题目：酶解工艺对发酵豆粕品质的影响
院（系）：动物科技学院
专业：动物科学
姓名：任文静
摘要
本试验在豆粕发酵过程中添加复合酶制剂，以检测复合酶制剂对发酵豆粕品质的影响。采用分组对比试验进行研究，既厌氧发酵和厌氧加酶发酵。发酵方式采用桶装发酵进行试验,发酵十二天。检测指标：粗蛋白、酸溶蛋白、脲酶活性、PH值。结果表明：厌氧发酵加酶组粗蛋白含量没有明显变化。抗营养因子方面：脲酶活性有所上升，在一定程度上，说明酶制剂的添加阻碍了微生物的正常生长，酶制剂的选择有必要进一步试验。
关键词：厌氧发酵；豆粕；复合酶制剂；酸溶蛋白；粗蛋白；脲酶活性
Abstract
In this test, adding compound enzymes preparation in soybean fer mentation process, in order to study the effect of compound enzym es on fermented soybean meal quality.Experimental studies using gr ouping comparison. That is anaerobic fermentation and anaerobic fer mentation of enzyme,Fermentation using barrels fermentation test.fer mented twelve days.Detection Indicator:Crude protein, acid-soluble pro tein, urease activity, PH value, the total number of colonies.The resul ts show that the anaerobic fermentation of enzyme group crude prot ein content didn’t change significantly.Anti-nutritional factors aspects: urease activity increased,To a certain extent, instructions to add enz yme impedes the normal growth of microorganisms, enzymes select the need for further tests.
Keywords:fermentation of soybean meal; complex enzyme; acid sol uble protein; crude protein; urease activity;
目录
一.材料与方法 (1)
1.1 试验材料 (1)
1.2 发酵底物配制 (1)
1.3 发酵方式 (1)
1.4 仪器设备 (2)
二. 指标检测方法 (2)
2.1 粗蛋白的检测方法 (2)
2.2 酸溶蛋白检测方法 (3)
2.3 pH值的检测方法 (3)
2.4 脲酶活性的检测方法 (3)
三.结果与分析 (4)
3.1 加酶发酵工艺对厌氧豆粕粗蛋白的影响 (4)
3.2 加酶发酵工艺对厌氧豆粕酸溶蛋白的影响 (4)
3.3 加酶发酵工艺对厌氧豆粕pH值的影响 (4)
3.4 加酶发酵工艺对厌氧豆粕脲酶活性的影响 (5)
四.讨论 (5)
4.1 加酶发酵工艺对厌氧豆粕粗蛋白的影响 (5)
4.2 加酶发酵工艺对厌氧豆粕酸溶蛋白的影响 (5)
4.3 加酶发酵工艺对厌氧豆粕pH值的影响 (5)
4.4 加酶发酵工艺对厌氧豆粕脲酶活性的影响 (5)
五.结论 (6)
参考文献 (6)
致谢 (7)
豆粕是大豆提取豆油后得到的一种副产品,其蛋白质、必需氨基酸含量较高、组成合理、平衡，是一种优质的植物性蛋白源。虽然豆粕中蛋白质含量丰富,但生豆粕中含有多种抗营养因子,这些抗营养因子阻碍营养成分的消化、吸收和利用,并对动物的生长发育和健康造成不良影响。发酵豆粕是以优质豆粕为主要原料,采用多菌种混合发酵的方式将豆粕中的多种抗营养因子去除,同时其在发酵过程中产生大量益生菌、乳酸等物质。有研究表明,在不影响喂养效果的情况下,发酵豆粕能部分代替饲料配方中进口优质鱼粉、乳清粉[1-5],显著降低饲料生产成本,有良好的应用前景。
微生物对豆粕的发酵作用主要依赖于其所产生的各种酶，特别是各种蛋白酶。理论上添加外源蛋白酶协同微生物发酵豆粕能够缩短发酵时间，产生更好的发酵效果[6]。但是目前研究的多是蛋白酶对大豆蛋白的酶解研究，关于豆粕发酵过程中使用复合酶对豆粕进行酶解研究较少。本试验采用分组对比的方式研究豆粕在发酵过程中添加复合酶制剂的效果。
一、材料与方法
1.1 试验材料
猪通用复合酶（HY511B），购自武汉新华扬生物股份有限公司；酵母菌：酿酒酵母、热带假丝酵母、产朊假丝酵母由德润生物自有菌种；豆粕、次粉、糖蜜、矿物质添加剂、食盐，为市面购买；其他试剂为国产分析纯。
1.2发酵底物配制
发酵底物组成：豆粕95%、玉米粉4%、发酵辅料1%。复合酶添加量均为0.02%；
1.3发酵方式
发酵底物水分调控至55%；20摄氏度左右室温发酵。发酵方式：采用桶装发酵。
1.4 仪器设备
仪器型号产地
电热恒温水浴锅DZKW-D-4 北京市永光明医疗仪器有限公司
离心沉淀器80-2 金坛市医疗仪器厂
pH计pHS-3C 上海仪电科学仪器股份有限公司
高速万能粉碎机FW-80 北京市永光明医疗仪器有限公司
电热鼓风干燥箱101 北京市永光明医疗仪器有限公司
手提式压力蒸汽灭菌器GMSX-280 北京市永光明医疗仪器有限公司
隔水式恒温培养箱GH 北京市永光明医疗仪器有限公司
德国赛多利斯BSA电子天平BSA8201 北京市赛多利斯科学仪器有限公司
电子万用炉DL-1 北京市永光明医疗仪器有限公司
消化炉KND-20C 上海昕瑞仪器仪表有限公司
二、指标检测方法
2.1 粗蛋白的检测方法
2.1.1试剂和溶液
硫酸、氢氧化钠、硼酸、蔗糖、硫酸铵
混合催化剂：0.4g硫酸铜，5个结晶水，6g硫酸钾或硫酸钠，磨碎混匀。
混合指示剂：甲基红0.1％乙醇溶液，溴甲酚绿0.5％乙醇溶液，两溶液等体积混合，在阴凉处保存期为三个月。
盐酸标准溶液：邻苯二甲酸氢钾法标定，按GB 601制备。
盐酸标准溶液：C（HCl）=0.1mol/L。8.3mL盐酸，注入 1 000mL蒸馏水中。
盐酸标准溶液：C（HCl）=0.02mol/L。1.67mL盐酸，注入1 000mL蒸馏水中。
硼酸吸收液：1％硼酸水溶液1 000mL，加入0.1％溴甲酚绿乙醇溶液10mL，
0.1％甲基红乙醇溶液7mL，4％氢氧化钠水溶液0.5mL，混合，置阴凉处保
存期为一个月（全自动程序用）。
2.1.2测定步骤
①选取具有代表性的试样用四分法缩减至200g,粉碎后全部通过40目筛,装于密封容器中,防止试样成分的变化。
②称取经粉碎试样0.2200g-0.2300g无损地置入已洗涤烘干的消化管中,加入混合催化剂3.2 g和浓硫酸7 ml。
③将消化管置于消化炉中进行消化。
④消化管冷却后使用定氮仪进行蒸馏,采用2%硼酸溶液吸收蒸汽。
⑤使用标准盐酸溶液(浓度为C)对硼酸进行滴定(V
2
),在消化管中不加样
品消化进行空白测定(V
1
)。
⑥粗蛋白含量计算公式CP(%)=（V
2-V
1
）*c*0.0140*6.25/（m*V’/V） *100%
⑦将空白测定的消化液同样处理，测定其中氨量。
2.1.3滴定
用蒸馏后的吸收液立即用0.1mol/L或0.02mol/L盐酸标准溶液滴定，溶液由蓝绿色变成灰红色为终点。
2.2 酸溶蛋白检测方法[8]
2.2.1试剂
①浓硫酸——过氧化氢——水混合液(2:3:1),在100ml水中慢慢加入200ml浓硫酸，冷却后再加入300ml过氧化氢，混匀，此液体放置阴凉处可保存一个月。
②混合催化剂：将10g硫酸铜、100g硫酸钾和0.2g硒粉，在研钵中研调使之通过40目筛，混匀后分成2g一包，用蜡光纸包好备用。
③甲基红——次甲基蓝指示剂：称取0.1g甲基红溶于75ml95%乙醇中（在研钵中加入乙醇研磨）；另称取0.1g次甲基蓝溶于80ml95%乙醇中，使用时将以上两种溶液按2:1比例混合即可（此混合指示剂在pH<5.5时呈紫红色，在pH=5.5时呈无色，在pH>5.5时呈绿色）。
2.2.2操作步骤
①准确称取样品6g于100ml烧杯中，准备加入15%三氯乙酸溶液50ml，混合均匀，静置5分钟。以中速定性滤纸过滤，弃去少许初始滤液，将滤液转移至离心管4000转/分钟下离心10分钟，准备移取其上清液10ml于消化管中，凯氏定氮法测定蛋白质含量，凯氏定氮法测定粗蛋白含量（略）。
②酸溶蛋白含量计算公式为：酸溶蛋白（%）=（V
1-V
）
*c*0.014*6.25*200/m*(1-W%)*100%
2.3 pH值的检测方法
用电子天平称取2.5000g样品溶于装有10ml蒸馏水的试管中，用玻璃棒搅拌均匀，5min后取上清液用pH计测定样品的pH。
2.4 脲酶活性的检测方法
2.4.1试剂和溶液
尿素、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、盐酸、氢氧化钠液、尿素缓冲溶液（pH6.9
至7.0）：4.45g磷酸氢二钠和3.40g磷酸二氢钾溶于水并稀释至1000mL，再将
30g尿素溶在此缓冲溶液中，可保存1个月。
2.4.2测定步骤
①称取约0.2g已粉碎的试样，称准至0.1mg，转入试管中（如活性很高只
称0.05g试样）,移入10mL尿素缓冲溶液，立即盖好试管并剧烈摇动，马上置于
（30±0.5）℃恒温水浴中，准确计时保持30min。即刻移入10mL盐酸溶液，迅
速冷却到20℃。将试管内容物全部转入烧杯，用5mL水冲洗试管两次，立即用
氢氧化钠标准溶液滴定至pH=4.70。
②另取试管作空白试验，移入10mL尿素缓冲液，10mL盐酸溶液。称取与
上述试样量相当的试样，也称准至0.1mg，迅速加入此试管中。立即盖好试管并
剧烈摇动。将试管置于（30±0.5）℃的恒温水浴，同样准确保持30min，冷却
至20℃，将试管内容物全部转入烧杯，用5mL水冲洗试管两次，并用氢氧化钠
标准溶液滴定至pH=4.70。
-V)/30*m
③脲素酶含量计算公式为：U=14*c(V
三、结果与分析
各检测指标结果见表1：
表1 各检测指标结果
样品粗蛋白含量（%）酸溶蛋白（%）平均pH值脲酶活性(U/g) 发酵豆粕48.83±0.79 8.16±0.77 5.36±0.08 0.00375±0.00000 加酶发酵豆粕50.05±0.42 4.39±1.61 5.10±0.03 0.00620±0.00346 3.1 粗蛋白含量
粗蛋白的高低反映饲料中氮元素含量的高低。由表1可得，加酶发酵豆粕的
粗蛋白含量略高于发酵豆粕粗蛋白含量，粗蛋白含量无显著性差异（P>0.05）。
3.2 酸溶蛋白含量
由表1可得，加酶发酵豆粕的酸溶蛋白含量低于发酵豆粕酸溶蛋白，酸溶蛋
白含量无显著差异（P>0.05）。
3.3 pH值
由表1可得，加酶发酵豆粕的PH值低于发酵豆粕PH值，PH值加酶后有所
下降，无显著差异（P>0.05）。
3.4 脲酶活性
豆粕中的脲酶和胰蛋白酶抑制因子含量成正相关。通过检测豆粕中脲酶活性来间接评判豆粕中胰蛋白酶抑制因子含量。由表1可得，加酶发酵豆粕的脲酶活性高于发酵豆粕脲酶活性，但是无显著差异（P>0.05）。
四.讨论
4.1 加酶发酵工艺对厌氧豆粕粗蛋白的影响
粗蛋白含量是发酵豆粕的重要商品价值指标，厌氧加酶发酵豆粕粗蛋白含量略有升高，变化不明显[9]。说明豆粕在发酵过程中加入复合酶制剂没有改变豆粕中的氮存留量。
4.2加酶发酵工艺对厌氧豆粕酸溶蛋白的影响
发酵豆粕中含有的酸溶蛋白可反映豆粕发酵过程中微生物对豆粕的转化程度，也可以在一定程度上反映豆粕进入机体后的可利用度。实验结果表明加酶发酵豆粕的酸溶蛋白含量低于发酵豆粕的酸溶蛋白含量。理论上讲，豆粕在发酵过程中加酶可降解豆粕中的大豆蛋白，提高微生物对大豆蛋白的利用率，本试验未出现这种效应。
加酶组酸溶蛋白含量低的主要原因可能是复合酶制剂对微生物蛋白产生影响，阻碍了微生物正常的生长、繁殖。
4.3加酶发酵工艺对厌氧豆粕pH值的影响
pH是微生物活跃程度的直接衡量，加酶发酵豆粕的pH值低于发酵豆粕pH 值。说明厌氧条件下天然存在的乳酸菌类在加酶条件下生长更快。
4.4 加酶发酵工艺对厌氧豆粕脲酶活性的影响
将豆粕通过生物发酵处理后，使豆粕中的各项抗原成分、抗营养因子被有效降低去除，如豆粕中的胰蛋白酶抑制因子、植物凝集素等因子得到很好的消除。
胰蛋白酶抑制因子含量的测定过程较为复杂，但其含量和脲酶有一定的关系[11] 。两者消除的程度成相应的比例，脲酶活性的测定相对简单。因此，可以用脲酶活性来衡量胰蛋白酶抑制因子的含量多少。实验证明，经加酶发酵豆粕的脲酶活性高于不加酶组，以上结果与酸溶蛋白指标相吻合，说明酶制剂的添加阻碍
了微生物的正常生长。
五、结论
本试验结果显示：（1）在豆粕厌氧发酵过程中是否加酶对发酵豆粕营养指标影响不一。（2）酶制剂的选择有必要进一步试验。
参考文献
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致谢
本论文是在导师孙新文的悉心指导下和严格要求下完成的，孙新文导师严谨的治学态度和科学的工作方法给予了我极大的帮助和影响。在此特向导师表示最衷心的感谢和最诚挚的敬意。
感谢石大德润生物科技有限公司在试验完成过程中给予的大力支持与帮助。感谢吴明海、杨鹏、邓瑶同学对我论文中试验研究工作给予了热情帮助，在此向他们表达我的感激之情。
任文静 2016年6月