2.1酵母双杂交该系统由Fields 和Song[3]首先在研究真核基因转录调控时建立。利用真核生长转录因子的两个不同的结构域：DNA结合结构域(DNAbinding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)，分别与目标蛋白X 及可能与目标蛋白相互作用的蛋白Y 相连，并共同转入酵母细胞。如果蛋白X与Y能够发生相互作用就能使转录因子原来分开的两部分结合，形成完整的活性形式从而激活下游报告基因。通过检测报告基因的表达产物就可判断两种蛋白是否发生相互作用[4~5]。
这一经典的蛋白相互作用研究方法接近于体内环境，那些瞬时、不稳定的两两相互作用也可以被检测到，并且与内源蛋白的表达无关[6]。鉴于这些优点并结合简便高效的Gateway表达载体构建方法[7]，在大规模的蛋白质－蛋白质相互作用研究中酵母双杂交系统得到了最为广泛的应用。Rain 等[8]用该法绘制了人类胃肠道病原菌Helicobacter pylori 的大规模蛋白质相互作用图谱。在261 种蛋白中，确立了1200 种相互作用关系，涵盖了整个蛋白质组得46. 6%。随后，Giot 等[9]和Li 等[10]在果蝇和线虫中也成功地研究了大规模的蛋白质相互作用。除了对模式生物的研究外，Stelzl 等[11]和Raul 等[12]则先后分析了人脑组织、人已知ORF中大规模的蛋白质相互作用网络。但酵母双杂交方法本身也有一定的局限性：(1)不能研究具有自激活特性的蛋白质；(2)只能检测两个蛋白间的相互作用；(3)检测的相互作用需发生在细胞核内，对于不能定位到细胞核中的蛋白质无法研究；(4)大部分实验中有将近50%的假阳性率，且推测的相互作用仅有3% 在两种以上的实验中得到验证。为了弥补方法本身的缺点及局限性，研究者也不断地对其进行完善和改进。Stelzl 等[11]在研究中就采用了以下的策略：(1)选择不同功能、不同大小的蛋白作为诱饵，以确保所选靶蛋白在整个蛋白质组中的代表性；(2)筛选过程中采用两轮杂交的方法：第一轮以混合诱饵(8 个)对文库进行筛选，结果呈阳性的克隆再进行一对一的第二轮杂交，这样既降低了工作量又提高了结果的准确性；(3)pull-down，免疫共沉淀对酵母双杂交的结果进行体内的相互作用验证；(4)利用生物信息学的方法对结果进行系统分析，包括基因的染色体定位、蛋白质作用网络的拓扑结构分析等，从多方面分析结果的可信度。据此，他们最终确认了911 对高可信度的相互作用涉及到401 种蛋白，数据分析中设立了6 个标准来判定得到的结果，大大提高了酵母双杂交实验结果的可信度。生物秀-专心做生物2.2串联亲和纯化Rigaut 等[13]首次采用串联亲和纯化技术(tandem affinity purification，TAP)研究了蛋白间的相互作用，与其他融合标签方法的最大不同是该方法选用了两个连续的标签而不是通常意义上的一个。标签共分三部分：蛋白A 、C B P (calmodulin binding peptide，钙调素结合多肽)和中间连接的TEV 酶识别的酶切位点。带有TAP 标签的融合蛋白在细胞中表达与内源相互作用蛋白形成复合物，细胞裂解后经IgG 偶联的层析柱纯化，蛋白A 与IgG 特异结合，从而使含有标签的复合物得到第一次纯化。为了除去与柱填料非特异结合的蛋白，用TEV 酶切割分离蛋白A 标签，使含有靶蛋白的复合物与层析柱分离并经过钙调素偶联的亲和层析柱进行第二次纯化，靶蛋白上的CBP标签可与钙调素结合；在加入过量螯合剂EGTA后CBP 与亲和层析柱分离使含有靶蛋白的复合体得到分离纯化，经SDS-PAGE，复合物中的各个蛋白被分开，切胶、胰酶消化后，即可通过质谱鉴定复合物中各个蛋白的氨基酸序列(图1)。该方法的优点：(1)不需要过多的背景知识就可以得到大量含靶蛋白的复合体；(2)蛋白表达及与复合物的结合都接近生理水平，是一种检测体内蛋白相互作用的方法；(3)TAP 采用两步亲和纯化，提高了纯化产物的特异性。一般在2L 的酵母培养基中(细胞湿重约10g)可以分离纯化得到足够一维电泳及质谱分析的蛋白复合物[ 1 5 ] 。
Gavin 等[16]采用TAP 结合质谱鉴定，对啤酒酵母的多蛋白复合物进行了大规模的研究。共分析了1 739 个基因其中与人类基因相关的有1 143 个，纯化了589 种蛋白，经生物信息学分析，它们分属于232 个不同的多蛋白复合体；在细胞中具有新功能的为344 个，231 个蛋白的功能以前未见报道。由于TAP/MS方法的高灵敏性使得仅有15个拷贝的蛋白
也能被检测到，鉴定的蛋白分子量从6.6kDa 到559kDa，等电点从3.9 到12.4。这一研究提供了真核生物中二元以上的蛋白相互作用网络，从中得到的有关其功能的各种信息也能为药物的筛选提供依据。TAP 技术的出现有效地促进了酵母中大规模的蛋白鉴定和纯化工作，但是其在高等真核生物中的应用却处于滞后状态，这是因为在真核细胞中表达的内源靶蛋白与带有标签的蛋白会发生竞争作用，影响相互作用的研究。因此，Forler 等[17]将RNAi 与TAP 技术联用在果蝇的S2 细胞(Drosoph ila melanogaster)中研究了蛋白质间的相互作用，该策略避免了内源蛋白的干扰，进而从高等真核细胞中分离并鉴定了相应的蛋白复合体，实验表明，蛋白纯化的特异性及有效性均得到提高，采用这种方法他们还对靶蛋白生物功能进行了分析。iTAP(TAP 与RNAi)保持了TAP 方法在原核生物中应用的一些优势：(1)基于标签的亲和纯化方法；(2)用TAP 标记的蛋白替代内源基因表达产物；但由基因本身的启动子调控蛋白的表达量，这一点在真核细胞中还无法实现。对于这部分相互作用的研究，人们多采用逆转录病毒载体，将带有标签的靶蛋白引入细胞中。由于逆转录病毒载体能够稳定的整合在宿主细胞的基因组中并且拷贝量较低，因此，外源蛋白可以近似于生理水平的低表达，进而避免由于高表达而出现的假阳性结果。此外Zhou等[18]在原代细胞中做了有益的尝试，将TAP标签通过基因敲入技术引入小鼠中，使得该技术能够应用于更多的基因并进行组织或细胞类型特异的复合体研究。TAP 纯化时存在蛋白污染问题，很难判断这些蛋白是真正的相互作用，还是蛋白处理过程中的副产品。为此，有人建议用三标签的方法[19]，但实验表明该法也不能排除蛋白的污染。其他标签也有应用，比较流行的是Flag[20]。GST、His6、生物素等也分别用于蛋白纯化，但由于他们有限的亲和力及较高的背景，在大规模的蛋白质相互作用研究中未得到广泛应用。选择何种标签也许是个难题，每种标签都有自身的弱点：大标签适于规模较大的相互作用研究，但可能影响蛋白的正常折叠和功能；小标签可能会更大程度的保持蛋白本身的特性，但在表达纯化时通常含量较低[21] 。2.3质谱在蛋白质相互作用分析中的应用在蛋白质相互作用的研究中，质谱最初只是作为鉴定蛋白质的一种快速、高效的方法：混合的蛋白样品首先经过纯化分离、然后通过SDS-PAGE 将复合体中的组分分开，随后对感兴趣的蛋白进行酶解；得到的肽段在质谱中进行鉴定，从而确定样品中的目标蛋白；但由于分离方法的灵敏度及技术本身的局限，对于那些相互作用较弱、分子量较大或偏碱性的蛋白往往不能达到理想的分析效果，增加了实验结果的假阴性。定量蛋白质组技术的出现解决了这一问题，而该技术的策略正是较好的利用了质谱的高灵敏度。目前已有许多种研究蛋白相互作用的定量蛋白质组学方法，以下就稳定同位素标记方法为例进行说明。稳定的同位素之间具有“轻”、“重” 之分，而其化学性质又保持相同，这就使得有同位素标记的蛋白在分离纯化时具有相同的特性，而在随后的质谱鉴定中又能根据质量数的差异被区分开。通常采用的同位素标记为2H、13C、15N 以及18O。加入同位素标记的方法主要分为：代谢标记法(stable isotope-labelled animo acids in cell culture，SILAC)和化学标记法(isotope-coded affinity tagging，ICAT)。前者是在培养细胞的过程中加入同位素标记(体内标记) ；后者则是在提取细胞内总蛋白并经过亲和纯化后加入同位素标记(体外标记)。最后两种方法都将得到的对照及实验组样品混合，进行质谱分析。由于同位素“ 轻”、“ 重” 差异，质谱能很容易的区分并鉴定实验组中特异的蛋白质。该方法中，亲和纯化过程是最大限度的保留实验组中的差异蛋白而非排除污染蛋白，系统本身的灵敏度在质谱分析中得到保证，这就避免了传统的定性蛋白质组技术中分离方法本身固有的局限性，大大提高了实验结果的灵敏度和准确性。Blagoev等[22]采用SILAC 策略研究了在EGF 刺激细胞后，能够与Grb2 的SH2结构域结合的相互作用蛋白。两组细胞分别在含有不同同位素(12C-Arg,13C-Arg)的培养基中生长一段时间，EGF 刺激其中一组细胞(实验组)10 分钟，随后两组细胞同时裂解、纯化并进行LC-MS/ MS 分析。最终228 个蛋白得到鉴定，其中28 个蛋白在被刺激的实验组中表达水平明显高于对照组。这些蛋白除了已知的信号分
子外，还有一些蛋白参与了信号衰减或具有细胞骨架的功能，此外还鉴定到了未知蛋白质。这表明该方法在研究信号通路中具有较大的潜力，值得一提的是，DNA、RNA、金属离子或代谢产物等小分子也参与了某些蛋白间的相互作用，进行蛋白活性的调节，或直接与蛋白质结合发挥生物学功能，酵母双杂交、TAP 等方法对这类相互作用似乎无能为力，而基于质谱的定量蛋白质组学方法则能继续发挥其自身优势。
2.4 蛋白质芯片蛋白芯质片技术的基本原理是将各种蛋白质有序地固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，然后，用标记了特定荧光抗菌素的蛋白质或其他成分与芯片作用，漂洗将未能与芯片上的蛋白质互补结合的成分洗去，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的关系，并最终达到测定各种蛋白质功能的目的。Zhu 等[23]置备了高密度的酵母蛋白质芯片，涵盖了近5 800 种蛋白，用以研究钙调素结合蛋白。理论上蛋白芯片除了可以研究蛋白间的相互作用外，还可以研究蛋白- 脂类、蛋白- 核酸以及蛋白- 配体间的结合，但目前应用还不够广泛，仅用于CaM、磷脂相互作用蛋白、结构域之间以及抗原与抗体的相互作用研究等[23~26]。随后，Ptacek 等[27]还研究了酵母激酶的相互作用蛋白，发现了近4 000 个磷酸化反应，涉及到1 325 种不同的蛋白。
2.5基于生物信息学的分析方法生物信息学的方法大都基于从已知数据库中分析比较未知蛋白的功能及其相关的相互作用蛋白，已知的数据库包括细菌、酵母的全部基因序列或已知的相互作用蛋白。比较基因簇的同源性推测蛋白功能(conserved gene neighborhood, GN )[28~29]，相关基因具有相似的系统发生模式(co-occurrence of genes, CO)[30]，相互作用蛋白的基因可能相互融合(gene fusion events, GF)[31~32] 等，以这些为依据采用适合的软件就可对大规模的蛋白质－蛋白质相互作用进行分析，目前已有许多网站开发了这样的功能(表1)。生物信息学分析无需具体的实验操作，往往是在整个基因组规模上进行研究，可获得较大的信息量。另外根据蛋白晶体结构的互补性，也可以推测蛋白间可能的相互作用，但遗憾的是这些方法以基因的同源性为前提，若数据库中没有同源基因则无法比较。目前大规模研究产生的数据都没有达到饱和，整合所有的研究数据而不是分析单一的实验结果，才能得到更加清晰有用的生物学信息。值得一提的是，在细胞中有些蛋白质的相互作用是瞬时的、不稳定的，以实验为基础的研究方法很难捕捉到这种相互作用，而基于生物信息学的分析则能弥补这一不足。
2.6其他方法具有相关功能或相互作用的蛋白质他们的基因有可能受到了相同的调控，在进化过程中也保持一定的相似性。因此，可以通过检测mRNA 在特定时期的表达量，分析相关的基因产物是否具有相互作用关系。Stuart 等[33]研究了人、果蝇及线虫的基因共表达模式，发现22 163 种共表达关系并且在进化上它们也表现出一定的保守性。必须指出的是，有些蛋白的表达与mRNA可能不存在相互关系，mRNA 的共表达不反映蛋白间的相互作用；另外所得数据的分析也是一个繁琐的任务。
除了上述大规模分析蛋白质相互作用的方法外，最近还涌现出一些其他的方法。多维蛋白鉴定技术(multidimensional protein identification technology, MudPIT)[34]，通过确定蛋白质的亚细胞定位来研究其相互作用等[35]。免疫共沉淀、GST pull-down、Far-western、化学交联等目前虽不适于大规模研究，但小范围的分析方法可对得到的结果进行补充印证。众多的研究方法可以从不同的角度研究蛋白质组中的蛋白相互作用，弥补单个方法的不足，从而得到尽可能完整的蛋白质相互作用图谱。
免疫共沉淀和亲和层析共分离：
免疫共沉淀是证明蛋白质-蛋白质相互作用的最直接最经典和最有效的方法，如蛋白A 能与B相互作用结合成异源二聚体，无论用抗A或抗B的抗体或与A或B的亲和物偶联的agarose小珠都能把A和B沉淀下来。因此广泛用于蛋白质相互作用研究。
常用的小珠：
GST-Agarose（不需要抗体）
ProteinA-Agarose(用时需加抗体)
基本方法：
1.表达蛋白质A
2.蛋白质A与亲和小珠结合
3.用结合有蛋白质A的亲和小珠调取细胞破碎液中蛋白质B
4.离心、洗涤亲和小珠若干次
5.处理亲和小珠使蛋白质A、B解吸附（可以直接用SDS-PAGE上样BUFFER煮）
酵母双杂交系统
基本原理，以酵母S.cerevisiae的转录因子GAL4系统为例
GAL4有两个结构上互相分开，功能上相互独立的结构域。
N 端1-147aa与DNA结合（DNA binding domain,BD）。
C端768-881aa能激活转录（Activation Domain,AD)。
BD＋AD—能激活GAL4效应基因的上游激活序列（UAS）。
把N和C分开分别构建成两种表达质粒。如把Gal4的N端和诱饵蛋白（研究的目标蛋白A）融合表达，把细胞cDNA和C端融合表达，cDNA编码的蛋白x如能和A互相作用,就能把Gal4N端C端和N端联系在一起，就可以激活UAS下游的基因表达。
半乳糖苷酶（Laz）基因克隆到URA3的下游。
在x-Gal的存在下酵母菌落成蓝色(Fields)
酵母GAL4基因缺失；GAL80基因缺失（GAL4的负调控因子）
方法略
假阳性多，因此还必须再用免疫共沉淀等直接证据证明
发展：哺乳动物双杂交系统、二倍体双杂交系统、酵母单杂交系统、细菌双杂交系统、酵母三杂交系统
FAR WESTERN
Western blot 是免疫印记，而Far western 是蛋白质铺盖技术，两者其实在本质上是相似的，只是免疫印记是直接用抗体去检测抗原，常用于蛋白质定性；而Far western则是用标记的蛋白（125I或荧光）去probe与之相互作用的蛋白，或再用抗这种蛋白的抗体显示这种蛋白的结合位置，用于研究蛋白质的相互作用。
基本步骤：
1.表达和提纯获得蛋白A，并作荧光或放射性标记，或制备抗A抗体
2.细胞总蛋白SDS-PAGE(一起染色，另一块转膜)
3.电转膜
4.封闭
5.加入蛋白A，如A带标记，洗膜后直接显影；如未标记，可加抗A抗体再加二抗或标记的蛋白A。
优点：简单、经济
缺点：SDS-PAGE影响蛋白质构象，可能影响相互作用
表面等离子共振（SPR）法原理：SPR法是生物科学、物理学和计算科学结合的方法，在玻璃表面镀上一层金薄膜，再把目标蛋白通过氨基共价偶联在金膜表面制成传感芯片。当一束偏振光照射到传感芯片的金膜时会引起金属中的电子共振，而导致反射光会在一定角度内大大减弱，其中反射光完全消失的角度称为共振角。共振角会随着金膜表面通过的液相的折射率的改变而改变，而折射率的改变又与结合在金膜表面的生物大分子的质量成正比，每
结合1ng/mm2折射率的变化相当于1000RU（共振单位），如果通过的液相中有能与膜表面偶联的靶蛋白相互作用而结合的蛋白质或其它化学物，就使结合在金膜表面的生物大分子质量增加，检测的共振单位（RU）也增加。通过光检测单元检测反射光的变化，经数据处理系统处理后，获得实时传感图。特点：1.灵敏度，所需样品少（20μl就可分析）2.可以同时确定互相作用动力学参数Ka、Kd值3.可以测蛋白质-蛋白质互相作用，也可测蛋白质与共它分子互相作用（小分子化合物、多肽、蛋白质、寡核苷酸、寡聚糖、类脂、噬菌体、病毒和细胞）（4）可以回收结合的蛋白进一步研究和鉴定（如质谱分析）SPR分析的条件控制：样品制备：样品的PH、离子强度，对相互作用有显著影响，一般PH范围在6.8-7. 8之间，低离子强度，样品中蛋白质浓度变化影响不大，样品体积20-50μl。温度：一般25℃+5℃，温度高于30℃对相互作用有影响进流速：全程流速恒定，进样速度不宜过快，保证接触时间，一般进样速度5-10μl/分所需仪器：生物分子相互作用仪（如Biocore X型）分析软件：如BLAevaluation(Version3.1)软件。
举世瞩目的基因组计划使大量的新基因不断被发现，然而单纯的基组DNA序列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静态的，而基因编码的产物－蛋白质则是动态的，具有时空性和调节性，是生物功能的主要体现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。 在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必不可少的，它是细胞进行一切代谢活动的基础。细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控，介导细胞的许多生物学活性。 虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。因此，揭示蛋白质之间的相互作用关系、建立相互作用关系的网络图，已成为蛋白质组学研究中的热点。 一、生物物理学方法 1. 融合蛋白pull-down实验 融合蛋白pull-down技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上（如Sepharose），当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。 被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。为了更有效地利用pull-down技术，可以将待纯化地蛋白以融合蛋白地形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化地配体蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽－S－转移酶（glutathione-S-transferase ，GST）融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此GST融合蛋白在蛋白质相互作用研究领域里得到了极大的推广。 GST融合蛋白在经过固定有GST（glutathione）的色谱柱时，就可以通过GST与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可以得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说，GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面：一是鉴定能与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质；二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用。 该方法比较简便，避免了使用同位素等危险物质，在蛋白质相互作用研究中有很广泛的应用。类似的融合蛋白很多，如与葡萄球菌蛋白A融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有IgG的色谱柱进行纯化；与寡聚组氨酸肽段融合的“诱饵”蛋白可以通过结合Ni2+的色谱柱进行纯化；与二氢叶酸还原酶融合的“诱饵”蛋白可以通过固定有氨甲喋呤的色谱柱进行纯化等等。 2. 亲和印迹 亲和印迹是将聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的蛋白样品转移到硝酸纤维素膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了的“诱饵”蛋白发生作用。此方法所要考虑的是如何保持膜上蛋白的生物活性，如何得到纯化的“诱饵”蛋白等。 3. 免疫共沉淀
蛋白质组学研究方法选择及比较 目前研究蛋白组学的主要方法有蛋白质芯片及质谱法，本文将从多方面对两种研究方法进行了解与比较； 蛋白质芯片（Protein Array） 将大量不同的蛋白质有序地排列、固定于固相载体表面，形成微阵列。利用蛋白质分子间特异性结合的原理，实现对生物蛋白质分子精准、快速、高通量的检测。 主要类型： ●夹心法芯片(Sandwich-based Array) ●标记法芯片(Label-based Array) ●定量芯片(Quantitative Array) ●半定量芯片(Semi-Quantitative Array) 质谱（Mass Spectrometry） 用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测，测出离子准确质量并确定离子的化合物组成，即通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。 主要类型：
●二维电泳+质谱(2D/Mass Spectrometry, MS) ●表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization- time of flight, SELDI) ●同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) Protein Array or Mass Spectrometry？ 如何选择合适的研究方法？以下将从六个方面进行比较与推荐： 1.筛查蛋白组学表达差异 建议选择：RayBiotech（1000个因子的芯片）+质谱 a)不同的方法学有不同的特点：对于质谱，可以筛查到未知的蛋白，但是对于分子量大、 低丰度的蛋白质，质谱的灵敏度和准确性有一定的限制。 b)不同的方法能筛查到的目标不同：根据Proteome Analysis of Human Aqueous Humor 一文中报道，质谱筛查到的差异蛋白集中在小分子与代谢物。而用RayBiotech芯片筛查到的结果，多是集中在细胞因子、趋化、血管、生长等等。 c)质谱筛查到355个蛋白，而RayBiotech抗体芯片也筛查到328个蛋白，且用定量芯片 验证25个蛋白有差异，这些蛋白是质谱找不到的。目前RayBiotech夹心法抗体芯片已经可以检测到1000个蛋白，采用双抗夹心法，尤其是对于低丰度蛋白，有很好的灵敏度和特异性，很多的低丰度蛋白是抗体芯片可以检测出来，而质谱检测不到的，且样品不经过变性和前处理，保持天然状态的样品直接检测，对于蛋白的检测准确度高。 d)质谱的重复性一直是质谱工作者纠结的问题，不同操作者的结果，不同样品处理条件， 峰值的偏移等影响因素都会产生大的影响；RayBiotech的夹心法芯片重复性高。
检测两种蛋白质之间相互作用得实验方法比较 1、生化方法 ●免疫共沉淀免疫共沉淀就是以抗体与抗原之间得专一性作用为基础得用于研究蛋白质相互作用得经典方法.改法得优点就是蛋白处于天然状态,蛋白得相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响;可以分离得到天然状态下相互作用得蛋白复合体。缺点:免疫共沉淀同样不能保证沉淀得蛋白复合物时候为直接相互作用得两种蛋白。另外灵敏度不如亲与色谱高。 ●Fａr—Ｗestｅrｎ 又叫做亲与印记。将PAGE胶上分离好得凡百样品转移到硝酸纤维膜上,然后检测哪种蛋白能与标记了同位素得诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点就是转膜前需要将蛋白复性。2?、等离子表面共振技术（Surfacｅｐｌasmoｎｒｅsoｎance)该技术就是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面,葡聚糖层固定于几十纳米厚得技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时,如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者得结合将使金属膜表面得折射率上升，从而导致共振角度得改变。而共振角度得改变与该处得蛋白质浓度成线性关系,由此可以检测蛋白质之间得相互作用。该技术不需要标记物与染料，安全灵敏快速,还可定量分析。缺点:需要专门得等离子表面共振检测仪器。 ３、双杂交技术原理基于真核细胞转录因子得结构特殊性,这些转录因子通常需要两个或以上相互独立得结构域组成．分别使结合
域与激活域同诱饵蛋白与猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达,如果两种蛋白可以发生相互作用,则可使结合域与激活域在空间上充分接近,从而激活报告基因．缺点：自身有转录功能得蛋白会造成假阳性.融合蛋白会影响蛋白得真实结构与功能。不利于核外蛋白研究,会导致假隐性. 5、荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（〈100埃)时，它们之间可发生能量转移得现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生得构象变化,也能研究分子间得相互作用。它可以在活体中检测,非常灵敏,分辩率高,能够检测大分子得构象变化,能够定性定量得检测相互作用得强度。缺点此项技术要求发色基团得距离小于100埃。另外设备昂贵,还需要融合ＧFP给蛋白标记。?此外还有交联技术(ｃrｏsｓ－ｌｉnＫing)，蛋白质探针技术,噬菌体展示技术(Pｈａgｅ dｉsｐｌaｙ）以及生物信息学得方法来检测蛋白质之间相互作用。 1，酵母双杂交 1-5 酵母双杂交系统就是将待研究得两种蛋白质得基因分别克隆到酵 体,从表达产物分析两种蛋白质相互作用得系统 酵母双杂交得原理就是,把报告基因HIS３与l a c Z 整合到酵母细胞基因组中,并受转录因子
研究蛋白质与蛋白质相互作用方法总结-实验步骤 蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分，蛋白-蛋白互作网络与转录调控网络对调控细胞及其信号有重要意义。把原来spaces空间上的一篇蛋白质与蛋白质间相互作用研究方法转来，算是实验技巧分类目录的首篇。(另补充2：检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较) 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。
检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较 1. 生化方法 ●免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。另外灵敏度不如亲和色谱高。 ●Far-Western 又叫做亲和印记。将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。缺点是转膜前需要将蛋白复性。 2. 等离子表面共振技术（Surface plasmon resonance）该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度的改变。而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。 3. 双杂交技术原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。分别使结合域和
激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。 5. 荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（<100埃）时，它们之间可发生能量转移的现象。荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。缺点此项技术要求发色基团的距离小于100埃。另外设备昂贵，还需要融合GFP给蛋白标记。 此外还有交联技术（cross－linKing），蛋白质探针技术，噬菌体展示技术（Phage display）以及生物信息学的方法来检测蛋白质之间相互作用。 1，酵母双杂交 1-5 酵母双杂交系统是将待研究的两种蛋白质的基因分别克隆到酵母表达质粒的转录激活因子（如GAL4等）的DNA结合结构域基因和转录激活因子（如GAL4等）激活结构域基因，构建成融合表达载体，从表达产物分析两种蛋白质相互作用的系统
DNA-蛋白质相互作用的研究方法2008-02-21 12:21一、凝胶阻滞试验 1.试验原理 又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay），在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。 2.主要步骤及内容 首先是用放射性同位素标记待检测的DNA片段(亦称探针DNA)，然后同细胞蛋白质提取物一道温育，于是便有可能形成DNA-蛋白质复合物。将它加样到非变性的聚丙烯酰胺凝胶中，在控制使蛋白质仍与DNA保持结合状态的条件下进行电泳分离。应用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置。如果细胞蛋白质提取物中不存在可同放射性标记的探针DNA结合的蛋白质，那么所有放射性标记都将集中出现在凝胶的底部，反之，将会形成DNA-蛋白质复合物，由于凝胶阻滞的缘故，其特有的放射性标记的探针DNA条带就将滞后出现在较靠近凝胶顶部的位置。 凝胶阻滞试验不仅可以用来鉴定在特殊类型细胞的提取物中，是否存在着能够同某一特定DNA片段结合的蛋白质分子(比如特异的转录因子等)，而且还可以用来研究发生此种结合作用之精确的DNA序列的特异性。 其办法是在DNA-蛋白质结合反应体系中，加入超量的非标记的竞争DNA(competitor DNA)。如果它与同位素标记的探针DNA结合的是同一种蛋白质，那么由于竞争DNA与探针DNA 相比是极大超量的，这样绝大部分蛋白质都会被其竞争结合掉而使探针DNA仍处于自由的状态，所以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带。相反地，如果反应中加入的竞争DNA并不能够同探针DNA竞争结合同一种蛋白质，于是探针DNA便仍然与特定蛋白质结合形成复合物，结果在电泳凝胶的放射自显影图片上就会呈现阻滞的条带。 在凝胶阻滞试验中使用竞争DNA，可以间接地阐明在体内发生的DNA与蛋白质之间的相互作用。例如，使用一种具有已知转录因子结合位点的竞争DNA，我们就可以判断通过特定的凝胶阻滞试验所检测到的蛋白质，是否就是属于此类转录因子，抑或是与之相关的其它因子。同样地，假如我们在竞争DNA上已知的转录因子结合位点处，事先引入一个或少数几个碱基突变，通过凝胶阻滞试验亦可有效地评估出这些突变对竞争DNA的性能及其与转录因子结合作用的影响。 二、DNaseI足迹试验(DNaseI footFIrinting assay) DNaseI足迹试验是一种测定DNA结合蛋白在DNA上的准确结合位点的技术。 首先是对包含一定顺式作用元件的双链DNA进行单链标记，然后用DNaseI水解单链标记的双链DNA，产生不同长度的片断，DNA结合蛋白与其特异序列结合处由于空间位阻，DNaseI对这部分DNA不能切割，即被DNaseI保护。DNaseI水解产物经尿素变性，PAGE 分离及放射性显影后，形成以相差一个核苷酸为梯度的一系列DNA条带，在此显影图中相
蛋白质相互作用的主要研究方法 细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。虽然有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子一起作用或是与其他蛋白质形成复合物来发挥作用的。因此，为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。在现代分子生物学中，蛋白质相互作用的研究占有非常重要的地位。 研究蛋白质相互作用时要根据不同的实验目的及条件选择不同的实施策略。研究已知蛋白间的相互作用人们关注的是蛋白间能否发生结合，实验本身更趋向于验证性，因此，应选择操作性强、可信度高、接近生理条件的技术方法，尽量减少实验本身带来的假阴性或假阳性。蛋白质相互作用方面的研究方法主要有免疫共沉淀、Far Western blotting、生物信息学、酵母双杂交系统、噬菌体展示、表面等离子共振、荧光能量转移等几种。 1 免疫共沉淀 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其基本原理是:细胞裂解液中加入抗体，与抗原形成特异免疫复合物，经过洗脱，收集免疫复合物，然后进行SDS-PAGE及Western blotting分析。免疫共沉淀既可以用于检验已知的两个蛋白质在体内的相互作用，也可以找出未知的蛋白质相互作用，不管是两者的哪个，其原则都是一样的，都需要用特异性的抗体与其中的一种蛋白质结合，之后通过蛋白质A或蛋白质G琼脂糖微珠将复合物沉淀下来，然后用SDS-PAGE鉴定。免疫共沉淀中设置正确的对照非常重要，因为该方法可能出现假阳性的概率比较高，设置的对照包括：在对照组中使用对照抗体，以缺失目的蛋白的细胞系作为阴性对照等等。 在免疫共沉淀试验中要保证试验结果的真实性应注意以下几点：（1）确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白。单克隆抗体的使用有助于避免污染的产生。（2）要确保抗体的特异性。即在不表达抗原
蛋白质相互作用的概述 一、为什么要研究蛋白质相互作用 二、蛋白质相互作用亲和力：K d=[A][B]/[AB] 三、蛋白质相互作用的应用 A、利用抗原和抗体的相互作用：Western blot，免疫共沉淀，染色质沉淀，抗体筛库 B、利用已知的相互作用建立tag：GST pull down，Biotin－Avidin结合， C、直接利用蛋白质的相互作用：蛋白质亲和层析，酵母双杂交，phage display，Bait蛋白质筛表达库，蛋白质组 四、相互作用的生物学意义：蛋白质间的相互作用是细胞生命活动的基础。 五、生物学功能的研究：获得功能或失去功能 I、一些常用蛋白质相互作用技术 ?Traditional co-purification (chromatography co-purification and co-sedimentation) ?Affinity chromatography：GST pull down，Epitope-tag ?(co-)Immunoprecipitation ?Western和Far-Western blot Surface Plasmon Resonance Two-Hybrid System Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) （实验过程及原理，注意事项，优缺点） III、研究实例讨论 一、酵母双杂交系统 作用：发现新的相互作用蛋白质；鉴定和分析已有的蛋白质间的相互作用；确定蛋白质相互作用的功能基团 具体过程：见书本 优点：是酵母细胞的in vivo相互作用；只需要cDNA，简单；弱的相互作用也能检测到 缺点：都是融合蛋白，万一融合出新的相互作用；酵母的翻译后修饰不尽相同，尤其是蛋白质的调控性修饰；自身激活报告基因；基因库德要求比较高，单向1/3是in frame 蛋白质毒性；第三者Z插足介导的相互作用；假阳性 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂
第35卷 第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) J o u r n a l o f N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y (N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n ) V o l .35,N o .1 J a n .,2011 h t t p ://w w w .n l d x b .c o m [d o i :10.3969/j .i s s n .1000-2006.2011.01.024] 收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10K J B 220002) 作者简介:甄艳(1976—),副教授,博士。＊施季森(通信作者),教授。E -m a i l :j s h i @n j f u .e d u .c n 。 引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J ].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄 艳,施季森 ＊ (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏 南京 210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q 81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 A p p l i c a t i o n o f m a s s s p e c t r o m e t r y i n p r o t e o m i c s s t u d i e s Z H E NY a n ,S H I J i s e n ＊ (K e y L a b o r a t o r y o f F o r e s t G e n e t i c s a n d B i o t e c h n o l o g y M i n i s t r y o f E d u c a t i o n , N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210037,C h i n a ) A b s t r a c t :W i t ht h e r a p i d d e v e l o p m e n t o f p r o t e o m i c s ,m a s s s p e c t r o m e t r y i s m a t u r i n g t o b e a p o w e r f u l t o o l a n dc o r e t e c h -n o l o g y f o r p r o t e o m i c s s t u d i e s d u r i n g t h e r e c e n t y e a r s .T h e s u p e r i o r i t y o f m a s s s p e c t r o m e t r y l i e s i n p r o v i d i n g t h e t h r o u g h -p u t a n d t h e m o l e c u l a r i n f o r m a t i o n ,w h i c hn o o t h e r t e c h n o l o g y c a n b e m a t c h e di np r o t e o m i c s .I nt h i s r e v i e w ,w e m a d e a g l a n c e o n t h e o u t l i n e o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e d p r o t e o m i c s .A n dt h e nw e a d d r e s s e d o n t h e a d v a n c e s o f d a t a a n a l y s i s o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,q u a n t i t a t i v em a s ss p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,p o s t -t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s b a s e d m a s s s p e c t r o m e t r y ,t a r g e t e d p r o t e o m i c s a n df u n c t i o n a l p r o t e o m i c s b a s e d -m a s s s p e c t r o m e t r y . K e yw o r d s :m a s ss p e c t r o m e t r y ;p r o t e o m i c s ;q u a n t i t a t i v ep r o t e o m i c s ;p o s t -t r a n s l a t i o n m o d i f i c a t i o n ;t a r g e t e d p r o -t e o m i c s ;f u n c t i o n a l p r o t e o m i c s 蛋白质组学(P r o t e o m i c s )是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ,E S I )和基质辅助激光解析离子化(m a -t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ,M A L D I )的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(i o n t r a p ,I T ),飞行时间(t i m e o f f l i g h t ,T O F ),串联飞行时间(T O F -T O F ),四级杆/飞行时间(q u a d r u p o l e /T O F h y b r i d s ),离子阱/轨道阱(I T /o r b i t r a ph y b r i d ) 和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /F o u r i e r t r a n s f o r m i o n c y c l o t r o nr e s o n a n c em a s s s p e c t r o m e t e r s h y b r i d s ,I T /F T M S ),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化
?技术与方法? 生物技术通报 B I O TECHNOLO G Y BULL ET I N 2006年增刊 蛋白质相互作用研究方法及其应用 王海波 安学丽 张艳贞 王爱丽 李巧云 晏月明 (首都师范大学生命科学学院,北京 100037) 摘 要: 过去10年来,蛋白质组学得到迅速发展,蛋白质间的相互作用作为蛋白质组学的重要内容,更是成为国内外竞相研究的重点,研究方法的快速发展为蛋白质间相互作用的研究奠定了坚实基础。着重就经典的噬菌体展示、酵母双杂交以及新近发展起来的串联亲和纯化、荧光共振能量转移技术和表面等离子共振等蛋白质相互作用研究方法的原理及应用作一综述并展望其发展前景。 关键词: P DT Y2H T AP FPET SPR Approaches and Appli cati ons of Protei n 2Protei n I nteracti on Studi es W ang Haibo An Xueli Zhang Yanzhen W ang A ili L i Q iaoyun Yan Yue m ing (College of L ife Science,Capital N or m al U niversity,B eijing 100037) Ab s tra c t: W ith the fulfill of HGP (Hu man genom ic p r oject ),the study t op r otein is s p ring up.Pr otein -p r otein in 2 teracti on is one of i m portant subjects of Pr oteom ic,it is i m p licated in every cellular p r ocesses .Now many methods have de 2vel oped t o identify and characterize p r otein 2p r otein interacti ons .The main content of this paper is describe both classical and es pecially recent methods t o study p r otein 2p r otein interacti ons such as Yeast t w o 2hybrid syste m (Y2H ),Tande m affinity pur 2ificati on (T AP ),Fluorescence res onance energy transfer (FRET )and Surface p las mon res onance (SPR ),fr om the p rinci p le t o p r ocess of these technol ogies,s ome ne w achieve ment obtained by these methods als o intr oduced . Key wo rd s: P DT Y2H T AP FPET SPR 作者简介:王海波,硕士研究生,首都师范大学生命科学学院608实验室 通讯作者:晏月明,Tel:010*********;E 2mail:yany m2004@https://www.doczj.com/doc/a55499549.html, 随着生命现象的研究逐渐由获取基因序列信息转向研究基因功能,一门新的学科———蛋白质组学应运而生。蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化的整体,其功能往往是通过蛋白质之间或与核酸之间相互作用而表现出来的,这种相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中,相互交叉形成网络,构成细胞中一系列重要生理活动的基础。因此,对于蛋白质相互作用的研究就成为蛋白质组学中最主要研究内容之一,迄今已发展了包括经典的噬菌体展示技术、酵母双杂交系统以及新近发展并广泛应用的串联亲和纯化和荧光共振能量转移技术、表面等离子共振技术等多种有效的研究蛋白质间相互作用的高通量分析方法,为蛋白质组学的发展奠定了坚实的基础。 1 噬菌体展示技术(P DT ) 大肠杆菌丝状噬菌体包括f1、fd 和M13,它们只感染含F 因子的大肠杆菌。1985年,美国M iss ouri 大学S m ith 博士等人 [1] 将R I 核酸内切酶基因片段 连接到丝状噬菌体fd 编码次要外壳蛋白的基因Ⅲ中,成功地得到了在外壳蛋白中融合表达了酶分子的噬菌体颗粒。后经验证,该噬菌体能被Eco R Ⅰ核酸内切酶抗体有效中和,说明展示在噬菌体外壳表面的酶分子具有与天然酶分子相同或极其相近的构象和活性,这一试验的成功标志着噬菌体展示技术(Phage dis p lay techniques,P DT )的诞生。 噬菌体展示技术是在噬菌体展示肽库建立之后才开始广泛应用到蛋白质相互作用研究的。1990年Scott 等人 [2] 利用噬菌体展示技术构建了随机多
研究蛋白质的相互作用的方法 一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附 上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。 四、荧光能量转移技术 荧光共振能量转移（FRET ）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用;与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展，FRET 荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET 效率以及供体与受体间距离的简单方法，仅需使用一组滤光片和测量一个比值，利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰。该方法简单快速，可实时定量测量FRET 的效率和供体与受体间的距离，尤其适用于基于GFP 的供体受体对。 五、抗体与蛋白质阵列技术
一、酵母双杂交系统 酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究。在实际工作中，人们根据需要发展了单杂交系统、三杂交系统和反向杂交系统等。Angermayr等设计了一个SOS蛋白介导的双杂交系统。可以研究膜蛋白的功能，丰富了酵母双杂交系统的功能。此外，酵母双杂交系统的作用也已扩展至对蛋白质的鉴定。 二、噬茵体展示技术 在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗，再将噬菌体过柱，柱上若含目的蛋白，就会与相应抗体特异性结合，这被称为噬菌体展示技术。此技术也主要用于研究蛋白质之间的相互作用，不仅有高通量及简便的特点，还具有直接得到基因、高选择性的筛选复杂混合物、在筛选过程中通过适当改变条件可以直接评价相互结合的特异性等优点。目前，用优化的噬菌体展示技术，已经展示了人和鼠的两种特殊细胞系的cDNA文库，并分离出了人上皮生长因子信号传导途径中的信号分子。 三、等离子共振技术 表面等离子共振技术(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成为蛋白质相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一种纳米级的薄膜吸附上“诱饵蛋白”，当待测蛋白与诱饵蛋白结合后，薄膜的共振性质会发生改变，通过检测便可知这两种蛋白的结合情况。SPR技术的优点是不需标记物或染料，反应过程可实时监控。测定快速且安全，还可用于检测蛋白一核酸及其它生物大分子之间的相互作用。 四、荧光能量转移技术 荧光共振能量转移（FRET ）广泛用于研究分子间的距离及其相互作用; 与荧光显微镜结合，可定量获取有关生物活体内蛋白质、脂类、DNA 和RNA 的时空信息。随着绿色荧光蛋白（GFP）的发展，FRET 荧光显微镜有可能实时测量活体细胞内分子的动态性质。提出了一种定量测量FRET效率以及供体与受体间距离的简单方法，仅需使用一组滤光片和测量一个比值，利用供体和受体的发射谱消除光谱间的串扰。该方法简单快速，可实时定量测量FRET 的效率和供体与受体间的距离，尤其适用于基于GFP 的供体受体对。 五、抗体与蛋白质阵列技术 蛋白芯片技术的出现给蛋白质组学研究带来新的思路。蛋白质组学研究中一个主要的内容就是研究在不同生理状态下蛋白水平的量变，微型化，集成化，高通量化的抗体芯片就是一个非常好的研究工具，他也是芯片中发展最快的芯片，而且在技术上已经日益成熟。这些抗体芯片有的已经在向临床应用上发展，比如肿瘤标志物抗体芯片等，还有很多已经应用再眼就的各个领域里。 六、免疫共沉淀技术 免疫共沉淀主要是用来研究蛋白质与蛋白质相互作用[/url]的一种技术，其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Pansobin珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA\|Pansobin”，因为SPA\|Pansobin比较大，这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物四组分又被分开。然后经Western blotting法，用抗体检测目的蛋白是什么，是否为预测蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的，符合体内实际情况，得到的蛋白可信度高。但这种方法有两个缺陷：一是两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三
蛋白质相互作用数据库和分析方法 1. 蛋白质相互作用的数据库 蛋白质相互作用数据库见下表所示： 数据库名 说明 网址 BIND 生物分子相互作用数据库 http://bind.ca/ DIP 蛋白质相互作用数据库 https://www.doczj.com/doc/a55499549.html,/ IntAct 蛋白质相互作用数据库 https://www.doczj.com/doc/a55499549.html,/intact/index.html InterDom 结构域相互作用数据库 https://www.doczj.com/doc/a55499549.html,.sg/ MINT 生物分子相互作用数据库 http://mint.bio.uniroma2.it/mint/ STRING 蛋白质相互作用网络数据库 http://string.embl.de/ HPRD 人类蛋白质参考数据库 https://www.doczj.com/doc/a55499549.html,/ HPID 人类蛋白质相互作用数据库 http://wilab.inha.ac.kr/hpid/ MPPI 脯乳动物相互作用数据库 http://fantom21.gsc.riken.go.jp/PPI/ biogrid 蛋白和遗传相互作用数据，主要来自于酵母、线虫、果蝇和人 https://www.doczj.com/doc/a55499549.html,/ PDZbase 包含PDZ 结构域的蛋白质相互作用数据库 https://www.doczj.com/doc/a55499549.html,/services/pdz/start Reactome 生物学通路的辅助知识库 https://www.doczj.com/doc/a55499549.html,/ 2. 蛋白质相互作用的预测方法 蛋白质相互作用的预测方法很非常多，以下作了简单的介绍 1) 系统发生谱 这个方法基于如下假定：功能相关的(functionally related)基因，在一组完全测序的基因组中预期同时存在或不存在，这种存在或不存在的模式(pattern)被称作系统发育谱；如果两个基因，它们的序列没有同源性，但它们的系统发育谱一致或相似．可以推断它们在功能上是相关的。
蛋白质组学及其研究方法与进展 蛋白质是生命活动的体现者，基因的表达最后是通过蛋白质来体现的，在这个过程中，蛋白质起了连接基因与表现的功能。蛋白质是有氨基酸组成的，组成蛋白质的氨基酸的种类及排列顺序构成了蛋白质的一级结构，而在一级机构基础上的多肽链本身的折叠和盘绕方式构成了蛋白质的二级结构，考虑到多肽链上原子在空间的分布，由二级结构进一步形成了蛋白质的三级结构，对于有多个亚基的蛋白质还存在四级结构。 蛋白质的一级结构决定了高级结构，而高级结构则决定着蛋白质的生物学功能。如今对于蛋白质研究已经单独形成了一个活跃的生物学分支学科―――蛋白质组学，在蛋白质的研究中发挥着很重要的作用，下面将介绍蛋白质组学的一些基本内容及研究进展。 一.产生背景[1] 在20世纪中后期随着DNA双螺旋结构的提出和蛋白质空间结构的解析，生命科学研究进入了分子生物学时代，对遗传信息载体DNA和生命功能的体现者蛋白质的研究，成为了其主要内容。90年代初期启动的庞大的人类基因组计划．在经过各国科学家多年的努力下，已经取得了巨大的成就。10多种低等模式生物的基因组序列测定L三完成；第一个多细胞生物一线虫基因组的DNA全序列测定也在1998年年底完成；人类所有基因的部分序列测定(EST)已经完成；人类基因组的全序列测定有可能提前到2003年完成。生命科学已跨入了后基因组时代。在后基因组时代，研究重心将从揭示生命的所有遗传信息转移到在整体水平上对功能的研究。这种转向的第一个标志是产生了功能基因组学这一新学科，即从基因组整体水平上对基因的活动规律进行阐述。如在mRNA 水平上，通过DNA 芯片(DNA chips)和微阵列(Microarray)法等技术检测大量基因的表达模式，并取得了很好的进展。但是，mRNA的表达水平(包括mRNA的种类和含量)由于mRNA储存和翻译调控以及翻译后加工等的存在．并不能直接反映蛋白质的表达水平}蛋白质自身特有的活动规律，如蛋白质的修饰加工、转运定位结构形成、代谢、蛋白质与蛋白质及其他生物大分子的相互作用等．均无法从在基因组水平上的研究获知。因此，对生物功能的主要体现者或执行者一蛋白质的表达模式和功能模式的研究就成为生命科学发展的必然。在此背景下．80年代中期，国际上葫发了一门研究细胞内垒部蛋白质的组成及其活动规律的新兴学科- 蛋白质组学(Proteomic)。 蛋白质组(proteome)一词是马克.威尔金斯(Marc Wilkins)最先提出来的, 最早见诸于1995年7月的“Electrophoresis”杂志上它是指一个有机体的全部蛋白质组成及其活动方式。蛋白质组研究虽然尚处于初始阶段, 但已经取得了一些重要进展。当前蛋白质组学的主要内容是, 在建立和发展蛋白质组研究的技术方法的同时, 进行蛋白质组分析。对蛋白质组的分析工作大致有两个方面。一方面,通过二维凝胶电泳得到正常生理条件下的机体、组织或细胞的全部蛋白质的图谱, 相关数据将作为待检测机体、组织或细胞的二维参考图谱和数据库。一系列这样的二维参考图谱和数据库已经建立并且可通过联网检索。二维参考图谱