实验一糖和蛋白质的理化性质检验
（4学时）
第一部分蛋白质的理化性质
第一节蛋白质的颜色反应
一、实验目的
掌握鉴定蛋白质的原理和方法。
二、实验原理
蛋白质分子中的某种或某些基团与显色剂作用，可产生特定的颜色反应，不同蛋白质所含氨基酸不完全相同，颜色反应亦不同。颜色反应不是蛋白质的专一反应，一些非蛋白物质亦可产生相同颜色反应，因此不能仅根据颜色反应的结果决定被测物是否是蛋白质。颜色反应是一些常用的蛋白质定量测定的依据。
三、实验器材与试剂
实验器材
1. 鸡蛋1个
2. 吸管1.0mL（×1）
3. 试管１.5cm×15cm（×2）
4. 试管架
5. 试管夹2个
6. PH试纸（5-7）
7. 水浴锅
实验试剂
1. 卵清蛋白液：将鸡（鸭）蛋白用蒸馏水稀释20-40倍，离心，上清液冷藏备用。
2.1%茚三酮溶液：1g茚三酮溶于95%乙醇并稀释至100mL。
3. 浓硝酸：比重1.42。
4. 10%NaOH溶液：10gNaOH溶于蒸馏水，稀释至100mL。
四、实验方法
A. 黄色反应
蛋白质分子中含有苯环结构的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等）。遇硝酸可硝化成黄色物质，此物质在碱性环境中变为橘黄色的硝苯衍生物（苯及苯丙氨酸较难硝化，需用浓硫酸促进之。反应如下：
操作方法：于一试管内，置蛋白质溶液10滴及浓硝酸5滴，加热，冷却后再加10％NaOH溶液20滴，观察颜色变化。
B. 茚三酮反应
蛋白质与茚三酮共热，则产生蓝紫色的还原茚三酮、茚三酮和氨的缩合物。此反应为一切蛋白质及ａ-氨基酸所共有。含有氨基的其他物质亦呈此反应。亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）与茚三酮反应呈黄色。
操作方法：取1mL蛋白质溶液置于试管中，加3-5滴茚三酮试剂，加热至沸，即有蓝紫色出现。
注意：此反应必须在pH5－7进行。
C.双缩脲反应（参考实验）
将尿素加热，两分子尿素放出一分子氨而形成双缩脲。双缩脲在碱性环境中，能与硫酸铜结合成红紫色的络合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子中含有肽键与缩脲结构相似，故能呈此反应（双缩脲反应可用以鉴定蛋白质是否完全水解，及用比色法作蛋自质之定量测定）。其反应式如下：
操作方法：
1. 取少许结晶尿素放在干燥试管中，微火加热，尿素熔化并形成双缩脲，释出之氨可用红色石蕊试纸试之。至试管内有白色固体出现，停止加热，冷却。然后加10％NaOH溶液1mL摇匀，再加2滴1％硫酸铜溶液，混匀，观察有无紫色出现。
2. 另取一试管，加蛋白质溶液10滴，再加10％NaOH溶液10滴及１％硫酸铜溶液2滴，混匀，观察是否出现紫玫瑰色。
注意：硫酸铜不能多加，否则将产生蓝色的Cu(OH)2。此外在碱溶液中氨或铵盐与铜盐作用，生成深蓝色的络离子Cu(NH3)42＋，妨碍此颜色反应的观察。
第二节蛋白质的沉淀反应
一、实验目的
1. 熟悉蛋白质的沉淀反应。
2. 进一步掌握蛋白质的有关性质。
二、实验原理
多数蛋白质是亲水胶体，当其稳定因素被破坏或与某些试剂结合成不溶解的盐后，即产生沉淀。蛋白质沉淀分为可逆沉淀和不可逆沉淀。可逆沉淀是指沉淀出来的蛋白质分子，内部结构改变很小或基本没有改变，仍然保持原来的生物活性，只要消除沉淀因素，沉淀会重新溶解而成原来的胶体溶液。不可逆沉淀是指沉淀出来的蛋白质分子，内部结构发生了较大的改变，蛋白质已失去了原来的生物活性，即使沉淀因素消失后，沉淀也不会重新溶解。
三、实验器材与试剂
实验器材
1. 试管1.5cm×15cm（×5）。
2. 吸管5.0ｍL（×2），2.0ｍL（×3），1.0ｍL（×1）。
3. 玻璃漏斗Φ5cm 1个。
4. 滤纸Φ9cm1张。
实验试剂
1. 蛋白质试液：见蛋白质颜色反应实验中的卵清蛋白液。
2. 硫酸铵晶体：如颗粒太大，最好研碎。
3. 饱和硫酸铵溶液：蒸馏水100ｍL加硫酸铵至饱和（硫酸的饱和度：
707g/1000mL）。
4. 95％乙醇。
5. 结晶氯化钠。
6. 1%醋酸溶液：冰醋酸1ｍL用蒸馏水稀释至100ｍL。
7. 5％鞣酸溶液：5g鞣酸溶于水并稀释至100ｍL。
四、实验方法
A. 蛋白质盐析作用
向蛋白质溶液中加入中性盐至一定浓度，蛋白质即沉淀析出，这种作用称为盐析。
操作方法：
1.取蛋白质溶液4mL，加入等量饱和硫酸铵溶液（此时硫酸铵的浓度为50％饱和），微微摇动试管，使溶液混和静置数分钟，球蛋白即析出（如无沉淀可再加少许饱和硫酸铵）。分取一半混合液，加水观察沉淀是否溶解。
2. 将混合液的另一半过滤，滤液中加硫酸铵粉末（约0.8g），至不再溶解，析出的即为清蛋白。再加水稀释，观察沉淀是否溶解。
注意： (1) 应先加蛋白质溶液，然后加饱和硫酸铵溶液；
(2) 固体硫酸铵若加到过饱和则有结晶析出，勿与蛋白质沉淀混淆。
B. 乙醇沉淀蛋白质
乙醇为脱水剂，能破坏蛋白质胶体质点的水化层而使其沉淀析出。
操作方法：取蛋白质溶液1ｍL，加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后再加入95％乙醇3mL混匀。观察有无沉淀析出。
C. 生物碱试剂沉淀蛋白质
植物体内具有显著生理作用的含氮碱性化合物称为生物碱（或植物碱）。能沉淀生物碱或与其产生颜色反应的物质称为生物碱试剂，如鞣酸、苦味酸、磷钨酸等。生物碱试剂能和蛋白质结合生成沉淀，可能因蛋白质和生物碱含有相似的含氮基团之故。
