小专论
小议在MTT 法测细胞增殖抑制率中IC 50的计算方法
赵 斌1
,葛金芳1
,朱娟娟2
,黄晓晖1
,李 俊
1
(安徽医科大学1.药学院;2.基础医学院生物教研室,安徽合肥 230032)
摘要:半数抑制浓度、半数致死量等半数量是分析和比较药效
及毒效的重要数值,可用以测定药物安全性、比较效价等,其具体应用范围广泛,但计算相同。本文阐述了半数抑制浓度(IC 50)的概念、含义、计算原理以及几种具有实际应用价值、精密度较好的计算方法。重点讨论在M TT 法测药物对细胞增殖抑制的影响中计算IC 50的特点和注意事项等,对正确、简便求解IC 50值进行了初步探讨。关键词:半数抑制浓度;IC 50;MTT
半数抑制浓度(50%concentra ti on of i nh i bition ,I C 50)、半数致死量(M edian L etha l D osage ,LD 50)、半数致死接触时间、半数有效量等反映药效或毒效的半数定量指标都建立在质反应(如动物的存亡、有效与否等定性反应)的量 效关系基础上的数据,其性质、特点、统计计算和数学规律均基本相同。1 IC 50的概念及含义
半数抑制浓度(IC 50)[1]是指在用药后存活的细胞数量减少一半时所需的药物浓度。在M TT 法中,就是以对照组吸光度OD 值减少一半所需的药物浓度为I C 50。除此以外,半数抑制浓度的含义还相当于药物对培养细胞的最小致死剂量的平均值,作为反映药效的定量指标,在各种药物的筛选中广泛应用。该结论可由1926年W ij ngaarden 在573头家猫身上进行了洋地黄制剂的最小致死量实验中得出。
M TT 法检测药物影响细胞增殖的原理是只有存活的细胞能使外源性的M TT 还原为难溶的蓝色结晶物甲瓉(for m azan)并沉积在细胞中,在二甲亚砜中溶解显色,而死细胞不能利用M TT 故不能显色[2]。对每个细胞而言只有死亡与存活、显色与不显色两种情况,与LD 50计算中要求的质反应一致,并且符合常态分布,故可以应用计算LD 50的方法来求解IC 50,同样半数抑制浓度相当于药物对细胞的最小致死量的均值。而IC 50、LD 50的测定比测定最小致死量要方便得多,其稳定性和准确性都比较好。所以,I C 50已成为标志药物效应的一种重要定量指标。2 IC 50的计算原理
为便于求解,这类质反应通过多次转变才可变为直线相关。具体如下[3]:
致死剂量的对数值与动物死亡率之间为常态累积曲线关系。每个动物的致死量与动物的个体差异有关,多数动物处于中等敏感的范围内。如果以致死量为横坐标,以动物死亡率为纵坐标,则可绘成一个钟形曲线,这一曲线与常态曲线不完全相同,其剂量大的一侧拖出长尾现象;
基金项目:安徽医科大学校科研基金(编号:2005KJ31)
安徽医科大学校科研基金追加项目(编号:2007K J ZJ02)
通讯作者:李 俊,男,博士,教授,博士生导师,E m ai:l lij un@ahm u .
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!将横坐标的剂量改为对数剂量,则曲线就化成为对称
的常态曲线;
?剂量对数值与死亡率间为S 型曲线,向心对称,对称中心纵坐标为50%死亡率,横坐标为Log IC 50。该曲线的两端平坦,中间陡斜,曲线中段死亡率在50%附近的点比5%、95%的点更为重要;
#剂量对数值与概率单位之间为直线关系。为了便于数学回归分析,需要将S 型曲线转化为直线,引入?机率单位%(P rob i t)的概念,通过查表可将死亡率转化为?机率单位%。 所有不同的LD 50计算方法都是基于这些质反应的特点设计和推导的。通过以上的分析,我们可以知道药物浓度和抑制率并不呈明确的直线相关,而是药物抑制率的机率单位同药物浓度的对数值呈直线关系。有人通过仅仅以药物浓度为横坐标,以抑制率为纵坐标,作X 、Y 的散点图,直线拟合,求得直线回归方程来计算IC 50,我们认为这种方法不够严谨,理论依据不足,不完全符合计算原理,计算结果不可信。并且在实际应用中,往往很难作出一条满意的直线,相关系数太小,故不推荐采用。
3 I C50的计算方法及适用条件
计算IC 50的方法多达几十余种[4],包括正规机率单位法、点斜法、顾汉颐氏公式法、图解法、寇氏法、序贯法、L og it 法等,近年来,又出现了上下移位法(up and down 法)[5]、固定剂量法(F ixed do se precedure)[6]、评估法等[7,8],本文主要介绍几种精密度较好,有实际应用价值的方法。其他方法虽多,但无特殊优点。3.1 正规机率单位法 B1iss 所创建,后为F i sher 等所发展的加权机率单位法,在数理上最为严谨精密,故称为机率单位正规法。其它许多方法虽然也称为机率单位法,但有的未计算权重。它有以下特点:作图估线、加权回归、作业校正、逐次逼近、全面检验。正规法可以算出I C 50、I C 10等及其标准误、可信区间等全面有关数据,而且可进行各种误差及精度检验。适用于任何实验设计,对符合常态分布原则的实验,本法可作为标准方法。但其计算复杂,现在多采用统计软件求解,具体方法如下。
3.1.1 SPSS 软件在IC 50计算中的应用[9] 进入SPSS 数据编辑器后,激活变量表(V ar i able v ie w )定义变量,在变量名(na m e)下,输入?剂量%、?抑制率%、?总值%,然后进入数据表(D ata v ie w ),根据表头提示,依次输入各组数据。选择参数A na l y si s regression prob it ,调出?Prob it ana l ys i s %对话框,将?剂量%选入?Covariates %栏中,?抑制率%选入?Response frequency %栏中,?总值%选入?T ota l observed %栏中,?总值%多设为100%,在?T ransfor m %栏中,选择?L og base 10%,在?M ode l %栏中选择?Probit %概率单位模型,在?O pti ons %栏中选择?calcu late fro m data %即依据现有数量所得的在缺少刺激条件下的响应率来估计自然响应率,其他保持默认选项,然后单击?OK %即可。
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完成上述操作,SPSS 会自动显示全部分析结果(Spss v ie
w er),首先显示共有几组数据进行了概率单位模型分析,回归方程经过几次叠代运算后确定,该方程拟合优度检验 2值、P 值(P >0.05),说明曲线拟合良好。接着,系统显示剂量对数值(X )、个体总数(N u mber of Subjects)、观察到的反应数(O b serv ed R esponses)、预期反应数(Expec ted R esponses)、残差(R es i dual)和效应的概率(P rob)之后,显示各效应概率水平的剂量值(包括0.50,即IC 50)及其95%可信区间值,以及对数单位与概率单位的关系曲线图。
3.1.2 SAS 软件在IC 50计算中的应用[10] 目前世界公认的专业统计软件,其统计程序、统计函数和各种算法科学、严谨、精确,适用于不同领域的统计计算。运用S A S 软件进行生物检定中LD 50的计算,直接利用原始试验数据,调用S A S 内部函数LD 50.sas ,或编制专门的程序[11],其算法科学合理,简便快速,结果精确可靠,具体见参考文献。
3.1.3 其他 应用F oxpro2.5中的LD 50计算函数[12],还可在Ex cell 中调用VB 编辑器编写程序[13],以B1iss 算法为原理,利用现代高科技计算机技术求解IC 50的值,具体见参考文献。3.2 点斜法 又名综合法、改良寇氏法,是我国孙瑞元教授提出的较实用的计算法,可以简捷地算得与正规法相当接近的全部IC 50有关数据。其精确度优于其它各种简化法。该法适用于: 剂量呈等比数列;!各组动物或细胞数基本相等,!死亡率、抑制率分布大致符合常态。采用Pm ?11,P n ?0时的校正法,死亡率(p)无论是否包括0%或100%,均可计算,这一点优于寇氏法。
基本公式: I C 50:I C 50=Log -1[Xm-i (( p-0.5)+i/4((1-P m -Pn)]!含0%及100%死亡率时的LD 50:
IC 50=L og -1
[Xm -i (( p-0.5)]
式中X m 为最高死亡率P m 组的剂量对数值,i 为组距,
Pm 为最高死亡率,Pn 为最低死亡率,n 为各组组内动物数。
3.3 图解法 L itchfi e l d 等提出,设计?机率单位 对数坐标纸%及一系列诺模图,使直接图解法可以算出I C 50各有关数据。优点有:简便、灵活,剂量间不一定要求有等距或等比关系、有权重含意。但目测图解法在精密度上则受到一些损失,特别是有些实验数据由不同人来计算,可能得到不同的IC 50值。3.4 I C 50参数的显著性检验
3.4.1 拟合度检验 检验预期回归线与计算的回归线是否拟合,B li ss 法中Y -y r 的差值不应超过0.2,否则要进行再一轮计算,如差值均小于0.2,则可以为预期拟合合格,可以计算IC 50及其有关数据。SPSS 软件中采用拟合优度检验 2值表示,并且求其P 值(P >0.05),以判断是否拟合良好,符合最小二乘原理。3.4.2 回归显著性系数(g)
IC 50计算中回归系数(b)也有
其标准误(S b ),F e iller 氏提出?回归显著性系数(g)%,g 是S b
与回归系数(斜率b)的比值之函数,当g 小于0.1时,可略而不计,如果g 大于0.1,则回归显著性系数的影响不容忽视,应当采用F eiller 校正式来计算更为精确的95%可信限。4 IC 50在M TT 法检测药物对培养细胞的增殖抑制作用中的特点及注意事项
4.1 M TT 法中计算I C 50的特点 在用M TT 法测细胞增殖抑制率时,常需计算药物的IC 50值,并通过IC 50值的大小来判
定药物作用的强弱和特异性,为药物筛选和临床研究提供依据。和LD 50计算不同的,M TT 法中IC 50计算有其自身特点: 体外实验和体内实验影响因素不同;!由整体动物模型变为细胞水平,更为精细;?样本数量变化大,每孔中的细胞数量可达到104~105个,远大于每组动物数;#细胞数量通过显色反应由测得的OD 值表示,并且由OD 值来计算药物对细胞的抑制率。这是因为细胞数量和O D 值大小在很大的范围(200~5(105个)成确定的直线回归关系,可用OD 值代表细胞数量,以OD 值来计算药物对细胞增殖的抑制率[14]。4.2 注意事项4.2.1 结果判断 在实验结果中,可能会出现一些数据比较混乱,参差不齐,或是小剂量组抑制率反而高于大剂量组,或是各点连线呈现曲线关系,造成这种情况可能有以下几方面的原因: 加药前每孔中接种的细胞数量相差较大,人为影响对抑制率的计算。解决的办法我们认为在给每组接种细胞的同时,接种一孔作为对照,比较各组对照孔的OD 值应无显著性差异;并且在横向分组时接种细胞的顺序应为纵向,以减少组间的细胞数差异;!可采用异质性检验,如异质性有显著意义。往往意味着实验数据不符合常态分布原理,应追查原因,重做实验。异质性数据可校正后计算IC 50值,此时可信限范围格有所扩大;?若出现多组数据混乱,可在实验的同时做一条细胞数量的标准曲线验证,即细胞计数后倍比稀释接种培养板,温育后不加药物,直接通过M TT 法测吸光度,绘制OD 值对细胞数量的回归线,正常应为直线关系,否则可能实验有错误,需重新实验;#药物对细胞的抑制作用有可能不成常态分布,已发现并经遗传药理学研究证明了某些药物的致死量并不符合常态曲线,如阿托品对家兔、异烟肼对大白鼠等。4.2.2 其他 多种药物筛选比较时,可通过各药的I C 50假
设检验
[4]
,明确药物作用效应的大小,比较两药IC 50之间的差
别有无显著意义,可用两组t 检验,但计算中不能直接计算
I C 50的差值,而应计算Log IC 50;!为了更全面地反映药物作用特征最好列出IC 50及95%平均可信区间(L 95),并用括号附以b 值或I C 10值;?实验时抑制率应超过50%,保证量)效曲线跨越足够的范围,不可外推计算I C 50;#因为细胞体外用药是极其微量的,可以达到10-9m o l &L -1,甚至更低,在应用软件求解时,可能会出现小数位数太多无法显示的情况,一方面可用科学计数法来表示,另一方面可以在计算把所有的药物浓度同时扩大105倍,求得IC 50后再转化回来。参考文献:
[1] R I 弗雷谢尼,动物细胞培养基本技术指南(分子克隆实验指南
系列)[M ].第4版.北京:科学出版社,2004:398-400.[2] 司徒镇强,吴军正.细胞培养[M ].西安:世界图书出版公司,
2004:250-2.
[3] 孙瑞元.定量药理学[M ].北京:人民卫生出版社,1987:155-61.
[4] 刘昌孝,孙瑞元.药物评价实验设计与统计学基础[M ].北京:
军事医学科学出版社,2001:84-9.
[5] Ya m J ,Reer PJ ,B ruce RD .C o m parison of t h e up and down m et hod
and t h e fi xed dose procedu re for acu t e oral t ox i city t esti ng [M ].Food C he m Toxico.l ENGLAND,1991:259-63.
[6] V an d en H euvelM J ,C lar k DG ,F i el der R J ,et a.l Th e i n t ernational
vali dati on of a fi xed dos e procedu re as an alternati ve to the cl assical LD50test[M 1].Food Che m Tox i co.l ENGLAND ,1990:469-82.
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口服药物服用的最佳时间和方法
赵丽华,徐学君,邹若飞
(武警安徽总队医院药械科,安徽合肥 230041)
关键词:口服药物;服药时间;服药方法
口服药物具有服用方便、疗效可靠、病人易于掌握等优点,在临床上广泛应用。随着医药科学的发展,人们发现许多口服药物的最佳服药时间与药物的疗效密切相关,用药时间、方法和剂量是临床安全有效用药的重要基础。依据药物作用的时间节律确定最佳投药方案,既可节省药物又降低毒性和提高疗效。国内外大量临床研究资料表明,人体的生理和病理变化有昼夜节律性波动现象,如胃酸分泌、糖皮质激素分泌、胆固醇合成、哮喘发作等[1]。根据疾病的昼夜节律性波动现象,选择最佳服药时间,达到最佳疗效并可避免某些不良反应[2]。
1 1d服用1次的药物
1.1 需早上服用的药物[3]
1.1.1 肾上腺皮质激素 如泼尼松(强的松)、泼尼松龙(强的松龙)、倍他米松、地塞米松(氟美松)等,因为人体内激素的分泌高峰出现在晨7~8时,此时服用可避免药物对激素分泌的反射性抑制作用,对下丘脑 垂体 肾上腺皮质的抑制较轻,可减少不良反应[4]。
1.1.2 降压药 血压在早晨和下午各出现1次高峰,因此有效控制血压,如每日仅服1次的长效降压药如氨氯地平、依那普利、贝那普利、拉西地平、氯沙坦、缬沙坦、索他洛尔、复方降压灵宜在早7时左右服;每日服2次的宜在下午4时再补充1次[5]。
1.1.3 抗抑郁药 抑郁的症状如忧郁、焦虑、猜疑等常表现为晨重晚轻,因此氟西汀、帕罗西汀、瑞波西汀、氟伏沙明宜清晨服。
1.1.4 利尿药 避免夜间多次起床,影响睡眠和休息。如呋塞米(速尿)、螺内酯(安体舒通)。
1.1.5 泻药 硫酸镁盐类泻药晨服可迅速在肠道发挥作用,服后5h致泻。
1.2 需晚上服用的药物
1.2.1 他汀类调血脂药 近年来研究发现,人体内的胆固醇合成有昼夜节律性;在午夜至清晨之间合成最旺盛,故对于调血脂药物如洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、阿伐他汀等,采用每日睡前顿服,代替每日3次服药效果最佳[6]。
1.2.2 抗哮喘药[7] 据统计哮喘在睡眠时的发作率是白天的100倍。哮喘多在夜间凌晨发作,晚上服用氨茶碱与白天服用相比较,有较低的血药峰浓度和较长的药物峰值时间。氨茶碱的疗效结果比较显示,每晚8时口服1次的平喘效果显著优于每日2次给药方案。因哮喘多在夜间凌晨发作,故1日服用1次的抗哮喘药多在睡前半小时口服。常用药物有:氨茶碱缓释片、长效
2
受体激动药;班布特罗、福莫特罗、沙美特罗等,白三烯受体拮抗药,孟鲁司特等。
1.2.3 催眠药 起效慢的如苯二氮卓类的劳拉西泮,需睡前半小时服用[8]。
1.2.4 轻泻药 治便秘的温和泻药如比沙可啶、酚酞、液状石蜡等,服用后8~10h见效,均需在睡前半小时服用,次日早晨排便。
1.2.5 H
2
受体拮抗剂(抗酸药) 西咪替丁、法莫替丁、奥美拉唑、兰索拉唑、泮托拉唑等,均有极强的抑制胃肠分泌的作用。它们不仅能缓解因溃疡引起的疼痛,而且可制止因溃疡引起的上消化道出血。所以在疾病的急性期早晚各服1次,待疾病缓解稳定后,改为每晚服用1次维持量[9]。近年来,国内外学者多主张采用全天量睡前顿服的疗法,因为胃酸的分泌有昼少夜多的规律(人体胃酸的分泌从中午开始缓慢升高;夜间20时急剧升高,22时左右达高峰)。临床研究显示本类药物睡前顿服与分次疗效相同或更优,不仅方便患者,而且减少不良反应[10]。
1.2.6 阿片类镇痛药 二氢埃托啡,美沙酮,曲马多用于癌症病人的止痛,以夜晚临睡前服用为好,因为人的痛觉以上午最为迟钝,而午夜至凌晨最为敏感,这与脑中存在的内源性脑啡肽等止痛物质有关。
1.2.7 其他类 (1)抗结核药[11]异烟肼晚间顿服较早晨顿服抗结核效果好,血药浓度测定表明,晚间服药后1h高峰期,远比早上服药1h高峰期要高,半衰期由早上2~5h延长到晚上4h。(早上使脑垂体2肾上腺轴和广泛的交感肾上腺能系统兴奋,促进了体内代谢转化和排泄速度,而晚上各组织器官松弛,激素水平较低,对异烟肼的代谢相对减慢,故异烟肼晚上顿服有利于增强抗结核作用);(2)!受体阻滞药特拉唑嗪,亦须睡前服用,以免引起体位性低血压;(3)氟桂利嗪,有嗜睡副作用,需在睡前半小时服用;(4)铁剂,宜在晚上19时服用;(5)降胆固醇药,宜在晚餐时服用。这是因为人体
[7] H all eW.Th eRegi s try ofCytot oxici ty:toxicit y t esti ng i n cell cultures
to pred i ct acute t oxici ty(LD50)and to redu ce testi ng i n an i m als [M].A ltern Lab An i m.Eng l and,2003:89-198.
[8] S ch l ede E,Gen scho w E,Sp iel m ann H,et a.l O ral acu te t oxic class
m ethod:a s u ccessf u l altern ati ve t o t he oral LD50test[M].Regu l Tox i co lPhar maco.l Un i ted S t ates,2005:15-23.
[9] 周一平.用s pss软件计算新药的LD_(50)[J].药学进展,
2003,27(5):314-6.
[10]李保华,董向丽,孙显明,等.用于计算半数致死量(LD50)的
sas程序[J].莱阳农学院学报,2004,21(4):269-74..[11]黄 卓,唐黎明,王依婷,等.采用sas软件包进行半数致死量
(LD_(50))的计算[J].药学服务与研究,2002,2(3):183-5.
[12]梅开顺.概率单位加权回归法计算LD_(50)在微机上的应用
[J].中国媒介生物学及控制杂志,2000,11(5):366.
[13]马桢红,马良才.生物测定中LC_(50)或LD_(50)的E xcell运
算方法[J].医学动物防制,1999,15(11):612-4.
[14]M os m ann T.Rap i d colori m etric assay f or cell u l ar gro w th and s u rvi v
al:app li cati on to proli feration and cytot oxici ty assays[M].J I m m u no lM et hod https://www.doczj.com/doc/a42164905.html, HERLANDS,1983:55-63.
(收稿日期:2007-03-26)
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