1. 检验目的与原理
1.1 检验目的
规范丙型肝炎病毒核心抗原检测试验，确保检测结果准确性和重复性。可用于临床辅助诊断是否感染丙型肝炎病毒。
1.2 检验原理
应用ELISA法原理检测人血清或血浆中的丙型肝炎病毒游离核心抗原，用2株丙型肝炎病毒核心抗原的单克隆抗体包被酶标板，另2株丙型肝炎病毒核心抗原的单克隆抗体标记辣根过氧化物酶，加入TMB显色液后显色，用来检测血清或血浆中的丙型肝炎病毒游离核心抗原。
1.3 分析参数
样品量100μL
试剂量100μL
方法ELISA
反应时间90分钟
反应温度37℃
2. 样本收集和贮存
2.1 原始样本系统
血清（包括SST管）和血浆（EDTA-K2、肝素锂、肝素钠、枸橼酸钠、ACD、CPDA-1、CP2D、CPD、草酸钾），尿液（晨尿、随时尿、24小时尿等）或其它体液（羊水等）使用玻璃管或塑料管分离样本，无黄疸、无溶血、无脂血，已分离出的样本应立即分析。
2.2 试管及填充物类型
血清样本需用标准试管或有分离胶的真空管，收集3ml血液。待血液凝固后3500rpm 离心5分钟，分离血清。
2.3 保存条件及时间
2.3.1接收标本后在置1-2h后将标本离心分离出血清或血浆，避免溶血。离心必须达到3000rpm 15min，离心后的血清中不能含有颗粒物和微量纤维蛋白。
2.3.2标本保存时间：室温（15-25℃）下可稳定48h，普通冰箱中（2-8℃）稳定5d，在-20℃最多可保存4周。避免反复冻融。不可使用热灭活的标本。
2.3.3已完成测试的标本保持完整的识别号，置4-8℃冰箱内保存7d。
3. 试剂
3.1 试剂成分
丙型肝炎病毒核心抗原检测试剂盒（酶联免疫法），湖南康润药业有限公司，国药准字
3401179。
试剂盒组分：1. 抗HCV-cAg单克隆抗体包被酶标板；
2.抗HCV-cAg酶标记抗体工作液；
3. HCV-cAg阳性对照；
4. HCV-cAg阴性对照；
5.浓缩洗涤液；
6.TMB显色液A；
7.TMB显色液B；
8.终止液；
9.附件：自封袋、封板模和产品说明书。
3.2 试剂准备
试验前提前将所需的试剂盒从贮藏冰箱领出，室温平衡30分钟。
3.3 试剂贮藏要求（Storage Instruction）
未打开的试剂盒保存于2-8℃，效期12个月。不可冻存。
4. 仪器
TECAN酶免工作站。
5. 校准
见TECAN酶免工作站SOP。
6. 操作步骤
6.1配液：浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释。
6.2加样：将微孔条固定于支架，按序编号。每次检测均需设置阴性对照、阳
性对照和空白对照各2孔。空白对照孔直接加入样品稀释液200微升，其余每孔加样品稀释液100微升，分别在相应孔加入待测样品、阴性对照和阳性对照各100ul。
6.3温育：充分混匀，封板，置37°C孵育60分钟。
6.4洗板：小心揭掉封板模，用洗涤液洗涤5遍，最后一次尽量扣干。
6.5加酶：每孔加入酶结合物200ul。
6.7 温育：充分混匀，加上封板膜，置37℃温育30分钟。
6.8 洗涤：小心揭掉封板模，用洗涤液洗涤5遍，最后一次尽量扣干。
6.9 显色：每孔加入显色剂A、B各50μl，轻轻振荡混匀，37℃避光显色10分钟。
6.10 测定：每孔加终止液50μl，轻轻振荡混匀，用酶标仪读值，在双波长
450nm/630nm（单波长检测以空白对照调零）下读取各孔A值。
7. 质量控制
无
8. 检验结果报告
8.1 结果计算
CUT OFF值=阴性对照孔A值+0.06。（阴性对照A值大于0.1和阳性对照A值小于0.6时应重新试验，阴性对照A值≤0.06时以0.06计算。）
待测样品A值＜CUT OFF值时，判为阴性。
待测样品A值≥CUT OFF值时，判为阳性。
8.2 结果审核
由资深专业人员负责检验结果的审核。确认反应板结果的有效性及室内质控在控。确认反应板反应外观与判读的结果一致，核对判断的阴阳性结果个数。审核者认真审核每一个测定结果，对发出报告结果的可靠性负责，并在报告单的审核者处签字。审核与其他标志物等的关系，如出现与临床不符甚至相悖的情况，应分析与查找原因。对弱阳性标本再重复试验确定它的结果。如果重复检测都是弱阳性结果的标本建议对其进行跟踪检测。
8.3 报告传输及打印
结果经审核后，确认准确无误后发出报告。报告单上标明结果的参考区间、报告日期、时间、操作者和审核者签名，并有与申请单相同的信息。如收到标本的质量可能对测定结果有影响的也在报告单上指出。
8.4 测量不确定度的评定方法见《免疫激素测量不确定度的评估报告》。
9．参考范围
阴性，提示没有检测到丙型肝炎病毒核心抗原。
10. 可报告区间
阴性～阳性。
11. 危急值报告
不适用。
12. 方法的局限性
12.1 本试剂仅用于定性检测人血清或血浆样品中的HCV游离核心抗原。
12.2 由于ELISA反应原理的限制，本试剂检测结果阴性并不排除HCV感染的可能，检测结果阳性必须结合确诊试剂或其他指标和临床信息进行分析。
13．临床意义
HCV-cAg为HCV的早期感染的标志，几乎与HCV-RNA同时出现，感染后的14-70d 为HCV-cAg的检测时段
14. 安全防范措施
本试剂盒应视为有传染性物质，请按传染病实验室检查规程处理。
14.1在处理试剂和标本的地方禁止吸烟，饮食。
14.2使用试剂盒和标本时，必须戴一次性手套，穿试验服。使用后请彻底洗手清洁。
14.3用过的加样枪头等耗材应作为医用垃圾处理；患者样本及其他潜在感染材料试验后应放
入医用垃圾桶内。
14.4试剂含有叠氮钠作为防腐剂，叠氮钠可以和铅铜反应形成爆炸的金属叠氮化合物。为防止金属叠氮化合物的形成，应用大量的水冲洗以免其堆积。
14.5使用过的器具、废液、废物等除用次氯酸钠（有效氯浓度1,000ppm，浸泡1小时以上），戊二醛（2%，浸泡1小时以上）进行消毒以外，还要进行高压蒸汽灭菌（121℃ 1小时以上）及焚烧等处理。
14.6为了避免形成气溶胶，所有样品尽可能不要在空气当中暴露太长时间；
14.7样本溢出，用吸水纸将溢出的标本吸干，并喷洒1000mg/L消毒液于表面保持
30-60分钟后再用抹布擦拭，最后用清水擦净。将用过的抹布放入1000mg/L的消
毒液中浸泡2小时。
15. 性能参数
15.1 精密度
15.2 分析灵敏度及分析特异性
试剂盒内带有的阳性对照血清按规定进行试验时，抗体效价相对于标准值在±1管以内。
15.3 准确度
15.4 特异性和灵敏度
15.5 分析测量范围
15.6 临床可报告范围
15.7 携带污染率
不适用。
15.8 干扰物质
15.8.1 样品中如果存在红细胞等其他有型成分，会给反应带来不便，所以应在离心出去之后
在进行检查。
15.8.2 血清样品即使钝化也不会影响检查结果。
16. 参考文献
试剂使用说明书。
细胞凋亡试验常用的方法（MTT法、荧光法、DNA琼脂糖凝胶电泳法与流式细胞仪检测法） （一）药物对肿瘤细胞的抑制效应的MTT法： 用培养基将肿瘤细胞调整至2 X108个/L，在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液于37℃、5% CO2下培养过夜。 次日每孔加入不同浓度的药物100mg/L作为试验组，设加完全培养基不加药物的阴性对照，并用功能明确的药物为阳性对照和0.5%的乙醇溶剂对照，每组均设4-6个复孔（平行孔）、37℃、5% CO2继续培养。 培养至12h、24h、48h、实验终止前4-6h加入10ulMTT（5g/L），培养4-6h后，阴性对照孔中已形成明显的蓝紫色颗粒结晶时加100ul/孔SDS-HCl终止反应，于37℃存放过夜。 用酶标仪在A570波长下测吸光度值，按下式计算抑制率 抑制率（%）=（1-试验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值）x 100%。 （二）荧光法： 选用上述最佳浓度作用于肿瘤细胞，培养细胞48h后，收货细胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室温下固定30min。 弃去固定液，并用PBS洗2次后，用1%Triton X-100作用4min加入适量的0.5mg/L DAPI 荧光染色60min，用PBS冲洗3次，取10ul滴片，干燥后于荧光显微镜下检测断裂的颗粒和片状荧光。 （三）DNA琼脂糖凝胶电泳法： 1、DNA提取： 用大方瓶培养肿瘤细胞，每瓶10ml，细胞浓度为3 x 108个/ml，每隔药物浓度、作用时间均设2瓶，共分3个时间段，4个药物浓度。共培养26瓶细胞。 分别于细胞中加入不同浓度的药物，于37℃、5% CO2中分别培养12h、24h、48h，收货细胞，用PBS洗2-3次。 于-20℃将细胞冷却处理10min后将细胞收集至离心管中，加1ml细胞裂解液，再加蛋白酶K，轻轻振摇使悬液混匀，成黏糊状，50℃过夜。 冷却后加入等体积的饱和酚溶液，混合后10000r/min离心10min，吸出上层水相，移至另一离心管中，再加入等体积饱和酚溶液重复抽提一次，直到无蛋白为止。 吸上清加入氯仿/异戊醇（24：1）按上述方法再抽提一次。 吸取水相层加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液，混匀。 再加入2.5倍体积冷无水乙醇，混合置-20℃处理30min后，10000r/min离心10min，沉淀部分为提供的DNA，弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗2次，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干乙醇。 加入200ulTE缓冲液融解DNA，再加入25ul的RNA酶，置37℃作用30min，置4℃冰箱保存。 2、琼脂糖凝胶电泳： TBE缓冲液配制1.8%琼脂糖凝胶。在微波炉内煮沸至琼脂糖融解，待冷却至60℃时，加入溴化乙锭，使其终浓度为0.5mg/ml，混匀后灌胶。 待凝胶固定后放入含TBE电泳液的电泳槽内，使TBE电泳液盖过凝胶。 取10-15ul提取的各组DNA样品液与上样缓冲液按4：1比例混匀后点样。 60V电泳1h，用紫外透射仪观察梯形条带。
常用细胞凋亡检测方法（图） 转载请注明来自丁香园 发布日期：2012-02-16 13:41 文章来源：丁香通 关键词：丁香园生物专题义翘神州细胞培养点击次数：951 一、细胞凋亡的形态学检测 1、光学显微镜和倒置显微镜 ①未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 ②染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA 特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释，终浓度为10 ug/ml。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为10 ug/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 3、透射电子显微镜观察 结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细核红染。因此将Annexin-V 与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 方法
ELISA检测方法有哪些？ 酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）是研究蛋白抗体的重要方法。它是采用抗原与抗体的特异结合将被测物质与酶标抗体进行直接或间接结合，然后通过标记酶与底物产生颜色反应进行定性和定量分析。那么，它与其它检测方法的灵敏度及您了解吗？跟着小编往下看 ELISA通常分为四种类型：直接法、间接法、竞争法、夹心法等，直接上图： 直接法（Direct ELISA）仅需要抗原和酶标一抗，操作简便，可避免交叉反应，然而该方法要求酶标一抗有较高的特异性要求，同时也并非所有的一抗适合标记处理。直接法在实际运用中并不多见，它并不能对样本中抗体进行定量分析，因为样本中抗体是非酶标抗体，无法进行后续显色，但是该法经过改进就是竞争性ELISA方法，见后文。 间接法（Indirect ELISA）使用了二抗增加信号强度，也使抗体的选择多样化，然而间接法容易产生交叉反应。间接法只能用于测定抗体，主要用于疾病的诊断，其优点是只需要改变包被抗原，酶标抗体是通用的。 夹心法（Sandwich ELISA）分为双抗体夹心法和双抗原夹心法： 双抗体夹心法中抗原被两个抗体——捕捉抗体和检测抗体，结合于不同位点。捕捉抗体固定于载体上，检测抗体通过结合抗原进行显色分析。应用于双抗体夹心法检测的抗体需是单抗，而且对同一抗原结合位点不同，如此才能避免交叉反应或两种抗体竞争性结合同一位点。夹心法具有高灵敏度、高专一性的优势，但该法只适用于有多个结合位点的抗原检测，主要用于检测各种大分子抗原——例如在医学检测中测定HBsAg、HBeAg、AFP等。由于双抗体夹心法特异性高，在检测过程中有时会将样本和酶标抗体同时加入进行反应（一步法），此时如果样本中抗原含量过高会导致其与固相抗体和酶标抗体均有结合而不形成“夹心复合物”，
细胞凋亡检测方法 一、细胞凋亡的形态学检测 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，全面皱缩，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体，凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 （2）染色细胞： 姬姆萨（Giemsa）染色、瑞氏染色等：正常细胞核色泽均一；凋亡细胞染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态；坏死细胞染色浅或没染上颜色。 苏木素-伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞），正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有：Hoechst 33342，Hoechst 33258，DAPI。三种染料与DNA 的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。 PI和Hoechst33342双标：PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但PI不能通过正常细胞膜，Hoechst则为膜通透性荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调
亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 3 透射电子显微镜观察 凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜内侧，但在细胞凋亡早期，PS可从细胞膜内侧翻转到细胞膜表面，暴露在细胞外环境中。磷脂酰丝氨酸的转位发生在凋亡早期阶段，先于细胞核的改变、DNA断裂、细胞膜起泡。体内的吞噬细胞可通过识别
实验14 细胞凋亡的诱导和检测 20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。 细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。细胞凋亡时的生化变化特征是核酸切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。 1．细胞凋亡的检测方法 凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。
形态学观察方法：利用各种染色法可观察到凋亡细胞的各种形态学特征： （1）DAPI时常用的一种与DNA结合的荧光染料。借助于DAPI染色，可以观察细胞核的形态变化。 （2）Giemsa染色法可以观察到染色质固缩、趋边、凋亡小体形成等形态。 （3）吖啶橙(AO)染色，荧光显微镜观察，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （4）吖啶橙(A())／溴化乙啶(EB)复染可以更可靠地确定凋亡细胞的变化，AO只进入活细胞，正常细胞及处于凋亡早期的细胞核呈现绿色；EB只进入死细胞，将死细胞及凋亡晚期的细胞的核染成橙红色。 （5）台盼蓝染色对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助，如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。使用透射电镜观察，可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 （6）木精-伊红（HE）染色是经典的显示细胞核、细胞质的染色方法，染色结果清晰。发生凋亡的细胞经HE染色后，其细胞大小的变化及特征性细胞核的变化：染色质凝集、呈新月形或块状靠近核膜边缘，晚期核裂解、细胞膜包裹着核碎片“出芽”凸出于细胞表面形成凋亡小体等均可明显显示出来。 DNA凝胶电泳：细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞小分子 质量DNA片段增加，高分子DNA减少，胞质出现DNA片段。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180～200 bp DNA片段，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片段，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒（酶联免疫法） 1 试剂信息 试剂厂家：北京万泰生物药业股份有限公司 2 样本要求 2.1 本试剂使用样品为人血清或血浆，含有EDTA、柠檬酸钠或肝素等抗凝剂的样品可用于本实验。 2.2 不能检测含悬浮纤维蛋白或聚集物，重度溶血的样品。 2.3 样品中应无微生物，可在2-8℃储存1周，长期储存应低温冻存，避免反复冻融。 2.4 使用前请将样品室温平衡30分钟以上，冷冻样品实验前需混匀。 3 检测步骤 3.1 配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释。 3.2 编号：将样品对应微孔板按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照1型、2型各1孔、空白对照1孔。 3.3 加样：分别在相应孔中加入待测样品或阴、阳性对照100μL。 3.4 温育：用封板膜封板后，置37±1℃温育60±2分钟。 3.5 洗板：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量扣干。 3.6 加酶：每孔加入酶标试剂100μL，空白孔除外。 3.7 温育：用封板膜封板后，置37±1℃温育60±2分钟。 3.8 洗板：操作同步骤5。 3.9 显色：每孔加入显色剂A、B液各50μL，轻轻震荡混匀，37±1℃避光显色30±1分钟。 3.10 测定：每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，10分钟内测定结果。 4 参考值 临界值（CUTOFF）计算：临界值=阴性对照A均值+0.12. 5 检验结果的解释 5.1 阴性对照孔A值≦0.10，阳性对照A值≧0.80，否则试验无效。 5.2 若有1孔阴性对照A值大于0.1应舍弃，若两孔或两孔以上阴性对照A值大于0.1，应重复试验。
5.3 阴性判定：样品A值<临界值（CUTOFF）者为HIV抗体阴性。 5.4 阳性判定：样品A值≧临界值（CUTOFF）者为HIV抗体阳性。（注意：初试阳性应重新取样双孔复试。复试阳性者应按《全国艾滋病检测技术规范》送HIV确证实验室进行确证实验。）
(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项 编辑整理： 尊敬的读者朋友们： 这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项）的内容能够给您的工作和学习带来便利。同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。 本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为(完整)常见细胞凋亡检测的方法与注意事项的全部内容。
常见细胞凋亡检测的方法与注意事项 大家常把细胞凋亡和细胞坏死混淆,其实两者是不同的细胞死亡形式，大家可以在死亡细胞的形态、生化和分子指标上将二者区分开来，细胞凋亡检测的方法不少，这里就总结下几种常用的检测方法. 细胞凋亡检测更多详情，点击查看不可不知的细胞检测方法——MTT 一、细胞凋亡的形态学检测 根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1) 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落. (2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等.凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割 成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有:HO 33342 (Hoechst 33342），HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ～1mg/ml。 结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样(creased)，部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体(图1）。 3 透射电子显微镜观察 结果评判：凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro—apoptosis nuclei)的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations)的空泡结构(图2）；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化;细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体。 图2
ELISA检测 ----- 固相捕获法测IgM抗体 在病原体急性感染的诊断中，通常需检测IgM抗体，如急性甲型肝炎诊断的血清抗HAVIgM检测、急性乙型肝炎病毒感染的血清抗HBc lgM检测和TORCH项目的系列IgM检测等。IgM抗体也有使用间接法测定的，如目前在市场上可见到的有些TORCH系列的IgM检测试剂盒。在使用间接法测IgM抗体时，由于临床血清样本中含有高浓度的IgG抗体，其中部分特异IgG抗体将与IgM抗体竞争与固相抗原结合，从而干扰IgM抗体的检测。 因此，在使用间接法测定IgM抗体时，通常须将血清样本用抗人IgG抗体或SPA预处理，以去除IgG的干扰。这样不但测定较为繁琐，而且影响测定的特异性和灵敏度。目前，常用的IgM抗体检测方法为捕获法，即以抗人IgM抗体(抗人u链)作为固相抗体，当加入血清标本时，其中的IgM类抗体(特异的和非特异的)即可被固相抗体捕获，再加入特异抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标抗特异抗原的抗体，最后加入底物显色。具体操作步骤如下： 1．首先将抗人IgMbt链抗体于碳酸盐缓冲液中40c下过夜包被聚苯乙烯等固相，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。 2．加入含待测IgM抗体的临床样本如血清等，温育一定时间后洗板；此时，待测样本中的IgM抗体就会与固相上的抗P链抗体反应而吸附于固相上。 3．加入特异的抗原如HAV抗原、HBcAg等，温育一定时间后洗板；此时，特异抗原就会与固相上的特异IgM抗体发生反应。 4．加入酶标记的抗特异抗原的抗体，温育一定时间后洗板；此时，在固相上即形成相应的抗原抗体复合物。 5．加入酶底物，温育显色测定 本方法要着重注意的是RF(1gM类)及其他非特异IgM的干扰。RF(1gM类)由于其能与固相抗人u 链抗体结合，并可与随后加入的酶标抗体(动物IgG)反应，从而导致假阳性反应。而非特异IgM由于其
细胞凋亡的几种检测方 法 Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】
细胞凋亡的几种检测方法 1、形态学观察方法 （1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。 （2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 （4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 2、 DNA凝胶电泳 细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规
律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。 正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带 3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。 检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体’ 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘ 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’ 4、加酶的底物，测光吸收制。 用途 该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，
ELISA（酶联免疫吸附测定，enzyme linked immunosorbent assay）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。 基本原理： ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 ③在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 ④加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 双抗夹心法 夹心法常用于检测大分子抗原，一般的操作步骤为: ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，检体中若含有待测的抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一的一次抗体，与待测抗原进行键结； ④洗去多余未键结一次抗体，加入带有酶的二次抗体，与一次抗体键结； ⑤洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果。 间接法 间接法常用于检测抗体，一般的操作步骤为： ①将已知的抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余的抗原。
②加入待测检体，检体中若含有待测的一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。 ③洗去多余待测检体，加入带有酶的二次抗体，与待测的一次抗体键结。 ④洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酶呈色，藉仪器（ELISA reader）测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。 竞争法 竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为： ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③加入带有酶的抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酶的抗原可键结的固著抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结，即所谓竞争法之由来。 ④洗去检体与带有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，当检体中抗原量越多，代表塑胶孔盘内留下之带有酶的抗原越少，显色也就越浅。 注：当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原，或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时，一般会考虑使用竞争法ELISA。
细胞凋亡的几种检测方法 1、形态学观察方法 （1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。 （2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 （3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 （4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 2、DNA凝胶电泳 细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发
生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带 3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。 检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体’ 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘ 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’ 4、加酶的底物，测光吸收制。 用途 该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，
细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。基因组DNA 断裂时，暴露的3'-0H 可以在末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal Deox yn ucleotidyl Tran sferase,TdT）的催化下加上荧光素（FITC）标记的dUTP（fluorescein-dUTP），从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测，这就是TUNEL 法检测细胞凋亡的原理。 TUNEL法特异性检测细胞凋亡时产生的DNA断裂，但不会检测出射线等诱导的DNA断裂（和细胞凋亡时的断裂方式不同）。这样一方面可以把凋亡和坏死区分开，另一方面也不会把 射线等诱导发生DNA断裂的非凋亡细胞判断为凋亡细胞。 针对问题2（TUNEL法的实验原理是什么？）： 基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dUTP进入细 胞内，在rTDT的辅助下dUTP与核断裂的DNA 3 -0H结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dUTP 上的biot in 结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biot in 分子），最后用DAB 过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情 况。■ 1. TUNEL工作原理：简单说就是一一TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况。 其原理是；生物素（biot in ）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT En zyme）的 作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3' - 0H末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的 链霉亲和素（Streptavidin-HRP ）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通 显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-0H形成，很少能够被染色。 针对问题3 （TUNEL实验中几个关键步骤是什么？）： 1. 充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60度20min，再用二甲苯两次5~10min ;而水化用梯度乙 醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀； 2. 把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10~30min, 几um切片用短时间；几十um切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和 抗体进入胞内。 3. 适当延长TUNEL反应液的时间。一般是37度1h,你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2h,但要结合你最终的背景着色。 4. DAB显色条件的选择。一般DAB反应10分钟左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过 30min;我不喜欢用promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色。 5. PBS的充分清洗。我个人认为，在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加 次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。 6. 此外，内源性POD的封闭也十分关键。对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，我的经 验是适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的 特异性染色。 针对问题5.细胞通透的原理、通透剂的浓度、孵育时间及其配制方法？ 1. 蛋白酶K是消化膜蛋白，从而起打孔作用，增加
细胞凋亡的检测方法 一、细胞凋亡概念： 细胞凋亡是指为维持内环境的稳定，有基因控制的细胞自主的程序性死亡。 细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。 细胞凋亡与胚胎发育、自身免疫耐受、肿瘤发生、病毒感染等生理、病理过程密切相关,近年来一直是生物医学领域各专业的研究热点。选择合适的凋亡检测方法是研究细胞凋亡研究的关键。 二、细胞凋亡的检测方法： 1. 磷酯酰丝氨酸(PS)外翻法(Annexin V 法) 在凋亡细胞中，磷酯酰丝氨酸 (PS) 从质膜内侧转移到外侧，暴露在细胞外环境中。 荧光基团或荧光蛋白标记的膜联蛋白V 可与暴露在质膜外侧的PS 结合，用于识别凋亡细胞。碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V 与PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。 应用实例：以FITC Annexin V/ PI Apoptosis Kit 为例子 2. Caspase-3活性的检测: 半胱氨酸蛋白酶caspase 家族蛋白的激活是凋亡进程中的一个必要的决定性事件。其中caspase-3的激活在凋亡信号传导的许多途径中发挥着关键的作用。Caspase-3正常以酶原（32KDa ）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KDa ）和两个小亚基（12KDa ）组成， 图1. 使用10 μM 喜树碱处理Jurkat 细胞4 小时作为阳性实验组（右图），同时设置未处理组做阴性对照（左图）。使用FITC Annexin V/ PI Apoptosis Kit 对以上两组细胞进行相应的实验处理，流式细胞仪进行观察。
ELISA可用于测定抗原,也可用于测定抗体.在这种测定方法中有三个必要的试剂1)固相的抗菌素原或抗体,即"免疫吸附剂"(immunosorbent);(2)酶标记的抗原或抗体,称为"结合物"(conjugate);(3)酶反应的底物.根据试剂的来源和标本的情况以及检测的具体条件,可设计出各种不类型的检测方法. ELISA可分类是根据抗原抗体的结合情况来分类的。 主要有以下几种类型:（直接法也称一步法） 1 双抗体夹心法测抗原 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下: 1) 将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体.洗涤除去未结合的抗体及杂质. 2) 加受检标本,保温反应.标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物.洗涤除去其他未结合物质. 3) 加酶标抗体,保温反应.固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合.彻底洗涤未结合的酶标抗体.此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关. 4) 加底物显色.固相上的酶催化底物成为有色产物.通过比色,测知标本中抗原的量.在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg,HBeAg,AFP,hCG等.只要获得针对受检抗原的异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法.如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物.如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物.这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步检测. 在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物".类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同(参见 1.3.2,图1-4),如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落.钩状效应严重时,反应甚至可不显色而出现假阴性结果.因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质(例如血清中HBsAg,AFP和尿液hCG等)时,应注意可测范围的最高值.用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应. 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇,例如HBsAg的a决定簇,也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物.但在HBsAg的检测中应注意亚型问题,HBsAg有adr,adw,ayr,ayw4个亚型,虽然每种亚型均有相同的a决定簇的反应性,这也是用单抗作夹心法应注意的问题. 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子(RF)的干扰.RF是一种自身抗体,多为IgM型,能和多种动物IgG的Fc段结合.用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF,它可充当抗原成份,同时与固相抗体和酶标抗体结合,表现出假阳性反应.采用F(ab')或Fab片段作酶结合物的试剂,由于去除了Fc段,从而消除RF的干扰.双抗体夹心法ELISA试剂是否受RF的影响,已被列为这类试剂的一项考核指标。 双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原,但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原,因其不能形成两位点夹心. 2 双抗原夹心法测抗体 反应模式与双抗体夹心法类似.用特异性抗原进行包被和制备酶结合物,以检测相应的抗体.与间接法测抗体的不同之处为以酶标抗原代替酶标抗抗体.此法中受检标本不需稀释,可直接用于测定,因此其敏感度相对高于间接法.乙肝标志物中抗HBs的检测常采用本法.本法关键在于酶标抗原的制备,应根据抗原结构的不同,寻找合适的标记方法. 3 间接法测抗体 间接法是检测抗体常用的方法.其原理为利用酶标记的抗抗体(抗人免疫球蛋白抗体)以检测与固
针对问题2（ TUNEL法的实验原理是什么？）： 基本原理：对不同组织切片先增加细胞膜通透性，然后让rTDT和bio标记的dUTP进入细胞内，在rTDT的辅助下dUTP与核断裂的DNA 3’-OH结合，再用HRP标记的链霉亲和素与dUTP上的biotin结合（每个链霉亲和素至少可以再结合3个biotin分子），最后用DAB、过氧化氢与SP上的辣根过氧化物酶HRP发生氧化、环化反应，形成苯乙肼聚合物而呈现棕褐色，最终通过计数每张切片上不同视野中TUNEL阳性细胞的比例来判断细胞凋亡发生情况。 工作原理：简单说就是——TUNEL细胞凋亡检测试剂盒是用来检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA的断裂情况。 其原理是；生物素（biotin）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下,可以连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3'－OH末端，并可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。 针对问题3（TUNEL实验中几个关键步骤是什么？）： 1. 充分脱蜡和水化。脱蜡可以先60度20min，再用二甲苯两次5~10min；而水化用梯度乙醇从高浓度到低浓度浸洗，这些以便后面的结合反应充分、均匀； 2. 把握好细胞通透的时间。一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，常用10~30min，几um切片用短时间；几十um切片用长时间，通过摸索达到既不脱片，有能够使后面的酶和抗体进入胞内。 3. 适当延长TUNEL反应液的时间。一般是37度1h，你也可以根据你的凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2h，但要结合你最终的背景着色。 4. DAB显色条件的选择。一般DAB反应10分钟左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过30min；我不喜欢用promega公司提供的DAB液（桃红色），不利于辨认棕褐色。
细胞凋亡实验步骤及注意事项 一、实验目的 1、掌屋凋亡细胞的形态特征 2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法 二、实验原理 细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。 在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。 在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder （梯状带纹）的特征。 相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。 一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。 三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。用 Hoechst33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）对细胞进行双重染色，可以区别凋亡、坏死及正常细胞。 细胞膜是一选择性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿过质膜。当细胞坏死时，质膜不完整，PI就进入细胞内部，它可嵌入到DNA或RNA中，使坏死细
细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。 一、细胞凋亡的形态学检测 根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1 光学显微镜和倒置显微镜 （1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。 贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 （2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割 成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。 2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜 一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。 常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。 Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。 DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。 结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。 3 透射电子显微镜观察 结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体 二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） 磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V 进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。 碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。