植物总基因组DNA提取纯化方法综述
易庆平1,罗正荣2,张青林2
(1.荆楚理工学院生物工程分院,湖北荆门448200;2.华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室,湖北武汉430070)
摘要 归纳植物DNA提取各个环节,同时对DNA提取过程中的常见问题、原因及应对策略作简要的分析。
关键词 植物;总基因组DNA;提取;纯化;进展
中图分类号 Q781 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2007)25-07789-03
Advances of G enom e DNA E xtraction and Purification in P lants
YI Q ing2ping et al (Departm ent of Bio2engineering,Jingchu C ollege of T echn ology,Jingm en,Hubei448200)
Abstract T he techniques of plant DNA extraction were studied.And the causes and the counterm easures of comm on problems in the DNA extraction were analyzed.
K ey w ords Plant;G en om e DNA;E xtraction;Purification;Advance
DNA提取是植物分子生物学研究的基础技术。目前,已经发展了多种方法,成功地从植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、韧皮部等组织器官中提取出DNA。但是有些情况下,不同植物甚至是同一种类植物组织材料的来源、部位、形态等外在性质的不同以及化学成分、组织结构等内在特点的差异,在提取基因组DNA时需要选择不同的方法或作一些特殊的处理[1]。从富含多糖、多酚、单宁、色素及其他次生代谢物质的木本植物中提取的方法难度就相对大于大多数的禾谷类及蔬菜类植物。从这些植物中分离出的DNA由于多酚被氧化成棕褐色,多糖、单宁等物质与DNA会结合成粘稠的胶状物,获得的DNA常出现产量低、质量差、易降解,影响了DNA质量和纯度,不能被限制性内切酶酶切,严重的甚至不能作为模板进行PCR扩增。针对这一现象,已有许多学者对植物特别是顽拗型木本植物的基因组DNA提取纯化进行了改良和发展。笔者就植物DNA提取各个环节,如样本的采集与保存、提取缓冲液成分的作用、DNA提取纯化方法等进行归纳,同时对DNA提取过程中的常见问题、原因及应对策略作简要的分析。
1 植物样品的采集与保存
植物组织材料的采集与保存对提取DNA的产量和质量有很大影响。通常应尽可能采集新鲜、幼嫩的组织材料,采集的过程中应尽可能使组织材料保持水分,在取样时立即用浸湿的纱布包裹采集的组织材料,放置在密闭的冰盒中,这样可使组织材料3～5d仍然保持新鲜。野外远距离采集样本时,在可能的条件下冷冻保存(如放置于液氮中);当不具备冷冻条件时,最好用盛有无水C aS O4的瓶子分别保存,使其迅速干燥,这种方法可将材料保存数月,返回后应尽快进行DNA的提取工作。对具有大量次生代谢物(如丹宁、酚类、醌类等)的植物材料,应尽可能采集幼嫩组织外,最好进行冷冻保存并在短时间内进行DNA提取。植物组织材料的化学保存法,如乙醇、丙二醇处理法,通常会导致DNA剧烈降解,因此,不作为推荐的保存方法[2]。对于采集回来的样品如要长期保存,应经液氮处理后贮存在-80℃冰箱或直
基金项目 国家自然科学基金(30270925)。
作者简介 易庆平(1981-),男,湖北荆门人,硕士,讲师,从事种质资源和生物技术研究。
收稿日期 2007204229
接储放于液氮中,且在与提取缓冲液接触前,应防止冰冻的样品在空气中融化,否则酚类易被氧化。
2 提取缓冲液
随着现代分子生物学的发展,DNA分离技术也层出不穷,DNA已经可以从诸如化石、木乃伊等极端材料中分离出来,也可以从痕量材料获得DNA。无论是什么材料,针对不同的来源和特点,调整设计相应的提取缓冲液及不同的技术方案是十分重要的。在实际应用中可针对不同的情况对具体实验方案的各个部分进行不同组合。缓冲液的成分应根据分离对象的不同而变化,缓冲液的pH值、保护剂和表面活性剂都要根据不同样品进行优化。十二烷基磺酸钠(S DS)是一种阳离子强表面活性剂,通常与蛋白酶K和抗氧化剂、螯合剂一起使用;而十六烷基三甲基溴化铵(CT A B)是一种在高盐下能与核酸结合形成可溶、稳定的复合物,低盐浓度下可沉淀的表面活性剂。乙二胺四乙酸(E DT A)可用于抑制金属离子依赖性的酶(螯合M g2+、C a2+)的活性。牛血清白蛋白(BS A)可使一些降解酶的表面变性。还原型巯基成分如β2巯基乙醇、谷胱苷肽、半胱氨酸、二硫苏糖醇等一些硫醇类物质,通常可用于保护DNA免受醌类物质、二硫化物、多酚氧化酶等物质的损害。加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)也可减少酚类、醌类及丹宁类物质的影响。还有其他一些非通用添加物,如抗坏血酸、维生素C可用于降低醌类物质的影响,精胺及其他多胺可用于降低核酶的影响,氰化物可用于降低重金属氧化酶的影响。另外还有在提取液中加入活性炭、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、重过亚硫酸钠、硼砂等物质防止多酚类物质氧化的报道[3-4]。
3 DN A提取方法
3.1 传统的DN A提取方法 传统的DNA提取与纯化,如CT A B法、S DS法是在裂解细胞的基础上,多次苯酚氯仿等有机溶剂抽提使蛋白质变性沉淀于有机相,而核酸保留在水相,达到分离核酸的目的;加入RNA酶除去核酸中的RNA;然后加入异丙醇、乙醇等沉淀DNA;用70%乙醇漂洗沉淀,除去分离过程中残留的有机溶剂和盐离子,以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应,最后用TE溶解DNA备用。CT A B是一种阳离子去污剂,能与核酸形成复合物,此复合物在高盐(>0.7m ol/L)浓度下可溶,并稳定存在,但在低盐浓度(0.1～0.5m ol/L NaC l)下CT A B-核酸复合物就因溶解度
安徽农业科学,Journal of Anhui Agri.Sci.2007,35(25):7789-7791 责任编辑 庆 责任校对 俞洁
降低而沉淀,而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。经离心弃上清后,CT A B-核酸复合物再用70%酒精浸泡可洗脱掉CT A B。S DS是一种阴离子去垢剂,在高温(55～65℃)条件下能裂解细胞,使染色体离析、蛋白变性,同时S DS与蛋白质和多糖结合成复合物,释放出核酸;提高盐(K Ac或NH4Ac)浓度并降低温度(冰浴),使S DS-蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式,使蛋白质及多糖杂质沉淀更加完全,离心后除去沉淀;上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。S DS法操作简单,温和,也可提取到高分子量的DNA,但所得到的产物含糖类杂质较多。基因组DNA经典的提取方法由于无需昂贵仪器和药品,提取的DNA纯度能够满足一般分子生物学的需要,一直作为DNA提取的常规方法。但这种方法操作步骤复杂,耗时长,易交叉污染,残留在DNA溶液中有机物质对DNA聚合酶有抑制作用。另外,酚、氯仿等有机溶剂易造成环境污染,有损操作者健康,因此使该方法的应用受到一定的局限性。
3.2 DN A提取新方法 近年来出现了以螯合树脂、特异性DNA吸附膜、离子交换纯化柱及磁珠或玻璃粉吸附等基础DNA提取新方法。这些方法主要应用于提取病毒、微生物、人和动物细胞、包埋组织样品、古生物标本及土壤环境样品DNA[5]。已有多篇利用纯化柱和玻璃粉纯化植物基因组DNA的报道。马小军等将CT A B液提取和氯仿抽提两步的上清液直接通过W izard纯化系统纯化得到的DNA,RAPD扩增效果良好,产率达2250μg/g[6]。张博等用硅珠(S iO2)颗粒吸附DNA纯化方法,从不同树木叶片中均得到了高质量的DNA样品[7]。黄椰林等对常规CT A B法提取的DNA用玻璃粉悬浮液纯化,所获DN的APCR产物能直接测序,比较适用于富含黏多糖、单宁、多酚和萜类化合物等次生代谢物的植物样品和长期保存的标本材料[8]。袁长春等也用玻璃粉吸附法从富含酚类的茶类植物中提取纯净的总DNA[9]。目前国内外开发了多种商品化的DNA提取纯化试剂盒,其分离原理有的利用核酸的分子量差异,有的利用特异性膜与DNA 结合达到分离、回收的目的,如离子交换柱、磁珠等。这些试剂盒针对不同的材料来源设计了不同的提取方法,操作简单、高效,DNA质量较高,但价格昂贵,提取量少。著名的国外的试剂盒生产厂家有S igma2Aldrich、Promega、Invitrogen、T aK aRa、Whatman等,它们针对不同来源的材料如微生物、动物体液、血液和组织、植物、加工产品、转基因产品等开发出一系列的试剂盒。国内的生物公司发展迅速,如上海生工、北京天为、北京博奥等也开发了系列试剂盒,质量与国外厂家相当,价格较低。除此之外,由于核酸提取纯化试剂盒制作门槛低,还有大量的生物公司提供试剂盒产品,使用者一定要慎重选择。DNA试剂盒经过了几十年的发展,已经不再局限于单纯的提取纯化,有些厂家推出了DNA提取—扩增PCR试剂盒,将DNA提取和PCR扩增结合起来,极大的提高了工作效率,如S igma2Aldrich公司的S igma’s E xtract2N2Am p Plant PCR kit等。另外,还有高通量的DNA提取产品,如高通量组织细胞研磨仪M M301,在常温和冷冻条件下对硬性、中硬性、韧性、脆性及纤维材料的研磨破碎,每次处理样品的个数可以多达48个甚至192个。美国应用生物系统公司6100型核酸提取仪,可用于RNA、DNA的提取纯化,可自编程序,可选预设的程序,具有严格的防交叉污染体系,可从不同来源的样品中同时提取96个样品。
4 DN A纯化及杂质去除
4.1 酚类杂质的去除 对植物中次生产物酚类物质的去除,普遍是在提取液中加入适量的抗氧化剂和螯合剂,防止多酚氧化褐变。在提取DNA过程中加入巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏糖醇、谷胱甘肽及抗坏血酸等巯基试剂,抑制氧化反应,避免褐化。在样品液氮研磨及提取缓冲液中加入高分子螯合剂PVP(聚乙烯吡咯烷酮)或PVPP(聚乙烯聚吡咯烷酮)等能络合多酚和萜类物质离心或氯仿抽提出去,有效的防止多酚物质氧化成醌类,避免溶液变褐而具有抗氧化作用。因此在提取液中加入适量的PVP或PVPP能提高DNA 的纯度),其用量视杂质的多少而定(1%～6%),PVP同时能有效去除多糖。因此将PVP和巯基乙醇配合使用并调整用量,能够有效地防止多酚污染。王玉成等认为以上的方法仅对褐化现象较轻者有效,却很难克服一些含酚类化合物丰富的植物,如柽柳、冷杉等树种的褐化。在CT A B缓冲液加入一定量的硼砂(提取缓冲液含0.0125m ol/L硼砂、2%CT A B、1.4m ol/L NaC l、巯基乙醇0.1m ol/L,pH值为9.0)提取柽柳、冷杉的RNA取得了良好的效果,而且在提取紫丁香、糖槭、旱柳等植物组织的RNA时也从未发生褐化[10]。
4.2 多糖类杂质的去除 多糖的污染是提取植物DNA时常遇到的另一棘手的问题[11]。植物组织中往往富含多糖,而多糖的许多理化性质与DNA很相似,因此很难将它们分开。经典的CsC l梯度离心能有效的除去植物中多糖,但梯度离心设备昂贵,操作不便且DNA得率很低。近年国内外有一些去除多糖的相关报道,Dellaporta等认为加入高浓度的K Ac有利于除去多糖[12];Fang等认为在1.0～2.5m ol/L NaC l 的高盐TE中,用无水乙醇沉淀DNA能除去多糖[13];Sue P orebski等在沉淀粗提DNA时,将NaC l的浓度提高至2.5 m ol/L以除去多糖[14];C andelario等通过调节材料的取样时期、使用量,在氯仿处理后加含2%CT A B的分离缓冲液,及延长离心时间等方法来有效去除仙人掌植物的多糖[15];徐志祥等将DNA沉淀重悬于30%乙醇中4℃放置过夜,离心,上清加乙醇至80%重新沉淀DNA,能去除多糖和其他杂质[16];陈大明等利用活细胞中由于细胞区室化多酚类以及其他杂质与DNA相互隔离的特性,在裂解细胞前用不含CT A B的提取缓冲液(0.14m ol/L葡萄糖、3%可溶性PVP、10 mm ol/Lβ2巯基乙醇)去除细胞质中大多数生化成分,同时有效地防止多酚类物质被氧化,从而达到排除多酚类等杂质干扰的目的[17];程运江等先用水饱、乙醚和1.2～1.5m ol/L Na2 C l溶液将大部分多糖去除,再用2倍乙醇沉淀DNA可大大提高效率[18]。An M ichiels等用生长2～4月的幼苗转移到暗室暗化处理4周的黄化叶提取DNA有效地防止多糖污染,同时发现在25℃异丙醇过夜沉淀DNA能减少杂质污染且大大提高产率[19]。关于提取DNA中蛋白质、糖类、多酚等各种杂质对分子生物学后续试验的影响,马小军等和文晓鹏等认为
0977 安徽农业科学 2007年
在一定范围内DNA样品中蛋白质含量的高低,可能不是影响PCR扩增的重要因素,去除RNA后尚未纯化的DNA作为模板进行RAPD扩增也能得到和纯化后一致的条带。但是,用E coRI和H indIII检测表明,未纯化的DNA不能用于酶切[20-21]。目前检测DNA的纯度最常用的方法是测定DNA 在230、260、280nm的吸收值,通过计算OD260/OD280来评价DNA的纯度,通常认为OD260/OD280在1.8～2.0表明DNA的纯度较好。尽管这种方法用得很普遍,但并不可靠,因为核酸在260nm处的吸收很强,只有存在高水平蛋白质杂质时才会引起这2个波长下吸收值的比值发生明显改变[22]。检测DNA纯度最佳的办法是采用E coRI、H indIII等限制性核酸内切酶对DNA进行酶切消化,只有能被酶切完全并可用作PCR模板的基因组DNA,才能证明其纯度高,所含蛋白质、多糖类等杂质少,才能进一步用于AF LP、RF LP、S outhern杂交等分子生物学的研究。
5 展望
快速、经济地从植物样品中提取高产量、高纯度的基因组DNA已成为植物分子生物学研究的首要问题。今后,基因组DNA提取方法研究的发展将趋于用非有机溶剂提取法替代传统的有机溶剂提取;实现一步提取法,省去繁琐的提取和多次离心过程,更适于批量操作;利用物理吸附法,操作简便、提取效率高、对基因组DNA没有损伤作用,适宜于自动化操作;提取过程自动化,把基因组DNA的提取与其他分子生物学技术(毛细细管电脉,PCR,基因芯片技术等)结合起来,实现从样品处理到基因分析过程的全部自动化操作。参考文献
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叶片含水量也逐渐下降;随着季节的变化,在高温季节(7～8月)各处理的草坪植物叶片含水量均达最低值,而在5～6月各处理的草坪植物叶片含水量均达到最高值。
(2)脯氨酸是植物体内的一种重要渗透调节物质,对干旱胁迫反应非常敏感。试验表明,当受到水分胁迫时,游离脯氨酸的积累效应在量上和速度上都得到大大加强,远远大于不受水分胁迫条件下游离脯氨酸的积累。其原因可能是:①由于合成受激,正常叶片脯氨酸抑制了其自身的合成,而干旱叶片中脯氨酸并不抑制其自身的合成;②氧化受到抑制;③干旱抑制了蛋白质的合成,从而也抑制了脯氨酸参与蛋白质的合成作用[6]。
(3)有研究指出,干旱胁迫破坏了植物体自由基的产生与清除间的平衡,降低了自由基清除系统的酶活力[5]。试验表明,随着土壤含水量的降低,草坪植物叶片中POD活性呈递增趋势。这说明干旱胁迫促使自由基产生,而活性氧的增加又对保护系统酶活性升高有诱导作用。
(4)草坪植物对不同土壤水分含量的反应敏感度最高的是游离脯氨酸含量,其次是叶片保护酶POD活性,再次是叶片含水量,而S OD、叶绿素含量对该研究设置的水分变化反应相对不敏感。
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1977
35卷25期 易庆平等 植物总基因组DNA提取纯化方法综述
植物基因组DNA的提取及其定性定量分析 【实验目的】 通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。 【实验原理】 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下(大于0.7 M NaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA。 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中，并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快，其次为线状DNA(L DNA)，最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。 核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。 1 OD260相当于dsDNA 50 μg/ml，ssDNA 33 μg/ml和ssRNA 40 μg/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260 nm和280 nm 的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000 μl量程各一支)、100 ml或250 ml锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、1.5 ml EP管、PE手套和乳胶手套。 二、药品 三羟甲基氨基甲烷(Tris)、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、β-巯基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化钠(NaCl)、盐酸、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、核酸染料。 三、试剂 1. 2×CTAB buffer 70%乙醇 RNaseA 0.5×TBE缓冲液(工作浓度) 凝胶加样缓冲液(6×) 6. 核酸染料 7. DNA marker 8. 酚/氯仿(1:1, V/V)
植物基因组DNA提取 一、实验目的 1、掌握植物基因组总DNA的抽提方法和基本原理。 2、学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 三、实验仪器及试剂 实验仪器：高速离心机；烘箱；冰箱；水浴锅；高压灭菌锅；Nanodrop。 实验试剂：玻璃珠，十二烷基磺酸钠(SDS)；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；乙二胺四乙酸（EDTA）；氯化钠；苯酚；氯仿；无水乙醇等。 四、实验步骤 1.SDS提取缓冲液在65℃水浴中预热。 2.将叶片置于1.5ml离心管中，液氮速冻，组织研磨器打样。 3.加入700 l的SDS提取缓冲液，涡旋摇匀。 4.置于65℃的水浴中，每隔10 min轻轻摇动，30 min后取出。
5.加入200 μl KAc溶液，摇匀，放入-20℃冰箱30 min。 6.10000 rpm离心5 min，上清移至新离心管中，12000 rpm离心5 min。 7.上清移至新离心管中，加入700 μl异丙醇，-20℃冰箱30 min。 8.10000 rpm离心5 min，弃上清，加入500 μl 70%乙醇漂洗。 9.弃液体，晾干。 10. DNA纯度与浓度测定（使用nanodrop）。 （1）DNA纯度：DNA的OD260/OD280一般为1.8左右。 OD260/OD280 ≈ 1.8：说明较纯； OD260/OD280 > 1.8：说明可能有RNA污染； OD260/OD280 < 1.8：说明可能有蛋白质污染。 五、注意事项 1. 叶片磨得越细越好。 2. 注意移液器的正确使用。 3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。 六、结果与分析 1.植物DNA提取所用试剂的作用？ 2.植物DNA提取的关键步骤有哪些？ 3.植物DNA提取后的用途有哪些？ 4.从化学结构、化学性质、存在场所以及功能等方面比较DNA和RNA的异同。
植物基因组D N A提取试剂盒(北京天根)
植物基因组DNA提取试剂盒 1 取植物新鲜组织约100 mg或干重组织约30 mg，加入液氮充分研磨。 2 将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700 μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20 min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。 3 加入700 μL氯仿，充分混匀，12,000 rpm（~13,400×g）离心5 min。 注：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚：氯仿/1:1进行等体积抽提。 4 小心的将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中，加入700 μL缓冲液GP2，充分混匀。 5 将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，弃掉废液。（吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心。） 6 向吸附柱CB3中加入500 μL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 7 向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 8 重复操作步骤7。 9 将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂
洗液。 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中的乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。 10 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min，12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，将溶液收集到离心管中。 注意：洗脱缓冲液体积不应少于50 μL，体积过小影响回收率。洗脱液的PH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2 min，12,000 rpm （~13,400×g）离心2 min。
1.2实验方法 1.2.1 茶花基因组DNA的提取 采用CTAB法[8]提取DNA，所有试剂（有机溶剂除外）和器皿都经高压灭菌，主要步骤如下： （1）取两片幼嫩新鲜叶片，置于预冷的研钵中，倒入适量液氮，迅速研磨成粉末状，随后加入3ml预热的2%CTAB抽提缓冲液和50ul抗氧化剂2-巯基乙醇，继续研磨成略有流动性的糊状或粥状，转入1.5ml的离心管中，于65℃水浴锅中保温约60min. (2)待混合物冷却至室温后加入等600ul的CI（氯仿：异戊醇=24：1）溶液混匀，轻轻颠倒离心管几次使管内混合物成乳浊液，常温下10000rpm离心10min,取上清液转入另一干净的离心管中。 （3）重复步骤（2）一次。 （4）取步骤（3）上清液加入2.5倍体积无水乙醇，仔细混匀，-20冰箱30min以上，沉淀DNA 4℃，12000rpm离心10min. (5)弃去上层有机溶剂，加500ul75%乙醇洗涤沉淀，4℃下8000rpm离心5min,弃去上清，洗涤沉淀3次。 （6）倒置或者37度培养箱烘干. (7)加50ulTE缓冲液溶解DNA，于-20℃冷藏备用。 1.2.2 DNA含量和质量的测定 （1）紫外分光光度法：取4ml提取的DNA，将之稀释200倍，测定提取的DNA在260nm 和280nm处的吸光度值，得出OD260/280的值以及DNA和蛋白质浓度。如蛋白质浓度过高，需纯化。 （2）琼脂糖凝胶电泳：配制1.0%琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液中，电压5V/cm电泳约60min，溴化乙锭染色20min,在凝胶成像系统上观察并拍照。 1.2.3 PCR扩增 (1)PCR反应在Biometro PCR仪上进行，反应体系为25ul:ddH2O 14ul,10×Buffer 2.5ul,MgCl(25mM) 2.5ul,dNTPs(2.5mM) 2.0ul,primer(2.0uM) 1.0ul,DNA 2.7ul(约
实验1 植物DNA的提取 实验目的 采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析。 掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。 实验原理 1、原理 核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中,前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。 在浓氯化钠溶液(1～2mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA 核蛋白的溶解度很 小；而在稀氯化钠溶液(0.14mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：①用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积95％乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。③用苯酚处理，然后离心分层，DNA或溶于上层水相，或存在于中间残留物中，蛋白变性后则停留在酚层内。吸出上面水层，将其注入两倍体积的95％乙醇溶液中，得到白色纤维状DNA沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的
DNA制品。为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。 在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH值4.0—11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。②物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性。又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂，不利于收集，应加以避免。③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，它会降解DNA分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。SDS和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。 2、DNA的提取原理 （1）CTAB法是一种快速简便的提取植物总DNA的方法：先将新鲜的叶片在液氮中研磨，破碎其细胞，然后加入CTAB分离缓冲液，将DNA溶解出来，再经氯仿-异戊醇抽提除去蛋白质，最后得到DNA。 （2）SDS法是植物总DNA的提取方法。先将新鲜的叶片在液氮中研磨以机械力破本碎细胞壁，然后加入SDS使细胞膜破裂，并同时将蛋白质和多糖等杂质与核酸分开。加入KAc可使SDS—蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式，使沉淀更加完全。 3、DNA的浓度测定和纯度分析 （1）定磷法：是对样品中核酸（DNA和RNA）含量的准确定量。将样品中的核酸用强酸（硫酸或高氯酸）消化成无机磷，然后用定磷试剂对生成的无机磷酸进行滴定。定磷试剂是酸性钼酸铵溶液，钼酸铵能与无机磷酸定量结合成磷钼酸络合物，该络合物能被抗坏血酸等还原剂还原成兰色的钼蓝，在660nm处有最大光吸收。 （2）紫外光吸收法：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。
题目：植物基因组DNA的提取与检测 一、实验目的 1.了解真核生物基因组DNA提取的一般原理； 2.掌握基因组DNA提取的方法和步骤。 二、实验原理 1.在液氮中对植物组织进行研磨，破碎细胞； 2.SDS等离子型表面活性剂能溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使核蛋白解聚，从而使DNA游离出来； 3.苯酚和氯仿等有机溶剂能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质； 4.上清液中加入异丙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE缓冲液中，即得植物基因组DNA 溶； 5.DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定：带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。 三、实验材料 1.设备 移液器，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，1.5ml离心管 2.材料 植物幼嫩叶片 3.试剂 （1）细胞提取液：100mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 5mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.25% SDS，1%β-巯基乙醇（去除酚类） （2）氯仿:异戊醇（24:1） （3）其它试剂：液氮、无水乙醇、 TE缓冲液、异丙醇、洗涤缓冲液 四、方法和步骤 1、取500μL细胞提取液于650C水浴（金属浴）中加热备用； 2、研钵用液氮预冷，新鲜植物叶片（自来水清洗，蒸馏水冲洗干），去除叶脉，剪成细条状，置于研钵中研磨成粉末状（越细越好）； 3、取0.1g粉末（大约两勺半）转移至500μL预热的细胞提取液中，迅速摇匀，650C 水浴（金属浴）中保温30min，10min左右温和颠倒混匀一次； 第 1 页
拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定 实验目的 1.通过实验学习并掌握用CTAB来提取DNA的方法。 2.了解CTAB的成分及作用。 3.学习PCR的原理并掌握其方法。 4.学习琼脂糖凝胶电泳的原理与方法。 实验原理 植物组织中绝大部分是核DNA，它和组蛋白、非组蛋白结合在一起，以核蛋白（即染色质或染色体）的形式存在于细胞核内。CTAB(十六烷基三甲基溴化铵，简称CTAB)：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度(0.3mol/L NaCl)时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇中。DNA是遗传信息的载体和基本遗传物质，它在遗传变异、代谢调控等方面起着重要作用，是分子生物学和基因工程研究的对象，但无论是研究植物DNA的结构和功能，还是开展外源DNA的转化、转导的研究，首先要做的就是从植物组织中提取天然状态的高分子量的纯化DNA。 T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA 序列,可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体；T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。 PCR基本原理： 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增DNA，具有类似细胞内DNA的复制过程:由一对
植物基因组D NA 提取 2ml 离心管提取 取新鲜叶片采用C TAB 法，按M urry 等{Murray, 1980 #9}的方法，略加改进，具体操作过程如下： 1. 2.0 ml 离心管加入离心管盖大小新鲜叶片2片； 2. 液氮充分研磨成粉末，加入900 μL CTAB 缓冲液； 3. 65 ℃水浴1小时，期间摇匀3次； 4. 置于4℃冰箱冷却至15 ℃以下； 5. 加入900 μL25: 24:1 酚/氯仿/异戊醇，上下混匀2-5 分钟，保证样品与氯仿 充分混合； 6. 12,000 rpm 离心20-30 分钟； 7. 取上清液约800 μL，加入预先加好的700 μL 异丙醇的1.5 ml 离心管中，轻 轻上下颠倒混匀； 8. -20℃冰箱静止30 分钟以上； 9. 12,000 rpm 离心15-20 分钟，弃上清夜； 10. 75%酒精洗涤沉淀，弃上清液，12,000 rpm 离心15-20 分钟； 11. 风干D NA，让酒精挥发干净（4 小时以上或过夜）； 12. 加入100 μL 的纯水（含终浓度为1%RNase）溶解D NA； 13. 放入37 ℃环境中，约60 分钟消化R NA； 14. 取2 μL DNA 进行检测。 50ml 离心管提取 取新鲜叶片采用C TAB 法，按M urry 等{Murray, 1980 #9}的方法，略加改进，具体操作过程如下： 1. 取新鲜叶片在研钵用液氮研磨成粉末； 2. 向50ml 离心管里加入叶片粉末，至刚好覆盖住管圆底部，加入20mlCTAB 缓 冲液充分混匀； 3. 65 ℃水浴1小时，期间摇匀3次； 4. 取出，冷却至15 ℃以下； 5. 加入20ml 的25: 24:1 酚/氯仿/异戊醇，上下混匀2-5min，保证样品与氯仿
一、植物基因组DNA提取 【实验目的】 掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 【实验原理】 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 【仪器、材料、试剂】 (一) 仪器 1．高速离心机 2．烘箱 3．冰箱 4．水浴锅 5. 高压灭菌锅 （二）材料 1．十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 2. 三羟甲基氨基甲烷（Tris） 3．乙二胺四乙酸（EDTA） 4. 氯化钠
5．2-巯基乙醇 6. 无水乙醇 7. 氯仿 8. 异戊醇 （三）试剂 1. CTAB抽提缓冲溶液: 250ml 配制方法：称取CTAB 4g，放入200 ml的烧杯，加入5 ml的无水乙醇，再加入100ml的三蒸水，加热溶解，再依次假如56 ml的5mol\l NaCl、20 ml 的1 mol\l Tris-HCl 20ml( PH8.0)、8ml 的0.5 mol/l EDTA定容至250 ml摇匀后，转到准备好的输液瓶中，贴上标签，高压灭菌后，降至室温, 冷却后加入2ml的1% 2-巯基乙醇（400ul），4℃保存。 2. 氯仿:异戊醇=24：1（配制方法如实验二） 3．TE缓冲液: PH8.0（配制方法如实验二） 【实验步骤】 (一) DNA的提取 1. 2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热； 2. 取少量叶片置于试管中，用小杵磨至粉状； 3. 加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动摇匀； 4. 置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出； 5. 冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇(24:1) 至满管，振荡2~3 min，使两者混合均匀； 6. 10000 rpm离心10 min，与此同时，将600 μl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中； 7. 10000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30s，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物； 8. 10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出 9. 加入800 μl 75%的乙醇，将DNA洗涤 30 min； 10. 10000 rpm离心30s后，立即倒掉液体，干燥DNA（自然风干或用风筒吹干）； 11. 加入50 μl 0.5 × TE缓冲液，使DNA溶解； 12. 置于-20℃保存、备用。
实验二、植物基因组DNA的小量提取 【实验目的】 掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 【实验原理】 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因DNA水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 【实验材料】 拟南芥叶片 【试剂和器材】 DNA提取液（1L）：称取24.228g Tris-HCl（0.2M, pH=9.0），LiCl 16.956g（0.4M），EDTA9.306g（2.5mmol/L），全部溶解完全后加入10g SDS先加入少量双蒸水搅拌至透明定容。 器材：研钵，恒温水浴，离心机，离心管等。 【实验步骤】 1、剪取新鲜幼嫩的植物叶片1~2片于1.5 mL离心管中. 2、先加入少量的DNA提取液100 μL，用研磨棒充分研磨尽量避免提取液溅出。 3、再加入600 μL的DNA提取液，使DNA提取液的总体积为700μL，上下颠倒混合均匀。 4、放入高速离心机4℃条件下12 000 rpm离心15 min。 5、取上层水相，移入标有相应序号的新的离心管中，加入600 μL的异丙醇（与加入DNA 提取液的总体积相同），上下颠倒混匀。放置于-20℃冰箱中40 min或以上，使DNA沉淀。 6、放入高速离心机，4℃条件下12 000 rpm离心10 min，沉淀DNA，弃上清。 7、加入1 mL 70%的乙醇洗涤，放入高速离心机，4℃条件下12 000 rpm离心5 min。 8、重复步骤（7），洗去DNA中的杂质。 9、将离心管倒置在吸水纸上，待干燥后，加入20 μL 60℃双蒸水，DNA完全溶解后，放4℃ 冰箱待用，长期保存需放入-20℃。 【实验结果】 可以看到管底有沉淀，待检测
实验四植物DNA的提取 一、实验目的 掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析。 二、实验原理 1、核酸提取的基本原理 核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。 在浓氯化钠溶液(1～2 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：①用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积的无水乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。③用苯酚处理，然后离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内。 吸出上面水层，加两倍体积的无水乙醇溶液，得到白色纤维状DNA沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。 为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。 在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH值4.0～11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。②物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性，又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂，不利于收集，应加以避免。③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，它会降解DNA分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。 SDS和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。
植物基因组DNA提取实验操作步骤 1取植物新鲜组织约100mg或干重组织约30mg，加入液氮充分研磨。（植物细胞有细胞壁,液氮可以让细胞冷冻起来,变得很脆,这样容易破细胞壁。同时,液氮的超低温可以大大降低酶活性,防止降解。 注： 1、液氮的温度是-196℃，不要冻伤自己的手，带上手套。 2、用一个保温杯，大一点的，把液氮取出来放在保温杯里，盖上盖子。 3、然后用液氮将研磨棒和研钵预冷。 4、将样品快速放入研钵中，快速研磨，在液氮挥发完之前再加入液氮，一定不要让液氮挥发完或者样品呈现那种黏糊的状态，这样样品中DNA容易降解。 5、等到样品呈现细粉末状态了基本就可以了，用药勺把样品迅速舀到1.5ml 离心管里。） 2将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μL65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。（水浴时间依实验具体情况而定，看样品裂解情况，具体看裂解液变得清澈透明为止） 3加入700μL氯仿，充分混匀，12,000rpm（~13,400×g）离心5min。 注：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚：氯仿/1:1进行等体积抽提。 4小心的将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中，加入700μL缓冲液GP2，充分混匀。 5将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000rpm（~13,400×g）离心30s，弃掉废液。（吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心。） 6向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 7向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm（~13,400×g）离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 8重复操作步骤7。 9将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm（~13,400×g）离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂
植物DNA的提取分离技术 摘要：主要介绍了近年来国内外几种常用的DNA提取方法：CTAB法、SDS法等，并在对其进行了简单的归纳总结与比较分析同时，并介绍了一些新的改良方法和其他植物提取方法 关键词：植物DNA 提取方法研究进展 市售中药材大多为干品,而中药材的加工和贮藏整个过程,如日晒、高温烘干等都不利于DN的完整性, 为达到要求目前国内外研究发现并使用的DNA提取方法有很多[1-12]，其中被最为广泛应用的DNA提取方法是传统的CTAB法和SDS法[13]。由于不同植物的材料组分和干湿程度各异，因此对不同植物DNA的提取存在着不同的效果。目前许多学者都在致力于研究不同的植物DNA提取方法。他们在探索新方法的同时，也针对不同的植物，在传统的提取方法上进行着一些新的改良。 1.十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）法 在目前众多的DNA提取方法中，CTAB法是其中最为广泛应用的一种。它既可以裂解细胞，又可以有效地去除多酚类和多糖类物质的沉淀，因而经常被应用于植物的DNA提取工作中。 1.1方法及原理 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB 与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸。通过有机溶剂抽
提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 1.2 CTAB提取缓冲液的经典配方 Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl 提供一个高盐环境，使DNP 充分溶解，在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离。 β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除 PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。 1.3适用范围及一些改良 由于CTAB提取法能够有效地去除多糖及酚类物质的沉淀，因而适用于从含酚类及糖类物质较高的植物材料中提取DNA。经研究发现CTAB提取法在落羽杉属树木、黑木相思、野生稻、野燕麦、枸杞、花生的DNA的提取中，相比较其他提取方法来说都是最好的提取方法。为了缩短提取流程，提高提取质量，研究人员在传统方法的基础上，针对不同植物的特点，对一些提取步骤进行了改进。李先进［11］在对四种药用蕨类DNA提取的比较研究中发现，由于酚类物质极其容易被氧化，因此可以在最开始研磨材料的时候加入4%PVP，以防止研磨中细胞组织破裂后酚的氧化，从而获得更为理想的DNA。黄永莲［5］
《分子生物学》实验报告 实验一植物基因组DNA的提取及其定性、定量分析【实验目的】
通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。 【实验原理】 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下(大于0.7 M NaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA。 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中，并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快，其次为线状DNA(L DNA)，最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。 核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。1 OD260相当于dsDNA 50 μg/mL，ssDNA 33 μg/mL和ssR NA 40 μg/mL。可以此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260 nm和280 nm 的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材 离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000 μL 量程各一支)、100 mL或250 mL锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、 1.5 mL EP管、PE手套和乳胶手套。 二、药品
植物基因组提取(CATB法) 一、实验目的 掌握植物总DNA的抽提方法和基本原理。学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十二烷基肌酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 三、实验材料 水稻幼叶 四、主要试剂配方 2% CTAB抽提缓冲溶液: CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml( PH8.0) 0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌, 冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇（400ul）氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。 五、实验步骤 1. DNA的提取 （1）2%CTAB抽提缓冲液在65℃水浴中预热。 （2）取少量叶片（约1g）置于研钵中，用液氮磨至粉状； （3）加入700ul的2%CTAB抽提缓冲液，轻轻搅动； （4）将磨碎液分倒入1.5 ml的灭菌离心管中，磨碎液的高度约占管的三分之二； （5）置于65℃的水浴槽或恒温箱中，每隔10 min轻轻摇动，40 min后取出； （6）冷却2 min后，加入氯仿-异戊醇（24：1）至满管，剧烈振荡2~3 min，使两者混合均匀； （7）放入离心机中10 000 rpm离心10 min，与此同时，将600 µl的异丙醇加入另一新的灭菌离心管中； （8）10 000 rpm离心1 min后，移液器轻轻地吸取上清夜，转入含有异丙醇的离心管内，将离心管慢慢上下摇动30 sec，使异丙醇与水层充分混合至能见到DNA絮状物； （9）10000 rpm离心1 min后，立即倒掉液体，注意勿将白色DNA沉淀倒出，将离心管倒立于铺开的纸巾上； （10）60 sec后，直立离心管，加入720 µl的75%乙醇及80 µl 5 M的醋酸钠，轻轻转动，用手指弹管尖，使沉淀与管底的DNA块状物浮游于液体中； （11）放置30 min，使DNA块状物的不纯物溶解； （12）10000 rpm离心1 min后，倒掉液体，再加入800 µl 75%的乙醇，将DNA再洗
实验一CTAB法提取植物基因组DNA 实验目的： 学习从植物组织中（幼叶）提取基因组DNA的基本原理和方法。 实验原理： 采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类（尤其是氧化酶类），其对DNA的抽提产生不利的影响，所以在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂（如巯基乙醇）以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜并与核酸形成复合物。 该复合物在高盐的溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀（CTAB能溶于乙醇）即可使核酸分离出来。 CTAB溶液在低于15度时会形成沉淀洗出，因此再将其加入冰冷的植物材料中之前必须预热（65度），且离心温度不要低于15度。 实验步骤： 1、取幼嫩的植物叶片（3-5g）剪碎液氮研磨成粉，转入1.5ml离心管内。加入等体积的65℃预热的DNA提取缓冲液置于65℃的恒温水浴摇床上1-2h(1.5h)。 2、加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻上下颠倒5分钟，静置5分钟，之后于12000rpm离心10分钟。 3、吸取上层水相，重复步骤2一次。 4、吸取上层水相，加入预冷2/3体积的异丙醇，轻缓颠倒2分钟并置-20℃冰箱内10min，待DNA沉淀后于12000rpm离心收集，收集的DNA于70%乙醇中洗2-3次。将弃去乙醇风干后的DNA加适量水使其溶解。 5、待DNA完全溶解后加入1-2μl不含RNAaseA（10mg/ml），37℃保温1h以除去DNA中的RNA。 6、于Eppendorf管中加入1mL氯仿：异戊醇（24：1）轻轻上下颠倒10分钟后10000rpm离心10分钟。 7、吸取上层水相并先后加入1/10体积的3M醋酸钠及2倍总体积的预冷的无水乙醇，接着置于-20℃冰箱，10分钟后10000rpm离心10分钟，弃去无水乙醇，加入70％乙醇洗涤2-3次，风干，最后将DNA溶于适量（200-500μl）TE中。