FVIII抗体检测
二、实验室诊断
（一）初筛试验
凝血酶原时间（PT）、凝血酶时间（TT）正常，活化部分凝血活酶时间（APTT）延长。
（二）纠正试验（证实有时间依赖性的抑制物存在）
延长的APTT不能被正常混合血浆纠正。多数血友病患者替代治疗后产生抑制物显示特征性模式，即患者血浆与正常混合血浆按1:1比例混合后的即刻APTT结果介于两种分别检测的APTT结果之间，但当37℃混合温育1~2小时后检测APTT，其APTT结果进一步延长。
（三）确诊试验
FⅧ:C减少，且随孵育时间呈进行性下降。
（四）抑制物定量测定（Bethesda方法；Nijmegen改良法）
1. Bethesda法（1975年，Kasper）
（1）试验原理：血友病A患者产生的FⅧ抑制物呈时间依赖性。在含抑制物的血浆中加入人源或猪源FⅧ，37℃混合温育，随孵育时间延长，FⅧ被抑制物逐渐中和。如加入FⅧ的量和孵育时间标准化，则可根据FⅧ被中和的量，以Bethesda单位的方式确定抑制物滴度。
（2）检测方法：将患者血浆与正常混合血浆按一定比例混合，37℃温育2小时后，测定该混合物中剩余的FⅧ :C水平。1BU的定义：能使血浆中FⅧ:C降低50%的抑制物活性为1个Bethesda单位（BU）。患者血浆稀释倍数的倒数为患者血浆抗体滴度的BU值。（图1）
图1. 抑制物检测（Bethesda法）
（3）操作步骤
1）将患者血浆用OVB缓冲液按一定比例倍比稀释，一般做多个稀释倍数，样本一直置于冰上保存。如果之前有关于抑制物检测的相关资料，则可作为参照对样本进行适当的稀释。
2）将正常混合血浆（FⅧ浓度已经过标准化检测）等量加入每份待测的稀释血浆样本中，FⅧ浓度通常为100 IU/dl。因此，每份混合物的FⅧ起始浓度大约为50 IU/dl。
3）37℃孵育2小时后进行FⅧ:C检测，采用正常混合血浆和乏FⅧ血浆的混合物作为标准品进行定标，并以该标准曲线来计算其它混合物的FⅧ活性。本检测中，此混合物的FⅧ:C 为100%。
4）根据残余FⅧ与抑制物单位的关系图计算抑制物的浓度。
（4）结果解释：Bethesda试验结果解释见表1。
表1. Bethesda试验的结果解释
滴度（BU/ml）结果解释
＜0.5 不显著
0.5~5 存在低浓度抑制物：
——可以被过量的FⅧ纠正
——可能是低反应型
＞5 存在高浓度抑制物：
——FⅧ不起作用
——免疫记忆反应，产生更多抑制物（高反应型）
2. Nijmegen改良法（NA）
（1）试验原理：在正常混合血浆中加入0.1mol/L、pH7.4咪唑缓冲液。由于使用了缓冲体系，使反应中pH值更加稳定，提高试验准确性与敏感性，适合低滴度抗体的检测，受到世界血友病联盟（World Federation of Hemophilia，WFH）的推荐。
（2）试验方法：将患者血浆与缓冲后的正常混合血浆于37℃共同温育2小时，以保证体系pH稳定。以正常混合血浆与乏FⅧ血浆组成的对照混合物（和患者血浆混合物在同样条件下温育）为标准品制备标准曲线，其余样本按照该标准曲线检测残余FⅧ水平。采用假定100%残余FⅧ= 0BU/ml，50%残余FⅧ= 1BU/ml（国际上认可的抑制物活性转换方式）而建立的残余FⅧ和抑制物之间的相互转换的双对数曲线，将残余FⅧ转换为抑制物单位。当
残余FⅧ活性＜25%，必须稀释后重新检测患者血浆，以免低估抑制物的滴度。规定抑制物滴度≥0.6BU/ml为阳性（具有显著性临床意义）。
（3）操作步骤：使用咪唑缓冲液作为稀释液，将患者血浆进行倍比稀释，建议从原倍开始，1/2、 1/4、以此类推，每管总体积为0.2 ml。如果患者之前接受过抑制物检测，其检测结果可作为稀释度的大致指南。如果患者最近接受过FⅧ治疗，则抑制物水平有可能偏高或偏低。其余步骤同Bethasda方法。
（4）结果解释：应选择残余FⅧ含量接近50%的稀释度，但也可选择残余FⅧ在30%~60%范围内的待测血浆稀释倍数用于抑制物的计算，只需计算每份稀释度的结果，取平均值即可。根据抑制物单位的定义，以残余FⅧ%-抑制物单位在双对数曲线上绘制标准曲线。
读取每份待测混合样本中残余FⅧ相对的抑制物水平，并以稀释倍数进行校正。例如：（1/4 稀释 + 正常混合血浆）残余FⅧ= 50%，抑制物单位（根据图表）= 1 BU，乘以稀释倍数（4倍稀释）= 4BU
抑制物的诊断通常要以至少2次抑制物滴度阳性为准，包括患者过去对治疗的反应及平时的药代动力学（pharmacokinetics，PK）研究。
（五）抑制物的分类（高滴度；低滴度；高反应；低反应）
2001年国际血栓与止血学会规定高滴度抑制物＞5BU；低滴度抑制物≤5BU。高反应型：输注FⅧ后抑制物滴度升高5BU以上；低反应型：输注FⅧ后抑制物滴度仍小于5BU。
（六）血友病B伴FⅨ抑制物
FⅨ抑制物是体内产生的特异性抑制或灭活FⅨ促凝活性，引起FⅨ水平降低的抗FⅨ抗体，包括：血友病B患者输注FⅨ制品替代治疗后产生灭活FⅨ活性的同种异体抗体；非血友病B患者自发产生的自身免疫性抗FⅨ抗体引起出血并发症（亦称获得性血友病B）。血友病B伴FⅨ抑制物发生率为1%~3%。
与抗FⅧ抗体不同的是抗FⅨ抗体在体外活性为即刻免疫反应（超敏反应），不依赖时间与温度。如果反复、大剂量输注FⅨ可产生肾病综合征（如免疫耐受诱导治疗）。
实验室检查：FⅨ:C减少；FⅨ抑制物呈即刻灭活FⅨ:C特点，不呈时间和温度依赖性。FⅨ抑制物定量（Bethesda法）测定（同 FⅧ抑制物检测）。
由于抗原/抗体呈快速反应，FⅨ抑制物与FⅧ抑制物显示出不同的酶动力曲线，与FⅨ进行完全且快速的抗原抗体反应。抗FⅨ IgG在体外的活性为即刻免疫反应，不依赖时间与温度，见表2。
表2 FⅧ抑制物与FⅨ抑制物不同生物学特点
FⅧ抑制物FⅨ抑制物
IgG：IgG4 亚型
无免疫复合物病
某些FⅧ抗体具有蛋白水解特性
IgG：IgG4为主
45% FⅨ过敏反应
反复、大量输注FⅨ可发生肾病综合征
体外活性：依赖温度与时间
体外活性：即刻（非温度与时间依赖）检测同Bethesda方法（无需孵育）
方法：患者血浆中加入等量外源性FIX（正常混合血浆），37℃孵育10分钟后进行FⅨ:C 检测。1个单位FⅨ抑制物的定义为：在37℃条件下，10 分钟内灭活50%FⅨ活性的抑制物的量。
凝血因子Ⅺ、Ⅻ、Ⅴ、Ⅹ、Ⅱ、Ⅶ、Fg抑制物罕见，其诊断可参照FⅧ抑制物检测，故本章不再赘述。
三、检测方法的特性
（一）抑制物检测的误区和局限性
1. 抑制物检测的误区
（1）当残余FⅧ活性＜25%时，易低估抑制物的滴度，必须稀释后重新检测患者血浆。
（2）如患者最近接受过FⅧ治疗，则抑制物水平有可能偏高或偏低。
（3）残余FⅧ＜25%或＞75% 的其他任何稀释度均不得用于计算抑制物的含量。
（4）重型血友病A患者进行抑制物定量检测时，其样本FⅧ含量很低或不能测出。如待测血浆中含有5 IU/dl以上的FⅧ，则在计算抑制物滴度时必须予以考虑。可采用如下三种方法：
方法1：在对照混合样本中加入比待测混合样本更多的因子，以补偿待测混合样本中的FⅧ。如待测血浆中含20 IU/dl FⅧ，则对照混合样本则由120μl正常混合血浆和80μl 乏FⅧ血浆制成（在孵育开始时，待测和对照混合样本中均含有大约60 IU/dl的FⅧ）。
方法2：分析前于58℃将待测血浆加热灭活90分钟，破坏所有凝血因子，包括FⅧ。由于免疫球蛋白具有耐热性，因此，抑制物的滴度不受这种处理方式的影响。
方法3：在对照混合样本中使用的乏FⅧ血浆非常重要。应包含正常水平的vWF，已证实如果乏FⅧ血浆不含vWF，则抑制物滴度可降低30%~50%。
2. 抑制物检测的局限性
（1）一期法检测局限性
1）如果存在狼疮抗凝物则有干扰。
2）一期法检测的正常FⅧ:C结果不能排除轻度血友病A。20%以上的轻度血友病A患者与
此差异相关，表明不同检测系统所得结果存在着两倍差异。一期法的结果往往比二期法或发
色底物法的结果高两倍，甚至5倍。少数患者一期法结果在正常值范围内，但二期法或发色
底物法结果降低。这些患者临床出血表型与二期法或发色底物法测得的低FⅧ:C一致。
约5%~10% 轻度血友病A患者一期法FⅧ:C正常，但基因分析确认为轻型血友病A，需采
用二期法或发色底物法检测，即使APTT和一期法检测结果正常。
有些轻型血友病A一期法检测FⅧ:C下降，但是二期法或发色底物法测得结果正常，没
有个人或家族出血病史，也无需 FⅧ:C替代治疗，其临床表型与发色底物法或二期法检测F Ⅷ:C一致。经基因确认为轻度血友病 A 患者。检测结果差异见表3。
表3 基因确认为轻度血友病 A 患者检测结果差异
病例一期法（IU/dl）二期法（IU/dl）发色底物法（IU/dl）
A 101 34 13
B 88 15 28
C 63 30 40
D 55 24 40
E 58 21 33
F 72 21 36
G 84 19 45
（2） Bethesda方法（BA）的局限性
1）非特异性
假阳性高达32%，假阴性5%。改良的Nijmegen方法（NA）通过缓冲正常混合血浆（buffered normal pool plasma，BNPP）和乏FⅧ血浆代替咪唑缓冲液作为参照样品提高敏感性和特异性。此外建议：试验中加热去除剩余FⅧ、选用标准的FⅧ参照血浆、应用4 mol/L咪唑溶液
以及剩余FⅧ与发色底物的作用，可进一步提高该方法的敏感性及特异性。
2）变异性大—室间质量评估（EQA）
各种EQA团队证实实验室内部变异系数（CV）高达（有时超过）50%。变异性大是由于
检测变异性可发生在检测的任何阶段，包括检测试剂的选择和来源、缓冲液、BNPP等，即使相同的流程，也难以得到RCPA EQA程序中两个相同的参数。虽然NA的变异性比BA低，但不同实验室NA的变异性同BA一样仍然很高。实验室内部差异可统一试验方法和试剂，通过试验方法的标准化可以得到可接受的实验室内部变异。
3. 检测结果的偏差
可发生在诊断过程中的任何阶段，包括分析前阶段（医师检测、标本收集），分析阶段，分析后阶段（实验结果解释和报告、医师的解释和处理）。
（1）分析前阶段：检查检测步骤的准确性及相关性（以确保检测正确实施）；核对和注意血液标本（准确的抗凝剂，适当填充等）；可避免误差及假阳性或阴性结果。
（2）分析阶段：了解检测的局限性如低抑制物敏感度；采用最优方法及已经验证的改良法（有助于保证准确性）；进行适当的内部质量控制并参与EQA（以确保准确性）；必要时重复检测（确保准确性，避免假阴性或假阳性）；
（3）分析后阶段：当检验结果与预期值不匹配时用新样本重复检测；向临床医生提供咨询以协助检测结果的解释。
4. 抑制物检测的敏感性和特异性有待进一步提高
BA和NA均对低抑制物活性缺乏敏感性。即使对于提高了特异性的NA来说检测临界值可能会更低，但国际上公认的检测临界值为0.6 Bethesda单位（BU）。但两种检测方法可能都无法检测出低滴度的抑制物。这些低滴度（检测不到）的抑制物可能有重要的临床意义，可能在免疫耐受诱导（induce immune tolerance，ITI）后期出现，导致替代治疗疗效欠佳，出血并发症以及增加FⅧ制剂剂量。因此，近期研制出更低临界值为0.03 BU的低滴度FⅧ抑制物检测（low titer assay，LTA）。
原理：与NA相同，除了采用浓缩血浆而非原始血浆，在该试验混合物中浓缩血浆/BNPP 比例为3:1，以及检测剩余FⅧ时采用显色底物。通过校正血浆中的凝血因子和替代率的分析数据，检测结果以BU表示。
应用LTA发现低滴度抑制物仍会存在于ITI治疗后的早期，虽然NA或BA为阴性结果。LTA反映输注的FⅧ半衰期，可能成为ITI后具有重要临床意义的、较为敏感的检测残余F Ⅷ活性的方法。
（二）检测抑制物的其他方法
抑制物本质上为抗体，因此，可通过功能抑制和刺激其形成蛋白的检测来证实。NA是直接针对FⅧ抑制物检测的金标准。但以凝血为基础的检测存在很多不足：可能受其他抗体
的影响，如狼疮抗凝物、非特异性凝血抑制物、静脉通路中肝素钠的影响，且相对不敏感。因此，发色底物法、酶联免疫吸附法（enzyme-linked immuno sorbent assay， ELISA）、荧光技术分析（fluorescence immunoassay， FLI）可提高基于凝血检测的敏感性及特异性。
1. 抗FⅧ抗体检测（ELISA法）
检测自身和同种抗FⅧ抗体可采用该法，敏感度是Bethesda法的10倍。用rFⅧ包被，4℃过夜，鱼胶封闭非特异位点，加入经稀释的患者血浆；37℃，加入辣根过氧化物酶标记的兔抗人Ig，终止反应，450nm处检测吸光度（A）。ELISA法具有较高的敏感性，所用的试剂盒已商业化。但由于可检测抑制性及非抑制性（即“非中和”）抗体，故其特异性比基于凝血原理的方法低。ELISA法筛选抑制物阳性时，必须结合凝血原理的检测加以证实和定量。
2. 免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）试验（同ELISA）
稀释患者血浆与125I标记的FⅧA1.A2.C2和轻链共同温育，加入蛋白G-Sepharose结合的磁珠，使用r计数仪检测结合的反射活性，以免疫沉淀单位/ml表示结果。
3. 荧光技术分析（FLI）
能同时检测出抑制性及非抑制性抗体。新FLI将抗体与黏附于聚苯乙烯微球体上的重组FⅧ结合。
4. 改良的Nijmegen-Bethesda法（MNBA）
在标准NA的基础上增加加热去除FⅧ的步骤；应用FⅧ:C发色底物，显色Nijmegen-Bethesda法（CBA）。CBA在883例MNBA阴性的样本中的阴性率为99.7%，在MNBA 42例抑制物活性≥2 NBU（Nijmegen-Bethesda单位）的样本中阳性率为100%（r=0.98）。
因子抑制物检测方法的广泛应用受高变异性、高假阳性和假阴性的困扰。每种方法成功的关键取决于实验室参与EQA，严谨评估自己实验室的结果，对测试结果合理解释，重复测试确认结果，尽可能使用推荐的方法。
（三）鉴别诊断（与获得性血友病、狼疮抗凝物鉴别）
1. 获得性FⅧ抑制物（获得性血友病A，AHA）
AHA可由于自身免疫性疾病、病理或医学干预引起免疫耐受破坏引起。AHA多成年发病，很少有关节畸型，既往无出血史，无阳性家族史，男女患病率均等，死亡率达22%。
APTT延长可被完全纠正。Bethesda 试验对AHA不甚敏感，尤其抗体滴度低时，建议采用ELISA法检测抗FⅧ抗体。
AHA诊断：既往无出血史或家族出血史的非血友病A患者突然发生自发性出血，实验室检查显示FⅧ:C减少，且血浆中存在时间依赖性FⅧ抑制物。
2. 狼疮抗凝物（lupus anticoagulant，LA）
LA并不针对特定的凝血因子，但可造成体外依赖磷脂的凝血试验的延长，故需排除。LA存在时，延长的APTT不能被正常血浆纠正，而补充外源磷脂能缩短或纠正。通过各种依赖磷脂的试验如高岭土凝血时间（Kaolin clotting time，KCT），狼疮-APTT试验LA-PTT 及稀释的蝰蛇毒试验（Dilute Russell Viper Venom Time，dRVVT）等延长以证实。狼疮抗凝物（LA）阳性，FVIII多大于10%，可PT延长，易发生血栓。（图2）
3. 抗FⅧ自身抗体和LA并存
如怀疑LA引起FⅧ:C减低可采用二期法FⅧ:C测定（发色法FⅧ试验）区别。FⅧ:C 正常或增加，FⅧ:C多大于10%；FⅧ自身抗体用ELISA方法。选用对LA不敏感的APTT，排除其对于凝血的影响。
2017版DIC专家共识
常用的单克隆抗体检测方法 通过杂交瘤技术制备单克隆抗体，在杂交瘤制备完成后，需要对抗体进行一个检测，本文介绍了几种常用的抗体检测的方法（1）免疫酶技术免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而 成的免疫学技术。由于它特异性强，灵敏度高，现已广泛用于筛选和鉴定单抗。①器材和试剂a、包被缓冲液：碳酸盐缓冲液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mol/L NaHCO3 17ml 混合，再加75ml蒸馏水，调PH至9.6。Tris-HCl缓冲液（PH8.0，0.02mol/L）：取0.1mol/L Tris 100ml，0.1mol/L HCl 58.4ml混合，加蒸馏水至1000ml。b、洗涤缓冲液（PH7.2的PBS）：KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，Tween-20 0.5ml，加蒸馏水至1000ml。c、稀释液和封闭液：牛血清白蛋白（BSA）0.1g，加洗涤液至100ml；或用洗涤液将小牛血清配成5-10%使用。d、酶反应终止液（2mol/L H2SO4）：取蒸馏水178.3ml，滴加浓硫酸（98%）21.7ml。e、底物缓冲液（PH5.0，磷酸盐-柠檬酸缓冲液）：取0.2mol/L Na2HPO4 25.7ml，0.1ml/L柠檬酸24.3ml，再加50ml蒸馏水。柠檬酸溶液及配成的底物缓冲液不稳定，易形成沉淀，因此一次不宜配制过多。f、底物使用液：OPD底物使用液（测490nm的OD值）：OPD 5mg，底物缓冲液10ml，3% H2O2
0.15ml。TMBS或TMB底物使用液（测450nm的OD值）：TMBS或TMB（1mg/ml）1.0ml，底物缓冲液10ml，1% H2O2 25ul。ABTS底物使用液（测410nm的OD值）：ABTS 0.5mg，底物缓冲液1ml，3% H2O2 2ul。g、抗体对照：以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清。h、抗原：可溶性抗原：尽量纯化，以获得高特异性。病毒感染的传代细胞或全菌抗原。淋巴细胞等悬液。i、酶标抗鼠抗体或酶标SPA或其他类似试剂。j、细胞固定液：-20℃丙酮；或丙酮-甲醛固定液：Na2HPO4 100mg，KH2PO4 500mg，蒸馏水150ml，丙酮225ml，甲醛125ml；或丙酮-甲醛溶液（1；1）；或-20℃甲醇。k、聚苯乙烯微孔板：40孔、96孔、或条孔；硬板或软板均可使用。l、酶联免疫阅读仪；或光镜。m、吸管、加样器及水浴箱、离心机等。②可溶性抗原的酶联免疫吸附试验（ELISA）a、纯化抗原用包被液稀释至1-20ug/ml。 b、以50-100ul/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。 c、弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干。 d、每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时；该步骤对于一些抗原，可省略。 e、洗涤液洗3次；此时包被板可-20℃或4℃保存备用。 f、每孔加50-100ul 待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃孵育1-2小时；洗涤，拍干。 g、加酶标第二抗体，每孔50-100ul，37℃孵育1-2小时，洗涤，拍干。 h、加底物
抗核抗体谱（ANAs ）检测项目及项目物价收费: 注明：项目编号250402003-2抗核提取物抗体测定，其中包含检测抗体（抗SSA、抗SSB、
抗JO －1、抗Sm 、抗nRNP 、抗ScL-70 、抗着丝点抗体的测定） 该表中湛江及附院收费是参考2011 年版的湛江物价局医疗收费及附院0212 年收费，请核对并完善。 抗核抗体谱17s 亚辉龙中标编号：3179998 ，中标价：133.00/T, 优惠价：120.00/T ，抗 核抗体谱12S 亚辉龙中标编号：3179999,中标价格：120.83/T,优惠价：96.00/T ， 抗核抗体谱8S 亚辉龙中标编号：3180000，中标价格：99.00/T,优惠价：70.00/T 项目的临床意义如下： 1. 高滴度的抗U1-nRNP抗体是混合性结缔组织病（MCTD ，夏普综合征）的标志， 阳性率为95-100％，抗体滴度与疾病活动性相关。在30-40％的系统性红斑狼疮患 者中也可检出抗U1-nRNP抗体，但几乎总伴有抗Sm抗体。 2. 抗SmD1 抗体是系统性红斑狼疮的特异性标志，与抗dsDNA 抗体一起，是系统性 红斑狼疮的诊断指标，但阳性率仅为5-10％。 3. 抗SS-A（Ro60）抗体最常见于干燥综合征（40-80 %）、也见于系统性红斑狼疮 （30-40％）和原发性胆汁性肝硬化（20％）中，偶见于慢性活动性肝炎。此外， 在100%的新生儿红斑狼疮中可出现抗SS-A 抗体。该抗体可经胎盘传给胎儿引起 炎症反应和新生儿先天性心脏传导阻滞。 4. 抗SS-A （RO52）抗体在自身免疫性疾病中是一个非特异性指标，与多种自身免 疫性疾病都有相关性，在很多疾病处于稳定期、控制好的情况下会显示阴性； 如果阳性会提示复发或者优先于其它指标预警，起到预防提示作用。此指标合 并其它指标阳性，常会提示预后不好。 5. 抗SS-B 抗体几乎仅见于干燥综合征（40-80%）和系统性红斑狼疮（10-20%）的女性患者 中，男女比例为29:1。在干燥综合征中抗SS-A 抗体和抗SS-B 抗体常同时出现。 6. 抗Scl-70 抗体见于25-75%的进行性系统性硬化症（弥散型）患者中，因实验方法和疾病活动 性而异（Scl=硬化症）。在局限型硬化症中不出现。 7. 抗Jo-1抗体见于多肌炎，阳性率为25-35 %。常与合并肺间质纤维化相关。 8. 1977 年，Wolfe 及其同事首先在多肌炎病人中描述了抗PM-Scl 抗体，并把该抗体 叫做抗PM 抗体。在1984年，Reichlin 与其同事经过研究，发现了抗PM-1 抗体的更准确的 特征和命名（抗PM-Scl 抗体）。在50-70%的所谓的重叠综合征患者中可检出这些抗体，在这 些患者中可合并出现多肌炎（PM）、皮肌炎（DM ）和进行性 系统性硬化症（Scl）。抗PM-Scl抗体在进行性系统性硬化症（弥散型）中的阳性率为3%， 在多肌炎和皮肌炎中的阳性率为8%。 9. 抗着丝点抗体与局限型进行性系统性硬化症（CREST 综合征：钙质沉着、Raynaud's 病、食管功能障碍、指硬皮病、远端血管扩张）有关，阳性率为70-90%。 10. 抗PCNA 抗体对系统性红斑狼疮具有很高的特异性，但其阳性率仅为3% 11. 抗dsDNA 抗体对系统性红斑狼疮具有很高的特异性。除抗Sm 抗体外，抗dsDNA 抗体也可 作为该病的一个血清学指标，阳性率为40-90% 。 12. 在系统性红斑狼疮患者血清中可检出抗核小体抗体，但是，由于用传统的核小体制品进行检
蛋鸡抗体检测实验室建设方法 一、面积、台面、墙面 面积至少要有6平方，放置一张操作台（桌子，面要平，长1.5米，宽1米），一张凳子，墙用彩钢板隔开，制作一个门，保持空间独立。 二、器材 1、一台小高压锅，用于灭菌。 2、冰箱，用于盛放易耗品等。 3、离心机（5000转以下）一台，用于制作红细胞。 4、移液枪两把，一把为1毫升的，另一把为200微升的。 5、电子天平一台。 三、耗材 1、枪头，1毫升的及200微升的，各500个。 2、盛放枪头的盒子，两种规格，各5个。 3、Ependorf管100个，Ependorf管架2个。 4、葡萄糖瓶子10各。 5、量筒2个。 6、记号笔一支。 四、 血凝试验(HA) 定义：某此病毒或病毒的血凝素，能选择性地使某种或某几种动物的红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝(hemagglutination，HA)，也称直接血凝反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验 (HA) 血凝抑制试验(HI) 定义：当病毒的悬液中先加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或其血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制(hemagglutination inhibiion，HI)反应，也称血凝抑制反应，利用这种特性设计的试验称血凝试验 (HI) 。 原理：特异性抗体与相应病毒结合，使病毒失去凝集红细胞的能力，从而抑制血凝现象。 用于禽流感、新城疫等具有血凝性病毒的鉴定 根据抗原与相应抗体的特异性中和反应原理，给未知病毒悬液中加入已知的抗禽流感病毒阳性血清或已知的抗新城疫病毒阳性血清，相应病毒便丧失了其凝集红细胞的能力。因此，可利用从发病的鸡、鸭、鹅体内分离的病毒作HA和HI试验。病毒悬液能凝集红细胞，并且能被已知的抗血清（阳性血清）所抑制，那么该病毒即是已知阳性血清相对应的病毒。如用新城疫阳性血清完全抑制了未知病毒培养物的血凝性，那么，这个未知病毒培养物就是新城疫病毒；如果病毒悬液虽然能凝集鸡红细胞，但不能被鸡新城疫血清所抑制，说明不是鸡新城疫病毒，可能是其他有血凝性的病毒。 阿氏（Alsevers）液配制
ELISA（酶联免疫吸附测定，enzyme linked immunosorbent assay）指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。 基本原理： ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。 ②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。 ③在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 ④加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅有无定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 双抗夹心法 夹心法常用于检测大分子抗原，一般的操作步骤为: ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，检体中若含有待测的抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一的一次抗体，与待测抗原进行键结； ④洗去多余未键结一次抗体，加入带有酶的二次抗体，与一次抗体键结； ⑤洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果。 间接法 间接法常用于检测抗体，一般的操作步骤为： ①将已知的抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余的抗原。
②加入待测检体，检体中若含有待测的一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结。 ③洗去多余待测检体，加入带有酶的二次抗体，与待测的一次抗体键结。 ④洗去多余未键结二次抗体，加入酶底物使酶呈色，藉仪器（ELISA reader）测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗体的含量。 竞争法 竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为： ①将具有专一性的抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体； ②加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结； ③加入带有酶的抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酶的抗原可键结的固著抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结，即所谓竞争法之由来。 ④洗去检体与带有酶的抗原，加入酶底物使酶呈色，当检体中抗原量越多，代表塑胶孔盘内留下之带有酶的抗原越少，显色也就越浅。 注：当需要侦测无法获得两种以上单一性抗体的抗原，或是不易得到足够的纯化抗体以固著于孔盘上时，一般会考虑使用竞争法ELISA。
一、自身免疫性溶血性贫血（AIHA）：机体免疫功能异常，或服用某些药物后，红细胞表面抗原性发生变化，产生抗红细胞膜表面抗原的自身抗体。自身抗体与自身抗原结合，激活补体，破坏红细胞，导致贫血。特点：（1）体内出现抗红细胞自身抗体。（2）抗人球蛋白试验（Coombstest）阳性。（3）红细胞寿命缩短。（4）AIHA多见于中年女性。（5）继发性者多继发于淋巴系统恶性病、结缔组织病、感染和药物应用后。（6）引起AIHA的药物有青霉素、奎尼丁、异烟肼、对氨基水杨酸、磺胺类、甲基多巴等。抗红细胞抗体可分为三类：①温抗体，为IgG型，37°C可与RBC结合，不聚集RBC.②冷凝集素，为IgG 型，低温时与RBC结合使其凝集，引起冷凝集素综合征。③DonathLaidsteiner抗体，为IgG 型，低温时与两种补体成分结合，温度升高至37°C时，激活补体链，导致溶血，引起陈发性冷性血红蛋白尿症（PCH）。PCH继发于梅毒或病毒感染后。病毒感染后引起的多见于儿童或年轻患者。二、免疫性血小板减少性紫癜（ITP）：主要表现为皮肤黏膜紫癜，血小板↓，骨髓中巨核细胞可增多，女性多发，发病率1／lOO00，患者有抗血小板抗体，其使血小板寿命缩短。三、重症肌无力（MG）：患者体内存在神经肌肉接头乙酰胆碱受体的自身抗体，该抗体结合到横纹肌细胞的乙酰胆碱受体上，使之内化并降解，使肌细胞对运动神经元释放的乙酰胆碱的反应性降低。引起骨骼肌运动无力。四、肺出血肾炎综合征（Goodpasture综合征）：患者体内可检到抗肾小球基底膜Ⅳ型胶原抗体，由于肺泡基底膜与肾小球基底膜有共同抗原，故肺、肾同时发病。青年男性多见，反复咯血、血尿、蛋白尿，最后发展为肾衰。五、系统性红斑狼疮（SLE）：是一种累及多器官、多系统的炎症性结缔组织病，多发于青年女性。其临床症状比较复杂，可出现发热、皮疹、关节痛、肾损害、心血管病变（包括心包炎、心肌炎和脉管炎）、胸膜炎、精神症状、胃肠症状、贫血等；疾病常呈渐进性，较难缓解。免疫学检查可见IgG、IgA和IgM增高，尤以IgG显著；血清中出现多种自身抗体（主要是抗核抗体系列）和免疫复合物，活动期补体水平下降。抗dsDNA和抗Sm抗体是本病的特征性标志。SLE的实验诊断：（1）抗核抗体1）免疫荧光法检测抗核抗体：该法以小鼠肝细胞、Hep-2细胞（人喉癌上皮细胞株）、Hela细胞（官颈癌细胞株）或小鼠腹水癌细胞等作为抗原片，以Hep-2细胞抗原片敏感性较高。2）抗DNA 抗体：分为天然（双链）DNA（ds-DNA）和变性（单链）DNA（ss-DNA）抗体。Ds-DNA抗体的测定方法有间接免疫荧光法（以短膜虫或马疫锥虫为抗原）、间接酶标抗体法（以短膜虫为抗原）、补体结合抗体法（以短膜虫为抗原，以抗人C3荧光抗体为第二抗体）、酶联免疫吸附试验（ELISA，以DNA为抗原）和放射免疫分析法（即Farr法）等多种方法。前四种方法检测到的都是低亲和力的抗dsDNA抗体，或敏感性低，或检测结果不稳定、重复性差。Farr 法检测dsDNA抗体的特异性最高，结果可靠，重复性好，因此是目前国际上公认的检测抗ds-DNA抗体的标准方法。当抗ds-DNA抗体结合率>20％时对诊断SLE有意义。3）抗可提取性核抗原（ENA）抗体：目前抗ENA抗体的检测方法有双向免疫扩散或对流免疫电泳和免疫印迹法。近年来随着分子生物学技术的发展，可以以重组抗原为底物，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测特异性抗体。4）抗增殖细胞核抗原抗体。（2）抗组蛋白抗体。（3）抗核糖体抗体。（4）抗Ku抗体。（5）皮肤狼疮带试验。与SLE病情判断有关的免疫学检测包括：1）血沉和C反应蛋白（CRP），SLE活动时血沉增快，CRP改变不明显。2）血清蛋白，包括白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原、冷球蛋白冷凝集素等。3）血清补体，包括总补体（CH50）和Cl、C3、C4、C2及C9. 4）循环免疫复合物（CIC）聚乙二醇（PEG）沉淀法。5）类风湿因子。6）细胞免疫功能。六、类风湿性关节炎（RA）：一种以关节病变为主的全身性结缔组织炎症，多发于青壮年，女性多于男性。本病的特征是关节及周围组织呈对称性、多发性损害，部分病例可有心、肺及血管受累。免疫学检查可见血清及滑膜液中出现类风湿因子，血清IgG、IgA和IgM水平升高。其他自身抗体也可出现：例如，抗角蛋白抗体；抗RA33抗体；抗环瓜氨酸抗体（抗CCP抗体）；抗核周因子
抗核抗体检测试剂注册技术审查指导原则 (征求意见稿) 本指导原则旨在指导注册申请人对抗核抗体( Antinuclear antibody ，ANA )检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审 评部门审评注册申报资料提供参考。 本指导原则是对抗核抗体检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是供申请人和审查人员使用的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、适用范围 抗核抗体作为自身免疫病( autoimmune diseases ，AID ) 重要的生物学标志，是临床应用中最广泛、最基础的一组自身抗体。临床常见于系统性红斑狼疮 ( Systemic Lupus Erythematosus ，SLE )、干燥综合征、系统性硬化病、混合结缔组织病及多发性肌炎/皮肌炎等系统性(非器官特异性) AID 患者。同时，ANA 可见于器官特异性AID 患者，如自身 免疫性肝病、自身免疫性甲状腺炎等。除此之外，ANA 也可见于慢性 感染性疾病及健康人群中 细胞核是ANA 靶抗原所在的最重要的结构部位，因此传统意义上的
ANA 是指抗细胞核抗原成分的自身抗体总称。随着检测技术的改进，尤其是培养细胞抗原基质（如HEp-2 细胞）的广泛应用，ANA 的定义扩展到以真核细胞各种成分（包括细胞核、细胞浆、细胞骨架蛋白及细胞分裂周期蛋白等）为靶抗原的自身抗体的总称。 目前，ANA 检测分成ANA 总抗体的检测和针对靶抗原的特异性自身抗体检测。其中，ANA 总抗体的检测方法主要包括间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence,IIF ）、酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ，ELISA ）等。ANA特异性自身抗体检测方法主要包括ELISA法、线性免 疫印迹法（line immunoassay,LIA ）、化学发光免疫分析法（c hemiluminescence immunoassay,CLIA ）等。 本指导原则所述抗核抗体检测试剂是指利用间接免疫荧光法、酶联免疫吸附法、化学发光法、线性免疫印迹法等基于抗原抗体反应原理，针对人血清、血浆样本中总抗核抗体或针对靶抗原的特异性自身抗体进行体外定性和/ 或半定量和/或定量检测的试剂。同时，本指导原则是针对抗核抗体检测试剂的通用指导原则，申请人应结合具体产品的特点进行申报。如果申报产品有具体指导原则，应参照执行。 本指导原则适用于进行注册申请和相关许可事项变更的产品。依据《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5 号）（以下简称《办法》）、《食品药品监管总局关于印发体外诊断试剂分类子目录的通知》（食药监械管 2013 〕242 号），抗核抗体及针对靶抗原的特异性自身抗体检 测试剂属于自身抗体检测试剂，管理类别为□类6840。 二、注册申报资料要求注册申报资料的撰写应符合《办法》和《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（国家食品药品监督管理总局公告2014 年第44 号）（以下简称44 号公告）
检测自身免疫抗体的蛋白质芯片技术 自身免疫性疾病是由异常免疫反应引起的慢性退行性或炎症性疾病。不同的自身免疫性疾病对 机体的影响各有不同。例如，在多发性硬化症中，自身免疫反应的侵害对象是中枢神经系统， 而在克罗恩病中则是肠道。此外，同种疾病对不同个体的组织和器官的影响程度不尽相同。 此类疾病的严重程度取决于患者的免疫系统情况。其人群患病率在3%以上，女性和老年人居 多。炎症是许多此类疾病的常见症状，其他症状包括：眩晕、疲劳、不适及低烧。器官特异性 自身免疫性疾病可侵害靶器官或组织，导致功能受损。 对此类疾病的诊断相当困难，尤其是在发病初期。对健康个体进行的特异性自身抗体检测表明：不同疾病的阳性结果发生率少则接近0%，多则超过10%。健康个体中的大多数抗体的滴定浓度都很低，对健康没有不良影响。 自身抗体并不总是针对某种风湿性疾病。例如，与天然双链DNA (dsDNA) 发生反应的抗体通 常对系统性红斑狼疮(SLE)具有诊断意义。但是，抗双链DNA 抗体也可见于患有其他疾病的个 体中，如风湿性关节炎、干燥综合症、硬皮病、药物性狼疮、慢性活动性肝炎、格雷夫斯氏病 及其他疾病。抗双链DNA 抗体在上述疾病的患者中发生率一般低于5%。因此抗双链DNA 抗体对SLE 没有诊断意义。 在少数情况下，自身抗体具有很强的疾病特异性。目前已鉴别出一些常见风湿性疾病的自身抗体靶点（表I ）。 本文就自身抗体检测技术进行了回顾性评述，开篇先介绍一些成熟的检测方法，最后则展望未来的发展趋势。多路复用蛋白质分析技术是讨论的核心焦点。本文还研究了各种多路复用自身免疫测定法，并阐述了开发人员所面临的困难。 目前的检测方法 检测自身免疫相关抗体的第一种方法是琼脂凝胶平板双向扩散法，但是这种方法早已被更快速、更灵敏的半定量方法所取代。 检测血清中自身抗体的常用实验室试验：免疫测定（通常为酶免疫测定）、间接免疫荧光显微技术 (IFA)、免疫印迹及免疫沉淀。上述试验中只有第一种是半定量试验；其他均为定性试验。通过IFA 法进行筛查需要耗费大量的人力，而且要求训练有素的技术人员对显微镜染色图谱进行目测解读。这种方法缺乏可靠的标准，其结果取决于观察者的技能。IFA 阳性结果并不能确定抗原的存在。因此，在提出具体治疗方案的建议方面，其作用十分有限。 磁性微粒的扫描电子显微照片，由Bio-Rad Laboratories 公司(美国加州，Hercules)的BioPlex 2200免疫测定系统（该设备具多路复用测定功能）采用。
自身免疫病中多种自身抗体的检测及分析【摘要】目的：通过对自身免疫病患者常用自身抗体的综合检测、分析，评价其在自身免疫病中的意义及价值。方法：选取临床上已确诊为自身免疫病患者216例作为疾病组（其中SLE患者102例，RA患者54例，MCTD患者18例，SS患者16例，PSS患者16，PM/DM患者10例），健康体检者30例作为对照组，抽取血液，分离血清，分别采用间接免疫荧光法、欧蒙免疫印迹法和ELISA法检测ANA、抗ds DNA、ENA多肽谱、RF。结果：6种自身免疫性疾病中，RF的阳性检出率以类风湿性关节炎（RA）患者为最高（74.2%），干燥综合症（SS）患者次之（62.5%），而多发性皮肌炎（PM/DM）患者中未检出；ANA在6种自身免疫病患者中均有较高的阳性检出率，以系统性红斑狼疮（SLE）患者为最高（94.1%），混合性结缔组织病（MCTD）患者次之（88.9%），RA患者最低（33.3%）；抗ds DNA则只在2种自身免疫病患者中检出，其中SLE患者阳性检出率最高（80.4%），而RA患者较低（3.7%）；6种自身免疫病患者中，ENA多肽谱的各种抗体的检出率差别较大，其中，抗SSA/R0均有检出，但阳性率不高（均低于40.0%），而抗Histones只在SLE患者中有检出，抗Scl70只在系统性硬皮病（PSS）患者中有检出，抗J01则只在PM/DM患者中有检出，但抗U1snRNP 则在MCTD患者中检出率较高（88.9%），抗Centromere均无检出。结论：自身免疫病患者同时检测多种自身抗体有助于疾病的特异性诊断和筛查。
【关键词】 RF； ANA；抗ds DNA； ENA多肽谱；自身免疫病 ［ABSTRACT］Objective: To evaluate the significance of multiple autoantibody detection and analysis in the process of diagnosing and screening autoimmune diseases. Methods: 216 cases of autoimmune diseases were compared with 30 health volunteers. 102 out of these cases are SLE, 54 are RA, 18 are MCTD, 16 are SS, 16 are PSS and 10 are PM/DM, Autoantibody including ANA, anti ds DNA, ENA antibodies and RF were detected. Results: Among six kinds of autoimmune diseases mentioned above, RA has the highest positive rate of RF (74.2%) followed by SS (62.5%). On the contrary, in PM/DM, RF was detected as negative. SLE has the highest positive rate of ANA (94.1%) followed by MCTD (88.9%) and RA (33.3%). Anti ds DNA was only detected in SLE and RA with a positive rate of 80.4% and 3.7%, respectively. The positive rates of ENA antibodies in autoimmune diseases are obvious different among each other. Conclusion: Detection of multiple autoantibodies is a useful way of diagnosis and screening autoimmune diseases. ［KEY WORDS］ RF； ANA； Anti ds DNA； ENA antibodies；Autoimmune diseases
附件2 过敏原特异性IgE抗体检测试剂 技术审查指导原则 本指导原则旨在指导注册申请人对过敏原特异性IgE抗体（Allergen-specific IgE）检测试剂注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门审评注册申报资料提供参考。 本指导原则是对过敏原特异性IgE抗体（Allergen-specific IgE）检测试剂的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。如申请人认为有必要增加本指导原则不包含的研究内容，可自行补充。 本指导原则是供申请人和审查人员的指导文件，不涉及注册审批等行政事项，亦不作为法规强制执行，如有能够满足法规要求的其他方法，也可以采用，但应提供详细的研究资料和验证资料。应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规、标准体系及当前认知水平下制定的，随着法规、标准的不断完善和科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。 一、范围 I型过敏反应性疾病相当普遍，人群总发病率高达10%～30%，
是当前世界性的重大卫生学问题，被世界卫生组织（WHO）列为二十一世纪重点防治的三大疾病之一。 过敏性疾病是患者吸入、食入或者注入含有致敏成分的物质（称为过敏原或变应原，Allergen）后触发机体的B细胞产生特异性免疫球蛋白E（Immunoglobulin E, IgE），IgE以其Fc 段与肥大细胞或嗜碱性粒细胞的表面相应的FcεRI结合，使机体处于对该过敏原的致敏状态。当相同过敏原再次或多次进入致敏机体时，可与肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面的IgE发生特异性结合，当过敏原与致敏细胞表面的两个或两个以上相邻的IgE结合时，发生FcεRI 交联，使肥大细胞和嗜碱性粒细胞活化，导致细胞脱颗粒并释放储存在细胞浆颗粒里的炎性介质——组胺，并通过花生四烯酸途径合成新介质——白三烯、免疫反应性前列腺素和IL4、IL5等细胞因子及趋化因子，从而引发过敏反应（或称变态反应，Allergy）的疾病及相关症状，如过敏性哮喘、枯草热、荨麻疹、过敏性鼻炎、湿疹、结膜炎及胃肠道I型过敏性疾病及严重过敏反应等。 上述过敏性疾病的发生，IgE抗体起关键作用。I型过敏反应性疾病的特征是患者体内循环血液中的过敏原特异性IgE抗体浓度较正常状况下高，且特异性IgE抗体浓度越高，诊断过敏性疾病的概率越高。 本指导原则适用于过敏原特异性IgE抗体检测试剂，包括总IgE和特异性IgE，同时适用于不同的检测方法（原理）。 本指导原则适用于申请产品注册和相关许可事项变更的产品。 二、基本要求
一、抗核抗体 抗核抗体（antinuclearantibodies，ANA）泛指抗各种核成分的抗体，是一种广泛存在的自身抗体。ANA的性质主要是IgG，也有IgM和IgA，甚至IgD和IgE。ANA可以与不同来源的细胞核起反应，无器官特异性和种属特异性。ANA主要存在于血清中，也可存在于其他体液如滑膜液、胸水和尿液中。 ANA在SIE患者的滴度较高，但也出现在其他许多自身免疫病中，在许多研究报告中，都将检出ANA作为自身免疫甚至自身免疫病存在的依据。这种现象的机制尚未明了，有待于进一步研究。 （一）ANA的类型及意义 由于细胞核成分的复杂性，不同成分的抗原性也不同；因此就会有多种不同的ANA。 1．抗核蛋白抗体核蛋白抗原（DNP）由DNA和组蛋白组成。由于DNP抗原存在不溶性和可溶性两个部分，可分别产生相应的抗体。不溶性DNP抗体通常不完全被DNA和组蛋白所吸收，它是形成狼疮细胞的因子；可溶性抗原存在于各种关节炎病人的滑膜液中，其相应抗体也出现于RA病人的滑膜液中。 2．抗DNA抗体可以分为两大类：①抗天然DNA（nDNA）抗体，或称抗双链DNA （dsDNA）抗体；②抗变性DNA抗体，或称抗单链DNA（ssDNA）抗体。抗dsDNA抗体对SLE有较高的特异性，70％～90％的活动期SLE病人该抗体阳性，效价较高，并与病情有关。抗ssDNA抗体可见于多种疾病中，特异性较差。 3．抗ENA抗体可提取性核抗原（ENA）多从动物的胸腺中提取。先将胸腺匀浆并破碎细胞，分离出细胞核；再经盐水或磷酸盐缓冲液处理后，很容易从胞核中提取出来。ENA 不含DNA，对核糖核酸酶敏感。近年来的研究表明，ENA可分为十几种，现仅介绍几种主要的ENA及其相应抗体。
第二十四章自身免疫性疾病及其免疫检验 autoimmune diseases and immunoassay 第一部分目的要求和教学内容 一、目的要求： 掌握自身免疫性疾病的概念特征及几种常见的自身免疫性疾病；掌握ANA、RF的检测方法及其临床意义。熟悉自身免疫病的发病机制及免疫病理机制。 二、教学内容 1、自身免疫病的概述：自身免疫和自身耐受、自身免疫病的概念及特征；AID的发病机理 及免疫病理机制。 2、自身免疫性疾病的分类：器官特异性AID；非器官特异性AID（SLE、RA）。 3、自身抗体的检测及其临床意义：抗核抗体的类型检测及意义；类分湿因子的检测及意义； 抗甲状腺球蛋白抗体、抗甲状腺微粒体抗体的检测及意义；其它自身抗体检测及意义。第二部分测试题 一、选择题： (一)单项选择题(A型题) 1．免疫系统对自身成分不发生免疫应答，称为自身耐受，这与T细胞（） A.在胸腺发育时不能遇到自身MHC分子有关。 B.在胸腺发育时不能遇到自身成分有关。 C.在胸腺发育时首先遇到外来抗原有关。 D.在胸腺发育时经历的阳性选择有关。 E.在胸腺发育时经历的阴性选择有关。 2．自身成分一般情况下对机体无免疫原性，主要是因为：（） A．免疫系统对自身成分不能识别 B．体内有针对自身成分的T抑制细胞 C．它不是外来物质 D．胚胎期形成了对自身成分的免疫耐受 E．自身成分分子量小 3.免疫耐受性的特点是：（） A.成年期易于诱导耐受性 B.T细胞比B细胞易于诱导耐受性 C.抗原经皮下注射易于诱导耐受性 D.免疫系统处于抑制状态时易于诱导耐受性 E.颗粒性抗原比可溶性抗原易于诱导耐受性 4．下列哪项疾病属于器官特异性AID：（） A.SLE B.类风湿关节炎 C.干燥综合症 D.桥本氏甲状腺炎
抗核抗体谱（ANAs）检测项目及项目物价收费： 注明：项目编号3-2抗核提取物抗体测定，其中包含检测抗体（抗SSA、抗SSB、抗JO
－1、抗Sm、抗nRNP、抗ScL-70、抗着丝点抗体的测定） 该表中湛江及附院收费是参考2011年版的湛江物价局医疗收费及附院0212年收费，请核对并完善。 抗核抗体谱17s亚辉龙中标编号：3179998，中标价：T, 优惠价：T ，抗核抗体谱12S亚辉龙中标编号：3179999, 中标价格：T, 优惠价：T，抗核抗体谱8S亚辉龙中标编号：3180000 ，中标价格：T, 优惠价：T 项目的临床意义如下： 1.高滴度的抗U1-nRNP抗体是混合性结缔组织病（MCTD，夏普综合征）的标志， 阳性率为95-100％，抗体滴度与疾病活动性相关。在30-40％的系统性红斑狼疮患 者中也可检出抗U1-nRNP抗体，但几乎总伴有抗Sm抗体。 2.抗SmD1抗体是系统性红斑狼疮的特异性标志，与抗dsDNA抗体一起，是系统性 红斑狼疮的诊断指标，但阳性率仅为5-10％。 3.抗SS-A（Ro60）抗体最常见于干燥综合征（40-80％）、也见于系统性红斑狼疮 （30-40％）和原发性胆汁性肝硬化（20％）中，偶见于慢性活动性肝炎。此外， 在100％的新生儿红斑狼疮中可出现抗SS-A抗体。该抗体可经胎盘传给胎儿引起 炎症反应和新生儿先天性心脏传导阻滞。 4.抗SS-A（Ro52）抗体在自身免疫性疾病中是一个非特异性指标，与多种自 身免疫性疾病都有相关性，在很多疾病处于稳定期、控制好的情况下会 显示阴性；如果阳性会提示复发或者优先于其它指标预警，起到预防提 示作用。此指标合并其它指标阳性，常会提示预后不好。 5.抗SS-B抗体几乎仅见于干燥综合征（40-80％）和系统性红斑狼疮（10-20％）的 女性患者中，男女比例为29:1。在干燥综合征中抗SS-A抗体和抗SS-B抗体常同 时出现。 6.抗Scl-70抗体见于25-75％的进行性系统性硬化症（弥散型）患者中，因实验方法 和疾病活动性而异（Scl=硬化症）。在局限型硬化症中不出现。 7.抗Jo-1抗体见于多肌炎，阳性率为25-35％。常与合并肺间质纤维化相关。 8.1977年，Wolfe及其同事首先在多肌炎病人中描述了抗PM-Scl抗体，并把该抗体 叫做抗PM抗体。在1984年，Reichlin与其同事经过研究，发现了抗PM-1抗体的 更准确的特征和命名（抗PM-Scl抗体）。在50-70%的所谓的重叠综合征患者中可 检出这些抗体，在这些患者中可合并出现多肌炎（PM）、皮肌炎（DM）和进行性 系统性硬化症（Scl）。抗PM-Scl抗体在进行性系统性硬化症（弥散型）中的阳性 率为3%，在多肌炎和皮肌炎中的阳性率为8%。 9.抗着丝点抗体与局限型进行性系统性硬化症（CREST综合征：钙质沉着、Raynaud’s 病、食管功能障碍、指硬皮病、远端血管扩张）有关，阳性率为70-90%。 10.抗PCNA抗体对系统性红斑狼疮具有很高的特异性，但其阳性率仅为3％ 11.抗dsDNA抗体对系统性红斑狼疮具有很高的特异性。除抗Sm抗体外，抗dsDNA 抗体也可作为该病的一个血清学指标，阳性率为40-90%。
自身抗体临床应用及检测技术概述 一、自身免疫与自身免疫性疾病 （一）基本概念 自身免疫（autoimmunity）：机体对自身成分发生免疫应答的现象，如衰老细胞或组织成分的清除等。 自身免疫病（autoimmune disease）：机体在某些诱因作用下对自身成分发生免疫应答发生紊乱而导致的疾病状态。 自身免疫性疾病的基本特征：血液中可测到高效价的自身抗体和/或自身应答性T淋巴细胞；自身抗体或自身应答性T淋巴细胞造成相应的组织细胞损伤或功能障碍；病情的转归与自身免疫应答的强度密切相关；多脏器或系统受累、病情反复发作和慢性迁延（疑难杂症）。 自身免疫性疾病临床诊断整合效应：患者自述+临床表征+检测结果(实验室\影像学检查等)。自身抗体检测已成为自身免疫性疾病临床诊断不可或缺的指标。 表1.自身免疫性疾病AID（美国数据） 表2.自身免疫性疾病中国患者统计（协和） RA 0.34 800 SLE 0.07 200 SS 0.77 820 AS 0.3 500 其他CTD 0.01-0.06 >300 (PM/DM/Scl) 合计患病人数>5000万 （二）自身抗体临床检测常见项目
1、抗核抗体（ANA）检测 2、自身免疫性肝病相关抗体检测 （三）自身抗体项目：ANA检测 1、ANA基本概念 传统定义是针对细胞核成分的自身抗体的总称。 广义定义是针对细胞内所有抗原成分的自身抗体的总称。对ANA的理解不再局限于核成分，而是指核酸和核蛋白抗体的总称。 靶抗原存在于包括细胞核、细胞浆、细胞骨架、细胞分裂结构等部位。 3、ANA检测的临床意义 ANA可见于多种疾病，特别是结缔组织疾病，常作为结缔组织病的诊断、病情判断和疗效观察的指标。在非结缔组织病（感染和肿瘤）中也可出现阳性。正常人中（特别是老年人）也可出现阳性，但滴度低，且常表现为IgM型，高滴度ANA则高度提示自身免疫性疾病。目前，ANA检测已成为临床上的一个极重要的自身免疫病的筛查实验。 表3.ANA检测的临床意义 （四）抗核抗体基本检测策略 1、初筛实验 2、确认/分型实验：多特异性检测，如：间接免疫荧光法 单特异性检测，如：ELISA, Immunoblot 结果 3、ANA荧光筛查实验 ANA荧光法筛查试验时的几个重点 临界值（起始稀释度）:用于初步甄别阴阳性结果 荧光核型：用于缩小靶抗原确认实验范围并提示部分疾病 抗体滴度：用于判断病情进展、预后等 考虑到荧光法筛查试验存在主观性强的特点，因此应以一种客观和现实的
第二十章自身抗体检测及应用 本章考点 1.概念 2.自身抗体的特性、概念 3.常见自身抗体的检测 4.自身抗体检测的临床应用 自身免疫：当机体免疫系统受某种因素作用使自身免疫耐受削弱或破坏时，免疫系统会对自身成分包括：正常或变性的组织、器官、细胞、蛋白质或酶类等自身抗原产生免疫应答反应，出现自身抗体或致敏淋巴细胞的这种现象称为自身免疫。 自身免疫性疾病：当某种原因使自身免疫应答过分强烈时，也会导致相应的自身组织、器官损伤或功能障碍，这种病理状态称为自身免疫性疾病。 自身抗体；血循环中针对自身组织、器官、细胞及细胞内成分的抗体称为自身抗体。 正常人血清中可有多种微量的自身抗体或致敏淋巴细胞，它能清除体内衰老细胞而起到免疫稳定的效应。 第一节自身抗体的特性 自身抗体是自身免疫性疾病的重要标志。每种自身免疫性疾病都伴有特征性的自身抗体谱。患者血液中存在高效价自身抗体是自身免疫性疾病的特点之一，也是临床确诊自身免疫性疾病的重要依据。 产生自身抗体的抗原包括以下几种：化学修饰的组织抗原；与自身组织成分存在交叉反应的外来抗原；隐蔽抗原；自身细胞HLA-DR抗原的表达以及低分化的组织抗原等，在一定条件下，均可刺激机体产生自身抗体。自身抗体与疾病的关系：某些自身抗体对某种疾病的诊断具有高度特异性，已经成为该病的血清标记性抗体或特异性抗体；某些自身抗体与疾病的活动性有相关性；少数自身抗体参与了免疫病理性损伤。 测定自身抗体的意义：自身免疫性疾病的诊断；疾病活动性的判断；疗效的观察；指导临床用药等。 第二节常见自身抗体的检测 自身抗体种类很多，这里只是简单介绍几种常见的自身抗体的检测。 一、类风湿因子 （一）概念 类风湿因子（rheumatoid factor，RF）是一种抗人或动物IgG分子Fc片段抗原决定簇的抗体，是以变性IgG为靶抗原的自身抗体。可与人或动物的变性IgG结合，而不与正常IgG发生凝集，最多见于类风湿性关节炎患者。 Rose等1984年在RA（rheumatoid arthritis）患者血清中发现RF。RF有IgM、IgG、IgA和IgE型，IgM型为主要类型。 （二）检测方法 1.胶乳凝集试验：以IgG吸附于聚苯乙烯胶乳颗粒上，如血清中含有RF，可与乳胶颗粒出现凝集反应。该法只能定性或半定量，灵敏度及特异性不高，只能检测IgM型RF。 2.速率散射比浊法：定量检测、准确、快速，准确性和敏感性高于胶乳凝集实验。也只能检测IgM型RF。 3.ELISA法：可检出不同Ig类型的RF，在酶标记抗体时，分别标记IgG、IgA或IgM。 （三）临床应用
关注自身免疫性疾病——关注自身抗体谱检测检验科宣 一、什么是自身抗体？ 自身抗体是指针对自身组织，器官、细胞及细胞成分的抗体，分为天然自身抗体和病理性自身抗体。天然自身抗体存在于健康人和动物血清中，多为IgM型，病理性自身抗体是受抗原刺激生成，多为IgG型，特异性强，与自身抗原的亲和力高，可引起自身组织的病理性损伤。 二、什么是自身免疫性疾病？ 自身免疫性疾病(AID)是指由于某些原因造成免疫系统对自身成分的免疫耐受减低或破坏，致使自身抗体或／和致敏淋巴细胞损伤自身器官组织而引起的疾病，表现为相应组织器官的功能障碍。 AID总体发病率占世界人口的3%，中国:3-4千万，临床表现复杂，疑难病，误诊误治多。 临床上AID分两大类： 器官特异性:１型糖尿病、炎症性肠病、多发性硬化、自身免疫性肝炎等； 全身性（或系统性）：系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、干燥综合征等。 三、开展自身抗体检测的临床价值： 自身抗体参与了自身免疫性疾病(AID)的发生；自身抗体有助于自身免疫性疾病的诊断、临床分型、判断预后；自身抗体导致自身免疫性疾病的机制逐渐被阐明；未来方向——有可能做到预防自身免疫性疾病的发生。 四、我院开展的自身抗体谱检测项目： 用于体外定性检测人血清或血浆中的抗 nRNP、Sm、SS-A（天然 SS-A 和 Ro52）、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENP B、PCNA、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体 P 蛋白和 AMA M2 共 14种不同抗原 IgG类抗体。 五、自身抗体谱检测的临床意义： 诊断自身免疫性疾病（包括硬皮病、系统性红斑狼疮、混合结缔组织病、干燥综合征、类风湿性关节炎、多发性肌炎和皮肌炎等） 详细的临床检测意义可咨询你的临床医生哦