实验动物学
肝纤维化动物模型制备
——原理及应用
肝纤维化动物模型制备
——原理及应用[摘要]肝纤维化是威胁人类健康的常见疾病，是各种慢性肝病最重要的病理基
础，也是原发性肝癌的发病危险因素之一。它是肝损伤后的修复反应，涉及一系列复杂的分子及细胞机制，如何制备与人类肝纤维化相似的动物模型，不仅是深入研究肝纤维化及肝硬化发病机制的重要基础。也是筛选防治药物的有效手段。本文重点讨论制备大鼠纤维化动物模型的不同研究方法及原理。并评述了CCL4模型的优缺点与应用范围。不同造模方法制备的肝纤维化动物模型各具特点，选择最为合适的动物模型。
[关键词]: 肝纤维化; 肝硬化；动物模型;优缺点
肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理过程，是向肝硬化发展的中间阶段。制作和选择肝纤维化动物模型，是防治肝纤维化研究的基础之一。肝纤维化研究是当今医学研究领域的热点难点之一,该病涉及到诸多复杂的致病因素及细胞功能和分子机制。。研究表明，肝纤维化这个阶段是可逆转的，因此，阻断肝纤维化已成为目前肝病研究的热点之一。然而建立一个能反映人肝纤维化的动物模型一直是科学研究中的难点，建立一个能反映人肝纤维化的动物模型应该考虑到许多
方面，构建一种稳定、可复制、便捷和仿真性强的肝硬化动物模型是研究的必要条件。近年来, 肝纤维化动物模型研究取得了可喜的进展。现将目前常用的造模方法及其原理、特点与应用范围进行归纳。综述如下。
1. 以 CCl4为主诱导的肝纤维化动物模型。
此法多用于研究肝纤维化发生机制、血清学标志物与组织病理的相关性及抗纤维化药物的筛选。四氯化碳(ccl4)进入动物体内后，可直接进入肝细胞，经线粒体单加氧酶(P4502E1)系统代谢，代谢过程中产生三氯甲基和二氯甲基过氧化物。这些自由基启动脂质过氧化反应，使细胞及细胞器膜性结构严重破坏，造成肝细胞变性、坏死。长期给予ccl4可造成肝纤维化、肝硬化。通过四氯化碳制备肝纤维化模型的途径有口服、腹腔注射、皮下注射。其形成肝纤维化的时间依据大鼠种系、给药途径、用药剂量的不同而有差别。
1.1 单因素诱导性肝硬化模型
目前．单因素CCl4诱导制备CM的主要途径包括皮下注射、腹腔注射和口服灌胃等。通常多采用30％～60％CCl。油剂皮下注射的方法．剂量因动物种类而不同．一般小鼠为l一3 ml／kg(体重)。大鼠为3～5 ml／kg，每周2次，通常12～15周即可成模。该方法虽操作简便，但CCl4。经皮下注射很快即被机体吸收进入循环系统。脑、肾毒性较大。注射位置易发生浸润性脓肿和溃疡。死亡率可高达30％～40％。CCL4腹腔内注射时，经门静脉系统吸收的浓度较皮下注射高，使肝硬化形成时间短，而较少的毒副反应使死亡率降至20％一35％日。CCL4灌胃的吸收和代谢途径类似于腹腔注射．经门静脉系统进入肝实质，其刺激较少和生理模拟性更佳，用中等剂量。CCL4制备小鼠CM时．灌胃诱导的速度优于腹腔注射．且二者在生存曲线上并无特异差别。
12～15周后，可以观察到大鼠一般状况：大鼠随着给药时间延长活动逐渐减少,精神萎糜,毛发蓬乱无光泽,常钻入垫；卷缩而卧,饮食量减少,至实验末时体重较原体重均有所增长；肝脏病理变化：大鼠肝脏明显肿大，肝包膜紧张，边缘钝，黄棕色，质硬。切面可见岛状结节。镜下大鼠肝脏小叶间结缔组织明显增多，出现由再生肝细胞形成的假小叶，其中有坏死细胞和气球样变细胞，中央静脉壁和汇管区的血管壁纤维有较明显的增生。透射电镜显示，肝星形细胞内的脂滴明显减少，细胞周围大量胶原沉积，星形细胞周围有胶原纤维形成。VON Gieson染色显示大量纤维间隔形成，纤维间隔分割包绕肝组织形成假小叶。给药30 d 后,大鼠肝脏出现少量纤维组织生;60 d 时,所检大鼠中,有部分呈现少量至中等纤维组织增生;90 d 时,所检大鼠中会出现全部呈中等至大量纤维组织增生。上述提示肝纤维化造模成功。
单因素CCl4诱导CM时．机制明确、效果肯定、重复性佳、剂量可控性强，常用于模拟暴发性肝功能衰竭、肝细胞脂肪样变所致的肝硬化．然而较高的死亡率和多器官毒副反应限制了其在肝纤维化和慢性肝硬化病理发展机制研究中的应用。CCl4法的优点是：在病理生理学方面与人类肝纤维化和肝硬化的某些方面相类似，如-二者均有肝细胞坏死后的再生，肝硬化晚期纤维的浸润儿乎不可逆：肝纤维化病程进展和病变特征稳定，重复性好；具有造模简便、费用低廉、耗时短的优点。此方法可应用于体内研究肝纤维化发生的细胞及分子机制、血清学标志物与组织病理的相关性以及抗纤维化药物的筛选。缺点：对于相同的CCl4处理，肝纤维化的程度个体差异较大，而导致不一致的组织学利病理生理学表现。CCl4
的肝毒性作用迅速而剧烈，若剂量掌握不当，死亡率很高；停止给药后，大鼠肝纤维化有自然恢复的倾向。该模型的原始启动机制显然是毒性化学物质对肝脏的损伤作用, 比较适合药物性肝炎方面的研究, 但其能否准确反应病原微生物感染人体后导致肝纤维化的机理尚待进一步探讨。
1.2复合因素诱导性肝硬化模型。
鉴于单因素制备的周期长，成模比例低，有不少学者采用CC14复合因素致肝纤维化模型，此种模型可靠且复制时间短，肝纤维化进展稳定，适合于以引起肝细胞损伤为始动机制的肝硬化发生发展过程的动态研究。此外，此模型可以观察到动物肝纤维化过程中糖、脂肪、蛋白质、色素等方面的代谢障碍，以及迅速出现的营养不良、脂肪变性、肝纤维等形态学改变。
① CC4+苯巴比妥联合造模：添加苯巴比妥可缩短造模时间，8一10周可形成肝硬化，但死亡率高达40％。原理为苯巴比妥诱导肝内混合功能氧化酶，增加细胞色素P450活性，加速ccl4向CCl3，转化从而增加ccL4肝毒性。方法为分别给大鼠口服CCL4,辅以苯巴比妥为唯一饮用水的方法建立肝纤维化动物模型，苯巴比妥的浓度分别采用0．05 mg／mL，其作用为诱导肝酶的活性，增加肝组织对ccL4的敏感性。Krahenbuhl制备模型时,CCl4首次用量为O．05 mL／kg，以后每周2次，每次用量以前次用量引起体重变化减少6％。9％为指标来决定，第5周时用量为(220±20)uL／只，第lO周为(220±40)uL／只，其建模时间10周时，结果显示肝脏表面可见结节形成．实质变致密，镜检可见在结节周围有少量纤维组织沉积，同时伴有脾大、慢性门脉高压表现。添加乙醇能诱导P450活性从而增加ccl4的肝毒性，在乙醇的致肝脂肪变作用下使用ccl4能加速肝细胞坏死，造模时间明显缩短，同时可减小两者剂量以降低药物副反应与动物的不耐受现象。吴盂超报道在小鼠使用该方法60d即可致成肝硬化．肝硬化稳定，分期明显，动物死亡率低。
②CCl4+乙醇复合高脂肪饮食为主诱导的肝硬化模型：用高脂低蛋白食物，30％酒精为唯一饮料，皮下注射CCL4,(第1次用5mL／kg，以后每隔3d皮下注射40％cCL4油剂(3mL／kg)，第6周末即可形成肝硬化。该方法简单、成功率高(100％)，且死亡率低(20％)。肝硬化形成后饲料中加入2％的氯化钠可制作肝硬化腹水模型。ccL4,是复合因素中的决定因素，单纯玉米面仅能供给所需蛋白质的一半，并属于低胆碱饮食，饮酒可增加对胆碱的需求量，均可促进肝脂肪变性，使肝细胞对CCA 更敏感，这一模型目前已被广泛采用，具有简便易行、价廉及病变典型等优点。该CM分期明确，在第l、2周以肝细胞变性坏死为主，第3、4周以弥漫性纤维增生为其特征，第5、6周，纤维间隔、结节与假小叶形成。因其分期明显，该模型有助于研究外在因素对肝硬化进程的干预作用。该方法用于小型动物较多，大型动物的尝试较少，与人肝炎肝硬化仍有差距。有助于研究外在因素对肝硬化进程的干预作用。该方法用于小型动物较多，大型动物的尝试较少，与人肝炎肝硬化仍有差距。
2.二甲基亚硝胺(DMN)法
DMN具有肝毒性、基因毒性和免疫毒性。大鼠染毒后肝内小叶炎性细胞浸润，出血性坏死。在肝内形成中心一中心纤维间隔或中心一门脉性纤维问隔。George 等给大鼠腹腔每周注射DMNA三次，处理3周，结果17d即可见中心肝小叶坏死及嗜中性细胞浸润，21d可见胶原纤维沉积、局部脂肪变、胆管增生、中央静脉周围纤维沉积，此模型与人类肝硬化早期改变及胶原纤维沉积相似，可作为筛选抗纤维
化药物的方便模型。王海燕等用SD大鼠按10 mg／kg的剂量，给予1％DMN生理盐水稀释液，腹腔注射10次，模型组大鼠均形成肝纤维化或早期肝硬化。纤维化程度在2～4期之间。该模型造模周期短，大鼠死亡率低，肝纤维化形成也相对稳定。在评价药物对伴凝血障碍、纤溶亢进的慢性肝病致纤维化的防治方面是一个比较理想的模型。缺点是小剂量不易形成肝纤维化，大剂量又容易形成肝细胞坏死后纤维化，剂量不容易掌握。
3.乙醇肝纤维化模型
通常慢性酒精中毒可引起肝脏的4种序贯性损伤．即脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纤维化和酒精性肝硬化。肝脏是乙醇代谢的主要场所，乙醇的中间代谢产物乙醛是高度反应活性分子，能与蛋白质结合形成乙醛一蛋白加和物，后者不但对肝细胞有直接损伤作用，而且可以作为新抗原诱导细胞及体液免疫反应，导致肝细胞受免疫反应的攻击。Tsul(amoto．French大鼠持续灌注法是较为通用的酒精性肝病造模方法。酒精持续灌注的方法虽然先进且避免了给动物灌胃的麻烦，但是国内没有生产胃灌注装置，而国外的产品价格难以接
受，国内多采用灌胃法。酒精引起肝纤维化的主要机制是酒精中间代谢产物乙醛对肝脏产生直接损害，其在肝脏使辅酶I(NAD)转变为还原性辅酶I(NADH)，从而其比值下降，而NDA／NADH比例下降使j致酸循环受抑制，进而脂肪氧化减弱，肝内脂肪酸合成增多。当其增多超过肝脏的处理能力就形成脂肪肝，最终形成肝纤维化。河福金等在大鼠常规喂养同时灌入酒精、橄榄油等的混合液．4周后可见肝小叶中央区明显坏死或呈局限性坏死、点状坏死，间质可见炎性浸润，电镜下可见肝细胞周围胶原纤维增生，此类模型依其处于不同的时期可作酒精性脂肪肝及肝纤维化的研究。
4. 血清免疫法建立肝硬化模型
造模方法是用异种血清或蛋白对大鼠进行皮下、腹腔或尾静脉注射。人或牛血清白蛋白直接经静脉注射，可引起过敏性休克，动物死亡率较高，加用前列腺素El可以降低动物死亡率而不影响肝纤维化形成的时间和程度。猪血清法操作简便，周期较短，成功率高，结果稳定，纤维化一旦出现不易改变，在研究肝纤维化产生机制和筛选抗纤维化药物方面有一定优势。用异种血清制品建立肝硬化，其主要原理是异种的血清进入体内引发机体免疫应答反应，在肝脏主要是在肝脉汇管区形成免疫复合物沉积，由沉积的免疫复合物引起局部炎性反应，进一步刺激胶原增生而造成肝组织纤维化。
4. 1 异源血清法目前常使用的异种血清有牛血清，血吸虫血清、猪血清等。其中牛血清白蛋白免疫损伤所致的肝纤维化，与临床上的慢性肝炎所致的肝纤维化在发病机制上更加接近。这些免疫损伤性模型与人类肝纤维化形成近似，属主动性纤维化，符合人的肝炎后纤维化的形成机制，但因没有病毒持续复制和肝实质持续损伤的过程，与人肝纤维化相比仍有较大的差距。
4．2 人血清白蛋白法李培建等将人血清白蛋白用生理盐水稀释，用等量的不完全福氏佐剂乳化，每只大鼠皮下多点注射，每次注射白蛋白4 mg，共4次，然后尾静脉注射白蛋白进行免疫攻击。该方法所造的动物模型肝细胞损伤较轻，无碎屑状或桥状坏死，有别于肝炎后肝硬化。
4. 3刀豆素蛋白A法小鼠经静脉注射植物凝集素刀豆素蛋白A(concanavalin
A，Con A)后，可以引起T细胞介导的急性肝损伤[26I。李鸿立等将小鼠经尾静脉注射12．5 mg／kg剂量的1 mol／L刀豆素蛋白A，每周1次，连续6周。与其他肝纤维化动物模型相比较，Con A诱导的肝纤维化模型的方法成功率较高，动物死亡率较低，方法简便易行。
5.胆汁淤积性肝纤维化
原理是通过切断胆管或注入硬化剂等方法人为地造成肝外胆道梗阻，从而引起梗阻部位以上肝管扩张、胆汁淤积，胆道内压力增高，并可引发肝内胆小管裂，胆汁中的胆红素和一部分胆汁酸可使线粒体受损，能量生成障碍、自由基产生、Ca+进入细胞内等，导致肝细胞的溶解、坏死。国外文献报道，大鼠胆管内逆行性注入N一丁基一2一氰基丙烯酸盐加胆管结扎导致胆管阻塞，可建立胆管阻塞性纤维化模型。胆管阻塞性肝纤维化模型ALT、AST、HA、LN均明显升高；病理组织学可见弥浸增生的胆小管，大量的胶原沉积在胆小管周围，肝细胞与增生的胆小管相比明显减少。Shen等采用胆总管双重结扎的方法制备肿纤维化模型，即在肝管汇合处及胰管汇处的上方分别结扎，然后在两个线结间完全剪断胆总管。4周时血清胆红素达到最高水平保持稳定，病理组织学检查发现，2周时可见胆管细胞增生，4周时月日管细胞增生更加明显，并伴有肝组织结构的变形，6周时肝内假小叶形成。顾小红等在胆管结扎人鼠肝纤维化模型中成功分离培养肝星状细胞(HSC)，对丁研究肝纤维化形成中的关键环节一HSC的活化，增殖和胶原合成机制的研究提供了便利条件。该模型的原理与发生在人体的继发性胆源性肝硬化的机制相吻合。造模方法操作简单、周期短、阳性率高、自发逆转率低。此模型的特点是在无炎症及坏死的情况下发生进行性肝纤维化, 与人类小结节性肝硬化的生化及组织学变化十分相似, 被认为是一种能模拟人肝纤维化比较理想的动物模型, 主要用于考察药物的直接抗纤维化作用及肝脏血液动力学研究。该模型存在的问题造模动物胆汁过度淤积, 高死亡率, 以及胆管再通, 组织学发生逆转。
6. 肝纤维化动物模型展望
科研过程中选择一个与人类疾病特征相似的动物模型是最为重要的, 它是科研工作能否成功以及有无科研价值最起码的基础之一。理想的肝纤维化模型病理改变呈阶段性，具有可逆与不可逆的阶段性演进过程，与人类疾病所致纤维化的形态特点一样，模型动物的表现符合中医“证”的特征，且造模方法简单，模型形成率高，重现性好。因为肝纤维化的病因多样性、以及动物与人种属差异, 理想的肝纤维化动物模型的建立是临床研究和实验研究中的一个难点, 尚需进一步深入研究.迄今为止, 能完全反应人类肝纤维化的动物模型尚未完全取得成功。这就要求科研工作者充分了解各种类型模型的特点,在前人实验基础上积极探索,寻找理想的肝硬化动物模型, 并在具体工作中充分考虑肝纤维化形成过程中的病因和机制、人与动物的物种差异、造模动物的自然恢复率等多种因素, 选择最为合适的动物模型。
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二十种常见实验动物模型 一、缺铁性贫血动物模型 缺铁性贫血（iron deficiency anemia，IDA）是体内用来合成血红蛋白（HGB）的贮存铁缺乏，HGB合成减少而导致的小细胞低色素性贫血，主要发生于以下情况：（1）铁需求增加而摄入不足，见于饮食中缺铁的婴幼儿、青少年、孕妇和哺乳期妇女。（2）铁吸收不良，见于胃酸缺乏、小肠粘膜病变、肠道功能紊乱、胃空肠吻合术后以及服用抗酸和H2受体及抗剂等药物等情况。（3）铁丢失过多，见于反复多次小量失血，如钩虫病、月经量过多等。 IDA是一种多发性疾病，据报道，在多数发展中国家，约2/3的儿童和育龄妇女缺铁，其中1/3患IDA，因此，研究IDA的预防和治疗具有重要的意义。在这些研究中，缺铁性贫血的动物模型（Animal model of IDA），又是实施研究的基础工具。常见的IDA动物模型的构建技术如下： 实验动物：一般选用SD大鼠，4周龄，雌雄不拘，体重65g左右，HGB≥130g/L。 建模方法：低铁饲料加多次少量放血法。低铁饲料一般参照AOAC 配方配制，采用EDTA浸泡处理以去除饲料中的铁，饲料中的含铁量是诱导SD大鼠形成缺铁性贫血模型的关键，现有研究表明，饲喂含铁量<15.63mg/Kg的饲料35天，SD大鼠出现典型IDA表现，而饲喂
含铁40.30mg/Kg的饲料SD大鼠出现缺铁，但并不表现贫血症状。建模时一般采用去离子水作为动物饮水，以排除饮水中铁离子的影响。少量多次放血主要用于模拟反复多次小量失血导致的铁丢失，还可以加速贫血的形成。放血一般在低铁饲料饲喂2周后进行，常用尾静脉放血法，1～1.5ml/次，2次/周。 模型指标：（1）HGB≤100g/L；（2）血象：红细胞体积较正常红细胞偏小，大小不一，中心淡染区扩大，MCV减小、MCHC降低；（3）血清铁（SI）降低，常小于10μmol/L，血清总铁结合力（TIBC）增高，常大于60μmol/L。 需要指出的是，以上模型不能用于铁吸收不良相关IDA的防治研究。根据具体的研究需要，也可以适当调整建模方法。 二、白血病动物模型 用免疫耐受性强的人类胎儿骨片植入重症联合免疫缺陷病(SCID)小鼠皮下，出于人类造血细胞与造血微环境均植入小鼠，建立具有人类造血功能的SCID小鼠模型称为SCID－hu小鼠。再将髓系白血病患者的骨髓细胞植入SCID－hu小鼠皮下的人类胎儿骨片内，植入的髓系白血病细胞选择性生长在SCID－hu小鼠体内的人类造血微环境中，即为人类髓系白血病的小鼠模型。SCID小鼠是由于其scid所致。T、B淋巴细胞功能联合缺陷，这种小鼠能接受人类器官移植物。 造模方法：
组织研磨管的使用方法 1.作用：只适用于蛋白提取、RNA提取、基因组DNA提取时的组 织裂解，不做他用； 2.组织研磨管：容量为1.5ml, 里面已经提前放置了研磨珠（有时也 不放置），研磨液（Trizol或RIPA裂解液，有时也不放置）一般在取回后才加入，如果已经加入了研磨液，请离心后才拧开管盖，以免研磨液溢出，对皮肤造成伤害，所以操作时，要小心注意！ 3.组织：把收取的组织分切，用生理盐水或PBS缓冲液把分切的组 织上的血液漂洗干净，然后用医用纱布或滤纸把组织表面的水分吸干，然后放入研磨管（组织体积大小为1颗绿豆至2颗黄豆，根据实际情况决定）中，然后把放入的组织尽量剪碎； 4.存放：上述过程应尽量在最短的时间内操作完毕，立即用液氮冻 结，然后置于液氮或-80℃保存； 5.操作事项：操作时间尽可能短，做好一个，立马放置一个；
实验方法总结（3）：动物模型部分 1、研究肿瘤细胞增殖 (2) 2、研究肿瘤细胞转移 (3) 2.1. 体外(浸润模型) (3) 2.2. 体内(转移模型) (3) 3、研究肿瘤细胞耐药 (5) 3.1. 耐药细胞株的建立 (5) 3.2. 裸鼠移植瘤耐药模型的建立 (6) 从肿瘤起源分，肿瘤动物模型的分类如下： 从研究目的来分，可以从增殖、转移、耐药三个角度来分析： 1、研究肿瘤细胞增殖 细胞准备：GeneA敲减慢病毒感染细胞扩增至需要的细胞量。分为：空白对照组、阴性对照组、实验组。 取Balb/c裸鼠，雄性，6周龄，每组10只，适应一周后进行肿瘤细胞注射。
XXX细胞消化离心后制成单细胞悬液，计数后取适量的细胞用PBS悬浮，在Balb/c裸鼠侧腹部皮下接种。每只接种2×106个细胞，注射体积为100 μL。此后，每隔5天测量注射部位肿瘤的体积。30天后裸鼠小鼠腹腔注射80 mg/kg 戊巴比妥钠，小鼠麻醉后置蓝色背景布上拍照（侧卧位，接种部位朝上），小鼠颈椎脱臼处死，取出肿瘤称重，将肿瘤置蓝色背景布上拍照，肿瘤一分为二，一份4%多聚甲醛固定，待后续病理分析，一份-80℃冻存。 2、研究肿瘤细胞转移 肿瘤转移的模型包括两大类：体外(浸润模型)和体内(转移模型)。体外(浸润模型)：了解肿瘤细胞对周围相连组织的侵润性。体内模型主要研究肿瘤细胞的转移性即肿瘤细胞在远端组织形成病灶的能力。 2.1. 体外(浸润模型) 例：浸润型脑胶质瘤动物模型的建立 方法：取若干只Balb/c免疫缺陷裸鼠，将分离和鉴定并转染携带绿色荧光蛋白的脑胶质瘤干细胞立体定向法行小鼠颅内接种，每组10只。小鼠麻醉后头部正中切口，剥离骨膜后钻孔(坐标是冠状缝后0.5 cm，矢状缝右侧2.5 cm) 。取2 μL胶质瘤干细胞以1×104 cells /只小鼠的剂量，经微量注射器缓慢注射入鼠脑纹状体内(深度是2.5 ～3 mm) 。在确定的时间点处死一部分动物进行荧光( 立体荧光显微镜下) 病理证实和比较，同时检查脑胶质瘤干细胞的体内生长特征以及干细胞标志物等。 2.2. 体内(转移模型)
我是学药剂的，现想做某一制剂的药效学研究。 主要是用于治疗肝癌或乙肝。 请问各位大侠这两个适应症的动物模型应该怎样选择或是怎么造模？ 谢谢！ 筛药效时，可用小鼠肝癌（H22），动物可选择小鼠,造模方法：细胞复苏后，计数，调整浓度为1×105/ml，每只小鼠腋下接种0.2ml，接种24小时后给药，连续给药10天。最后一次给药后24小时，杀鼠取瘤。计算抑瘤率。 谢谢dianzhuo 不知你指的小鼠是小裸鼠吗？若不是裸鼠，那这样接种就是同种移植 这样的模型与人的肝癌就有比较大的区别，这样作出来的结果可行度有多大啊？ 另外，除抑瘤率外，一般还有哪些指标可用来评价？ 谢谢？ 可先用小鼠肝癌（H22），再用人肝癌(Bel-7402)/裸鼠，观察瘤重，抑瘤率，体重，动物一般状况，肿瘤生长曲线，有效还可做其他指标。 谢谢版主！ 作这些指标要用到试剂盒吗？若要一般用哪些？价钱如何（因经费有限）？ 这种药有前辈们做了bel-7402,HepG2,肝星状等细胞的研究。 我现在做的是这种药的制剂的药效，若直接用人肝癌(Bel-7402)/裸鼠，有什么不妥？ 我的剂量设计可否利用他们细胞实验的结果？若可以，怎样换算(由mg/l换算到mg/kg)？ 人肝癌(Bel-7402)/裸鼠模型，是临时造的，还是有现成的这样的模型卖？ 若自己造，一般要多长时间才可造成？评价造模成功的指标一般有哪些？ 谢谢!!! 我是学临床医学的，看了你的帖子，有点感想。 前段时间有幸参加聆听一名学者的开题报告，他本人也不是医学出身，我听了他的报告的第一句话，就很迷惑，因为他的第一句话就犯了一个医学上的概念上的错误。今天看了你的帖子，也有同样的感觉。请问一下，你的那个制剂是用来治疗肝癌的，还是用来治疗乙肝的，因为我觉得这两个病种的病因，病理都是有区别的，你的那个制剂无疑是个中药制剂，请你先确定一下制剂的适应证先。个人认为，还没有那个药物可以牛到同时治疗肝癌和乙肝。 那药物是对肝癌方面，有体外细胞实验的研究的报道，结果还是蛮好的。 对乙肝方面，在抗病毒方面的报道没有，我对此也没信心，但保肝降酶，促进肝细胞再生的报道较多。 若做乙肝方面的药效，选一些肝损伤的模型（四氯化碳，D－半乳糖胺等损伤的模型），若结果为阳性，那么结论只能是该药物有保肝降酶，抗肝纤维化。对治疗乙肝来说，它是治标不治本，只是辅助治疗药物。这样的理解有问题吗？ 另外，做治疗乙肝的药物，是不是都要做抗病毒实验。若不做或做了之后是阴性结果，再做别的乙肝方面的模型，最好的结果也只是该药是治疗乙肝的辅助药物。这样理解正确吗？ 体外细胞实验的数据，对剂量设计有什么帮助或参考价值？若有，该从哪些方面去考虑？ 谢谢！
第章实验动物模型 第一节实验动物选择的原则 第二节生物科学研究中的动物模型
实验动物模型 选择什么样的实验动物作实验是生物医学研究工作中一个重要环节，不能随便选用一种实验动物来作科学研究，因为在不适当的动物身上进行实验，常可导致实验结果的不可靠，甚至使整个实验徒劳无功，直接关系到科学研究的成败和质量。事实上，每一项科学实验都有其最适宜的实验动物。
第一节实验动物选择的原则 ?科学研究工作中实验动物的选择，首先应根据实验目的和要求来选择，其次再参考是否容易获得、是否经济，是否容易饲养和管理等情况。 ?在实验动物选择上必须注意三点，即实验动物的种类（Species）；品种（Breed）或品系（Strain）；质量和实验动物的健康状态。
尽量选择与研究对象的机能、代谢、结构及疾病特点相似的实验动物； ?生物医学研究的根本目的是要解决人类疾病的预防和治疗问题。因此，在选择实验动物时应优先考虑的问题是动物的种系发展阶段。在可能的条件下，尽量选择那些机能、代谢、结构和人类相似的实验动物作实验。一般来说，实验动物愈高等，进化愈高，其机能、代谢、结构愈复杂，反应就愈接近人类，猴、狒狒、猩猩、长臂猿等灵长类动物是最近似于人类的理想动物。
第二节生物科学研究中的动物模型 一、动物模型的意义和优越性 ?生物科学研究的进展常常依赖于使用动物模型作为实验假说和临床假说二者的试验基础。人类各种疾病的发生发展是十分复杂的，要深入探讨其疾病的发病机理及疗效机理不能也不应该在病人身上进行。可以通过对动物各种疾病和生命现象的研究，进而推用到人类，探索人类生命的奥秘，以控制人类的疾病的衰老，延长人类的寿命。
心理科学进展 2008，16（3）：371~377 Advances in Psychological Science 371 创伤后应激障碍的动物模型及其神经生物学机制* 安献丽 郑希耕 （中国科学院心理研究所心理健康院重点实验室，北京 100101） 摘 要 创伤后应激障碍是指个体由于经历对生命具有威胁的事件或严重的创伤，导致症状长期持续的精神障碍。研究创伤后应激障碍的主要动物模型为条件性恐惧和应激敏感化模型。研究表明，创伤后应激障碍中长时程留存的恐惧性记忆、高唤醒等症状与大脑杏仁核、内侧前额叶皮层和海马三个脑区及下丘脑-垂体-肾上腺轴负反馈功能增强密切相关。其中杏仁核活动增强是条件性恐惧记忆获得、保持和表达的关键神经基础。内侧前额叶皮层对杏仁核的去抑制及海马向杏仁核传递的威胁性环境信息，促进创伤后应激障碍症状的出现。在经历创伤应激后糖皮质激素受体的上调及多巴胺活动的增强是创伤后应激障碍产生的主要神经基础。对创伤后应激障碍的药物治疗研究证明多巴胺D2受体在改善患者症状中的作用比较重要，但仍需作更深入的探索。 关键词 创伤后应激障碍，恐惧条件化，敏感化，多巴胺，下丘脑-垂体-肾上腺轴。 分类号 B845 1 前言 创伤后应激障碍（posttraumatic stress disorder ，PTSD ）是指个体由于经历对生命具有威胁的事件或严重的创伤，导致系列精神症状长期持续的精神障碍。美国精神障碍诊断统计分类手册-第四版（DSM-Ⅳ）将PTSD 归在焦虑障碍中，并将其分为三种类型：急性（症状持续小于3个月）、慢性（症状至少持续3个月）、伴延迟起病（症状在应激后至少6个月才出现）。PTSD 症状主要表现为对创伤事件的病理性重现（re-experiencing ）、对创伤相关线索的回避（avoidance ）、持续性的高唤醒（hyperarousal ），以及对创伤经历的选择性遗忘和情感麻木（emotional numbing ），患者因此而感到痛苦不堪。PTSD 症状一般在遭受创伤后数日甚至数月后出现，病程可长达数年。PTSD 动物模型研究发现经过创伤应激处理后的动物在生理和行为上表现出与PTSD 患者很强的相似性，表现在下丘脑-垂体-肾上腺轴系统（hypothalamic-pituitary-adrenal axis, HPA axis ）负反馈抑制增加、听觉惊吓反应（acoustic startle response ，ASR ）增强、条件性恐惧反应（conditioned 收稿日期：2007-12-31 ? 国家自然科学基金（30470578，30770722）资助。 通讯作者：郑希耕，E-mail: zhengxg@https://www.doczj.com/doc/a411840481.html, 电话：（010）64877528；传真：（010）64872070 fear response ）持续保存、空间记忆受损等。其中多巴胺（DA ）和糖皮质激素系统对这些症状具有重要的影响。 2 PTSD 相关动物模型 PTSD 动物模型主要是通过给予动物严重的创伤应激，测试动物行为和生理的变化，这种变化是应激强度（剂量）依赖的，并可持续较长时间或随时间逐渐增强。研究主要集中于联想性学习的恐惧条件化过程（fear conditioning ）和非联想性学习形成的敏感化行为（sensitization ）。这是两种不同的学习过程，前者与创伤记忆相联结，表现为病理性重现、回避和对创伤线索的高度警觉反应等症状；后者则与创伤记忆没有直接联结，主要表现为高唤醒、易激惹、惊吓反应增强、情感麻木及社会退缩等症状，二者具有不同的神经生物学基础。由于PTSD 是由系列精神症状构成的临床实体，在基础研究中，研究者一般通过单一动物行为模型探索某个“单一”症状的神经生物学机制，其中研究最多的是条件性恐惧记忆模型及敏感化模型的特异性的脑机制。 2.1 PTSD 条件性恐惧动物模型 条件性恐惧是模拟PTSD 防御性回避行为的一种动物模型，鉴于在这种模型下创伤事件和无关“中性”刺激之间有紧密的条件性联系，因此此模型又
实验方法总结：动物模型部分 1、研究肿瘤细胞增殖 (1) 2、研究肿瘤细胞转移 (2) 2.1. 体外(浸润模型) (2) 2.2. 体内(转移模型) (2) 3、研究肿瘤细胞耐药 (4) 3.1. 耐药细胞株的建立 (4) 3.2. 裸鼠移植瘤耐药模型的建立 (5) 从肿瘤起源分，肿瘤动物模型的分类如下： 从研究目的来分，可以从增殖、转移、耐药三个角度来分析： 1、研究肿瘤细胞增殖 细胞准备：GeneA敲减慢病毒感染细胞扩增至需要的细胞量。分为：空白对照组、阴性对照组、实验组。 取Balb/c裸鼠，雄性，6周龄，每组10只，适应一周后进行肿瘤细胞注射。
XXX细胞消化离心后制成单细胞悬液，计数后取适量的细胞用PBS悬浮，在Balb/c裸鼠侧腹部皮下接种。每只接种2×106个细胞，注射体积为100 μL。此后，每隔5天测量注射部位肿瘤的体积。30天后裸鼠小鼠腹腔注射80 mg/kg 戊巴比妥钠，小鼠麻醉后置蓝色背景布上拍照（侧卧位，接种部位朝上），小鼠颈椎脱臼处死，取出肿瘤称重，将肿瘤置蓝色背景布上拍照，肿瘤一分为二，一份4%多聚甲醛固定，待后续病理分析，一份-80℃冻存。 2、研究肿瘤细胞转移 肿瘤转移的模型包括两大类：体外(浸润模型)和体内(转移模型)。体外(浸润模型)：了解肿瘤细胞对周围相连组织的侵润性。体内模型主要研究肿瘤细胞的转移性即肿瘤细胞在远端组织形成病灶的能力。 2.1. 体外(浸润模型) 例：浸润型脑胶质瘤动物模型的建立 方法：取若干只Balb/c免疫缺陷裸鼠，将分离和鉴定并转染携带绿色荧光蛋白的脑胶质瘤干细胞立体定向法行小鼠颅内接种，每组10只。小鼠麻醉后头部正中切口，剥离骨膜后钻孔(坐标是冠状缝后0.5 cm，矢状缝右侧2.5 cm) 。取2 μL胶质瘤干细胞以1×104 cells /只小鼠的剂量，经微量注射器缓慢注射入鼠脑纹状体内(深度是2.5 ～3 mm) 。在确定的时间点处死一部分动物进行荧光( 立体荧光显微镜下) 病理证实和比较，同时检查脑胶质瘤干细胞的体内生长特征以及干细胞标志物等。 2.2. 体内(转移模型)
肿瘤动物模型的构建——白血病篇 导读白血病( Leukemia )是一种常见的恶性血液疾病，俗称血癌。据统计，白血病是儿童恶性肿瘤的头号原因，在儿童及35 岁以下成人中发病率位居第一[1] 。同时也是十大恶性肿瘤之一。目前，白血病具体的发病原因至今尚未研究透彻，因此建立合适的白血病动物模型，对于白血病发病机制及药物研发具有重要意义。本期为大家综述了白血病的基本情况及小鼠模型的分类、建立方法和应用。 第一章：白血病基本常识白血病是常见液体瘤白血病是常见的液体瘤，与结肠癌、肝癌等实体瘤不同的是，它是造血干细胞的异常分化和过度增殖导致，因此肿瘤细胞会遍布全身，会侵犯身体的每个脏器，造成全身衰竭。造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，具有长期自我更新和分化成各类成熟血细胞的能力。如下图为造血干细胞可分类形成各种血细胞，如红细胞、血小板和白细胞：造血干细胞分化成各类血细胞(图片来自https://www.doczj.com/doc/a411840481.html, 网站) 白血病致病因素有哪些呢？ 现阶段认为白血病的发病因素：化学因素、电离辐射、药物、毒物、病毒、遗传因素等有关。 白血病主要分为四类 根据白血病细胞的成熟程度和自然病程，白血病可分为急性
和慢性两大类，临床上，白血病共分为四大类：急性髓系白 血病（AML ）、急性淋巴细胞白血病（ALL ）、慢性髓系白血病（CML ）和慢性淋巴细胞白血病（CLL ）。儿童白血病90% 以上是急性的，其中急性白血病中70% ～80%是ALL。第二章：实验研究所用白血病模型首先，来了解一下常用 的细胞株白血病中常用的小鼠品系用于建立白血病小鼠模型的小鼠可分为近交系和突变系。根据不同类型和目的选择不同的小鼠品系，具体如下图所示：最后说说常用的动物模型，主要分为三类： 一、异种移植模型异种移植模型是最常用的淋巴瘤动物模型。根据实验目的选择相应的小鼠品系和细胞株后，通常细胞的接种方式为皮下注射、腹腔注射和尾静脉注射。 皮下注射和腹腔注射操作简单，很快在接种部位形成肿瘤或 腹腔内形成多发性肿瘤，适合筛选针对白血病的药物。但该 类模型与白血病临床病人实际情况差距较大。异种移植型白 血病模型异种移植示意图[2] 尾静脉注射接种模型，可形成全身性扩散的白血病模型。符 合白血病临床过程规律，此模型以动物生存期作为评价药效 的主要指标，并对采血样本进行血细胞的形态学检测。下面以尾静脉注射模型实验步骤为例： 根据实验目的选择实验小鼠和细胞（如NOD-SCID 小鼠和人急性早幼粒细胞白血病细胞株）；荷瘤细胞量一般1-2 ×
常用学习记忆障碍动物模型 药理研究中常用学习记忆障碍动物模型的行为学分析(1) 摘要:目的本研究对老年、基底前脑损伤、东莨菪碱注射和双侧颈总动脉结扎大鼠四种药理研究中常用的学习记忆障碍动物模型的行为学表现进行了分析。方法采用水迷宫及旷场分析法对上述四种动物模型组及正常青年对照和假手术组进行了研究,数据采用多因素方差分析法处理。结果发现老年动物学习记忆能力减弱, 对新环境的紧张程度增强,但空间认知能力及兴奋性无明显改变; 基底前脑损伤动物的学习记忆及空间认知能力明显下降,但兴奋性及情绪反应正常; 东莨菪碱动物模型不但学习记忆及空间认知能力明显下降, 而且兴奋性异常增强;双侧颈总动脉结扎动物的学习记忆及空间认知能力明显下降, 但兴奋性及情绪反应正常。 结论从行为学角度将上述四种动物模型进行了比较,为药理学研究应用这些模型提供了背景资料。 关键词:老年性痴呆; 动物模型; 行为学 老年痴呆主要包括Alzheimer. s病和血管性痴呆, 是老年人致残最严重的疾病之一, 并且随着人口的老龄化, 患者日益增多, 将给家庭和社会带来沉重的负担。因此对老年性痴呆药物的寻求和研究是当前医学界的一个紧迫问题。良好的动物模型是进行该病研究的基础。目前作为老年痴呆的药理学研究常用动物模型主要有: M受体阻断剂东莨菪碱或樟柳碱致动物学习记忆障碍模型, 兴奋性氨基酸基底前脑注射致动物学习记忆障碍模型, 正常老年动物模型, 以及双侧颈总动脉结扎动物模型等。为更好地了解这四种模型动物的行为学表现,我们采用了水迷宫及旷场分析方法对这四种动物模型进行了比较观察, 水迷宫是一种较好地评定动物空间学习记忆能力的方法, 而旷场分析能对动物对新异环境的兴奋性、适应性、探究、紧张、记忆等行为进行评价。 1 材料和方法 1.1.1 动物SD大鼠, 雄性, 由北京实验动物研究中心提供( 许可证编号SCXK( 京) 2002-2003) 。 1.1.2 试剂氢溴酸东莨菪碱注射液( Scopolaminehydrobromide) 为上海禾丰制药有限公司产品( 批号:950901) , 鹅膏覃氨酸( Ibotenic acid, IBO) 为美国Sigma公司产品。 1.1.3 模型制备 1.1.3.11 老年动物组: 正常24月龄雄性SD大鼠; 青年对照组为3月龄大鼠。 1.1.3.12 基底前脑损伤大鼠: 采用3月龄SD大鼠,1%戊巴比妥钠麻醉, 脑立体定位仪固定, 平颅头位,按大鼠脑定位图谱, 在AP( 前囟后) : 018mm; ML( 中线旁) : 310mm; DV( 自脑表面深度) : 710mm; 双侧注射1LL鹅膏覃氨酸( 10LgPLL, 溶于生理盐水中) 。假手术对照组注射等量生理盐水, 手术后1个月进行实验。 1.1.3.13 东莨菪碱模型: 3月龄大鼠, 按5mgPkg体重于实验前20min腹腔注射氢溴酸东莨菪碱溶液。以上述青年对照组为对照。
缺血性中风动物模型研究 2013级硕士8班陈林伟南京中医药大学 摘要:实验动物或细胞模型完全模拟人类的中风十分困难，动物模型与临床的拟合具有重要意义。脑缺血动物模型为研究脑缺血后病理过程.病理生理机制及评价潜在的治疗干预效果等提供了极其重要的手段。 关键词:缺血性中风；动物模型；大脑中动脉闭塞 脑卒中，俗称中风，包括脑出血、脑血栓和脑梗塞等。缺血性中风是由大脑主动脉或其分支血栓形成，或内栓子阻塞引起，且多为大脑中动脉(MCA)栓塞。利用实验动物或细胞模型完全模拟人类的中风十分困难，过去二十年，经动物模型研究证明有效的700多种药物中，除一种新自由基消减剂(NXY-059)外，其余全都未能在三期临床得到阳性结果，从而无法证明其有效性，故研究建立与人类发病机理相近、可长期观察、结果稳定可靠、便于操作、价格低廉而实用的符合人类中风的动物模型成为一个迫切需要解决的问题。 1 实验动物的选择 在新药研发与脑缺血基础工作中，选择恰当的动物模型是非常重要的。缺血性中风动物模型中使用的实验动物有两大类：即灵长类和啮齿类。对于中风的生理病理的了解，最初来源于中风患者。因此，灵长类动物对中风的基础研究具有重要作用。与人类相似的多脑回灵长类动物种属(如猕猴)，在行为和感觉运动整合方面与人类有密切的相似性，是中风基础研究、探索性研究和临床前评价的最佳动物模型。利用非人灵长类动物制备模型，已有了几十年的经验积累，如狒狒。STAIR会议提出，药物一旦用小动物做出阳性结果，应该在较高的物种进行验证，然后才能开始临床试验[1]。最近报道，利用狨猴模型发现了神经保护药物氯美噻唑。国内也有学者采用光化学法成功造成树鼩局部脑缺血模型呤[2]，其造模方法亦被多人借鉴采纳。但是，到目前为止，尚无标准化的、被广泛接受的灵长类动物中风模型。 与灵长类较大的动物相比，啮齿类动物模型，如大鼠和小鼠，具有价格便宜、来源充足、品种纯化、制作模型方法简单、存活率高、脑血管解剖和生理较接近于人类、易于监测生理参数，脑标本制作容易等多面的优势[3]。但是啮齿类动物的大脑与人和非人灵长类
常用疾病动物模型 上海丰核可以为广大客户提供各种疾病动物模型定制服务，同时提供相关疾病模型的药物敏感性实验分析服务。 客户只需要提供疾病模型的用途及建模方法的选择，我们会根据客户的具体要求量身定做各种动物模型服务。
小鼠或裸 鼠 加贴近实际（八）心血管疾病模型 1. 动脉粥样硬化（高脂高胆固醇+维生素D喂养）兔高脂、高胆固醇饲喂兔造模，成 膜后血脂变化显著，为伴高血脂 症的动脉粥样硬化 4月血管组织病 理切片染色 2. 主动脉粥样硬化（高脂高胆固醇+主动脉球囊损伤）兔此模型用大球囊损伤加高脂饲 养方法成功建立兔主动脉粥样 硬化狭窄的动物模型，为相关基 础研究提供可靠模型。 2月动物实验模型病理切片展示 一、CCl4诱导的肝脏纤维化 简介：肝纤维化是肝细胞坏死或损伤后常见的反应，是诸多慢性肝脏疾病发展至肝硬化过程中的一个中间环节。肝纤维化的形成与坏死或炎症细胞释放的多种细胞因子或脂质过氧化产物密切相关。CCl4为一种选择性肝毒性药物，其进入机体后在肝内活化成自由基，如三氯甲基自由基，后者可直接损伤质膜，启动脂质过氧化作用，破坏肝细胞的模型结构等，造成肝细胞变性坏死和肝纤维化的形成。通过CCl4复制肝纤维化动物模型通常以小鼠或大鼠为对象，染毒途径主要为灌胃、腹腔注射或皮下注射。 动物模型图. 经过3个月的CCl4注射造模，小鼠的肝脏在中央静脉区形成了比较明显的肝纤维化，中央静脉之间形成了纤维桥接。（Masson染色） 二、CXCL14诱导的急性肝损伤动物模型
简述：CCl4是最经典的药物性肝损伤造模毒素之一，其在肝内主要被微粒体细胞色素P450氧化酶代谢，产生三氯甲烷自由基和三氯甲基过氧自由基，从而破坏细胞膜结构和功能的完整性，引起肝细胞膜的通透性增加，可溶性酶的大量渗出，最终导致肝细胞死亡，并引发肝脏衰竭。根据CCl4代谢和肝毒性机制可复制不同的肝损伤模型，其中给药剂量和给药方法是其技术关键。对于复制急性肝衰竭动物模型，往往采用大剂量一次性灌胃或腹腔注射给药。 图. (A) CCl4注射后0.5 d的HE染色表明CXCL14过表达增加了肝脏组织的嗜酸性变性面积(在照片中用虚线标记)(p < 0.05)。 (B) 1.5天组织样本的HE染色表明CXCL14过表达造成了比对照组更大面积的细胞坏死(p < 0.05)。 (C)同时还造成了中央静脉周围肝细胞中明显的脂肪滴积累。图中P和C分别表示动物模型的门静脉和中央静脉。KU指凯氏活性单位。 细胞凋亡检测结果 TUNEL标记没有显示CXCL14免疫中和小鼠和对照小鼠在凋亡细胞数量上的差异。C0, C1和C2分别是对照组0 d，1 d,和2 d样本，T1
肿瘤动物模型的建立可以： （1）评价抗肿瘤免疫治疗的疗效； （2）作为抗肿瘤药物筛选模型； （3）为肿瘤转移研究提供更好的研究平台； （4）为研发抗肿瘤转移性药物提供良好的实验工具。 实验方法：诱发性肿瘤动物模型 实验方法原理：诱发性肿瘤动物模型是指研究者用化学致癌剂、放射线、致癌病毒诱发动物的肿瘤等。 实验材料：肿瘤细胞小鼠 试剂、试剂盒、无血清培养基质、3%中性甲醇石腊 仪器、耗材、低温离心机、血球计数器、游标卡尺 实验步骤 一、肝癌 1．二乙基亚硝胺（DEN）诱发大白鼠肝癌 （1）取体重250 g左右的封闭群大白鼠，雌雄不拘； （2）按性别分笼饲养。除给普通食物外，饲以致癌物，即用0.25%DEN水溶液灌胃，剂量为10 mg/kg，每周一次，其余5天用0.025%DEN水溶液放入水瓶中，任其自由饮用；（3）共约4个月可诱发成肝癌； （4）也可以单用0.005%掺入饮水中口吸服8个月诱发肝癌。 2．4-2甲基氨基氮苯（DBA）诱发大鼠肝癌 （1）用含0.06%DBA的饲料喂养大鼠，饲料中维生素B2不应超过1.5～2 mg/kg； （2）4～6月就有大量的肝癌诱发成功。 3．2-乙酰氨基酸（2AAF）诱发小鼠、狗、猫、鸡、兔肝癌 （1）给成年大鼠含0.03% 2AAF标准饲料； （2）每日每平均2～3 mg 2AAF（也可将2AAF混于油中灌喂），3～4月后有80～90%动物产生肝肿瘤。 4．二乙基亚硝胺诱发大鼠肝癌： （1）用剂量为每日0.3～14 mg/kg体重，混于饲料或饮水中给予； （2）6～9个月后255/300大鼠发生了肝癌。 5．亚胺基偶氮甲苯（OAAT）诱发小鼠肝癌 （1）用1%OAAF苯溶液（约0.1 ml含1 mg）涂在动物的两肩胛间皮肤上，隔日一次，每次2～3滴，一般涂100次。 （2）实验后7～8周即而出现第一个肝肿瘤，7个月以上可诱发小鼠肝肿瘤约55%。 （3）或用2.5 mg OAAT溶于葵瓜子油中，给C3H小鼠皮下注射4次，每日间隔10天，也可诱发成肝癌。 6．黄曲霉素诱发大鼠肝癌 （1）每日饲料中含0.001～0.015 ppm，混入饲料中喂6个月后，肝癌诱发率达80％。 二、胃癌 1．甲基胆蒽诱发小鼠胃癌 （1）取20 g左右的小鼠，无菌手术下，在腺胃粘膜面穿挂含甲基胆蒽（MC）线结。（2）含MC的线结是用普通细线，在一端打结后，将线结置于盛有MC小玻璃试管内，在
肿瘤动物模型的构建——白血病篇
肿瘤动物模型的构建——白血病篇 导读白血病（Leukemia）是一种常见的恶性血液疾病，俗称血癌。据统计，白血病是儿童恶性肿瘤的头号原因，在儿童及35岁以下成人中发病率位居第一[1]。同时也是十大恶性肿瘤之一。目前，白血病具体的发病原因至今尚未研究透彻，因此建立合适的白血病动物模型，对于白血病发病机制及药物研发具有重要意义。 本期为大家综述了白血病的基本情况及小鼠模型的分类、建立方法和应用。 第一章：白血病基本常识白血病是常见液体瘤 白血病是常见的液体瘤，与结肠癌、肝癌等实体瘤不同的是，它是造血干细胞的异常分化和过度增殖导致，因此肿瘤细胞会遍布全身，会侵犯身体的每个脏器，造成全身衰竭。 造血干细胞是血液系统中的成体干细胞，具有长期自我更新和分化成各类成熟血细胞的能力。如下图为造血干细胞可分类形成各种血细胞，如红细胞、血小板和白细胞： 造血干细胞分化成各类血细胞（图片来自https://www.doczj.com/doc/a411840481.html,网站）白血病致病因素有哪些呢？ 现阶段认为白血病的发病因素：化学因素、电离辐射、药物、毒物、病毒、遗传因素等有关。
白血病主要分为四类 根据白血病细胞的成熟程度和自然病程，白血病可分为急性和慢性两大类，临床上，白血病共分为四大类：急性髓系白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）、慢性髓系白血病（CML）和慢性淋巴细胞白血病（CLL）。儿童白血病90%以上是急性的，其中急性白血病中70%～80%是ALL。 第二章：实验研究所用白血病模型首先，来了解一下常用的细胞株白血病中常用的小鼠品系 用于建立白血病小鼠模型的小鼠可分为近交系和突变系。根据不同类型和目的选择不同的小鼠品系，具体如下图所示： 最后说说常用的动物模型，主要分为三类： 一、异种移植模型 异种移植模型是最常用的淋巴瘤动物模型。根据实验目的选择相应的小鼠品系和细胞株后，通常细胞的接种方式为皮下注射、腹腔注射和尾静脉注射。 皮下注射和腹腔注射操作简单，很快在接种部位形成肿瘤或腹腔内形成多发性肿瘤，适合筛选针对白血病的药物。但该类模型与白血病临床病人实际情况差距较大。异种移植型白血病模型异种移植示意图[2]
老年性痴呆（AD）动物模型的制作 一、简介 二、前言 1. AD的病理和症状 2. AD的分子标志和危险因子 三、AD动物模型的分类 1. 前脑胆碱能系统损害模型 2. 自然衰老认知障碍模型 3. 转基因动物模型 4. 其它损害造成的AD模型 四、AD动物模型的制作 1. 穹窿-海马伞切断模型 2. IBO损害模型 3. 免疫毒素选择性损害模型 4. 老年认知障碍鼠模型 5. 长期脑供血不足痴呆模型 6. Okadaic酸损害模型 7. App转基因动物模型 五、AD动物模型的应用 六、参考文献 一、简介 本节介绍Alzheimer’s型老年痴呆（AD）的动物模型的制作，首先介绍AD的病理特征和模型的制作原理，然后着重介绍三类AD模型的制作方法。前脑胆碱能系统损害模型是用机械的、化学的或免疫的方式损害前脑胆碱能系统，造成动物前脑胆碱能系统病变和相关的认知缺失；自然衰老认知障碍模型是用行为筛选的方式，将老年灵长类或鼠类认知能力下降较严重的个体选择出来，它们通常表现出较为严重的脑老化的病理特征；转基因动物模型是用实验方法将外源性App 基因（野生或突变型）导入，使动物过多地表达App基因或突变产物，引起中枢神经系统的Aβ
的沉积和相关病理损害或临床症状。 二、前言 老年性痴呆是导致老年人生活质量低下和死亡的主要疾病，其中以Alzheimer’s型老年性痴呆（Alzheimer’s disease, AD）最为常见。AD是一种中枢神经系统退变性疾病，65岁以上人口发病率约5～10%，其主要症状为记忆力减退，认知能力低下和思维迟钝，且进行性加重，最后生活不能自理而死亡，病程一般8～10年。随着人口老年化趋势的加重，AD困扰着许多老年人，带来了严重的社会、经济和家庭问题。因此，积极研究AD的发病机制和寻找有效的治疗方法是临床和基础医学面临的急迫课题。但由于AD的病理学机制尚不清楚，要研究其发病机制和试验新的治疗方法，一个重要的突破口是制作AD的动物模型，即在动物上模拟AD的病理改变和临床症状。制作AD动物模型的前提是对AD的病理和行为变化的充分认识。 (一) AD的病理改变 AD的主要病理学改变是患者脑组织出现大量神经纤维缠结（Neurofibrillary Tangles，NFT）、老年斑（Senile plaque），突触和神经元丢失。NFT是出现在易感神经元胞体和突起内的丝状物，可以通过镀银染色或免疫组化的方法将其显示。电子显微镜下NFT是由配对缠绕的螺旋丝或15nm的直丝所组成。老年斑是神经细胞外的斑块状沉积，它同样可以通过镀银或免疫组化方法显示。NFT和老年斑在正常老年人脑组织也可出现，但在AD患者脑内其数量显著增多。它们主要沉积在额、颞叶皮质、海马、杏仁等脑区。累及上述脑的易感神经元，使其功能丧失或死亡。例如基底前脑胆碱能神经元、新皮质和海马的投射神经元丢失，导致靶的突触输入的减少和失支配，这些病理改变构成了AD认知障碍和记忆减退的神经基础[1-4]。 (二) AD的分子标志和危险因子 近年来，随着分子生物学技术的渗入，对AD发病的分子机制的认识有了长足的进步，其中最突出的成就是发现了AD有关的二大分子标志物：Tau蛋白和β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein，Aβ）。Tau是组成细胞骨架的微管相关蛋白（Microtubule associating protein）之一，由于某种原因引起Tau的异常磷酸化，使其从微管上解离，从面导致细胞骨架解聚，干扰了神经细胞功能，进而使受累神经元死亡。而过磷酸化的Tau本身相互缠绕形成了NFT[5]；Aβ是一个由39～43个氨基酸组成的多肽，它来自于含695～770个氨基酸的前体蛋白（Amyloid procursor-like protein，App）。业已发现，Aβ沉积和老年斑形成有着密切的关系，Aβ是老年斑的主要成份之一。用A β的抗体免疫组化方法可显示老年斑。App基因定位于第21号染色体，在一些早发的家族性AD 的患者其App基因突变已被证实[6-8]。
一. 背景： 本次动物实验相关疾病介绍、国内外相关治疗及研究的现状及结果（含临床、基础）、相关引文摘要等。 二、实验所用器械简介： 三、实验目的 1、使用猪或其他适宜动物为实验模型, 按照临床要求对产品进行模拟 使用，对* *器械的* *性能、* *效应进行测试。 2、通过动物实验取得数据和经验, 以便为产品的临床使用撰写详尽的使 用指南。 3、确定* * 器械置入猪后的最长可回收天数, 以便为临床使用的最长 可回收时间提供参考。 4、研究* *器械置入* *天后的可回收性, 以回答以往实验中未能解决 的* * 器械在置入* * 天后是否可取出的问题。 四、实验模型和材料 1、实验模型 （1）.动物模型：猪，体重：25?35KG （2）.体外模型：拟采用透明塑料软管作成的20mm 25mm两 种直径的下腔静脉模型。 2、材料： （1）* *器械采用XX公司研发生产的器械。 （2）其他手术配套器械采用临床通用器械。 3.过程要求：
本实验开始前必须取得动物道德委员会的许可（注：国外 有此要求，国内仅少数几家大医院有动物伦理委员会） 五.实验设计 动物数量及分组方法：实验动物共22头，在置入器械后分为A和B两组.A组动物采用介入方法取出滤器，B组动物采用外科方法经腹切开方法取出滤器.下腔静 脉滤器置入后饲养观察时间为7、10、12、14、16、20、30、60和90天，具体分组方法见下表。 分组（头） 时间（天）- A B 7 1 1 10 1 1 12 3 1 14 3 1 16 1 1 20 3 1 30 0 2 60 0 1 90 0 1 六、实验方法： 1、随机选取实验动物以1:1的比例进行* *实验，并记录* * 总结出的操作要求。7?20天实验用以观察器械置入后的可回收期，30、60、90天实验用以观察器械置入后的长期通畅情况。 2、所有动物器械取出前应造影复查，并与器械置入时的资料进行对比，判断器
III.实验动物心肌肥厚模型 A、压力超负荷/主动脉缩窄 压力超负荷引起的心脏肥厚常用的手术方法是主动脉缩窄（i.e.缩窄升主动脉）。 小鼠行主动脉缩窄（TAC）可以引起心脏机械性的压力超负荷，最终导致心肌肥厚、心衰（20,84）。TAC通常诱导方法采用在近胸骨端行小切口, 缩窄主动脉的这样的开胸手术。TAC模型虽然不能完全模拟人类的心室重构，但该模型可以用于肥厚发病过程中多种基因学的研究。主动脉缩窄模型能很好的模拟血流动力学超负荷引起左心室肥厚的发生发展。该动物模型在主动脉缩窄造成心肌肥厚几个月后会导致心衰。 B、容量超负荷 在静脉回流适当的情况下，心脏不能排出足够的血液满足全身组织代谢的需要就会引起CHF（充血性心力衰竭）。心内檐沟血或回心血量增加导致瓣膜闭锁不全就会引起心室容量超负荷。在慢性动脉和/或二尖瓣瓣膜回流疾病中的容量超负荷，我们会观察到“舒张期压力-容积曲线”整体右移,说明心脏僵硬度增加，即发生LVH (可见于主动脉瓣狭窄、高血压、肥厚性心肌病)（36）。通常情况下，容量超负荷CHF模型制备方法是腹主动脉-下腔静脉分流术。即于肾动脉上方分离出下腔静脉和腹主动脉，用血管夹在近肾动脉端夹闭主动脉阻断血流；用0.6-mm的针头由主动脉远端刺入，继续进针刺入下腔静脉，使动静脉联合。退针后，缝合血管壁伤口。4-5周后，就能复制出心肌肥厚模型，并具有左心室收缩力增强、舒张末期压力增加的特点（257）。 C、冠状动脉结扎 冠状动脉结扎常用于复制心衰动物模型。冠脉左前降枝（LAD）结扎后会阻断心脏的供养和营养输送，这种情况类似于人类心脏病发作时伴随的症状。血氧和营养供输阻断后，心肌细胞死亡，心脏整体功能受影响，最终导致心功能紊乱。由于这种动物模型非常接近临床心衰疾病的发生发展，研究证明该模型是心衰发病机制研究的重要手段（13）。 D、转基因型心脏肥大模型 几十年以来，一些心脏肥大和心力衰竭的转基因小鼠模型被学者们用于心肌肥厚和心衰这些致命疾病的可能的分子机制研究。受条件限制，在此不能针对于所有模型作一全面的综述，但在此文中，我们介绍一种转基因小鼠模型，该模型能成功模拟心肌肥厚的发生发展以及最终演变为心衰的过程。表1列举的是截止目前，研究学者们发现的较成熟的心肌肥厚/心衰模型。 表1：小鼠心衰模型 转基因小鼠模型代谢转变模型ECM紊乱转基因模型 肌侵蛋白，TNFα，G i，Gαq，PKCβ，PKA，β1AR, 磷酸化蛋白, 肌集钙蛋白, 钙调磷酸酶, L-型Ca2+ 通道 线粒体功能紊乱 氧化应激 脂肪酸氧化(FAO) 通路的受损 基质金属蛋白酶2/MMP2 基质金属蛋白酶9/MMP9 组织金属蛋白酶抑制剂 1/TIMP1
肿瘤动物模型的构建 第一类是皮下移植瘤 顾名思义，这种模型的建立是将肿瘤细胞或肿瘤组织直接种植在小鼠的皮下。种植的点也有讲究，一般选择血运淋巴回流丰富的腹股沟和腋窝。可根据实验设计选择移植点，统一移植点的位置，除了遵守实验统一的条件外，待肿瘤成熟后收集肿瘤时留下照片证据也显得美观。 裸鼠（Balb/c 鼠，无毛发，T 淋巴细胞缺陷）是比较常见和常用的实验用鼠，尤其是在皮下移植瘤肿瘤模型的建立中起到重要作用。裸鼠移植瘤模型的建立具有建立周期短、成瘤率高、易于操作、成本低的优点。当然，这种肿瘤模型也有缺陷，即不能很准确的模拟正常人体肿瘤发生发展的过程。 肿瘤细胞移植时的简要步骤： 首先准备好要移植的肿瘤细胞（细胞量根据不同肿瘤略有不同，我们所用的前列腺癌细胞系每个移植点一般选择1x106左右；肿瘤细胞可与基质胶1:1 混匀后用 1 ml 注射器吸取，基质胶能够给肿瘤细胞提供营养环境，有助于肿瘤细胞生长）。 戴无菌手套后，将小鼠用左手大拇指和食指捏住颈部皮肤，然后将鼠尾用左手无名指和小指固定于左手大鱼际。将腋窝或腹股沟用75% 酒精消毒 3 次。右手持吸有肿瘤细胞和基质胶混合液的注射器，在腹股沟或腋窝的位置，45 度斜角进针，注意不要突破腹膜，将针头保持于皮下位置。 然后近水平位置将针头几乎完全插入皮下，将混有基质胶的肿瘤细胞注射入皮下（肿瘤细胞量约1x106），快速退针，左手食指轻压针孔约1 min 后将小鼠放回饲养笼中，注意将小鼠侧放于垫料上，防止其不适呕吐时呕吐物误入呼吸道引起窒息。2～3 h 后观察小鼠是否苏醒。 如果是利用肿瘤组织（人体肿瘤标本或小鼠移植瘤传代）建立裸鼠皮下移植瘤模型，则需要首先将肿瘤组织用无菌PBS（或1640 培养基）洗涤 3 次，然后在无菌平皿上切成或用无菌剪刀剪成<1 mm3 体积的小块（种植前可裹基质胶）备用。 将小鼠用水合氯醛麻醉后平卧于解剖板上，四肢用胶带固定，将腋窝或腹股沟用75% 酒精消毒3 次，然后用眼科剪剪开约0.5 cm 小口，小镊子将皮下筋膜与皮肤分开，然后将肿瘤组织放入贴近腹股沟或腋窝的深部，每个位置放置2～3 块肿瘤组织，注意不同组间统一放置肿瘤组织块数以保持一致。 然后缝合皮肤，消毒后将小鼠侧卧位放置于饲养笼的垫料上。2～3 h 后观察小鼠是否苏醒。 影响皮下移植瘤肿瘤形成因素： 1. 移植肿瘤细胞的生长状态：肿瘤细胞应选取传代后汇合度达60%～80% 为最理想状态，此时细胞生长进入对数期，生长速度最快，状态最为理想，易于形成移植瘤。 2.肿瘤细胞收集后种植到小鼠皮下不宜时间过长，应尽快种植到小鼠体内，我们一般在 2 h 内完成。 3. 裹有基质胶的肿瘤细胞种植比单纯的肿瘤细胞种植更易成瘤。基质胶为肿瘤细胞在接受宿主营养之前提供充足营养环境，起到桥梁的作用。 4. 肿瘤组织移植种植时，应将肿瘤组织切成1 mm3 的小块，过小或过大均不利于肿瘤形成，组织块过大时不利于肿瘤组织中的肿瘤细胞接触新的环境生长，组织块过小时则肿瘤细胞过少，大部分在切块时破坏，均不利于肿瘤形成。 另外从肿瘤组织离体到种植到小鼠皮下不宜时间过长，我们一般在 4 h 内完成移植种