中国组织工程研究 第18卷 第10期 2014–03–05出版
Chinese Journal of Tissue Engineering Research March 5, 2014 Vol.18, No.10
ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 1609www.CRTER
.org
李艳琪，女，1988年生，山东省淄博市人，汉族，天津大学在读硕士，主要从事脐带间充质干细胞分离培养等方面的研究。 通讯作者：靳继德，博士，副研究员，军事医学科学院放射与辐射研究所，北京市 100039 并列通讯作者：吴祖泽，研究员，中国科学院院士，天津大学化工学院制药工程系系统生物工程教育部重点实验室，天津市300072；军事医学科学院放射与辐射研究所，北京市 100039 doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.10.021 [https://www.doczj.com/doc/aa10079031.html,] 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)10-01609-06 稿件接受：2014-01-18 Li Yan-qi, Studying for master’s
degree, Key Laboratory of
Systems Bioengineering,
Ministry of Education, and
Department of Pharmaceutical
Engineering, School of
Chemical Engineering and
Technology, Tianjin University,
Tianjin 300072, China
Corresponding author: Jin
Ji-de, M.D., Associate
investigator, Institute of
Radiation Medicine, Academy
of Military Medical Sciences,
Beijing 10039, China
Corresponding author: Wu
Chu-tse, Academician,
Investigator, Key Laboratory of
Systems Bioengineering,
Ministry of Education, and
Department of Pharmaceutical
Engineering, School of
Chemical Engineering and
Technology, Tianjin University,
Tianjin 300072, China; Institute
of Radiation Medicine,
Academy of Military Medical
Sciences, Beijing 10039, China
Accepted: 2014-01-18
人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进
李艳琪1，王洪一2，姚 尧2，刘晶晶3，徐 潇2，张 宇2，刘 洋3，吴祖泽1，
4，靳继德4(1天津大学化工学院制药工程系系统生物工程教育部重点实验室，天津市 300072；2解放军沈阳军区总医院，辽宁省沈阳市 110016；3北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京市 100022；4军事医学科学院放射与辐射研究所，北京市 100039)
文章亮点：
在脐带干细胞的培养过程中，实验特色性的对传统的组织块贴壁法进行了改进，将传统组织贴壁法中本应丢
弃的组织转移到新的培养瓶中，进行二次贴壁培养，在较短时间内获得更多数量的间充质干细胞。通过二次
贴壁法得到的细胞经流式细胞仪检测符合间充质干细胞的特性，且增殖能力旺盛，具有体外多向分化潜能，
可成为临床研究和应用的细胞来源。
关键词：
干细胞；脐带脐血干细胞；脐带；间充质干细胞；分离培养；二次贴壁
主题词：
干细胞；脐带；间质干细胞；细胞培养技术
摘要
背景：脐带来源的间充质干细胞因其具有高度的自我更新和多向分化潜能，以及取材方便等优点而日益受到
关注。
目的：建立一种改进的人脐带间充质干细胞分离、培养方法，并对其生物学特性进行分析。
方法：无菌条件下获取足月妊娠分娩胎儿脐带，利用改良的组织块贴壁法分离培养脐带间充质干细胞，即将
传统组织贴壁法中本应丢弃的组织转移到新的培养瓶中进行二次贴壁培养，取第3代脐带间充质干细胞进行
生物学特性分析。
结果与结论：组织贴壁后第5-7天可见有梭形细胞从组织块边缘爬出，第10天左右可形成明显的细胞克隆。
将组织块转移到新培养瓶中继续培养，2 d 后即可见有细胞爬出，细胞生长速度较快，5 d 即可形成细胞克隆。
传代后的细胞形态均一，呈成纤维细胞样的长梭形。流式细胞仪检测细胞高表达CD90、CD105，不表达CD34、
CD45、HLA-DR 。细胞增殖能力旺盛，平均倍增时间为50 h 左右，41.24%的细胞处于G 2/S 期。体外可诱导
分化为成骨细胞和脂肪细胞。上述实验结果证明二次贴壁培养出的细胞也具有间充质干细胞的生物学特性，
而且通过这种培养方法获得的原代间充质干细胞数是传统方式培养的2倍。
李艳琪，王洪一，姚尧，刘晶晶，徐潇，张宇，刘洋，吴祖泽，靳继德. 人脐带源间充质干细胞分离培养方法
的改进[J].中国组织工程研究，2014，18(10):1609-1614. An improved method for isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells Li Yan-qi 1, Wang Hong-yi 2, Yao Yao 2, Liu Jing-jing 3, Xu Xiao 2, Zhang Yu 2, Liu Yang 3, Wu Chu-tse 1, 4, Jin Ji-de 4 (1Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education and Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China; 2the General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110016, Liaoning Province, China; 3College of Life Sciences and Bio-engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China; 4Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 10039, China) Abstract BACKGROUND: Human umbilical cord mesenchymal stem cells with capabilities for self-renewal and multi-differentiation have attracted widespread attention. OBJECTIVE: To develop an efficient method for isolation and culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells, and to analyze the cell biological features. METHODS: Mesenchymal stem cells were isolated and cultured from human umbilical cord by improved tissue cultivation. Immunophenotype and cell cycle were analyzed by flow cytometry. Growth curve was determined by MTT assay, and differentiation ability was evaluated by in vitro osteogenic and adipogenic induction as well. RESULTS AND CONCLUSION: Some fusiform cells crawled out from human umbilical cord tissues after cultivation for 5 days and formed colonies about 10 days later. When the removed tissues were further cultured, more cells appeared again within 2 days and formed colonies after 5 days. The isolated cells exhibited similar morphology of fibroblast-like shape after passage. Furthermore, the cells expressed CD90, CD105, but were negative for the markers of CD34, CD45, HLA-DR. Population doubling time of the cells calculated from the result of MTT was about 50 hours and cell cycle analysis showed that 41.24% cells were in the G 2/S phrase. Therefore, the isolated cells had a high prolification ability. In addition, the isolated cells could be induced into osteoblasts
李艳琪，等. 人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进 P .O. Box 10002, Shenyang 110180 https://www.doczj.com/doc/aa10079031.html, 1610
and adipocytes in vitro . In a word, the results of this study demonstrated that the cells from the second tissues culture possessed the biological characteristics of mesenchymal stem cells and more primary umbilical cord mesenchymal stem cells were acquired through the improved method.
Subject headings: stem cells; umbilical cord; mesenchymal stem cells; cell culture techniques
Li YQ, Wang HY, Yao Y, Liu JJ, Xu X, Zhang Y, Liu Y, Wu CT, Jin JD. An improved method for isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2014;18(10):1609-1614.
0 引言 Introduction
间充质干细胞是来源于发育早期中胚层的一类具有高
度自我更新能力和多向分化潜能的干细胞，可在体外分化成
脂肪细胞、成骨细胞、心肌细胞、血管内皮细胞和表皮细胞
等[1-5]。早在20世纪70年代，Friedenstein 等[6]发现在骨髓中
存在长梭形成纤维细胞样的塑性贴附细胞，后来有学者利用
梯度离心方法得到了占细胞总量0.001%-0.01%的高纯度
的成纤维样贴壁细胞，这些细胞可以重复出以往Fridenstein
等所进行的关于干细胞特性的所有实验，鉴于它们最终都可
以分化为间质系统细胞，所以又将其定义为间质干细胞[7-8]。
体外培养的间充质干细胞形态均一，平行生长或漩涡状生
长，能够表达多种表面抗原，如高表达间质细胞标志
(CD44、CD90、CD105)，不表达造血干细胞标志(CD34、
CD45、CD14)、内皮细胞标志(CD31、CD33)及人白细胞
抗原(HLA-DR 、-DP 、-DQ)等[9]。
后来实验证明间充质干细胞分布广泛，存在于脂肪、
脐带、皮肤、滑膜等多种组织中[10-11]，其中脐带来源的间
充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem
cells ，hUC-MSCs)因取材方便、无免疫排斥等优势而成为
组织工程理想的种子来源。目前分离脐带来源的间充质干
细胞主要有组织块贴壁法和酶消化法。酶消化法获得的细
胞纯度略低、状态不均一、部分可能因消化酶的损伤无法
贴壁生长；组织贴壁培养法得到的细胞纯度较高，对细胞
伤害小，操作相对简单，将组织块剪碎、贴壁后加培养基
培养即可，但原代培养所需周期较长、获得细胞数量相对
有限。
本实验拟采用一种改良的二次组织贴壁培养方法，
将传统组织贴壁法中本应丢弃的组织转移到新的培养瓶
中，进行二次贴壁培养，以便在相对短的时间内获得更
多数量的间充质干细胞，为临床研究和应用提供充足的
细胞来源。
1 材料和方法 Materials and methods
设计：细胞学观察实验。
时间及地点：2012至2013年在军事医学科学院放射与
辐射研究所实验室进行。
材料： 脐带标本：取自解放军301医院的足月健康婴儿脐带组织，产妇及家属同意将脐带用于实验研究，产妇无传染性疾病，胎儿无先天性疾病。 实验方法： 脐带间充质干细胞的分离、培养：将无菌条件下取得的足月妊娠分娩胎儿脐带，用PBS 洗3次，去掉残留的血细胞。把脐带剪切成2.0 cm 左右的片段并剔除血管(1条脐静脉，2条脐动脉)，取出其中的凝胶状组织，将其剪成大小约1 mm 3的组织块，然后置于培养瓶中。6 h 后，加入含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 链霉素的DMEM/F12培养基，放置在37 ℃、体积分数为5%CO 2培养箱中培养。3 d 后半量换液，1周后再次换液，此后每隔3 d 换液1次。观察贴壁组织周围的细胞生长情况，当细胞达到80%-90%融合度时，用胰酶消化传代，并将组织转移到一个新的培养瓶中，按上述方法继续培养，获得第二次组织块贴壁培养的细胞。取第二次组织培养得到的脐带间充质干细胞进行下述实验。 细胞免疫表型鉴定：取第3代脐带间充质干细胞，0.05%胰酶消化后制备成单细胞悬液。用预冷的PBS 洗2次后重悬于0.5 mL PBS ，分别加入FITC-CD34，PE-CD45、PE-CD90、PE-CD105、PE-HLA-DR 抗体或小鼠IgG 对照，4 ℃避光孵育30 min ，PBS 洗涤2次，于流式细胞仪检测分析。 MTT 法测定细胞生长曲线：取第3代脐带间充质干细
胞，以1×107 L -1的细胞浓度接种于96孔板，每孔200 μL ，各设6个复孔，于37 ℃、体积分数为5% CO 2的培养箱中培养。每天在固定时间点取出96孔板，每孔加入20 μL MTT (5 g/L)，37 ℃培养箱中放置4 h ；轻轻吸掉培养基上清，然后每孔加入二甲基亚砜150 μL ，用酶标仪(波长490 nm)
测定各孔吸光度值，以时间为横轴、吸光度值为纵轴绘制
生长曲线。按公式计算倍增时间(Population doubling
time ，PDt)：
人脐带来源间充质干细胞分离培养实验所需主要试剂： 试剂 来源 培养基DMEM/F12、DMEM-HG GIBCO 胰蛋白酶 Amresco 胎牛血清 Hyclone 荧光标记小鼠抗人单抗CD34-FITC 、CD45-PE 、 CD90-PE 、CD105-PE 、HLA-DR-PE 、小鼠同型阴性对照IgG-FITC 、IgG-PE BD Biosciences PI 染液 赛尔斯生物技术有限公司
RNA 酶、地塞米松、胰岛素、IBMX 、吲哚美辛、 甘油磷酸钠、抗坏血酸 Sigma
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1611www.CRTER
.org PDt =t[ lg2/(lg A t -lg A 1)]
其中，t 为培养的天数，A t 为培养t 天的吸光度值，A 1
为接种后第1天的吸光度值。 流式细胞仪测细胞周期：取第3代处于生长对数期的脐带间充质干细胞，0.05%胰酶消化后制备成单细胞悬液，离心收集细胞，用预冷的PBS 洗涤3次后加入预冷的体积分数为70%乙醇，吹打成单细胞悬液，4 ℃固定过夜；离心去固定液，PBS 洗涤1次，离心去上清，加入500 μL 碘化丙啶(RNase A 质量浓度100 mg/L ，碘化丙啶质量浓度50 mg/L)，4 ℃避光孵育30 min ，流式细胞仪检测细胞周期。 成脂、成骨诱导分化：对于成脂诱导分化，将第3代脐
带间充质干细胞以1×107 L -
1的浓度接种于24孔板内。当细胞达到70%融合时，去掉原培养基，加入含体积分数为10%
胎牛血清、1 μmol/L 地塞米松、10 mg/L 胰岛素、200 mmol/L
吲哚美辛的DMEM(HG)成脂诱导培养液，每隔3 d 换1次
液，诱导2周。当观察到胞质中脂滴形成时，小心移去培养
液，用PBS 轻洗2次，40 g/L 多聚甲醛固定20 min ，油红O
染色30 min ，于倒置显微镜下观察、拍照。
对于成骨诱导分化，取第3代脐带间充质干细胞，以
1×107 L -1的浓度接种于24孔板内。于第2天去掉原培养基，加入含有体积分数为10%胎牛血清、0.1 μmol/L 地塞米松、10 mmol/L 甘油磷酸钠、50 μmol/L 抗坏血酸的DMEM/F12成骨诱导培养液进行诱导培养，每隔3 d 换1次液，诱导3周，当观察到有圆形钙化结节形成时用茜素红染色鉴定。 主要观察指标：倒置显微镜观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞表面标志物及细胞周期，MTT 法检测细胞增殖能力，茜素红染色鉴定细胞成骨分化能力，油红O 染色鉴定细胞成脂分化能力。 2 结果 Results 2.1 脐带间充质干细胞的分离、培养 组织块培养第5天左右，开始有细胞从组织块边缘爬出，呈细小梭形(图1A )；第10天左右可形成明显的细胞克隆。将组织块转移到新培养瓶中后，2 d 即可见有细胞爬出，5 d 可形成细胞克隆(图1B)。用这种方法可在短时间内获得原来两倍的细胞量。传代后的细胞生长速度较快，形态均一，呈梭形或成纤维状。 2.2 细胞免疫表型鉴定 流式细胞分析结果显示(图2)，分离培养的第3代细胞表达CD90(99.35%)、CD105 (99.13%)，不表达CD34(0%)、CD45(0.47%)、HLA-DR (0.13%)，说明第2次组织贴壁培养得到的细胞也是间充质干细胞。 2.3 脐带间充质干细胞的生长曲线 由生长曲线(图3)可知，细胞传代后前两天增殖不明显，3-5 d 进入对数生长期，第6天开始进入平台期，根据生长曲线计算细胞培养第5天的倍增时间为50 h 。 2.4 细胞周期 细胞周期检测结果(图4)显示，第3代脐带源间充质干细胞58.76 %处于G 0/G 1期，16.70%处于G 2/M 期，24.54 %处于S 期，说明第3代细胞增殖能力旺盛。 2.5 诱导分化 成脂诱导后，细胞形态逐渐由典型的长梭形变短、变圆，呈椭圆形。诱导10 d 后于镜下可见胞浆内
出现点状小脂滴，继续诱导培养1周，胞浆内脂滴增多增大。
油红O 可见胞浆内的大量脂滴染成红色(图5A )，说明脐带
源间充质干细胞在体外具有向脂肪细胞分化的潜能。
成骨诱导1周左右，细胞逐渐由长梭形变为方形、鳞片
形。诱导2周后，细胞外基质分泌增多，胞质中及胞质外出
现许多黑色小颗粒，3周后可见结节状结构。茜素红染色可
见红色矿化沉着物(图5B )，说明脐带源间充质干细胞在体
外具有向成骨细胞分化的潜能。 3 讨论 Discussion 间充质干细胞是目前备受关注的一类具有多向分化潜能的组织干细胞，在细胞治疗领域有着重要的应用前景。临床上应用间充质干细胞已经在神经系统疾病、心血管系统疾病、糖尿病及肝脏疾病等方面取得了重要进展，如治疗脊髓损伤、脑缺血、心脏病、多发性硬化、成骨不全症等[12-15]。体外培养的骨髓间充质干细胞已被广泛应用于研究领域[16-19]，然而骨髓间充质干细胞的增殖分化潜能会随
供者年龄的增大而下降，并且采集骨髓常常存在出血和感
染等问题[20-21]，这些都限制了骨髓源间充质干细胞的临床
研究和应用。脐带是连接胎儿脐部与胎盘之间的组织，一
般在胎儿分娩时被当作废弃物。脐带取材方便，易于收集
保存，不易污染，不涉及伦理道德问题，而且脐带组织中
的间充质干细胞含量丰富，较为原始，分化能力强，可在
体外迅速扩增、生物性能稳定，为细胞治疗提供了一种新
的种子细胞来源。
本实验在传统组织块贴壁法的基础上进行二次贴壁培
养，得到脐带源间充质干细胞。脐带包括1条静脉和2条动
脉，周围是华通氏胶组织，外层由羊膜来源的上皮包裹。
传统组织贴壁法是将脐带中的华通氏胶剪碎贴壁[22-23]，1
周左右可以在光镜下观察到少数长梭形贴壁生长的细胞或
从小组织块周围长出少许贴壁生长的细胞，大约2周时可见
大量长梭形细胞散开分布或围绕组织块呈克隆状生长，用
胰酶消化传代时即将组织块丢弃。本实验首次组织块贴壁
培养情况和上述结果相符，但是并未将培养后的组织块丢
弃，而是转移到新的培瓶中继续培养，两三天即可见到贴
壁细胞，第5天可形成明显的细胞克隆。相对于传统组织贴
壁法，这种改进的方法可在较短时间内获得大量原代细胞。
脐带源间充质干细胞不表达或低表达免疫排斥相关标
记，是一类免疫缺陷细胞，异体移植无免疫排斥反应或反
应较弱，适宜于不同个体之间的移植，是细胞治疗的理想
靶细胞。经流式检测结果显示，二次贴壁培养所获得的细
胞高表达CD90、CD105，不表达造血干细胞标记CD34、
CD45，不表达HLA-DR ，具有低免疫原性，符合间充质干
细胞的特性。
李艳琪，等. 人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 1613
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间充质干细胞的培养潜伏期为12-24 h ，2 d 后进入对
数生长期，对数增殖期持续3-5 d ，六七天后进入生长平
台期。实验通过MTT 法得到细胞的生长曲线，由生长曲线
可知细胞的群体倍增时间为50 h ，与之前文献报道的45 h
差异不大[24]。细胞周期是细胞生命活动的基本过程， 其
中S 期为DNA 合成期，实验结果显示41.24%的脐带源间
充质干细胞处于G 2/S 期，比以往文献报道的G 2/S 期比例
高[23-24]，表明细胞有丝分裂旺盛，增殖能力强。大量研究
表明间充质干细胞具有可塑性，经体外诱导培养能向多种
成体细胞分化[25]。本实验获得的脐带源间充质干细胞也可
在体外诱导为成骨细胞和脂肪细胞，符合间充质干细胞多向分化潜能的特性。因此，上述实验结果表明，二次贴壁培养获得的细胞也具有间充质干细胞的生物学特性。 实验对传统组织块贴壁法分离培养脐带源间充质干细胞进行了改进，将培养后的组织块转移到新的培养瓶后，细胞的生长速度加快，可在短时间内扩增出大量原代细胞。间充质干细胞作为种子细胞在细胞替代治疗方面显示出巨大的前景，实验所用的这种改进的脐带源间充质干细胞原代分离培养方法，简单快捷，相同的原料，可获得更多的原代间充质干细胞，为其临床研究和应用提供了实验依据。 0.70.60.50.40.3
0.2
0.1
吸光度值(A ) 01 2 34567图3 人脐带间充质干细胞的生长曲线
Figure 3 Growth curve of human umbilical cord mesenchymal stem cells 图注：传代后前两天细胞增殖不明显，3-5 d 进入对数生长期，第6天开始进入平台期。 时间(d)图4 人脐带间充质干细胞的细胞周期分析结果
Figure 4 Cell cycle analysis of human umbilical cord mesenchymal stem cells 图注：第3代人脐带间充质干细胞58.76 %处于G 0/G 1期，16.70 %处于G 2/M 期，24.54 %处于S 期，说明第3代细胞增殖能力旺盛。
李艳琪，等. 人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进 P .O. Box 10002, Shenyang 110180 https://www.doczj.com/doc/aa10079031.html, 1614 作者贡献：实验设计为第七作者，实验实施为第一、二、三、七作者，实验评估为第四、五、六作者，资料收集为第一作者。第一作者成文，通讯作者进行审校，第一作者和通讯作者对文章负责。 利益冲突：文章及内容不涉及相关利益冲突。 伦理要求：提供样本的产妇及家属同意将脐带用于实验研究，并且签署“知情同意书”，实验方案获得医院伦理委员会批准。 学术术语：细胞周期-由细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所经历的过程，可分为G 1、S 、G 2和M 期4个时期。G 1期为DNA 合成前期，主要合成RNA 和核糖体；S 期为DNA 合成期；G 2期为DNA 为合成后期，DNA 合成终止；M 期为有丝分裂期。细胞周期可反映细胞的增殖能力。 作者声明：文章为原创作品，无抄袭剽窃，无泄密及署名和专利争议，内容及数据真实，文责自负。 4 参考文献 References [1] Kadivar M, Khatami S, Mortazavi Y ,et al.In vitro cardiomyogenic potential of human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells.Biochem Biophys Res Commun. 2006;340(2):639-647. [2] Dominici M, Le Blanc K, Mueller I,et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 2006;8(4):315-317. [3] Wakitani S, Saito T, Caplan AI.Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine.Muscle Nerve. 1995;18(12):1417-1426. [4] Pittenger MF, Martin BJ.Mesenchymal stem cells and their potential as cardiac therapeutics.Circ Res. 2004;95(1):9-20. [5] 唐欣,王岩,易海波,等.人脐带间充质干细胞诱导分化为心肌细胞的特异性基因表达[J].中国组织工程研究,2013,17(27): 4988-4991. [6] Friedenstein AJ, Petrakova KV, Kurolesova AI,et al. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues.Transplantation. 1968; 6(2):230-247. [7] Horwitz EM, Le Blanc K, Dominici M,et al.Clarification of the nomenclature for MSC: The International Society for Cellular Therapy position statement.Cytotherapy. 2005;7(5):393-395. [8] Prockop DJ."Stemness" does not explain the repair of many
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胚胎干细胞培养有新法 2010-12-22 来源：科技日报责编：杨婷 据美国每日科学网12月19日报道，美国研究人员发现，利用软凝胶基质代替硬培养皿来培养小鼠胚胎干细胞，无需添加昂贵的生长因子，便可让干细胞培养物长时间维持同质的多能状态。研究人员表示，这一技术在未来的再生医学中有着巨大的应用前景。相关论文发表在《公共科学图书馆·综合》杂志上。 干细胞研究面临的主要障碍就是如何让小鼠胚胎干细胞培养物保持一种均一的多能状态。多能干细胞可自发地分化成皮肤或者肌肉等不同的组织类型，长期以来，科学家都是利用一种被称作生长因子的化学物质来维持干细胞的多能态不变，但即便如此，培养出来的干细胞还是会很快进入各自的分化阶段，呈现出不同的基因表达和形态，这种多样性分化使得干细胞培养物很难被诱导生成所需的特定组织。 该研究负责人之一、伊利诺伊大学基因组生物学研究所动物科学教授田中哲也表示，可以从培养一群同质的未分化细胞入手，诱使其分化成特定的细胞类型以实现临床应用。 研究小组发现，多能小鼠胚胎干细胞喜欢“抱团”黏附在一起，而处于群体边缘、与坚硬的培养皿接触的细胞分化速度相对较快，于是他们决定对小鼠胚胎干细胞进行机械学研究而非化学研究。由于干细胞比成熟细胞要柔软10倍，研究人员猜测是否是培养皿和细胞之间的机械力刺激了细胞分化，并通过前期研究证实，即使很小的机械力也可诱导细胞分化。 接下来，研究小组将小鼠胚胎干细胞分成3组进行平行试验：第一组用加入了生长因子的常规培养基培养；第二组采用与这些细胞同样硬度的软凝胶基质进行培养，并加入生长因子；第三组同样用软凝胶基质培养，但没有加入生长因子。结果显示，即使缺乏生长因子，利用软凝胶基质培养的干细胞在3个多月传代20次后仍能表现出更明显的同质性和多能性。 研究合作者、伊利诺伊大学机械科学和工程系教授王宁(音译)说，这体现了事物的两面性：机械力能够诱导分化，但如果降低培养基和干细胞之间的机械力，就可以将干细胞保持在多能状态。这项研究证实了在干细胞分化过程中力学环境的重要性不亚于化学生长因子。在活的有机体中，细胞只在短期内分泌生长因子，而机械力则始终在影响每个细胞。 研究小组下一步打算利用这种新技术来培养诱导多能干细胞(iPS)，虽然iPS 细胞医学应用前景广阔，但也是出了名的难以培养。田中哲也说：“我们可以试
间充质干细胞培养方法 1、间充质干细胞MSＣ基本形态 2、干细胞应用与干细胞调控。 3、间充质干细胞MSC生长过程 ４、间充质干细胞MSC培养得合适气体环境 5、细胞培养板得选择 7、如何维持培养液p Ｈ ６、如何选用细胞培养基? 8、血清与干细胞得培养?9、胎牛血清（F B S )就是否需要灭活?1０、细胞得细菌、真菌污染及排除?１1、细胞培养污染得预防 １2、使用胰蛋白酶时加入 E DTA得目得就是什么 13、胶原酶得种类与选型?1４、胶原酶V S胰酶?1５、干细胞得种类与表面标记 １6、间质干细胞培养原理概述? 17、间质干细胞成脂与成骨诱导分化?1８、干细胞老化得表现 20、冷冻保护剂作用与选择? 21、细胞冻存指导 19、细胞传代消化过程指导? 与处理? 22、干细胞冷冻与复苏 23、移植细胞得基因修饰?1。间充质干细胞MSＣ基本形态?体外培养细胞根据它们在培养器皿就是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞与上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长.?间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3厘米个长短不同得突起。可瞧到细胞成螺旋状生长。 ?2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞得调控就是指给出适当得因子条件，对干细胞得增殖与分化进行调控,使之向指定得方向发?２、１内源性调控 展.? 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖与分化，包括调节细胞不对称分裂得蛋白，控制基因表达得核因子等。另外,干细胞在终末分化之前所进行得分裂次数也受到细胞内调控因子得制约。 （1)胞内蛋白对干细胞分裂得调控?干细胞分裂可能产生新得干细胞或分化得功能细胞。这种分化得不对称就是由于细胞本身成分得不均等分配与周围环境得作用造成得.细胞得结构蛋白，特别就是细胞骨架成分对细胞得发育非常重要。如在果蝇卵巢中,调控干细胞不对称分裂得就是一种称为收缩体得细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白与细胞周期素A。收缩体与纺锤体得结合决定了干细胞分裂得部位，从而把维持干细胞性状所必需得成分保留在子代干细胞中。?（2）转录因子得调控在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化得调节非常重要。比如在胚胎干细胞得发生中,转录因子Oct ４就是必需得.Ｏcｔ4 就是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达得转录因子,它诱导表达得靶基因产物就是FＧＦ—４等生长因子，能够通过生长因子得旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层得进一步分化。Oct４缺失突变得胚胎只能发育到囊胚期,其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LＩF)对培养得小鼠ES 细胞得自我更新有促进作用,而对人得成体干细胞无作用，说明不同种属间得转录调控就是不完全一致得。又如Tｃf/Lｅｆ转录因子家族对上皮干细胞得分化非常重要.T ｃｆ/Leｆ就是Wnt 信号通路得中间介质，当与β－Catｅnｉn 形成转录复合物后,促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊.? 2、2外源性调控 除内源性调控外,干细胞得分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素得影响。?(1）分泌因子?间质细胞能够分泌许多因子,维持干细胞得增殖，分化与存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们就是TGFβ家族与Wnｔ信号通路.比如TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞得分化。最近研究发现,胶质细胞衍生得神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多
脐带间充质干细胞概述 医学实验班70080103 王雪彤 脐带是胎儿时期连接母体与胎儿的索状结构,其外被羊膜,内含2条脐动脉、1条脐静脉,在动静脉之间含有特殊的胚胎粘液样结缔组织———华尔通氏胶(Whartonps Jelly) ,从华尔通氏胶分离得到的基质细胞即为人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 。 1人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 的形貌分析: 倒置显微镜下观察人脐带间充质干细胞贴壁生长, 为形态相对均一的梭形细胞,呈平行排列生长或旋涡状生长,低密度时较扁平, 密度增加趋于融合时细胞变细长。扫描电镜下观察呈长条状纤维样, 细胞膜表面不光滑, 有小结节状物, 细胞无明显突起,细胞间无网络状连接。透射电镜观察核大, 不规则, 核仁明显, 常染色质多, 异染色质少, 胞浆少。胞质内细胞器较少, 以粗面内质网和线粒体为主, 内有大量游离核糖体, 部分细胞可见内质网肿胀。 ——植块法培养获得的人脐带间充质干细胞(×200) 例如三代细胞的形态学特征——人体脐带间充质干细胞离体培养后，培养至第三代。第三代人脐带间充质干细胞以均一长梭形的细胞为主，细胞周边有较多的丝状伪足，见图1，2；并形成毗邻细胞之间的网状连接，见图3；细胞核较大，核膜清晰，含两三个核仁，核质比较小，见图4。 图1图
2图3 图4 2人脐带间充质干细胞(HUMSCs) 的生物学特性： HUMSCs既非胚胎干细胞又非成体干细胞,是别于两者之间的一类新的多能间充质细胞,它们之间既有联系又有差异。根据国际细胞疗法间充质与组织干细胞委员会( the Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee of the Internation2 al Society for Cellular Therapy)制定的最低标准, 脐带间充质干细胞（MSCs）需满足以下条件: 1)MSCs在标准培养条件下呈贴壁生长; 2 )MSCs表达CD105, CD73和CD90,不表达CD45, CD34, CD14或CD11b, CD79a或CD19和HLA2DR; 3)MSCs在体外至少能向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化。和其他来源的 MSCs一样HUMSCs呈长条梭形贴壁生长,表达CD73、CD90、CD105、CD166、CD10、CD13、CD29、CD44 及HLA2ABC ,不表达CD34、CD45、CD31等造血干细胞标记或CD33、CD14、CD56及HLA2DR、2DA、2DP、2DQ ,体外诱导培养能向多种成体细胞分化。比照这些条件,表明华尔通氏胶来源的间质细胞具有MSCs特性。HUMSCs还表达原始干细胞标记,如白血病抑制因子受体通路、胚胎干细胞特异基因Ⅰ及端粒逆转录酶及Nanog、STAT3、AP、Oct24、BMP4、PAX6、ADAM12、Nestin、HLA2Ⅰ。另外, HUMSCs低表达移植相关的细胞表面标记CD80、CD86、CD40 和CD40 l等。在混合淋巴细胞检测中呈免疫抑制,并抑制T细胞的增殖,异体移植该细胞可产生免疫耐受性,表明其为一类免疫缺陷细胞,异基因移植不会发生免疫排斥反应。 3脐带间充质干细胞(UMSCs)的移植治疗作用: 骨髓MSCs用于改善心、脑功能的机制主要在于其分泌SDF一1和VEGF 等局部细胞因子, 诱导微血管的生成, 改善缺血组织微环境。UMSCs表达SDF 一1和VEGF, 提示了UMSCs治疗心脑梗塞、脊髓损伤的可能。 1)UMSCs对脑损伤的治疗作用 外源性UMSCs对脑组织的修复机理可能涉及到诱导内源性VEGF表达, 局部微血管增生, 抑制细胞凋亡等。利用液压冲击脑损伤模型, 证明
以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。 一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM（高糖） 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF 复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。 步骤： 1．从液氮中取出一管细胞； 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）； 3．将细胞转移到一15ml Falcon管中； 4．加入5ml ES培养基（用培养基冲洗冻存管）； 5．离心3分钟； 6．弃上清，用2ml ES培养基重悬细胞，至少吹打10次； 7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿； 8．孵育。 冻存细胞 冻存液
间充质干细胞培养方法 1. 间充质干细胞MSC基本形态 2. 干细胞应用与干细胞调控。 3. 间充质干细胞MSC生长过程 4. 间充质干细胞MSC培养的合适气体环境 5. 细胞培养板的选择 6. 如何选用细胞培养基 7. 如何维持培养液p H 8. 血清与干细胞的培养 9. 胎牛血清（F B S ）是否需要灭活 10. 细胞的细菌、真菌污染及排除 11. 细胞培养污染的预防 12. 使用胰蛋白酶时加入E DTA的目的是什么 13. 胶原酶的种类和选型 14. 胶原酶V S胰酶 15. 干细胞的种类和表面标记 16. 间质干细胞培养原理概述 17. 间质干细胞成脂和成骨诱导分化 18. 干细胞老化的表现和处理 19. 细胞传代消化过程指导 20. 冷冻保护剂作用和选择 21. 细胞冻存指导 22. 干细胞冷冻和复 23. 移植细胞的基因修饰 1．间充质干细胞MSC基本形态 体外培养细胞根据它们在培养器皿是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞和上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长。 间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似，细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3 厘米个长短不同的突起。可看到细胞成螺旋状生长。 2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞的调控是指给出适当的因子条件，对干细胞的增殖和分化进行调控，使之向指定的方向发展。 2.1源性调控 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖和分化，包括调节细胞不对称分裂的蛋白，控制基因表达的核因子等。另外，干细胞在终末分化之前所进行的分裂次数也受到细胞调控因子的制约。 （1）胞蛋白对干细胞分裂的调控 干细胞分裂可能产生新的干细胞或分化的功能细胞。这种分化的不对称是由于细胞本身成分的不均等分配和周围环境的作用造成的。细胞的结构蛋白，特别是细胞骨架成分对细胞的发育非常重要。如在果蝇卵巢中，调控干细胞不对称分裂的是一种称为收缩体的细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白和细胞周期素A。收缩体与纺锤体的结合决定了干细胞分裂的部位，从而把维持干细胞性状所必需的成分保留在子代干细胞中。
人脐带间充质干细胞操作规范 一、人脐带间充质干细胞的分离和培养 1. 准备4~5个培养皿，打开放在超净台中，将消毒过的平剪×1，弯剪×2， 有齿镊子×4，放入超净台，紫外照射30 min，通风10 min; 2. 在1#、3#和4#号培养皿倒入25 ml生理盐水，在2#培养皿倒入25 ml酒精; 3. 将盛放脐带的器皿用酒精消毒外表面后放入超净台，用弯嘴钳取出脐带放入1# 培养皿，清洗残留血渍，用第2把弯嘴钳配合挤出脐带血管内的积血; 4. 将脐带 转移至2#培养皿，完全浸泡，计时1 min; 5. 将脐带转移至3#培养皿，用平剪剪成3 cm左右的小段，清洗脐带内的积血(如果积血较多，可再次转入另一加盐水的培养皿); 6. 用有齿镊子分离2根动脉和1根静脉，剥离华尔通氏胶，放入4#培养皿; 7. 将剥离的胶体转移至50 ml离心管中，2000 rpm离心5 min; 8. 弃上清液，将胶 体倒入干净的培养皿中，用小剪刀将其剪成糊状并转移至50 ml离心管中; 9. 以0.5 ml/瓶的量将胶体组织块接种至T75培养瓶，每瓶加入4 ml脐带有 血清培养液(DMEM/F12 + 10% FBS + 1% L-Glutamine + 1% MEM NEAA + 10 ng/ml bFGF)，水平摇晃培养瓶使组织块分布均匀; 10. 第2天观察是否有污染，每3天换一次液，并观察细胞爬出情况(过程中 须注意平稳地拿放培养瓶，避免组织块发生移动); 11. 培养14天左右，倒去上清培养液，加生理盐水(3 ml/瓶)洗涤，用0.25% 胰酶(2 ml/瓶)消化下爬出细胞及组织块，并用上清培养液(1 ml/瓶)终止消化; 12. 收集细胞及组织块悬液，2000 rpm离心5 min; 13. 弃上清液，加入适量生理盐水混匀，用70 μm滤网过滤去除组织块，即 得到P0代脐带间充质干细胞;
胚胎干细胞培养标准化操作规程(SOP) 一、细胞 多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡 1．表达绿色荧光蛋白（EGFP）的B5-ES细胞。由Dr. Nagy的实验室制备。 2．D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。 3．J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。我们得到时大约传了7－9代。 4．J1rtTA-rtTA表达J1细胞，由Dr. Jaenish的实验室友情提供。 5．表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞，由Dr. Nagy的实验室提供。 二、一般培养——维持ES细胞处于未分化状态 ES细胞培养用含有ESGRO（白血病抑制因子）的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。 培养基 ES：配制一20×不含DMEM，HS，ESGRO的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml FALCON管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基，0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。注：一瓶DMEM是500ml。 贮存液 DMEM(高糖) 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST ESGRO 复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。 步骤
(一)1.Sections of 8–10 cm of umbilical cords, which are routinely discarded, were internally washed with phosphate-buffered saline (PBS), supplemented with 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, https://www.doczj.com/doc/aa10079031.html, ) and immediately immers ed in Dulbecco ’s modi fied Eagle ’s medium- low glucose (DMEM-LG; Invitrogen-Gibco) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Invitrogen-Gibco) and 3% penicillin/streptomycin (Invitrogen-Gibco). All samples were processed within 12 –15 h after collection. 2. UCs were fil led with 0.1% collagenase (Sigma-A ldrich, St. L oui s, https://www.doczj.com/doc/aa10079031.html,/sigma-aldrich/home.h tml) in PBS and incuba ted at 37°C for 20 min. Each UC was washed wi th proli feration medium, and the detach ed cell s were harvested after gentl e mass age of the UC. Cells were centr ifuged at 300 g for 10 min, resus -pended in prolifera tion medium, and seeded in 25-cm^ 2 flasks at a densi ty of 5 × 10^7 cells per ml.After 24 h of incubation, non-adherent cells were removed, and culture medi um was replace d every 3 days. （二）HuMSCs were prepared as previously described.8 Wharton's jelly was processed within 24 hours of collection and cut into pieces of about 1 mm3 for culture. These pieces were placed in 24-well plates and cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 5 ng/ml EGF, 5 ng/ml basic fibroblast growth factor, 100 U/ml penicillin and 100 mg/ml streptomycin, and 1 μg/ml amphoterin B. The culture plate was placed in an incubator with saturated humidity at about 37°C containing 5% (v/v) CO2. The medium was changed every three days and the cells were passaged when they reaching 70% confluence. Adherent cells were recovered by treatment with 0.25% trypsin for 3 to 5 minutes then centrifuged. (三) 脐带间充质干细胞的分离：脐带自手术台取下后，浸入含抗生素的生理盐水中，4 ℃保存，在操净台内取出脐带，用D-PBS冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1 mm^3大小的组织块后放入200 mL 蓝盖试剂瓶，加入质量/ 体积比为0.1%的Ⅱ型胶原酶30 mL，置于恒温振荡仪内持续消化6 h ，100 目筛网过滤收集细胞。加入D-Hank’s液冲洗细胞3 次，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12重悬细胞，调整细胞密度为(4.8×10^3~1×10^4)/cm^2，接种于6 孔板内，于37 ℃、体积分数为5%的CO2孵箱内培养，24 h 后换液。 脐带间充质干细胞在不同培养体系中的体外扩增：待原代培养的脐带间充质干细胞贴壁后，在两个6 孔板中进行3 种培养体系的生长对比实验。第1 个6孔板中细胞密度为1×10^7 L^-1，采用连续适应法使细胞由原代培养时使用的DMEM/F12分别逐步过渡到低糖DMEM、MesenPRO RS?Medium 和STEMPRO?MSC SFM 3 种培养体系，即用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基和相应的3种培养基按体积比1 ∶1 混合培养细胞，通过下列混合培养基的方式，连续几代减少当前培养基的量，即1 ∶2 ，1 ∶4 ，1 ∶16和100% 替代培养基，每次适应改变培养体系时，传代细胞一两次，其中孔 1 为原代培养时的DMEM/F12培养液，孔2为低糖DMEM，孔3 为MesenPRO RS?Medium ，孔4 为STEMPRO? MSC SFM。第2 个6孔板中细胞密度为2×10^7 L^-1，每孔培养液设置同上，目的是避免在不同时间消化传代间充质干细胞时出现实验操作上的误差。 (四)脐带间充质干细胞的体外分离培养 (1)脐带白手术台取下后，浸入含抗生素的0．9％生理盐水中，4"C保存； (2)在超净台内取出脐带，用生理盐水冲洗净脐动脉和脐静脉内的残余血液，用止血 钳和剪刀剔除上述血管，将脐带剪成1mm^3大小的组织块； (3)加入质量／体积比为0．1％的II型胶原酶至完全覆盖组织块，置于培养箱内持续消化
脐带间充质干细胞（MSCS）抗衰老的临床实验 作者：Simon Sun Isa Li 【摘要】目的：观察脐带间充质干细胞对人体衰老的影响和安全性，对比观察脐带间充质干细胞对衰老的逆转现象。方法：抽取20名健康人作为志愿者，进行脐带间充质干细胞静脉回输（其中男性6人，女性14人，年龄为50-80岁），实验组10名志愿者进行静脉滴注3个疗程脐带间充质干细胞，对照组滴注生理盐水。实验组和对照组志愿者均为双盲实验，疗程结束后3个月、6个月、12个月的对比观察。结论：治疗组有效率为90%，从外表、内分泌、精神状态、体能、睡眠均表现出有效性。 Abstract: Objective: To observe the effect and safety of umbilical cord mesenchymal stem cells (MSCs) on human aging. Methods: a total of 20 healthy volunteers, of umbilical cord mesenchymal stem cells reinfusion (6 males, 14 females, aged 50-80 years old), the experimental group of 10 volunteers were intravenous infusion of 3 cycles of umbilical cord mesenchymal stem cells, the control group of normal saline drip. The experimental group and the control group were double blind experiment, 3 months after the end of treatment, and the observation of 6 months and 12 months. Conclusion: the effective rate of the treatment group was 90%, which was effective from the appearance, endocrine, mental state, physical fitness and sleep. 对抗衰老延长寿命是人类的梦想，但以往的方法以失败见终，究其原因均是不能针对衰老的根本原因所致。而人类衰老的原因一是衰老的细胞不能被代替，正常的新陈代谢因为干细胞的补充不足所致。随着干细胞和研究的发展，以及进行临床治疗中所带来的抗衰老表现，提示脐带间充质干细胞会对衰老的过程产生正影响，具有良好的市场应用价值。本实验就是采取双盲实验的方法来进行对证，验证MSCS对衰老的逆转影响。 脐带间充质干细胞（Mesnchymal Stem Cells，MSCs）是指存在于新生儿脐带组织中的一种多功能干细胞，它能分化成许多种组织细胞，具有广阔的临床应
细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养
骨髓间充质干细胞的分离与培养 艾国平,粟永萍,闫国和,冉新泽,刘晓宏,罗成基,程天民(第三军医大学预防医学系防原医学教研室、全军复合伤研究所,重庆400038) 提要:目的摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,并观察其部分生物学活性。方法采用常规的细胞培养传代技术以及光、电镜技术和细胞增殖活性检测法,观察不同贴壁时间、不同浓度血清、不同种植密度对骨髓间充质干细胞生长、增殖、形态的影响,并观察培养细胞的部分生物学特性。结果以选用4～24ｈ贴壁的有核细胞,加入5%～10%胎牛血清、种植密度(4～8)×104个/ｍｌ的培养条件为最适宜细胞生长;在此条件下,培养扩增的细胞仍具有干细胞多向分化性;其形态呈梭状,具有快速增殖的能力;培养细胞在3～4ｄ进入对数生长期,随后进入平台期,分裂相细胞明显减少;光镜下细胞呈梭状或类成纤维状,2～10代的细胞呈均质状;超微结构显示为早期幼稚细胞形态。结论建立了骨髓间充质干细胞体外分离、培养的条件,探讨了骨髓间充质干细胞部分生物学特性,为进一步深入研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 关键词:骨髓间充质干细胞;组织工程学 干细胞是近年来研究的热点,骨髓中除造血干细胞以外,还含有另一类干细胞—间充质干细胞(Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ,ＭＳＣ),在不同的诱导条件下,具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力,如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化的能力[1,2]。随着细胞工程学和组织工程学的发展,利用干细胞的多向分化性,选择合适的生物材料和有靶向性目的基因,已有报道ＭＳＣ在骨、软骨、肌腱和神经胶质修复中的作用[3,4],国内在这方面的工作尚处于起步阶段。本实验旨在摸索体外分离培养骨髓间充质干细胞的最佳条件,为进一步研究骨髓间充质干细胞的诱导分化和应用打下基础。 1材料与方法 1.1骨髓ＭＳＣ的分离从胸骨无菌抽取约1～2ｍｌ的骨髓,肝素化后,加入红细胞裂解液5ｍｌ,混匀,1200ｒ/ｍｉｎ,离心10ｍｉｎ;弃上清,用0.01ｍｏｌ/Ｌ的ＰＢＳ(ｐＨ7.2)洗2～3次,1200ｒ/ｍｉｎ,各离心10ｍｉｎ;计数,以2×109/ｍｌ种入10%ＦＢＳα ＭＥＭ培养基,青霉素100Ｕ/ｍｌ、链霉素100μｇ/ｍｌ,37℃,5%ＣＯ2孵箱中培养;不同时相点弃悬浮细胞,用0.01ｍｏｌ/ＬＰＢＳ(ｐＨ7.2)尽量轻轻洗去未贴壁的细胞,加入含10%ＦＢＳα ＭＥＭ培养基。 1.2不同贴壁时间对ＭＳＣ增殖的影响选用贴壁后1、2、3、4、6、8、12、24、48、72ｈ的细胞进行传代培养,观察不同时间贴壁的细胞传代、增殖能力及形态学的变化。 1.3不同浓度胎牛血清(ＦＢＳ)对ＭＳＣ生长的影响细胞按4×104/ｍｌ种入96孔培养板中,分别加入以下ＦＢＳ浓度的α ＭＥＭ培养基:0%、1%、 2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%、20%,每个浓度6孔;培养48ｈ后,加入20μｌＭＴＴ(5ｍｇ/ｍｌ二苯基四氮唑溴盐),37℃避光培养4ｈ;尽量吸掉上清液,加入150μｌ二甲基亚砜,室温振荡10ｍｉｎ,ＨＴ7000ｐｌｕｓ多孔读数仪490ｎｍ处读取Ｄ490值,以培养液作空白对照。 1.4比较不同种植密度对ＭＳＣ生长的影响用含10%ＦＢＳ的α ＭＥＭ培养基;细胞按以下密度(×104/ｍｌ):0.3、0.6、1.0、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0、10.0种入96孔培养板中,每一密度6孔;培养48ｈ后,按上述方法测其Ｄ490值。 1.5培养细胞生长曲线细胞按0.5×104/ｍｌ种入24孔培养板,每孔培养液为1ｍｌ,每天取3孔测其Ｄ490值,连续测8ｄ,绘出培养细胞生长曲线。 1.6培养细胞分裂指数曲线按检测细胞生长曲线的细胞密度接种于放有小盖玻片的24孔培养板中,每24ｈ取出3块小玻片,连续8ｄ;用95%酒精固定,ＨＥ染色、封片。对每一时间组细胞进行计数,算出1000个细胞中分裂相细胞的百分比。 1.7ＭＳＣ的形态学观察在倒置显微镜下,直接观察第2、4、8代ＭＳＣ的活体形态;并分别用光镜及透射电镜观察其形态结构。 1.8统计学分析用哈佛统计软件,进行单因素方差分析及均数间的显著性差异检验,用Ｍｉｃｒｏｓｏ
中国组织工程研究 第18卷 第10期 2014–03–05出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research March 5, 2014 Vol.18, No.10 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 1609www.CRTER .org 李艳琪，女，1988年生，山东省淄博市人，汉族，天津大学在读硕士，主要从事脐带间充质干细胞分离培养等方面的研究。 通讯作者：靳继德，博士，副研究员，军事医学科学院放射与辐射研究所，北京市 100039 并列通讯作者：吴祖泽，研究员，中国科学院院士，天津大学化工学院制药工程系系统生物工程教育部重点实验室，天津市300072；军事医学科学院放射与辐射研究所，北京市 100039 doi:10.3969/j.issn.2095-4344. 2014.10.021 [https://www.doczj.com/doc/aa10079031.html,] 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2014)10-01609-06 稿件接受：2014-01-18 Li Yan-qi, Studying for master’s degree, Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, and Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China Corresponding author: Jin Ji-de, M.D., Associate investigator, Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 10039, China Corresponding author: Wu Chu-tse, Academician, Investigator, Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education, and Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China; Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 10039, China Accepted: 2014-01-18 人脐带源间充质干细胞分离培养方法的改进 李艳琪1，王洪一2，姚 尧2，刘晶晶3，徐 潇2，张 宇2，刘 洋3，吴祖泽1， 4，靳继德4(1天津大学化工学院制药工程系系统生物工程教育部重点实验室，天津市 300072；2解放军沈阳军区总医院，辽宁省沈阳市 110016；3北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京市 100022；4军事医学科学院放射与辐射研究所，北京市 100039) 文章亮点： 在脐带干细胞的培养过程中，实验特色性的对传统的组织块贴壁法进行了改进，将传统组织贴壁法中本应丢 弃的组织转移到新的培养瓶中，进行二次贴壁培养，在较短时间内获得更多数量的间充质干细胞。通过二次 贴壁法得到的细胞经流式细胞仪检测符合间充质干细胞的特性，且增殖能力旺盛，具有体外多向分化潜能， 可成为临床研究和应用的细胞来源。 关键词： 干细胞；脐带脐血干细胞；脐带；间充质干细胞；分离培养；二次贴壁 主题词： 干细胞；脐带；间质干细胞；细胞培养技术 摘要 背景：脐带来源的间充质干细胞因其具有高度的自我更新和多向分化潜能，以及取材方便等优点而日益受到 关注。 目的：建立一种改进的人脐带间充质干细胞分离、培养方法，并对其生物学特性进行分析。 方法：无菌条件下获取足月妊娠分娩胎儿脐带，利用改良的组织块贴壁法分离培养脐带间充质干细胞，即将 传统组织贴壁法中本应丢弃的组织转移到新的培养瓶中进行二次贴壁培养，取第3代脐带间充质干细胞进行 生物学特性分析。 结果与结论：组织贴壁后第5-7天可见有梭形细胞从组织块边缘爬出，第10天左右可形成明显的细胞克隆。 将组织块转移到新培养瓶中继续培养，2 d 后即可见有细胞爬出，细胞生长速度较快，5 d 即可形成细胞克隆。 传代后的细胞形态均一，呈成纤维细胞样的长梭形。流式细胞仪检测细胞高表达CD90、CD105，不表达CD34、 CD45、HLA-DR 。细胞增殖能力旺盛，平均倍增时间为50 h 左右，41.24%的细胞处于G 2/S 期。体外可诱导 分化为成骨细胞和脂肪细胞。上述实验结果证明二次贴壁培养出的细胞也具有间充质干细胞的生物学特性， 而且通过这种培养方法获得的原代间充质干细胞数是传统方式培养的2倍。 李艳琪，王洪一，姚尧，刘晶晶，徐潇，张宇，刘洋，吴祖泽，靳继德. 人脐带源间充质干细胞分离培养方法 的改进[J].中国组织工程研究，2014，18(10):1609-1614. An improved method for isolation of human umbilical cord mesenchymal stem cells Li Yan-qi 1, Wang Hong-yi 2, Yao Yao 2, Liu Jing-jing 3, Xu Xiao 2, Zhang Yu 2, Liu Yang 3, Wu Chu-tse 1, 4, Jin Ji-de 4 (1Key Laboratory of Systems Bioengineering, Ministry of Education and Department of Pharmaceutical Engineering, School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China; 2the General Hospital of Shenyang Military Region, Shenyang 110016, Liaoning Province, China; 3College of Life Sciences and Bio-engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China; 4Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 10039, China) Abstract BACKGROUND: Human umbilical cord mesenchymal stem cells with capabilities for self-renewal and multi-differentiation have attracted widespread attention. OBJECTIVE: To develop an efficient method for isolation and culture of human umbilical cord mesenchymal stem cells, and to analyze the cell biological features. METHODS: Mesenchymal stem cells were isolated and cultured from human umbilical cord by improved tissue cultivation. Immunophenotype and cell cycle were analyzed by flow cytometry. Growth curve was determined by MTT assay, and differentiation ability was evaluated by in vitro osteogenic and adipogenic induction as well. RESULTS AND CONCLUSION: Some fusiform cells crawled out from human umbilical cord tissues after cultivation for 5 days and formed colonies about 10 days later. When the removed tissues were further cultured, more cells appeared again within 2 days and formed colonies after 5 days. The isolated cells exhibited similar morphology of fibroblast-like shape after passage. Furthermore, the cells expressed CD90, CD105, but were negative for the markers of CD34, CD45, HLA-DR. Population doubling time of the cells calculated from the result of MTT was about 50 hours and cell cycle analysis showed that 41.24% cells were in the G 2/S phrase. Therefore, the isolated cells had a high prolification ability. In addition, the isolated cells could be induced into osteoblasts