DNA提取实验报告
生物学大实验（二）
实验名称：质粒扩增、提取和鉴定实验
实验目的通过对智力扩增、提取和鉴定试验的实验原理介绍和实际操作，加深对分子生物学基本技术的理解和掌握。
实验仪器设备：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、摇床、离心机、不同型号移液枪若干支、磁力搅拌器、恒温水浴锅、电炉、制冰机、琼脂糖凝胶电泳仪、超净工作台等。
实验原理：质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，通过对细菌、放线菌和真菌的培养来实现对质粒的扩增。经过处理的线状dna在外界环境恢复正常的时候不能够复性而质粒dna可以复性，从而可以实现质粒dna和染色体dna的分离。限制性内切酶能特意地结合于一端被称为限制性酶识别系列的dna系列之内或其附近的特异位点上，并切割dna。当对提取的质粒dna进行电
泳时，同一质粒dna其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。
实验步骤：
一质粒扩增
（1）普通lb固体培养基制备：
制备lb培养基，倒入灭菌瓶中高压灭菌，待完全冷却后，保存备用。
（2）将大肠杆菌接种于lb培养基中，37℃振荡培养过夜(200转/分)
二质粒dna的提取(碱法)
1将菌液倒入1.5ml的微量离心管中，12000rpm离心一分30秒，弃去上清液，以得到较多的细菌沉淀；
2、将微量离心管开口倒置在卫生纸上，使离心管底部的液体流尽。
3、加入100μl用冰预冷的溶液i，剧烈振荡，将沉淀彻底悬浮，然后室温放置5分钟。
4、加入200μl现配的溶液ii，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管（不要振荡，以避免dna断裂），使混合物混匀，冰浴5～10分钟。
5、加入150μl预冷的溶液iii，盖紧管口，温和颠倒混匀，使粘稠地细菌裂解物均匀地分布于溶液iii中，冰浴5分钟。
6、取上部水相，移入新的离心管，加入2倍体积预冷的无水乙醇（也可同时加入1/10倍体积的醋酸钠），震荡混匀，室温放置10分钟沉淀双链dna，然后4℃，12000rpm离心10min。
7、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使离心管底部的液体流尽后，加入预冷的1ml 70％乙醇。
8、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使液体流尽，置dna干燥5～10分钟。
9、吸除上清液，将管口倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。
10 、将沉淀溶于34υlte缓冲液或灭菌水（ph8.0）中，储于-20℃冰箱中
三dna酶切反应
1、将洁净干燥并经灭菌的eppendorf 管（最好0.5ml）编号，用微量移液枪分别加入dna （υl）和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液
2υl，将管内溶液混匀后加入0.5υl酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可以用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。
2、混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37℃水浴锅保温2-3小时，使酶切反应完全。
3、每管加入2υl0.1mol/l edta
（ph8.0），混匀，以停止反应，置于冰箱之保存备用。
四 dna的琼脂糖凝胶电泳
1、取5×tbe缓冲液100ml加蒸馏水至1000ml，配成0.5×tbe稀释缓冲液，待用。
2、胶液的制备：称取3g琼脂糖置于1000ml 锥形瓶中，加入300ml 0.5×tbe稀释缓冲液，加入微波炉里加热至琼脂糖全部融化，取出摇匀，此为1%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使其附于瓶盖上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸发。
3、胶版的制备：想冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭（eb）溶液使其终浓度为0.5υlg/ml。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则溶液出现气泡，待胶完全凝固后，拔出梳子注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5υ×tbe稀释缓冲液至页面恰好没过胶板上表面
4、加样：取20υl的酶解液与2υl10×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中，每加完一个样品要更换tip头以防止互相污染，注意上
样时要小心操做，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿
5、电泳：加完样后合上电泳槽盖，立即接通电源，控制电压保持在60-80v，电流在40ma以上，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿2cm时停止电泳
6、观察和拍照
五实验结果
六实验结论
通过本次试验加深了对分子生物学以及基因工程的深入了解，右上第三第四根亮柱是我的结果。结果显示，第三条中酶切效果良好，rna被降解的很完全，第四根没有被酶切，质粒dna跟rna 同时存在，出现了两条亮带，质粒dna跟rna分离效果较好。
本实验需要细致认真的完成，所以特别在凝胶电泳中要十分注意以下事项：