课实验 课程属性：基础课 学时学分：学时16学分1 面向专业： 一、课程的任务和基本要求 遗传学实验是生物学所有专业的一门专业基础课程，是一门独立的实验课程，同时也是为了配合遗传学的教学而开设的一门实验课程,本课程由基础操作性、综合性和设计性等多层次实验内容构成，目的在于巩固和加深学生对遗传学知识的理解、验证遗传学理论、并初步掌握遗传学研究所必需的基本实验技术。在此基础上，进行一定比例的综合性、设计性实验，将实验理论和实验技能融为一体，从而培养学生的基本实验思想、实验方法、实验技能和综合应用能力。本课程的任务是从个体、细胞水平揭示遗传学的基本现象与规律，培养学生牢固掌握经典遗传学研究方法与技术，并初步掌握现代遗传学实验操作技能，熟悉遗传学分析方法，同时要求学生初步具备进行遗传学创新性研究的基本能力与素质。 二、实验项目 植物染色体核型分析 果蝇的培养及生活史和形态观察 小鼠骨髓染色体的制片及观察 人群中基因频率的调查 人类巴氏小体观察 三、有关说明 1、与其它课程和教学环节的联系 先修课程：动物学、植物学、生物化学、微生物学 后续课程：分子生物学、基因工程、人类遗传学 平行开设课程：细胞生物学 2、教材和主要参考书目 （1）教材：刘祖洞江绍慧遗传学实验高等教育出版社1987年第二版 （2）主要参考书目 ①张文霞等编遗传学实验指导高等教育出版社2005 年版 ②张贵友等编普通遗传学实验指导清华大学出版社2003 年 实验一1、洋葱根尖有丝分裂染色体标本制备及观察（３学时） 一、教学基本要求： 1. 掌握植物染色体压片法。 2. 掌握有丝分裂各时期的特征。 3. 掌握用秋水仙素诱发多倍体的一般方法 二、教学内容： 1、洋葱根尖有丝分裂染色体标本制备及观察 〖目的和要求〗 本次实验通过对植物根尖的制片和观察, 要求学生初步学会对植物组织、细胞的固定、离析和压片方法，了解有丝分裂的全过程及其染色体的动态变化情况,掌握有丝分裂各时期的特征。〖实验原理〗 有丝分裂是细胞均等增殖的过程, 是体细胞分裂的主要方式.在有丝分裂过程中.细胞内每条染色体都能复制一份, 然后分配到子细胞中,因此两个子细胞与母细胞所含的染色体在数目,形态和性质上均是相同的，在各种生长旺盛的植物组织中均存在着有丝分裂。分生组织→固定→解离→染色→压片→观察（间期、早期、中期、后期、末期） 〖材料和方法〗 洋葱或大蒜或种子根尖 水浴锅、显微镜 卡诺氏固定液、石炭酸品红（或醋酸洋红）染色液，1N盐酸（或0.5%果胶酶+纤维素酶）,秋水仙素（0.1%）1、取材：大蒜、洋葱根尖，恒温箱
xxxXXXXX 学校XXXX 年学年度第二学期第二次月考 XXX 年级xx 班级 姓名：_______________班级：_______________考号：_______________ 一、选择题 （每空？ 分，共？ 分） 1、下列有关基因工程和蛋白质工程的叙述，正确的是 A ．蛋白质工程的流程和天然蛋白质合成的过程是相同的 B ．基因工程合成的是天然存在的蛋白质，蛋白质工程合成的可以不是天然存在的蛋白质 C ．基因工程是分子水平操作，蛋白质工程是细胞水平（或性状水平）操作 D ．基因工程完全不同于蛋白质工程 2、PCR 是一种体外迅速扩增DNA 片段的技术，下列有关PCR 过程的叙述，不正确的是 A ．变性过程中破坏的是DNA 分子内碱基对之间的氢键 B ．复性过程中引物与DNA 模板链的结合是依靠碱基互补配对原则完成 C ．延伸过程中需要DNA 聚合酶、ATP 、四种核糖核苷酸 D ．PCR 与细胞内 DNA 复制相比所需要酶的最适温度较高 3、35．采用基因工程技术将人凝血因子基因导入山羊受精卵，培育出了转基因羊。但是人凝血因子只存在于该转基因羊的乳汁中。下列有关叙述，正确的是（ ） A ．人体细胞中凝血因子基因的碱基对数目，小于凝血因子氨基酸数目的3倍 B ．可用显微注射技术将含有人凝血因子基因的重组DNA 分子导入羊的受精卵 C ．在该转基因羊中，人凝血因子基因只存在于乳腺细胞，而不存在于其他体细胞中 D ．人凝血因子基因开始转录后，DNA 连接酶以DNA 分子的一条链为模板合成mRNA
4、ch1L基因是蓝细菌拟核DNA上控制叶绿素合成的基因．为研究该基因对叶绿素合成的控制，需要构建该种生物缺失ch1L基因的变异株细胞．技术路线如图所示，对此描述错误的是（） 5、下图表示基因工程中目的基因的获取示意图，不正确的是： A、同种生物的基因组文库大于cDNA文库 B、③表示PCR技术，用来扩增目的基因 C、从基因文库中要得到所需目的基因，可根据目的基因的有关信息来获取 D、只要基因的核苷酸序列已知，就只能通过人工合成的方法获取 6、图1表示含有目的基因D的DNA片段长度（bp即碱基对）和部分碱基序 列，图2表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有MspⅠ、BamHⅠ、MboⅠ、SmaⅠ4种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为：C↓CGG、G↓GATCC、↓GATC、CCC↓GGG。下列分析中正确的是：
《基因工程综合实验》教学大纲 学时：54学时学分：3学分课程性质：必修 实验个数：7个适用专业：生物技术，生物工程大纲执笔人：朱常香大纲审定人：郑成超 一、实验课的性质与任务 本课程是一门专业实验课。该课程以植物基因工程的研究程序为主线，综合了目的基因的分离、克隆，载体的构建，目的基因转化、转基因植株的鉴定等方面的实验内容，在注重专业性和可操作性的前提下突出先进性和系统性，加强教学内容的选择性。通过本课程的学习和实践，使学生对基因工程的全过程有系统、明确的认识，达到熟识、理解并掌握基因工程的实验原理和操作方法，提高分析问题和解决问题的能力，开拓创新能力，为从事生物技术及其相关领域的科学研究工作打下基础。 二、实验的目的与要求 本课程的目的是培养高年级本科生及研究生进行基因操作的能力。教学中，要求调动教学双方的主观能动性，组织学生参加实验准备，让学生和教师共同讨论理论和实验问题，指导学生分析总结实验结果，学会正确书写科学报告（论文）。
三、实验项目及内容提要
四、实验报告的格式 实验报告的撰写要求使用专用实验报告纸。实验报告的内容应包括：实验目的，实验的基本原理，实验用的仪器设备及试剂，实验操作程序，实验结果，实验应注意事项。 五、本课程考核方式、方法及实验成绩评定方法 考核可采取闭卷、开卷、课程论文等形式，或多种形式相结合，对学生的学习情况做出全面科学的评价。 成绩评定把学生的实际动手能力放在重要地位。根据考试情况、实验报告撰写情况及平时表现给予综合评定。 六、实验应配套的主要仪器设备及台（套）数
附：教学参考书目 1、使用实验指导 《基因工程综合实验》操作手册。温孚江，朱常香，宋云枝等，2003。 2、参考书目 （1）《分子克隆实验指南》（第三版）。J·萨姆布鲁克，D·W·拉塞尔著，黄培堂等译。科学出版社，2002。 （2）《基因工程原理与技术》。王关林，方宏筠主编，科学出版社，1998。
专题1 基因工程综合检测 时间45分钟，满分100分。 一、选择题(每小题3分，共60分) 1．下列关于基因工程技术的叙述，正确的是( ) A．切割质粒的限制性核酸内切酶均特异性地识别6个核苷酸序列 B．PCR反应中温度的周期性改变是为了DNA聚合酶催化不同的反应 C．载体质粒通常采用抗生素合成基因作为筛选标记基因 D．抗虫基因即使成功地插入到植物细胞染色体上也未必能正常表达 答案] D 解析] 本题考查基因工程的相关知识。不同的限制性核酸内切酶特异性地识别核苷序列不同，A错误；酶具有专一性，PCR反应中温度的周期性改变是为了不同的酶将DNA解旋、扩增，B错误；载体质粒通常采用抗生素抗生基因作为筛选标记基因，C错误；基因成功插入也未必会表达，D正确。解答此类题目一定要准确把握基因工程的步骤、基因工程的工具。 2．下列关于基因工程的说法中，正确的是( ) A．基因工程的设计和施工都是在细胞水平上进行的操作 B．目前基因工程中所有的目的基因都是从供体细胞中直接分离得到的 C．只要检测出受体细胞中含有目的基因，那么目的基因一定能成功表达 D．基因工程能使科学家打破物种界限，定向改造生物性状 答案] D 解析] 基因工程是在分子水平上进行的操作，目前获取目的基因的方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成三种。检测出受体细胞中含有目的基因，只能证明目的基因已导入受体细胞，目的基因是否翻译成蛋白质要用抗原—抗体杂交法检测。 3．甲、乙两图表示从细菌细胞中获取目的基因的两种方法，以下说法中错误的是( ) A．甲方法可建立该细菌的基因组文库 B．乙方法可建立该细菌的cDNA文库 C．甲方法要以脱氧核苷酸为原料 D．乙方法需要逆转录酶参与 答案] C 解析] 甲方法是以细菌中的DNA为基础，用限制酶进行切割，它包括了细胞所有的基
基因工程实验报告
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基因工程实验报告 、
小麦GAPDH截短体的重组与表达 摘要：本实验通过基因工程（genetic engineering）手段对小麦总RNA进行提取、PCR扩增及与质粒载体的重组构建的操作，并将重组质粒以氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞，诱导目的基因表达，并在蛋白水平进行Western检测。通过本对实验的实践，我们对基因工程技术将会有一个比较全面的认识和了解。 关键字：小麦基因；载体；感受态 前言 基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术。为在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。 （一）实验过程
1.实验部分流程： 片段胶 小麦幼苗小麦总RNA RT-PCR扩增小麦pGEX-4T-1 表达载体 表达菌株 目的蛋白 目的蛋白 Western
2．小麦总RNA提取（Trizol法） 2.1 材料 小麦幼苗 2.2 试剂配制及器具处理 ① 0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯） ②器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在 0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。 ③无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃×2h）装蒸馏水，然后加入 0.1%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。 ④Trizol ⑤ 75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 ⑥氯仿(最好用新的)。 ⑦异丙醇(最好用新的)。 2.3 操作步骤： ①先在研钵中加入液氮，再将小麦叶片剪成小段在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意研磨粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。 ②室温放置5min，然后加入200μL的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。 ③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500μL异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm 离心10min。 ④小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。 ⑤重复步骤④。 ⑥弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30μL DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。 3. RT-PCR扩增目的基因cDNA 3.1 试剂 ① RNA模板 ②Olig（dT）18 ③反转录缓冲液 ④dNTP ⑤ M-MULV反转录酶 ⑥ RNA抑制剂（RNasin） ⑦Premix EX Taq DNA聚合酶 ⑧ PCR特异引物 3.2操作步骤： 3.2.1 RNA的反转录 采用Thermo Scientific（Fermentas）RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit Total RNA 6μL（需加入RNA约1μg） OligodT primer 1μL H2O（nuclease-free）5μL 12μL 65℃ 5min，补加下列试剂： 5× Reaction buffer4μL RibolockRNase Inhibitor 1μL 10mM dNTP Mix 2μL RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase 1μL 20μL 42℃ 60min 70℃，5min，﹣20℃保存