J 1SHANXI AGRIC 1UNIV 1(N at ural S cience Edition )
学报(自然科学版)2010,30(1)
002618
收稿日期:2009211210 修回日期:2009212220
作者简介:李宁(19782),女(汉),山西太原人,硕士,主要从事生物化学方面的研究。
银杏叶总黄酮提取工艺的正交设计研究
李宁1,李楚2
(11山西医科大学药学院,山西太原030001;21山西省中医药研究所,山西太原030001)
摘 要:为了筛选银杏叶总黄酮提取最佳工艺,试验运用正交设计法,考察了溶剂浓度、料液比、提取次数和提取时间
4个因素对银杏叶总黄酮提取工艺的影响,并用紫外吸收法测定银杏叶总黄酮的含量。研究结果表明:芦丁标准品在0105～0130mg ?mL -1范围内,线性良好(r =019920),该提取方法操作简便,结果准确可靠。以总黄酮含量为指标,
确定了60%乙醇,料液比1∶8,提取2次,每次1h 为最佳提取条件。关键词:银杏叶;总黄酮;正交设计;紫外分光光度法
中图分类号:R28411 文献标识码:A 文章编号:167128151(2010)0120074203
The Orthogonal Experimental Design On Total Flavanoid In Leaves Of Ginkgo Bilobal LI Ning 1,LI Chu 2
(11College of Pharmacy ,S hanx i Medical Universit y ,T ai y uan S hanx i 030001,China;21Research L aboratory of T raditional Chinese Medicine ,Tai y uan S hanx i 030001,China )
Abstract :To optimize the extraction of total flavanoid f rom leaves of ginkgo bilobal ,we used the four factors ,i.e.the concentration of ethanol ,volume of solvent ,number of extraction and extraction time.The effect of the four factors on the concentration of total flavanoid in leaves of ginkgo bilobal is examined by orthogonal design and ultraviolet spec 2trophotometric technique.The result indicated that the linear relationship of rutin sample was good (r =019920)in the range of the 0105～013mg ?mL -1.60%ethanol ,1∶8,2times ,1h is the best extraction method.The method is sim 2ple ,accurate and reliable.
K ey w ords :Leaves of ginkgo bilobal ;Total flavanoid ;Orthogonal design ;Ultraviolet spectrophotometric method
银杏叶为银杏科植物银杏的叶片,主要化学成分为黄酮类、萜类,其中总黄酮含量最高[1～3]。天然来源的生物黄酮分子量小,能被人体迅速吸收,能通过血脑屏障,进入脂肪组织,进而体现消除疲劳、保护血管、防止动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、活化大脑及其他脏器的功能。试验通过参考相关文献[4～6],最终采用乙醇水溶液作为溶剂,通过正交设计方法,考察总黄酮在提取物中的含量,以确定银杏叶的最佳乙醇回流提取工艺。
1 材料与仪器
银杏叶采自太原儿童公园,芦丁标准品(中国
生物制品检定所,批号:008029705),亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、正丁醇(无水)、乙醇(分析纯)。
主要仪器:旋转蒸发仪RE 252AA ,电子天平,UV 2760CR T 双光束分光光度计,恒温水浴槽,电
热恒温鼓风干燥箱。
2 实验方法
211 试验因素及方案
参考前人研究结果[7],确定影响总黄酮提取效率的考察因素有4个,分别为:溶剂浓度(A )、料液比(B )、提取次数(C )、提取时间(D ),正交实验考察因素见表1。考虑各种影响因素,选择了L9(34)的正交试验方案[8]。212 供试品溶液的制备
将采摘的银杏叶片放入60～70℃的干燥箱中烘干24h ,粉碎后过40目筛,取1516g 银杏叶粉末置于提取容器内,加不同浓度乙醇适量回流提取,过滤。残渣再加不同浓度乙醇适量回流提取,过滤。残渣用醇液洗涤数次,转移至250mL 容量瓶中,用乙醇定容。用UV 2760CRT 双光束分光光度
计在510nm 处进行测定[9～11],以60%乙醇作参比液,采用硝酸铝比色法[12～14],测定总黄酮的含量。
表1 正交实验考察因素
T able 1 Levels of orthogonal experiment
水平
Level
溶剂浓度(A )
Volume of solvent
料液比(B )
g ∶mL 提取次数(C )
Number of Extraction
提取时间(D )
Extraction time
130%
1∶61
110
260%1∶821153
90%
1∶10
3
210
总黄酮含量(%)=供试品吸光度×标准品相当芦丁量/标准品吸光度×供试品量213 对照溶液的制备
精密称取芦丁对照品20mg ,置于10mL 的容量瓶中,加入60%的乙醇溶液6mL ,微热使其溶解,再用60%的乙醇定容至刻度,摇匀,得浓度为2mg ?mL -1的芦丁标准贮备液[15～17]。214 标准曲线的制备
精密吸取对照溶液0125、015、0175、1、1125、115mL 分别置于编号1、2、3、4、5、6号的10mL
具塞刻度试管中,先加5%亚硝酸钠溶液013mL ,
摇匀,放置6min ,再加10%硝酸铝溶液013mL ,摇匀,再放置5min ,加4%氢氧化钠溶液4mL ,各加60%乙醇定容至10mL ,放置15～20min ,在波长510nm 处测定各试管中溶液的吸光度。以浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,得回归方程:A =810643c +010339(r =019920,n =6)。在0105～0
13mg ?mL -1范围内,线性关系良好。
图1 芦丁标准曲线
Fig 11 Standard curve of rutin
215 精密度试验
准确量取同一浓度的芦丁标准品溶液012mL ,置于10mL 量瓶中,在510nm 波长处连续6次,测定吸光度,测得精密度RSD =0128%。216 稳定性试验
取同一浓度的供试品溶液,每隔4h 测定一次,结果6次测定的吸收值基本不变,RSD =0132%,表明供试品溶液至少在24h 内稳定。
217 加样回收率试验
准确量取212中的供试品溶液10mL ,分别取
6份,准确加入芦丁标准品1mg ,按供试品提取测定方法,计算回收率,得平均回收率=96176%,RSD =1109%(n =6)。
3 结果与分析
311 试验结果分析
按照正交试验方案对总黄酮提取条件进行了研究,结果见表2。
表2 正交试验设计及试验结果分析L9(34)
T able 2 Orthogonal design and analysis of results L9(34)
试验号
Sample No 1
A
B
C
D
总黄酮含量/%
Total content of flavonoid/%
1111111221212221147531333112444213311533522211161662312113957312311158832311123693
3
1
2
01971
K131940319123158741073K241544413274124931841K331365318754101331935k1
11313113041119611358k211515114421141611280k311122112921133811312R
01393011500122001078
由表2可看出,K1、K2、K3表示各个因素分别取3个水平时相应的试验结果之和;k1、k2、k3为K1、K2、K3的算术平均值;极差R 是k1、k2、k3中最大值与最小值之差,它反映了试验中各因素影响的大小。它们的大小顺序反映出相关因素分别取三个水平时提取率的高低。312 试验因子影响的比较分析
为了比较正交实验中4个实验因素对实验结果的影响,确定哪些或哪个参考因素对实验提取结
5
730(1)李宁等:银杏叶总黄酮提取工艺的正交设计研究
果的影响是最显著的或比较显著的,从而寻找出最佳实验操作条件,进行了方差分析,结果见表3。
表3 正交试验方差分析
T able3 Variance analysis of orthogonal experiment
因素Factor
偏差平方和
Error sum of square
自由度
Degree of freedom
F比
F statistic
F临界值
Critical value
显著性
Significance
溶剂浓度14112215151191000显著料液比0164320171191000
提取次数412224169191000显著提取时间0104520105191000
误差01902
由表3方差分析可知,各因素影响的顺序为:
A>C>B>D,即乙醇的浓度对提取率的影响
最大,提取时间影响最小。A2B2C2D1的组合最
佳,即称取1516g银杏叶粉末加60%乙醇,料液
比为1∶8,提取2次,每次1h为提取的最佳条件。
313 试验结果的稳定性验证
将采摘的银杏叶片放入60～70℃的干燥箱中
24h,粉碎后过40目筛,置于提取容器内,按已确
定的最佳提取工艺,过滤,重复一次。残渣用醇液
洗涤数次,转移至250mL容量瓶中,乙醇定容。
重复试验3次,数据见表4。
表4 银杏叶总黄酮最佳提取工艺的验证
T able4 Best extraction technique of F G
样品号Sample No1
总黄酮含量/%
Total content of flavonoid/%
111610 211615 311618
表4结果表明:验证试验结果与正交试验结果相近,确定该提取工艺基本稳定、可行。
4 讨论
以银杏叶总黄酮提取液在510nm波长处的吸光度为参考指标,通过总黄酮提取工艺的正交试
验研究,确定了从银杏叶中提取总黄酮的最佳条件
为:以60%乙醇为溶剂,料液比为1∶8,提取2次,
每次1h,提取处理银杏叶1516g。通过稳定性实
验,确定总黄酮至少在24h内是稳定的。该提取
方法操作简便,结果准确可靠。为进一步研究银杏
叶中总黄酮提取工艺提供理论依据。银杏叶含有
丰富的黄酮[18～20],具有广泛开发和利用价值,值得
综合利用,应该加强其资源开发。
参 考 文 献
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(编辑:杨忠义)
67山西农业大学学报(自然科学版)2010
银杏叶提取黄酮及分离纯化 组员：李佳辉、黄埔、赵超武 一、实验目的 1.掌握传统的溶剂提取法并对银杏中的黄酮进行提取 2.掌握紫外分光光度计的应用，以及相关溶液的配置 3.学会自主设计实验，培养团队合作精神 二、实验原理 ⑴关于黄酮：银杏中最具药用价值的成分，有提高人体免疫力的作用；并且抗衰老、调节内分泌，还具有抗炎、抗真菌的作用； ⑵实验需设置空白参比液，由文献资料可知芦丁标准液的最大波长大概为510nm; ⑶本实验采用硝酸铝（氯化铝）法测定银杏叶总黄酮的质量浓度，因 为黄酮类化合物可以与铝盐发生络合显色反应。 其主要原理为：在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在的条件下，黄酮类化合物与铝盐发生螯合反应，加入氢氧化钠溶液后，溶液显橙红色，在510nm（左右）处有吸收峰，且符合定量分析的朗伯—比尔定律（即A=kbc）一般与芦丁标准溶液比较定量。先用亚硝酸钠还原黄酮类化
合物，再加铝盐络合，最后加氢氧化钠溶液使黄酮类化合物开环，生成2-羟基查尔酮而显色。显色原理发生在黄酮醇类邻位无取代的邻二酚羟基部位，不具有邻位无取代的邻二酚羟基的黄酮类成分加入上述试剂时是不显色的。（如二氢黄酮类化合物就不发生该显色反应）
目前银杏叶黄酮的提取方法主要有：溶剂提取法、超临界流体萃取法（SFE法）、高速逆流色谱技术提取法（HSCCC)微波提取法、超色波提取法、酶提取法、分子烙印技术。因溶剂提取法操作简单，所需试剂廉价易得，故通常使用此法来进行大规模生产。 其工艺流程如下： 银杏叶—→粉碎—→NaOH-60%乙醇回流提取—→离心—→过滤—→滤液收集—→二次醇提—→合并两次滤液—→树脂吸附—→脱吸—→浓缩—→干燥—→提取物 由于银杏叶黄酮中的类黄酮主要为芦丁，故用芦丁为对照物绘制标准曲线，并采用分光光度法进行测定。 三．实验材料及器材 1.材料 酸银杏叶、芦丁、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、95％乙醇、磷酸氢二钠、磷二氢钠、D101大孔吸附树脂、盐酸
银杏叶中的主要成分、分离方法及药理作用 的研究 摘要 银杏叶提取物中的主要成分为萜类内酯化合物，具有强大的抗氧化与自由基能力，因此在临床上具有很好的应用。随着对银杏叶成分、药理作用、制剂、临床应用范围的研究领域进一步扩大、加深,银杏叶在传统治疗的作用越来越重要。其对心血管疾病、神经系统疾病、高脂血症以及感染、损伤等都有很好的疗效。本文主要研究了银杏叶提取物的主要成分和分离方法，并通过实验得出其药理作用。 关键词：银杏叶提取物分离药理作用 前言 银杏叶中的类黄酮物质对动物的循环系统、脑功能有改善作用，从此展开了对银杏叶药理及应用的广泛研究。现研究表明，银杏叶提取物具有广泛的药理作用，如肝脏保护作用、抗毒作用、抗肿瘤作用、抗辐射作用、肾脏保护等作用以及抗氧化、促智作用、抗焦虑及镇静作用、调节血脂和减轻缺血再灌注损伤作用等，其中心血管系统和血液系统的保护作用尤为当前的研究热点。银杏叶提取物能降低心血管系统疾病发生率，药理机制有:①增加人血浆抗氧化能力;②减少血检的形成;③降低血清TG;④扩张血管，增加血流量，改善缺血组织代谢;⑤在心肌缺血再灌注中清除氧自由基。 正文 1银杏叶的主要成分简述 银杏叶中的成分比较复杂，化学成分主要有黄酮苷类（flavonoidglycosides）、萜内酯类（terpenes）、聚异戊烯醇类（polyprenols）、6-羟基犬尿喹啉酸（6-hydroxykynurenic acid ,6HKA）、有机酸、银杏酚酸类（phenolic acids）及烷基酚、烷基酚酸、又称银杏酸（ginkgolic acids）、4’-甲氧基吡哆醇（4’-O-methypyridoxine）等。
注射用银杏叶提取物的工艺研究 更新时间：2005-7-20 银杏叶中含多种生理活性成分，如黄酮类化合物、萜内酯等，预防和治疗心、脑血管疾病和老年性痴呆具有良好的效果。银杏叶黄酮多为黄酮糖苷。已从银杏叶中分离出二萜内酯有5种，即银杏内酯 A,B,C, J和M,倍半萜内酯1种，即白果内酯（gink- golide）。 国内已开发上市的含银杏叶提取物的品种有固体制剂和注射液，目前市场上作者未见有供注射用的银杏叶提取物原料药，本试验针对其工艺进行了中式规模的研究，该工艺简便，适合于工业生产。 试药与仪器 银杳叶为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶，购于山东郑城，经检定，本品符合中华人民共和国药典2000年版一部银杏叶项下有关规定。槲皮素、白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C 均由中国药品生物制品检定所提供。 岛津LC-l0ATVP双泵，岛津SPD-10AVP 紫外-可见检测器。CLASS-VP色谱工作站。试剂：乙腈为色谱纯，乙醇为医用酒精，其他试剂为分析纯，水为重蒸水。ZFQ-971型旋转薄膜蒸发器。 方法与结果 1 工艺过程 1.1 粗品制备 已经粉碎至0.3～0.5cm碎块的银杏叶以70％乙醇60℃温浸提取，提取2次，每次2h，合并提取液，回收乙醇至相对密度（1.03～1.09，50℃测），加 4倍叶重量的水，1～4℃冷藏放置8h，过滤。滤液上DM130大孔吸附树脂柱，分别以3～4倍柱体积水、 3倍柱体积15％乙醇、70%乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，在温度为50～60℃，真空度-0.08～- 0.09MPa条件下，减压浓缩，真空干燥，得粗品。 1.2 精制过程
银杏叶黄酮提取及含量测定 一、实验目的 1、掌握银杏叶中黄酮的提取方法 2、了解银杏叶中黄酮的含量测定 二、实验原理 近几年来，随着对黄酮类化合物研究的日益深入与重视，黄酮类化合物提取技术的发展也得到了促进。目前提取黄酮类化合物的方法主要包括有机溶剂浸提法、超声波提取法、超临界流体萃取法、微波提取法和酶提取法等。 １．１有机溶剂浸提法 目前国内外使用最广泛的银杏叶中黄酮的提取方法就是有机溶剂提取法，一般可用乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇或某些极性较大的混合溶剂，如甲醇－水（１＋１）溶液。由于甲醇的毒性、挥发性较大，因此一般采用乙醇作为提取剂。银杏叶干燥粉碎后用有机溶剂浸泡、提取、过滤，滤液中的溶剂经减压蒸馏除去后得银杏叶浸膏粗提物。徐桂花等［１］提取银杏叶中黄酮类化合物时，采用乙醇（７０＋３０）溶液为提取剂，提取温度为７０℃，料液质量浓度比为１ｇ比４０ｍＬ，提取时间为４ｈ。由于乙醇提取工艺在安全性、溶剂成本、效率及杂质酚酸去除等方面都不能应对日益严酷的市场竞争，张林涛等［1］提出了以硼砂－ 氢氧化钙碱水为溶剂提取银杏叶黄酮，其黄酮提取率与文献值相近，但提取工艺时间缩短为１ｈ。 １．２超声波提取法 超声波提取法是利用搅拌作用、强烈的振动和空间效应、高的加速度等使药物有效成分进入溶剂，从而提高提取率，缩短提取时间，并能消除高温对提取成分影响的一种提取法。刘晶芝等［2］运用了超声波技术与水浸提取相结合的方法得出超声波提取的最佳工艺条件为：超声频率４０ｋＨｚ，超声处理时间５５ｍｉｎ，料液质量比１比１００，提取温度３５℃，静置３ｈ，提取率为８１．９％。郭国瑞等［3］以水为介质，超声波提取银杏叶中黄酮苷，与常规水浸提法比较，超声波提取效率大大提高，确定超声波提取的最佳工艺为：超声处理时间５５ｍｉｎ，料液质量比１比３０，提取温度５０℃，提取率为８２．３％。 １．３超临界流体萃取法 超临界流体萃取法是一种以超临界流体代替常规有机溶剂对有效成分进行萃取和分离的新技术。可作为超临界流体的物质很多，其中二氧化碳临界温度（ＴＣ＝３１．３℃）接近室温，且具有无色、无毒、无味、不易燃、化学惰性、价廉、易制成高纯气体等优点而被广泛应用，特别在中药材及其制剂中更显示出其独特、简便、快速、具有较高的选择性、提取杂质少、可直接进样分析的优点。邓启焕等［4］探讨了超临界萃取银杏叶有效成分的影响因素，最佳条件为萃取压力２０ＭＰａ、时间９０ｍｉｎ、粒度３．９ｍｍ、温度４０℃，经测定银杏叶黄酮的质量分数为２８％，高于国际公认标准。 １．４微波提取法 微波提取法是利用分子或离子在微波场中的导电效应直接对物质进行加热从而提取植物细胞内耐热物质的新工艺。曾里等［5］的研究表明以乙醇溶液作溶剂比以水作溶剂的效果好，最佳条件为以乙醇 （６０＋４０）溶液为提取剂，解冻处理２０ｍｉｎ。张鹏等［6］对微波法提取银杏叶中黄酮类物质进行了研究，最佳提取条件为以乙醇（５０＋５０）溶液
银杏叶中黄酮提取及含量测定 一、实验目的 提取银杏叶中的总黄酮并测定其含量。 二、实验原理 银杏系银杏科银杏属落叶乔木，银杏叶中含有多种生理活性成分，其中黄酮类化合物是重要的生理活性物质，具有保肝护肝、预防治疗心血管疾病、抗氧化、抗衰老等作用。因此，将银杏叶作为高营养、保健功能价值的资源加以开发利用，这对于提高银杏叶综合利用率有重要意义。银杏叶黄酮类化合物的提取方法目前研究的有水浸取法，成本低但浸取率低；有机溶剂浸取法中，乙醇浸取的效率高且无毒，是目前采用较多的方法；韩玉谦等采用超临界流体萃取法，在70%乙醇溶液中加热回流法和CO2 超临界流体萃取法提取银杏叶中的活性成分，银杏黄酮回收率为84 . 4 % ，是常规萃取法回收率的2倍多；乙醇超声波浸取法, 黄酮提取率可达到8 6 . 7 %。银杏黄酮含量的测定常用分光光度法和高效液相色谱法。分光光度法自20世纪9 0年代以来一直是用来测定银杏黄酮的一种重要方法, 由于其成本低、便于操作等特点, 是一种快捷有效的方法[1]。本实验采用乙醇作溶剂进行索氏提取，建立了用Al(NO3)3显色法对芦丁标准品和银杏叶提取液进行光谱扫描测定银杏叶总黄酮含量的方法[2]。 三、实验仪器和试剂 材料：银杏叶粉末50g 试剂：标准芦丁样品，无水乙醇（600ml），50mlAl(NO3)3（0.1mol/L），乙醚，5%NaNO2溶液，10%AL(NO3)3，4%NaOH溶液。
仪器：紫外分光光度计、电子分析天平、水浴锅、烘箱、烧杯、容量瓶（100ml1个、50ml1个、10ml6个）、索氏提取器、减压蒸馏装置、锥形瓶、沸石等。 四、实验步骤 1.1提取银杏叶中总黄酮 （1）将银杏叶洗净, 在103℃下烘干至恒重,用研钵捣碎制得银杏叶粉（2）准确称取10.0g，置于索氏提取器中，按下列条件加热回流提取：乙醇浓度80％，料液比1：20(g／ml)，回流温度85℃，回流时间2 h，平行进行1~3次实验。 （3）将圆底烧瓶中提取液倒入烧杯，加入一倍蒸馏水，再加入相同量的乙醚，混合均匀，倒入分液漏斗中，静置20min，分层后，收集下层液体。 （4）减压蒸馏，回收乙醇，得到淡黄色黏液，干燥得到银杏叶中总黄酮提取物。 1.2银杏叶中总黄酮含量测定 （1）芦丁标准溶液的配置：称取0．0100g芦丁标准品，放入烧杯中，加入80%的乙醇溶液使其溶解，置于100ml的容量瓶中，制成0.1g/L的芦丁标准溶液。定容，摇匀备用。 （2）绘制芦丁标准曲线：分别移取0，0.4 ，0.8，1.2，1.6，2.0 ml 芦丁对照品溶液，于6个10ml 容量瓶中，标记1~6，分别加入2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0ml的80%乙醇溶液，加入5%NaNO2溶液0.5ml，摇匀，放置6min，加入0.5ml10%AL(NO3)3，摇匀，放置6min，加入4%NaOH 溶液4.0ml，加入80%乙醇定容，摇匀，放置20min。在波长510nm处分
银杏黄酮即银杏叶提取物，它能够增加脑血管流量，改善脑血管循环功能，保护脑细胞，扩张冠状动脉，防止心绞痛及心肌梗塞，防止血栓形成，提高机体免疫能力。对冠心病、心绞痛、脑动脉硬化、老年性痴呆、高血压病人均十分有益。 银杏黄酮 银杏黄酮亦称银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E. [本品来源]本品为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶提取物。 [植物分布]全国大部分地区有产，主产湖北、江苏、广西、四川、河南、山东、辽宁等地。. [产品性状]银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E为浅黄棕色可流动性棕黄色粉末，略有银杏叶香味。 [产品含量]总黄酮甙含量：24-26%（HPLC法）,总萜内酯含量8-10%（HPLC法）白果内酯≥2.5% 银杏内酯A≥1.4% 银杏内酯B≥1.2%，银杏内酯C≥0.9% ，银杏酸≤1-5ppm重金属含量≤20ppm AS≤1PPM 干燥失重≤3%，炽灼残渣≤1.5%，溶济残留≤1%。 [产品用途]适用于制药、保健品、日用品、化妆品等各个领域 [适用范围]增加脑血管流量，降低脑血管阻力，改善脑血管循环功能，保护脑细胞，免受缺血损害，扩张冠状动脉，防止心绞痛及心肌梗塞，抑制血小板聚集，防止血栓形成，清除有害的氧化自由基，提高免疫能力，具有防癌抗衰功能。对治疗冠心病、心绞痛、脑动脉硬化、老年性痴呆、高血压等病有神奇疗效。 1. 促进循环 银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E.能同时促进大脑和身体肢体的循环。银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E.的一个主要保健功能就是抑制一种称为血小板活化因子（PAF）的物质，PAF是一种从细胞中释放的介质，其会导致血小板聚集（堆积在一起）。高含量的PAF会导致神经细胞损伤，中枢神经系统血流量降低，发炎，和支气管收缩。与自由基非常相似，高PAF 水平也会导致衰老。银杏内酯和白果内酯可在缺血（体内组织缺少氧气）时期内保护中枢神经系统的神经细胞不受损伤。该功能可能能对苦于中风的患者有辅助治疗的作用。除了抑制血小板粘着外，银杏提取物调节血管张力和弹力。换句话说，其可令血管循环更加有效率。该提升循环效率作用对循环系统中的大血管（动脉）和较小血管（毛细血管）都有同样作用。 2. 抗氧化作用 银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E.可能在大脑，眼球视网膜和心血管系统中可发挥抗氧化特性。其在大脑和中枢神经系统中的抗氧化作用可能有助于防止因年龄导致的大脑功能衰落。银杏叶提取物在大脑中的抗氧化功能特别使人感兴趣。大脑和中枢神经系统特别易受自由基攻击。自由基
银杏叶提取工艺 一．实验仪器及试剂 1.实验器材：电子分析天平，烘箱，粉碎机，分样筛(60目)，恒温水浴锅，分光光度 计，真空干燥机 2.玻璃仪器：棕色广口瓶，烧杯（1L），容量瓶（25mL）玻璃棒，温度计，普通漏斗， 分液漏斗，布氏漏斗，具塞刻度比色管（10mL），移液枪，比色杯 3.试剂：60%乙醇溶液(取640mL95%乙醇,360mL纯净水配成60%乙醇溶液)，石油醚， 30 %乙醇溶液，5%亚硝酸钠溶液，10%硝酸铝溶液，1mol/L氢氧化钠溶液，芦丁粉 4.装置：蒸馏装置，抽滤装置，萃取装置 5.其他材料：纱布，银杏叶 二．实验步骤 1.预备取新鲜银杏叶，洗净，晾干，于70℃烘箱中烘9h(时间视样品水分含量定, 可以8～12h)，取出置于干燥箱内冷却，用粉碎机粉碎过60目筛，粉末置于棕色广 口瓶中存储。 2.浸提配制60%乙醇溶液(取640mL95%乙醇，360mL纯净水配成60%乙醇溶液)。取 100g银杏叶粉于700mL60%乙醇中，在水浴锅内加热到60℃～70℃，浸提2h，每10min 搅拌一次，用纱布过滤,残渣中加入60%乙醇700mL，60℃～70℃继续浸提2h，每10min 搅拌一次,纱布过滤，合并浸提液。同时做平行实验。 3.除脂类和叶绿素将滤液盛于分液漏斗中，用石油醚萃取1~2次，每次石油醚用量 约为滤液体积的1/25，直到水层不含叶绿素为止。 4.抽滤先用纱布粗滤,去除大颗粒沉淀,以提高抽滤速度。安装抽滤仪器,往布氏漏斗 中加入少量浸提液进行抽滤,由于银杏叶中含有胶状沉淀物,滤纸易造成堵塞,导致抽 滤速度下降,故应经常更换滤纸。抽滤结束后,取滤液弃滤渣。 5.蒸馏、浓缩安装蒸馏、浓缩仪器,抽滤液中含大量乙醇溶液,用蒸馏装置进行乙醇 浓缩。一定量的乙醇也具有杀菌作用,在测定提取物抑菌作用时,应尽量排除乙醇溶 剂的干扰,使乙醇完全挥发干净。为了不破坏提取物中有效成分,水浴温度控制在 60℃～70℃,而95%乙醇的沸点在75℃左右,故蒸馏速度慢,时间长。可采取简单的方 法,直接水浴加热,在空气中挥发乙醇,此法缺点:不能回收乙醇。最终得到的提取物为 一部分沉淀浸膏,颜色为深棕色粘稠物。 6.干燥由于浓缩的浸提液中仍含有部分乙醇和水分,采用真空干燥法,温度控制在 60℃～70℃之间,利用增大真空度来降低沸点,去除最后的乙醇和残留的部分水分。 如果条件允许还可以采用冰冻干燥法干燥。此时的提取物中除含有黄酮类和内酯外, 还含有一定量的杂质。
溶剂提取法提取银杏叶中得黄酮实验报告 小组成员：周璟、胡静、左兵华、刘云飞 2014年5月一、实验目的 ⅰ）掌握传统的溶剂提取法并对银杏中的黄酮进行提取 ⅱ）掌握紫外分光光度计的应用，以及origin软件绘图的基本操作ⅲ）学会自主设计实验，培养团队合作精神 二、实验原理 ⑴关于黄酮：银杏中最具药用价值的成分，有提高人体免疫力的作用；并且抗衰老、调节内分泌，还具有抗炎、抗真菌的作用； ⑵实验需设置空白参比液，由文献资料可知芦丁标准液的最大波长大概为510nm; ⑶本实验采用硝酸铝（氯化铝）法测定银杏叶总黄酮的质量浓度，因 为黄酮类化合物可以与铝盐发生络合显色反应。 其主要原理为：在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在的条件下，黄酮类化合物与铝盐发生螯合反应，加入氢氧化钠溶液后，溶液显橙红色，在510nm（左右）处有吸收峰，且符合定量分析的朗伯—比尔定律（即A=kbc）一般与芦丁标准溶液比较定量。先用亚硝酸钠还原黄酮类化合物，再加铝盐络合，最后加氢氧化钠溶液使黄酮类化合物开环，生成2-羟基查尔酮而显色。显色原理发生在黄酮醇类邻位无取代的邻二
酚羟基部位，不具有邻位无取代的邻二酚羟基的黄酮类成分加入上述试剂时是不显色的。（如二氢黄酮类化合物就不发生该显色反应） 三、实验药品及仪器 ⑴药品：银杏叶（阴干碾碎储藏备用），芦丁，无水乙醇，亚硝酸钠，氯化铝和氢氧化钠； ⑵仪器：电子天平，旋转蒸发仪，索氏提取器，uv-1800型紫外分光光度计，研钵，比色皿，容量瓶（10ml*6,50ml*1,100ml*2），移液管，量筒，烧杯，玻璃棒。 四．实验步骤 Ⅰ）配制60%的乙醇溶液（黄酮同时具有水溶和油溶性）。 Ⅱ）准确称取10g银杏叶粉末置于索氏提取器中，加入60%的乙醇溶液10ml，回流提取3h，然后用旋转蒸发仪浓缩并回收乙醇溶液，抽滤得到银杏叶黄酮粗提物。再用60%的乙醇定容到100ml。 Ⅲ）芦丁标准液的配置：准确称取芦丁标准品0.005g，用60%的乙醇溶液加热溶解，并转移到50ml容量瓶内用乙醇溶液定容，摇匀，得质量浓度为0.1mg/ml的芦丁标准液。 Ⅳ）分别吸取上部配制的母液0.0,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0ml于6只10ml容量瓶中摇匀，先加入5%的亚硝酸钠0.5ml摇匀，静置6min，再加入10%的氯化铝溶液0.31ml，摇匀，静置6min，再加入4%的氢氧化钠溶液4ml，用60%的乙醇溶液定容到10ml，放置20min。其中，加入
Platelet-Activating Factor 即血小板活化因子。 一种强效生物活性磷脂，由白细胞、血小板、内皮细胞、肺、肝和肾等多种细胞和器官产生。PAF通过与靶细胞膜上的PAF受体结合而发挥作用。可引起血小板聚集，中性粒细胞聚集和释放；产生大量活性氧、白三烯等炎性介质。PAF阻断药 PAF通过与细胞膜受体结合发挥作用， PAF受体阻断药能阻止PAF与受体结合，因此对与PAF生成过量有关的疾病如哮喘、败血性休克等应当具有治疗意义。 银杏黄酮 银杏黄酮亦称银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E. [本品来源]本品为银杏科植物银杏Ginkgo biloba L.的干燥叶提取物。 [植物分布]全国大部分地区有产，主产湖北、江苏、广西、四川、河南、山东、辽宁等地。. [产品性状]银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E为浅黄棕色可流动性棕黄色粉末，略有银杏叶香味。 [产品含量]总黄酮甙含量：24-26%（HPLC法）,总萜内酯含量8-10%（HPLC法）白果内酯≥2.5% 银杏内酯A≥1.4% 银杏内酯B≥1.2%，银杏内酯C≥0.9% ，银杏酸≤1-5ppm重金属含量≤20ppm AS≤1PPM 干燥失重≤3%，炽灼残渣≤1.5%，溶济残留≤1% 。 [产品用途]适用于制药、保健品、日用品、化妆品等各个领域 [适用范围]增加脑血管流量，降低脑血管阻力，改善脑血管循环功能，保护脑细胞，免受缺血损害，扩张冠状动脉，防止心绞痛及心肌梗塞，抑制血小板聚集，防止血栓形成，清除有害的氧化自由基，提高免疫能力，具有防癌抗衰功能。对治疗冠心病、心绞痛、脑动脉硬化、老年性痴呆、高血压等病有神奇疗效。 1. 促进循环 银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E.能同时促进大脑和身体肢体的循环。银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E.的一个主要保健功能就是抑制一种称为血小板活化因子（PAF）的物质，PAF是一种从细胞中释放的介质，其会导致血小板聚集（堆积在一起）。高含量的PAF会导致神经细胞损伤，中枢神经系统血流量降低，发炎，和支气管收缩。与自由基非常相似，高PAF水平也会导致衰老。银杏内酯和白果内酯可在缺血（体内组织缺少氧气）时期内保护中枢神经系统的神经细胞不受损伤。该功能可能能对苦于中风的患者有辅助治疗的作用。除了抑制血小板粘着外，银杏提取物调节血管张力和弹力。换句话说，其可令血管循环更加有效率。该提升循环效率作用对循环系统中的大血管（动脉）和较小血管（毛细血管）都有同样作用。 2. 抗氧化作用 银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E.可能在大脑，眼球视网膜和心血管系统中可发挥抗氧化特性。其在大脑和中枢神经系统中的抗氧化作用可能有助于防止因年龄导致的大脑功能衰落。银杏叶提取物在大脑中的抗氧化功能特别使人感兴趣。大脑和中枢神经系统特别易受自由基攻击。自由基导致大脑损伤被广泛认为是导致伴随衰老而来的多种疾病的影响因素，其中甚至包括阿兹海默症。 3. 抗衰老功能 银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E.提升大脑血流量并对神经系统有极好的滋补作用。包含上万患者的数百次科学研究证实了银杏叶提取物的功效对包括大脑血流不足和老年患者的智力衰退在内的诸多问题的效力。银杏对许多衰老的可能症状都有很好的效果，例如：焦虑和忧郁、记忆损伤、难以集中注意力，机敏度下降、智力下降、眩晕、头痛、耳鸣（耳中鸣响）、视网膜黄斑部退化（成人失明的最普遍原因）、内耳骚动（其会导致部分失聪）、末端循环不良、阴茎血流不良导致的阳痿。 4. 痴呆，阿兹海默症和记忆力提升 科学家回顾了所有已出版的对银杏和轻微记忆损伤的高质量研究，并得出结论：银杏在提升记忆力和感知功能方面较安慰剂明显更加有效。银杏在欧洲被广泛用于治疗痴呆。银杏被认为可有助于防止或治疗这些脑部紊乱的原因是其可增加脑部血流量及其抗氧化功能。尽管许多临床试验有科学上的缺陷，银杏可能增加阿兹海默症患者思考能力，学习能力和记忆力的证据仍被抱以很大期望。 5. 月经前不快症状 一次评价银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E.对有月经前不快症状妇女益处的双盲受控安慰剂研究，该试验包括143名年龄在 18-45岁的妇女，并跟踪她们两个月经周期。在第一个周期的第16天每个妇女都收到银杏叶提取物Ginkgo biloba P.E.（每天
收稿日期:2004-02-28 作者简介:高琳(1962-),女,河南泌阳县人,副教授,从事有机化学及分析化学研究. 文章编号:1671-1629(2004)02-0075-03 银杏叶提取物精制工艺的研究 高 琳1 ,孟春丽1 ,雷天乾 2 (1.河南纺织高等专科学校,河南郑州450007;2.郑州市医药科技开发中心,河南郑州450066)摘要:研究了溶剂精制银杏叶粗提取物的工艺.粗提物经溶剂溶解精制,总黄酮含量达24%,黄酮收率>95%,指标接近超滤除杂、树脂吸附制备提取物的工艺.关键词:银杏叶;黄酮;精制;超滤 中图分类号:TS201.2 文献标识码:B 银杏黄酮是银杏叶提取物中的主要活性成分之一,在抗氧化及治疗心脑血管疾病等方面具有独特的疗效.银杏叶提取物的生产工艺主要有丙酮溶剂提取和乙醇提取、树脂分离两种方法.我国主要采用乙醇提取、树脂分离法生产提取物,工艺流程为:乙醇水溶液提取、树脂吸附、乙醇水溶液单次或分级洗脱、浓缩干燥得产品.但大多企业生产条件较差,控制手段落后,经常出现产品质量不稳定或收率低的现象.近年来,在该工艺路线的基础上,以提高产品质量及收率进行了多种方法的研究,主要有:(1)在提取液中加入适当的絮凝剂[1,2];(2)使用超滤对提取液净化[3,4];(3)超临界CO 2精制粗提取物 [5];(4)研制吸附和选择性 好、效率高的新型树脂[6] .(1)和(2)以除去大分子 的单宁、鞣质、蛋白质和多糖等杂质为目的.其中(1)、(2)、(3)的研究工作都取得了较好的效果,但需要增加较多的工艺步骤或加大设备投资;研制生产选择性好、效率高的树脂尚需要较长的时间,企业同样需要较完善的分析条件与之相匹配.为此,作者在研究超滤除杂净化提取液、树脂吸附制备银杏叶提取物的基础上,对溶剂精制粗提取物工艺进行了研究. 1 仪器和试剂 液相色谱仪(美国Waters 公司,600E 型泵系统,996型二极管阵列检测器,RC M8.0×1.0C 18、5 μm 径向加压柱);超滤器(美国Milipore 公司,卷式膜,截流相对分子质量3万). 槲皮素(中国药品生物制品检定所),山萘酚、异鼠李素(Sigma 公司),DM130树脂(山东齐鲁抗生素股份有限公司);银杏叶(河南省银杏科技开发中心提供,经高效液相色谱测定总黄酮含量为1.02%);95%乙醇(食用级).溶剂RS -A 、RS -B (购于河南省医药供应公司),其它试剂均为分析纯. 2 实验方法 2.1 总黄酮含量测定方法 参照文献[7],高效液相色谱法测定.色谱条件:甲醇-0.4%磷酸溶液(55∶45)为流动相,流速:1.0mL /min ,进样量:10μL ,检测波长:360nm ,柱温:25℃.外标法则定. 银杏叶样品的制备:准确称取银杏叶1.5g ,甲醇索氏提取8h ,60℃浓缩至15mL ,加入1.5mol /L 盐酸20mL ,摇匀,回流20min ,冷却后转入50mL 容量瓶中,用甲醇定容,备用. 银杏叶提取物样品的制备:准确称取银杏叶提取物0.1g ,加甲醇20mL 使其完全溶解,加入1.5mol /L 盐酸20mL ,摇匀,回流120min ,冷却,转入50mL 容量瓶中,用甲醇定容,过滤备用.2.2 精制工艺 提取液的制备:按文献[4]的工艺条件,取适量的银杏叶,将其切成条状,用银杏叶重8倍量的70%(V /V )的乙醇回流提取两次,第1次3h ,第2次2h ,趁热过滤,合并提取液,回收乙醇,水溶液加10倍的无盐水,管式离心机离心除杂后备用(取样,60℃浓缩、干燥后测黄酮含量,黄酮提取 第25卷第2期 郑州工程学院学报 Vol .25,No .22004年6月 Journal of Zhengzhou Institute of Technology Jun .2004
２００６年第１３卷第６期 化工生产与技术ＣｈｅｍｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ !!!!!!" !" !!!!!!" !" 研究与开发 收稿日期：２００６－１０－１０ 以银杏叶提取物（ＧＢＥ）为原料制成的药物具有清除自由基，防止脑缺血和脑水肿，改善脑功能等多种作用。银杏叶制剂还可用于保健食品和化妆品等［１，２］。银杏叶中黄酮类化合物的提取直接决定着银杏叶的药用价值，因而成为国内外的研究热点。 提取方法最早用水浸提法，此方法具有设备简单、成本低且对环境和人类无毒害的特点，但提取率偏低、杂质含量较高，后处理难度大。有机溶剂法尤其酮、醇提取法是相当经典的方法，比如用丙酮作为提取剂的方法有：（１）丙酮提取－四氯化碳萃取法；（２）丙酮提取－氢氧化铅沉淀法；（３）丙酮提取－氨水沉淀法；（４）丙酮提取－硅藻土过滤法。（１）法工艺产品黄酮含量太低，达不到标准，（２）～（４）法工艺虽然能较好地从银杏叶中提取出有效成分含量较高的提取物，但它们存在着很多缺点。例如，使用了丁酮、四氯化碳等有毒害溶剂等，产品中无法避免这些物质的残留；操作复杂和步骤多，导致ＧＢＥ收率低且最终精制品的质量不够稳定。 随着超临界流体提取技术的迅速发展，应用该技术提取植物中活性成分已越来越广泛，与有机溶剂提取法相比，超临界流体萃取方法具有产品收率高、质量好、有效成分破坏少、无溶剂残留、操作方便等优点。但是超临界流体萃取法设备规模较大、技术要求高、投资大，安全操作要求高，难以用于较大规模的生产。乙醇和丙酮对活性成分提取率相近，但考虑到溶剂的成本和操作的安全性，使用乙醇水溶液比丙酮水溶液更合适。因此采用乙醇－水 为提取剂，对影响浸取的主要因素进行了研究。 １ 实验部分 １．１ 主要材料、试剂及仪器 银杏叶：产于连云港花果山，自采；氢氧化钠、无 水乙醇、硝酸铝、芦丁、亚硝酸钠、二氯甲烷和甲醇，均为分析纯。 ７２３可见分光光度计，ＤＦ－１型集热式磁力搅拌 器，ＲＥ－５２８５Ａ型旋转蒸发器，恒温水浴锅，电热鼓风干燥箱，ＳＨＺ－ＣＤ型循环水式真空泵，等。１．２工艺流程 采用有机溶剂提取法，因为甲醇和丙酮具有毒性，所以采用乙醇－水作为提取剂比较合适［３］。 ＧＢＥ的提取工艺流程如下： 干燥银杏叶→粉碎→浸取→过滤→减压蒸馏→银杏浸膏粗提物→二氯甲烷萃取→减压除去溶剂→干燥→产物。 １．３银杏叶中总黄酮含量的测定 将银杏叶洗净，在低温下烘干至恒重，准确称取 ２ｇ，置于索氏提取器中用甲醇回流提取至提取液无色；提取液经浓缩，并转入５０ｍＬ容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，取１ｍＬ按照标准曲线的作法测定吸光度［４］，水浴温度控制在７５℃左右。 银杏叶中总黄酮的质量分数＝５０×ρ１／ｍ１，ρ１为银杏叶中总黄酮的质量浓度，ｍｇ／ｍＬ；ｍ１为银杏叶质 量，ｍｇ。 本实验中银杏叶中总黄酮的质量分数＝５０×０．７／ 银杏叶中黄酮类化合物的提取工艺研究 朱平华 （淮海工学院化工系，江苏连云港２２２００５） 摘要 对银杏叶中黄酮类化合物的提取工艺进行了研究，通过单因素试验和Ｌ９（３３）正交试 验，研究了浸取温度、乙醇含量和固液质量比对黄酮类化合物提取率的影响。结果显示温度是影响提取率的主要因素，最佳工艺为浸取温度８０℃，乙醇的体积分数为７０％和固液质量比１：７，银杏叶中黄酮类化合物的浸出率可达到９２．３％。关键词 银杏叶；黄酮类化合物；乙醇；提取 中图分类号ＴＱ２３４．２＋１，ＴＱ４６０．６＋１文献标识码Ａ文章编号１００６－６８２９（２００６）０６－００２５－０３ ?２５ ?
银杏叶提取物的作用 【关键词】银杏叶提取物;药理作用;临床应用 银杏叶性甘，味苦、涩、平，归心、肺经，有敛肺、平喘、活血化淤、止痛之功效。银杏叶提取物(Ginkgo Biloba Extract，GBE)主要含有黄酮苷和萜烯酯，黄酮苷主要是山奈酚及槲皮素的葡萄糖苷，萜烯酯主要是银杏内酯和白果内酯[1]，均具有多种药理作用。本文即对GBE在临床中的应用作一综述。 1 中枢神经系统疾病 GBE中的黄酮苷具有扩张脑血管、降低脑血管阻力，降低毛细血管通透性，增加脑血管流量，清除自由基等作用;银杏内酯则是血小板活化因子拮抗剂，能降低血黏度，改善血液流动特性[2]。GBE 在抗脑缺血的作用中，能改善能量代谢障碍和对抗酸中毒，拮抗兴奋性氨基酸(EAA)毒性和自由基损伤，阻止缺血后炎症反应发生，减少神经细胞凋亡，还能明显抑制神经细胞内钙超载，从而减轻缺血缺氧对脑组织的损伤[3]。 1.1 眩晕症戴春富等[4]采用随机对照的方法，选用甲磺酸倍他司汀为对照药，疗程12周，结果研究组患者治疗第12周末眩晕发作频率、持续时间以及眩晕症状总体评分经Wilcoxon秩和检验均明显优于对照组，P值均小于0.05。经12周的治疗，两组患者间治疗总有效率无统计学差异;显效率差异有统计学意义，研究组为44.8%，对照组为1 2.9%。 1.2 帕金森病帕金森病(PD)是一种黑质致密层多巴胺能神经元病变所致的慢性进行性老年变性疾病，临床以震颤、强直、运动迟缓为主要表现。在对银杏叶的基础研究中发现，GBE除了具有扩血管作用、对中枢神经系统缺血缺氧的保护作用、抗自由基作用、抗焦虑及镇静作用外，还有抗帕金森病的作用。刘学文等[5]将帕金森病患者68例分为GBE组36例和对照组32例，治疗组给予 GBE20ml/d静滴，连续2周;2组均给予美多巴125～250mg，2～3次/d，每5～7d调整剂量。2周后2组疗效差异有统计学意义(P<0.05)，GBE组治疗前后Webster评分差异有统计学意义(P<0.05)，这表明GBE 治疗帕金森病有良好疗效，能有效缓解症状，改善患者生活质量。 1.3 脑梗死丁国祥等[6]将132例脑梗死患者随机分为2组。治疗组给舒血宁20ml，脑蛋白注射液60mg,l次/d,静滴，连用14d;对照组单用丹参注射液20ml加人生理盐水250ml中静滴，1次/d,14d 为1疗程。比较治疗前后疗效及血流变指标,治疗组均有明显改善，治疗组总有效率为9 2.64%，对照组总有效率为84.37%，差异有统计学意义(P<0.05)。 1.4 老年痴呆症盛树力[7]使用GBE(120mg/d)和麦角生物碱类(5.9mg/d)及安慰剂对60例轻、中度老年性痴呆进行治疗，每组20例。结果显示GBE和麦角生物碱类都有一定疗效，两组间无统计学差异，安慰剂组无变化。采用随机双盲方法观察GBE(80mg/d，共3个月)对另一组40例老年性痴呆的疗效，经SKT等量表评定发现，治疗组服药1个月后记忆力、注意力比空白对照组有明显改善，其他多项测验也有改善。 2 心血管系统疾病 银杏叶提取物中的总黄酮苷通过抑制缩血管物质内皮素(ET) 发挥体内扩血管作用[8]，银杏苦内酯则具有改善心肌缺血的作用，从而缓解心绞痛，机制可能是通过控制心律不齐和缩减梗死范围来提供对心肌的保护[9]。 武宇洲等[10]将60例老年冠心病患者随机分为GBE治疗组和对照组(给予生理盐水250ml)各30例。治疗组心电图有效率优于对照组(P<0.05)，显示GBE能明显增加老年冠心病患者冠状动脉左前降支舒张期峰值流速、收缩期峰值流速和舒张期时间速度积分(P<0.01);而对照组冠状动脉左前降支血
目录 1、产品简介 2、处方和依据 3、生产工艺流程图和生产环境洁净区域划分 4、制备方法 5、生产操作过程及工艺条件及操作要点 6、工艺卫生管理 7、本产品工艺过程中所需的标准操作规程名称及要求 8、原辅材料、中间产品和成品的质量标准、检验方法、技术参数及贮存注意事项 9、工艺用水的制备、质量标准及质量控制 10、需要进行验证的关键工序及其工艺验证的具体要求 11、原辅材料消耗定额、技术经济指标、产品收率以及各项指标的计算方法 12、设备一览表、主要设备生产能力 13、技术安全、工艺卫生及劳动保护 14、劳动组织、岗位定员与产品周期 15、综合利用与三废处理 16、附页
1、产品简介 【中文名】银杏叶提取物 【汉语拼音】Yinxingye Tiquwu 【性状】本品为浅棕黄色至棕褐色的粉末；味微苦。 【有效期】12个月。 【制剂】银杏叶片 【贮藏】密封，避光。 2. 标准依据 2.1 标准依据 《中国药典》2005年版一部281页。 2.2 原材料质量标准 应符合《中国药典》2005年版一部220页“银杏叶”项下有关各项规定。 2.3 生产批量处方
4、制备方法 取银杏叶，粉碎，用稀乙醇加热回流提取，合并提取液，回收乙醇并浓缩至适量，加于已处理好的大孔吸附树脂柱上，依次用水及不同浓度的乙醇洗脱，收集相应的洗脱液，回收乙醇，喷雾干燥，即得。 5、生产操作过程、工艺技术条件及操作要点 5.1 中药材的前处理 5.1.1 生产指令 由生产技术部下达批生产指令一式四份，质量管理部部长审核、签字，生产厂长批准后执行。批生产指令生产技术部留存一份，其余三份分发至质量管理部一份，作为质量监控与检验依据；物料部一份，作为物料发放依据；生产车间一份，作为生产和物料领取依据。 5.1.2 称量配料 生产车间核算员按照批生产指令，填写领料单，交仓库保管员备料，并同领料员、车间质检员一起到仓库，按“称量配料岗位生产标准操作规程SC/SOP/QC/001-01”进行称量配料、领料，并及时填写生产记录，产品与下一生产工序净制进行交接。 要点：重点核对物料名称、批号、数量、物料放行审核单、称量核对。 5.1.3 前处理依据：《中国药典》2005年版一部（炮制通则）及药材项下的规定、《药材炮制规范》（修订本）。 5.1.4中药材前处理的方法和要求 5.1.4.1净制 按“净制岗位生产标准操作规程SC/SOP/QC/002-01”进行操作。在挑选工作台上手工净制生产，净制完毕及时填写生产记录，并检查中药材收率范围与规定的物料消耗定额核对，填写“物料周转单SC/R/TY/021-01”，产品与下一个生产工序切制进行交接。 要点：（1）除杂、除尘； （2）标志管理：生产状态标志、清洁状态标志、设备状态标志、清场合格证等。 规定收率：≥99%。 5.1.4.2银杏叶前处理要求：净制； 5.1.4.3前处理药材规定的分步收率及总收率参考下表：
银杏叶提取物生产工艺规程 1、产品简介 【中文名】银杏叶提取物 【汉语拼音】Yinxingye Tiquwu 【性状】本品为浅棕黄色至棕褐色的粉末；味微苦。 【有效期】12个月。 【制剂】银杏叶片 【贮藏】密封，避光。 2. 标准依据 2.1 标准依据 《中国药典》2005年版一部281页。 2.2 原材料质量标准 应符合《中国药典》2005年版一部220页“银杏叶”项下有关各项规定。 2.3 生产批量处方
3、生产工艺流程图(包括生产环境洁净区域划分) 三十万级 4、制备方法 取银杏叶，粉碎，用稀乙醇加热回流提取，合并提取液，回收乙醇并浓缩至适量，加于已处理好的大孔吸附树脂柱上，依次用水及不同浓度的乙醇洗脱，收集相应的洗脱液，回收乙醇，喷雾干燥，即得。 5、生产操作过程、工艺技术条件及操作要点 5.1 中药材的前处理 5.1.1 生产指令
由生产技术部下达批生产指令一式四份，质量管理部部长审核、签字，生产厂长批 准后执行。批生产指令生产技术部留存一份，其余三份分发至质量管理部一份，作为质量监控与检验依据；物料部一份，作为物料发放依据；生产车间一份，作为生产和物料领取依据。 5.1.2 称量配料 生产车间核算员按照批生产指令，填写领料单，交仓库保管员备料，并同领料员、车间质检员一起到仓库，按“称量配料岗位生产标准操作规程DXC/001-01”进行称量配料、领料，并及时填写生产记录，产品与下一生产工序净制进行交接。 要点：重点核对物料名称、批号、数量、物料放行审核单、称量核对。 5.1.3 前处理依据：《中国药典》2005年版一部（炮制通则）及药材项下的规定、《药材炮制规范》（修订本）。 5.1.4中药材前处理的方法和要求 5.1.4.1净制 按“净制岗位生产标准操作规程DXC/002-01”进行操作。在挑选工作台上手工净制生产，净制完毕及时填写生产记录，并检查中药材收率范围与规定的物料消耗定额核对，填写“物料周转单DXC/021-01”，产品与下一个生产工序切制进行交接。 要点：（1）除杂、除尘； （2）标志管理：生产状态标志、清洁状态标志、设备状态标志、清场合格
银杏叶黄酮的提取 一、溶剂提取法：国内外使用最广泛的方法，步骤多、周期长、产率低、产品中有机溶剂易残留。溶剂系统主要有乙醇，水溶液、丙酮-水溶液、NaOH-水溶液、NaOH-乙醇等。精提物常在粗提物制备基础上精制，常用液-液提取法、沉淀法和吸附．洗脱法。 以60％丙酮为起始溶剂粗提取，再脱脂、去银杏酚酸等15道工艺制成提取物。NaOH-水溶液提取效果最好，NaOH-乙醇溶液次之，正丁醇萃取水溶液中银杏黄酮苷，获得最佳萃取条件为萃取5 min温度60℃4次，萃取物中黄酮苷含量为57％。V水：V正丙醇=1:25最佳。银杏叶精提物树脂吸附纯化法以石油醚回流提取，再以80％乙醇回流提取，减压浓缩，新型澄清剂沉降，树脂分级吸附，pH值为3—4酸水和酸性25％乙醇洗涤，75％乙醇洗脱，喷雾干燥 将银杏叶洗净，于60℃烘干至恒重，粉碎，过50目筛。称取粉末25 g，置于索氏提取器中恒重，粉碎，过50目筛。称取粉末25 g，置于索氏提取器中加入60％乙醇至250．0 ml，80℃下回流提取3．0 h，蒸馏回收乙醇，并用活性炭脱色，得银杏叶黄酮提取物。乙醇浓度为50％一70％时,提取率随浓度增加提高，当浓度70％时提取率达最大。随水浴温度升高总黄酮提取率快速增加。当温度80℃时提取率达最大。提取时间为三小时为佳。 二、超临界流体萃取法(SFE法)：利用临界或超临界状态的流体及被萃取的物质在不同蒸汽压力下所具有的不同化学亲和力和溶解能力进行分离纯化的操作。最佳萃取实验工艺条件为萃取压力15 MPa、乙醇浓度90％、萃取温度55℃，此时，黄酮类化合物萃取得率较理想. 三、高速逆流色谱技术提取法：是一种不用任何固定载体的液一液分配色谱技术W=70%的乙醇连续循环喷淋逆流6级萃取，m乙醇：m银杏叶=5:1，总萃取时间240min,萃取温度50~55度，萃取率99%以上。 四、微波提取法：微波提取法能对萃取体系中的不同组分进行选择性加热，受溶剂亲和力的限制较小，可供选择的溶剂较多及热效率较高，升温快速均匀，大大缩短了提取时间，提高了萃取效率。以水为介质的条件下，对银杏叶进行微波处理。 工艺流程银杏叶一干燥一粉碎一加入适量氢氧化钙溶液一微波预处理一加入适量碱水一调节pH和硼砂含量→恒温水浴浸提—过滤一定容 通过对提取温度、提取时间、液料比、微波功率、微波时间、解析剂比6个因素进行正交实验，优选得到最佳的萃取工艺条件为：提取温度80℃，提取时间60min，液料比．50：1，微波功率700W，微波时问180s，解析剂比7：l。 五、超声提取法：超声技术应用于天然活性产物的提取，具有速度快、提取率高、节省溶剂、节约能耗、不破坏有效成分的特点。最佳操作条件为超声波频率40kHz处理时间10min、静置时间12 h。以水为介质，在较低温度下 六、酶提取法: 加入淀粉部分水解产物及对葡糖基有转移作用的葡糖苷酶或转糖苷酶，使油溶性或难溶于水或不溶于水的有效成分转移到水溶性苷糖中，既提高了有效成分的提取率，又促进难溶于水或不溶于水的有效成分在体内的吸收. 在常规的醇一水浸提之前用纤维素酶对原料进行酶预处理(酶解时间为2h) 七、分子烙印技术:在极性溶剂中，以丙烯酞胺作功能单体，以强极性化合物槲皮素为模板，
目录 第一章绪论 4 1.1银杏叶功效成分简述 4 1.2 银杏叶主要成分研究情况 4 1.3黄酮类化合物4 （1）组成及结构4 （5）银杏黄酮类化合物的理化性质5 第二章理论分析 6 2.1银杏叶采集分析 6 2.2 提取分析 6 第三章实验仪器及其材料7 第四章实验方法及其过程7 4.1银杏叶采集、干燥7 4.2银杏叶中黄酮等物质的提取7 4.3细菌培养8 4.4制作菌悬液9 4.5提取物的抑菌性检测实验9 第五章实验结果分析10 第六章结论14 银杏叶中黄酮的提取及其抑菌性检测 摘要 银杏是我国的特有植物，又称公孙树。银杏叶为最古老的中生代孑遗植物银杏的干燥叶。银杏有裸子植物活化石之称。据《本草纲目》记载，银杏果具有敛肺平喘、止遗尿、白带的作用。在医药上有很高的利用价值。银杏所含黄酮类成分主要为银杏双黄酮、异银杏双黄酮，去甲基银杏双黄酮，其他还有二萜内酯、银杏内酯A、B、C等，其中黄酮类和二萜内酯类物质具有捕获游离基和抑制血小板活化因子、扩张脑血管、促进血液循环、抗氧化等功能，从而广泛用于治疗冠心病、心绞痛、治疗老年痴呆症和增强记忆功能、防治皮肤病、脱发等多种疾病，随着深入的研究银杏的开发和利用，银杏所特有的医药、经济价值逐步受到重视。银杏叶的提取方法有有机溶剂萃取法、水提取法、碱性稀醇或碱性水提取法、超临界萃取法、超声波提取法、酶法等。本文采用有机溶剂提取黄酮类化合物，结果表明实验证明提取银杏叶黄酮等物质用乙醚3小时提取70℃下2次回流最佳。菌体浓度试验表明当实验用菌体浓度在OD值为0.557，稀释到10-5和10-6比较适合，涂布能够成为单菌落，便于以后进行试验。提取抑菌性试验证明加入0.5ml时对大肠杆菌就有明显抑制作用，其抑菌效果随着提取物浓度的增加而增强，当提取物加入2.0ml时具有完全抑菌效果。 关键词：银杏叶，总黄酮，乙醇，抑菌性检测 第一章绪论 1.1银杏叶功效成分简述 银杏树是目前发现的当今世界上最奇特、对人类贡献最大的植物，特别是银杏叶具有五大成分五大功效，银杏叶将是世界上最有发展前景的中药材，能够治疗世界上很多的疑难杂症：（1）黄酮苷类：对心脑血管疾病，高血脂，高血压，清除氧自由基具有显著的疗效，是目前世界上治疗该类疾病最显著的药物。 （2）银杏内酯A、B、C、M类：是血小板活化因子（PAF）拮抗剂，是银杏叶中最重要的活