第二章基因工程制药
教学目的：
了解基因工程技术在医药工业中的应用；
熟悉基因工程制药中常用的工具酶、克隆载体；
掌握基因工程药物无性繁殖系的构建过程。
教学重点：
基因工程药物无性繁殖系的构建
计划学时：4
第一节基因工程制药概述
DNA技术，是基因分子水平上的遗传工程，是70年代初期在分子遗传学基础上发展起来的一个崭新领域，是一门能人工定向改造生物遗传性状的育种新技术。
一、基因工程技术在医药工业中的应用
（1）基因工程药物品种的开发
利用基因工程细菌等表达人类—些重要基因片段，可产生具生理活性的肽类和蛋白质类药物，降低生产成本。
如应用传统的技术方法提取1mg生长激素抑制素(Somatostatin)需要用十万只羊的下丘脑，所要耗费的资金大约等于经由人造卫星从月球上搬回1kg石头。而用基因工程方法生产这一激素只需10L大肠杆菌培养液，其价格大约为每毫克0.3美元。
（2）应用基因工程技术建立新药的筛选模型
应用基因重组技术将各种酶、受体模型筛选所需的靶酶的活性中心或受体的配体、亚基等在微生物中大量表达，有利于采用机器人进行大量筛选。
（3）应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物。
（4）基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用
用带关键酶基因的质粒转换菌种，增加菌种中的关键酶基因剂量和转录水平；抑制菌种其它非必要基因的表达，提高相应产量的同时使提取、精制、半合成等后处理工序变得更方便；将血红蛋白基因克隆进菌种后提高对缺氧环境的耐受力，减少供氧这一限制因素的影响并节约能量。
（5）利用转基因动、植物生产蛋白质类药物。
（6）基因工程抗体在医药工业中的应用
它通过原核生物细胞或昆虫细胞表达抗体的小分子有效部位进行大规模廉价生产，可用作导向药物的载体。
二、应用基因工程和蛋白质工程技术开发的新型药物简介
1．人胰岛素（Insulin)
胰岛素用于临床糖尿病的医治已有近70年的历史，长期以来，其来源仅仅是从动物的胰脏中提取，而动物胰岛素与人胰岛素在氨基酸组成上存有一定的差异，长期注射人体会产生自身免疫反应，影响治疗效果。自80年代初开始用基因工程技术大量生产人胰岛素了。
国外人胰岛素的基因工程生产一般采用两种方式：一是分别在大肠杆菌中合成A链和B链，再在体外用化学方法连接两条肽链组成胰岛素。美国Eli Lilly公司采用该法生产的重组人胰岛素Humulin 最早获准商品化；另一种方法是用分泌型载体表达胰岛素原，如丹麦Novo Nordisk工业公司用重组酵母分泌产生胰岛素原，再用酶法转化为人胰岛素。
我国，1993年，北京大学报道了以部分牛凝乳酶原B基因与人胰岛素原基因进行融合，高表达出融合蛋白，经加工后可得到具有天然活性的人胰岛素原纯品。
2 人生长激素（Human growth hormone, hGH）
主要用途是治疗侏儒症，临床试验认为对慢性肾功能衰竭和Turner综合症也有很好疗效。
3 干扰素(Interferon，IFN)
干扰素是一类在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，是一种类似多肽激素的细胞功能调节物质，是—种细胞素。干扰素在临床上主要用于治疗恶性肿瘤和病毒性疾病。
4 白细胞介素(Interleukin, IL)
白细胞介素是一类重要的免疫调节剂。目前已发现的白细胞介素已达15种之多，它们的生物学功能十分广泛。白细胞介素在临床上主要用于治疗恶性肿瘤和病毒性疾病(如乙型肝炎、艾滋病等)。
5 集落刺激因子（Colony-stimulating factor, CSF）
集落刺激因子是一类能参与造血调节过程的糖蛋白分子，故又称造血刺激因子或造血生长因子。近年来的研究表明，CSF不仅在造血细胞的增殖与分化中起重要作用，而且也参与对成熟细胞的功能调节，并在宿主抗感染免疫中起着重要作用。CSF在临床上多用作癌化疗的辅佐药物，如化疗后产生的中性白细胞减少症，也用于骨髓移植促进生血作用，还可用于治疗白血病、粒细胞缺乏症、再生障碍贫血等多种疾病。
6 促红细胞生成素（Erythropoietin, EPO）
促红细胞生成素是一种由肾脏分泌的重要激素，在病理状态下，与多种贫血尤其与终末期肾脏疾病贫血密切相关，在生理情况下，它能促进红细胞系列的增殖、分化及成熟。临床上治疗慢性肾功能衰竭引起的贫血和治疗肿瘤化疗后贫血。
7 肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factou, TNF）
TNF除具有抗肿瘤活性外，对多种正常细胞还具有广泛的免疫生物学活性，临床上用于治疗某些恶性肿瘤，用于临床诊断。
8 组织型纤溶酶原激活剂（Tissue-type plasminogen activator, tPA）
tPA是一种丝氨酸蛋白酶，能激活纤溶酶原生成纤溶酶，纤溶酶水解血凝块中的纤维蛋白网，导致血栓溶解，主要用于治疗血栓性疾病。临床上用于治疗急性心急梗塞，急性肺栓塞。
9 心钠素（Atrial natriuretic factor, ANF or ANP）
心钠素即心房利钠因子。由于其化学结构属于一种多肽，故又称心房肽（ANP）。心钠素具有较强的利钠、利尿、扩张血管和降低血压的作用。在调节体液容量和浓度、控制血压、维持体液平衡方面起着重要作用，可作为降血压药和利尿药，用于治疗充血性心脏衰竭、高血压、肾功能衰竭、水肿和气喘等疾病。
10 重组乙肝疫苗
重组乙肝疫苗是以基因工程技术研制的第二代乙型肝炎疫苗（HB），是基因工程疫苗中最成功的例子。
除上述介绍的10种主要基因工程多肽药物和疫苗外，还有抗血友病因子、凝血因子Ⅷ、超氧化物歧化酶（SOD）、其他基因工程疫苗等。此外，一大批新型的基因工程和蛋白质工程药物正处在不同的研究阶段并不断涌现出来。
第二节基因工程制药中常用的工具酶和克隆载体
一基因工程制药中常用工具酶
基因工程的重要特点之—是在体外实行DNA分子的切割和重新连接。例如要取得所需药物之目的基因并要将此特定目的基因与载体DNA连接在—起，在很大程度上要依赖于某些工具酶。((Restriction enzymes)
是一类专一性很强的核酸内切酶。与一般的DNA水解酶不同之处在于它们对碱基作用的专一性上及对磷酸二酯键的断裂方式上具有一些特殊的性质。
20000～100000，是简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或只需Mg2。能识别双链DNA上特异的核苷酸序列，底物作用的专一性强，而且其识别序列与切断序列相一致。这类酶对基因工程中的生化操作特别重要。
2．限制酶的命名
1973年由Smith和Nathaus提出。是以寄主微生物属名大第一个字母（大写）和种名的前两个字母（小写）写成斜字体的3个字母缩写，菌株名以非斜体符号加在这三个字母的后面。若同一菌株中有几种不同的限制酶时，则以罗马数字加以区分。
例如：Hin d Ⅲ表示是从Haemophilus influenzae(流感噬血杆菌)菌株d中分离出来的第三种限制酶。3．限制酶的特性
(1)专一识别不同的特异核苷酸序列
(2)识别序列具有回文结构
回文结构：如果都从5' 末端向3' 末端读其碱基顺序，则在识别序列的两条核苷酸链中的碱基排列次序是完全相同的，这种结构称为回文结构（Palindromic structure）。
（3）各种限制酶的切割类型
Cohesive ends）：限制酶错位切断DNA双链而形成的彼此互补的单链末端。
Flush ends）：限制酶在同一位点平齐切断DNA两条链而形成的双链末端。
(二
DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶，这类酶作用时大多数需要DNA 模板并且优先作用于DNA模板，也可作用于RNA模板，但效率较低。
最常用的依赖于DNA的DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ(全酶)；大肠杆菌DNA聚合酶I 大片段(Klenow片段)；T 4和T7噬菌体编码的DNA聚合酶；经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶(测序酶)；耐热DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶和AmpliTaq TM)。反转录酶，是依赖于RNA的DNA聚合酶，可优先拷贝RNA。
1．大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ
2. 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片断
3. T4噬菌体DNA聚合酶
4. 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶）
5. TaqDNA聚合酶及AmpiTaq TM DNA聚合酶
6. 反转录酶
（三）DNA连接酶（DNA ligase）：能将两段DNA拼接起来的酶。
1. T4噬菌体DNA连接酶：催化DNA的5'羟基之间形成磷酸二酯键。
2. 大肠杆菌DNA连接酶：用途较窄，不常用。
（四）基因工程中常用的其他酶
1. 末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶或TDT酶）
2. T4噬菌体多核苷酸酶
3. 核酸酶（Nuclease）
4. 碱性磷酸酯酶（Alkaline phosphodiesterase）：能催化去除单链或双链DNA和RNA分子中的5' 磷酸基（脱磷酸作用）。分为细菌碱性磷酸酯酶（BAP），牛小肠碱性磷酸酯酶（CIP）。
二基因工程制药中常用的克隆载体
DNA分子就是外源DNA片段（基因）的运载体（Vector）,又可称为分子载体或无性繁殖载体。
基因工程制药中常用的目的基因克隆载体主要有：质粒、λ噬菌体、M13噬菌体和粘粒。
（一）质粒
1
Plasmid）是一些存在于微生物细胞内染色体外的闭合环状双链的小型DNA分子，是能进行独立复制并保持恒定遗传的辅助性遗传单位。
2 常用的几种质粒载体
（1）pBR322及其衍生载体
pBR322 最早构建成功的较理想载体，分子质量2.6×106u，4.36kb，属松弛型复制，含有两个抗性基因（Tet r和Amp r），已确定32个限制酶切割位点的相对位置。Bam H I等10个切点位于Tet r基因内，Pst I 等6个切点位于Amp r基因组内，EcoR I位点位于这两个基因之间，有利于检出重组转化子。pBR322衍生质粒：:
PAT153载体：用限制酶Hae Ⅱ进行部分消化pBR322后再重新连接而获得，是不能被带动的较小质粒载体（3.66kb），拷贝数比pBR322增加1.5～3倍。
pBR327载体：用Eco R Ⅱ部分酶切pBR322，去除非必需区段（位点1442~2502）后构建而成。长仅3.27kb；没有泳动功能；质粒拷贝数增加2～4倍。
(2) pUC系列载体
ⅠpUC18、pUC19质粒载体
含有pBR322的Amp r基因、复制原Ori和M13噬菌体M13mp系列载体所用的LacZ基因，在Lac 区内有独特的限制酶识别位点组成的多聚接头顺序（即多克隆位点），这两个载体不同之处在于多克隆位点以互为相反的方向排列。pUC质粒缺乏与控制拷贝数有关的mop基因，故这些质粒复制的拷贝数要比带有pMB1(或ColE1)复制起点的质粒高的多。pUC18/19载体能表达LacZ基因产物（β－半乳糖苷酶）的氨基端片段，在相应的宿主（Lac-）中可出现α互补。
ⅡpUC118、pUC119质粒载体
ⅢpUC的衍生质粒载体：pSP64、pSP65、pGEM-3Z、pGEM-3Zf(-)、pGEM-4、pGEM-4Z等。（二）λ噬菌体
1 常用的λ噬菌体载体
（1）Charon系列载体
为克隆DNA大片段而设计的替换型载体。代表性载体有：Charon4A、pCharon21A(早期)、Charon32～35和Charon40等。
（2）EMBL系列载体
克隆大片段基因组DNA的替换型载体。最常用的是EMBL3、EMBL4和EMBL3A，这些载体多克隆位点上的Bam H I位点两侧分别有Eco R I和Sa l I位点，EMBL3和EMBL3A含有对称的两个多酶位点聚合接头序列（Sal I-Bam H I-Eco R I），以便于Sal I、Xho I（都是↓TGGA）、Bam H I、MboＩ、Bgl Ⅱ、Xho I (都是↓GATC)和EcoR I等7种限制酶切点外源DNA片段的克隆。EMBL4的多聚接头区的限制性内切酶位点顺序刚好与EMBL3颠倒。
（3）λgt系列载体
插入型系列载体，包括λgt10、pλgt11和λgt18～23等系列载体。
λgt载体是专门为在其免疫区（imm434）内单一的EcoR I位点上克隆小的cDNA片段（约6kb）而设计的。λgt10为43.3kb，在它的阻遏基因CI中有唯一的EcoR I位点，外源cDNA片段（<7.6kb）插入此处时，使CI基因失活，形成了重组的CI－噬菌体，噬菌斑为清亮斑，可与非重组的CI－噬菌斑所产生的阴暗噬菌斑相区别。
λgt11载体是一个常用的，可用于免疫学筛选的载体。具有可表达性，为43.7kb，在它的LacZ基因末端（位于终止密码上游53bp处），有唯一的EcoR I 位点，可用于插入外源DNA片段。
λgt18、λgt19是λgt的衍生载体，其LacZ内的EcoR I位点插入了一个含Sal I、Sac I、Xba I和EcoR I位点的多克隆位点，但只有EcoR I和Sal I是单一酶切点，cDNA片段可插入LacZ内单一的EcoR I或Sal I位点。
（三）M13噬菌体
1 M13噬菌体的基本特性
M13噬菌体的基因组为环状单链DNA分子，由6407个核苷酸组成，有8个基因。M13是雄性专一性的，即只吸附于带有F质粒的雄性大肠杆菌（F＋）的性纤毛上而引起感染的。
受M13感染的细胞不被裂解破坏，在平板上不形成空斑而是形成缓慢生长的慢性感染细胞圈。
2 常用的M13噬菌体载体
M13mp18和M13mp19，这两个载体在LacZ区内的多克隆位点中都含有13个不同的酶切位点（只是在多克隆位点的方向上有所不同），可供插入由多种各不相同的限制酶切割而成的DNA片段。（四）粘粒（Cosmid）
1
是一种有λ噬菌体粘性末端的杂种质粒，由λDNAcos区与质粒DNA重组构建而成。它是为克隆和增殖基因组DNA的大区段而设计的，是组建真核生物基因文库及从多种生物中分离基因的有效手段。粘粒大小一般为4~7kb。
最简单的粘粒是一些经过改造的质粒，它们带有一个拷贝的cosDNA序列（将DNA包装的λ噬菌体颗粒中所必需的序列），携有一个复制起点（通常是ColE1复制起点）和一个抗药性标记（通常是Amp r）
（五）哺乳动物细胞载体系统（用于转染哺乳动物细胞的载体，有两类）
（1）不带真核复制子的质粒型载体：在原核质粒中插入一个完整的哺乳动物细胞转录单位和一个选择标记基因而组成的简单载体系统。这类载体在转染哺乳动物培养细胞之前要在细菌中进行扩增，而在转染后则整合到细胞基因组中并在基因组调控下低水平地表达相应的蛋白质。如pTK2、、pHyg和pRSVneo等。
（2）带有真核病毒调控序列元件的质粒表达载体。如：SV40载体、牛乳头瘤病毒（BPV）载体和人类疱疹病毒（EBV）载体。
第三节基因工程药物无性繁殖系的组建
1
Clone），是指制备一群由一个亲本而来的彼此相同的子代（无性繁殖系）的操作技术。
2 基因工程药物无性繁殖系的构建过程
（1）基因工程药物目的基因的制取
（2）目的基因与克隆载体的体外重组
（3）重组克隆载体引入宿主细胞的转化与转导（感染）
（4）含目的基因重组体的筛选、鉴定与分析
（5）目的基因在宿主细胞中的高效表达
一、基因工程药物目的基因的制取
获得所需的特定基因即目的基因，这是基因工程能否成功的先决条件。
获取目的基因的3种主要方法：化学合成法；构建基因文库法；酶促合成法。目前制取基因工程药物目的基因主要是采用构建基因文库法与酶促合成法。
（一）构建基因文库法分离目的基因（鸟枪收集法/散弹射击法）大致步骤：从所需的细胞或组织中制备高质量的基因组DNA，用限制酶把含有目的基因的供体基因组DNA切割成许多片段，将这些片段克隆到适当的载体（通常是λ噬菌体载体）中，并包装繁殖而产生重组噬菌体克隆（构成基因组DNA文库的成员），采用放射性探针杂交筛选目的基因DNA克隆
片段。当制备的克隆数多到足以把某种生物的全部基因都包含在内时，这一组克隆的总体就称为该生物的基因文库。
以λ噬菌体为载体构建真核基因组DNA（随机片段）文库为例，基本步骤如下：
（1）用一种或两种限制酶消化λ噬菌体置换型载体（可接纳20~24kb外源DNA片段），选用适当方法将λ载体左、右臂与中间的填充片段分离开。
（2）用一种或几种限制酶部分消化高分子量的真核基因组DNA，再用凝胶电泳或密度梯度离心法分离出适宜长度的DNA片段。
（3）λ噬菌体载体臂与真核DNA片段连接成较长的多联体，随后利用体外包装系统装入λ噬菌体头部，成为有感染力的重组噬菌体。
（4）重组噬菌体通过在大肠杆菌中生长而得以扩增，所获得的基因组DNA文库可被长时间利用和贮存，并用于筛选多种不同基因。
（二）酶促合成法制取目的基因
该法是以某一目的基因的mRNA为模板，用逆转录酶先合成其互补DNA（cDNA）的第一链，再进而酶促合成双链cDNA。酶促合成法的前提是必须首先获得某目的基因对应的mRNA，哺乳动物细胞中mRNA仅占总RNA的1%~5%，而且种类繁多，分离难度大。而从分化细胞中制取目的mRNA 较容易。
1 从构建的cDNA文库中筛选目的cDNA
cDNA文库的构建
基本步骤：
①cDNA第一链的酶促合成：合成cDNA第一链是以mRNA为模板，用反转录酶在Oligo(dT)引导下来催化合成反应的。
②cDNA第二链的合成
A 自身引导法：较少应用。
B 置换合成法
原理：利用cDNA：mRNA杂交体为切口平移反应的模板，由RNA酶H在mRNA链上造成切口和缺口而产生一系列RNA引物，再由E.coli DNA聚合酶I用这些引物以切口平移反应合成cDNA第二链。
C 双链cDNA与载体DNA的连接：同聚物加尾法，合成接头或衔接头法。（下一节详述）
D λ噬菌体体外包装及感染构建cDNA文库。
E 目的cDNA克隆的筛选：核酸杂交法；特异性抗原的免疫学检测法；cDNA克隆的同胞选择法。
2 RT-PCR法合成目的cDNA
（1）反转录－聚合酶链式反应（RT-PCR）技术合成目的cDNA的一般程序
A 从真核生物组织或细胞中提取纯化总RNA；
B 在Oligo(dT)的引导下，以总RNA中的总mRNA为模板，在反转录酶的作用下，合成总cDNA的第一条链；
C以两个引物所结合的单链cDNA（靶序列）为模板，在Taq聚合酶的作用下进行PCR扩增，合成双链目的cDNA。
（2Polymerase chain reaction）技术，简称PCR技术，是一种用于在体外扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的分子生物学技术。
（3）PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理是首先使双链DNA在反应液中热变性而分开成单链，在低温下与两个引物进行退火，使引物与单链DNA配对结合，再在中温下利用TaqDNA聚合酶的聚合活性及热稳定性进行聚合（延伸）反应。每经过一次变性、退火、延伸三个步骤为一个循环，通过三个不同温度的重复循环，在经过30次后，所扩增的特定DNA序列的数量可增至106倍。（图2-11）
（3）PCR反应体系的组成
A 含靶序列的DNA：闭环靶序列DNA的扩增效率比线状DNA低，最好现将其线状化；使用极高分子量的基因组DNA为靶序列时，优先选用起点罕见的限制酶先行消化；模板DNA需达到一定的量。
B 寡核苷酸（引物）：最适长度为20～24个核苷酸，浓度1μmol/L；人工设计合成PCR引物时，尽量选择碱基随机分布的序列，GC含量尽可能接近50％；设计引物时，常使其5' 端带一罕有的限制酶序列，使扩增产物既含有目标序列，两端又带有酶切位点。
C TaqDNA 聚合酶：包括从水生栖热菌中提纯的天然酶；由E.coli合成的基因工程酶（AmpliTaq TM）。加酶量1～5u/100μL反应体系。
D 四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）：dATP、dGTP、dCTP和dTTP，在PCR反应混合液中的浓度通常为每种个50～200μmol/L。
E PCR缓冲液：标准缓冲液中含有50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris HCl(pH8.3, 于室温)，1.5mmol/L MgCl2。
（5）PCR体外扩增DNA操作过程：通常在PCR自动扩增仪中进行。
二目的基因与克隆载体的体外重组
（外源DNA片段）用DNA连接酶在体外连接的合适的载体DNA上，这种重新组合的DNA称为重组DNA，简称重组体。
（一）目的基因DNA与质粒载体DNA的连接
依据外源DNA（目的基因）片段末端的性质以及质粒载体与外源DNA上限制酶切位点的性质，可选用下列方法来进行外源DNA片段与质粒载体的连接。
1
当用两种不同的限制酶（如用Bam H Ⅰ和Hin d Ⅲ）消化外源DNA时，可以产生带有非互补突出末端的外源DNA片段，此种片段可采用所谓的定向克隆方法，即只以一个方向很容易地将其插入到同样用Bam H Ⅰ和HindⅢ进行消化而产生相匹配粘性末端的载体当中。
Ⅱ制备定向克隆载体应注意的问题：
（1）用两种不同限制酶消化后，应通过凝胶电泳或大小排阻凝胶层析纯化载体大片段，以便与切下来的小片段分开；
（2）尽量避免使用在多克隆位点上彼此直接相邻的限制酶切位点；
（3）必须检查两种限制酶对载体的消化是否完全。
2
对于带有相同粘性末端的外源DNA片段，必须与用单一限制酶消化而形成具有同样匹配粘性末端的线状质粒载体相连接。
注意问题：
（1）为提高重组率，使目的连接产物的数量达到最佳水平，须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度；
（2）用碱性磷酸酶去除线状载体DNA两端的5' 磷酸基团以尽量减少载体DNA的自身环化；（3）连接反应中应含有足够量的DNA；
（4）要求带粘性末端的外源DNA浓度要等于或稍高于载体DNA，以利于增加有效连接产物的数量。
3 平端连接法
带有平整末端的外源DNA片段与载体进行连接反应要具备的条件：
（1）极高浓度的T4噬菌体连接酶；
（2）高浓度的末端外源DNA和质粒DNA；
（3）低浓度（0.5mmol/L）的ATP；
（4）不存在亚精胺一类的多胺。
提高连接效率方法：加入适量凝聚剂（聚乙二醇或氯化六氨合高钴），可使连接反应在连接酶和DNA浓度不高的条件下进行。
凝聚剂的作用：使平整末端DNA的连接效率提高1～3个数量级；改变连接产物的分布，使DNA 分子内连接受到抑制，所形成的连接产物都是分子间的连接产物。
4 快速克隆法
从纯化的凝胶中回收含目标条带的琼脂糖块，熔化后直接进行质粒载体和外源DNA的连接。
需大量连接酶，效率较低。
5 同聚物加尾法
利用末端转移酶可催化dNTP加到单链或双链DNA 3' 羟基端的能力，在目的DNA和质粒载体上加入互补同聚物，两者再通过互补同聚物之间的氢键形成可转化大肠杆菌的开环重组分子。
6 加合成接头或衔接头法
（1）合成接头：化学合成的两个自相互补的核苷酸寡聚体（8～12bp），而两个寡聚体可形成带一个或一个以上限制酶切位点的平整末端双链体。
（2）使用合成接头的克隆：使平整末端的双链接头与平整末端的目的DNA相连，然后经加热灭活连接酶并用适当的限制酶切割以产生粘性末端，通过柱层析除去剩余的接头；将加上接头的目的DNA片段与带有匹配粘性末端的载体DNA相连接。
（3）衔接头：是一小段带有一个平整末端（与双链DNA连接）和一个粘性末端（与载体的相应末端连接）的双链寡核苷酸。它在与双链目的DNA连接后无需限制酶消化，便可与去磷酸化载体DNA进行连接反应。
7 其他转换末端形式连接法
（1）部分补平3' 凹端：使用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow 片段部分补平3' 凹端，该法可将本来无法匹配的3' 凹端转变为粘性末端。
（2）完全补平3' 凹端：使用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow 片段完全补平3' 凹端
（3）除3' 突出端：选用T4噬菌体DNA聚合酶
（二）目的基因与λ噬菌体载体DNA的连接
1 λ噬菌体载体臂DNA的制备
（1）用密度梯度离心法纯化λ噬菌体载体臂；
（2）用碱性磷酸酶处理λ噬菌体臂：当应用含单个克隆位点的载体（如λgt10、λgt11）或填充片段不能用物理方法除去时，应采用碱性磷酸酶处理除去λ噬菌体臂末端的5' 磷酸基团，这样能够有效防止自身环化，并降低载体左右臂连接以后所形成的非重组载体的数目。
（3）用双酶消化λ噬菌体载体：当某些λ噬菌体载体（如EMBL3和4、Charon34和35等）在其中央填充片段的两端有两个方向互为相反的多克隆位点时。
2 λ噬菌体载体臂与外源目的DNA片段的连接
λ噬菌体载体臂与外源目的DNA片段的连接反应时须考虑两个参数：
一个是载体臂与外源DNA片段的比例；
另一个是这两种DNA片段在连接反应混合液中的浓度。
对每个新制备的噬菌体载体臂和外源DNA片段的连接，一般都必须进行连接预试验。
三重组克隆载体引入宿主细胞的转化与转染
（一）基本概念
1 是指在转化和转导(感染)中接受外源基因的宿主细胞。
2 基因工程的宿主细胞必须具备的性能：
(1) 具有接受外源DNA的能力，即能发展成感受态细胞；
(2) 一般应为限制酶缺陷型(或限制与修饰系统均缺陷)，即外源DNA进入宿主细胞后不致被限制酶所降解或修饰；
(3) 一般应为DNA重组缺陷型，以保持外源DNA在宿主细胞中的完整性；
(4) 不适于在人体内或在非培养条件下生存；
DNA不易转移，重组载体DNA只在宿主中复制。
2 DNA引入受体细胞的过程称为转化。
3 DNA直接引入受体细胞的过程称为转染。
4 DNA被包装到噬菌体头部成为有感染力的噬菌体颗粒，再以此噬菌体为运载体，将头部重组DNA导入受体细胞中，这一过程称为转导，通常称为感染。
（二）重组质粒DNA引入大肠杆菌细胞的转化
1 感受态
重组质粒DNA转化到大肠杆菌细胞中的效率与其“感受态”有关。
就是细菌吸收转化因子(DNA)的生理状态，细菌在低温下经过CaCl2溶液处理，再作短暂加热后，会使受体细菌中诱导产生出一种短暂的感受态。在此期间它们能够摄取各种不同来源的DNA，如λ噬菌体DNA或质粒DNA等。
2 用氯化钙制备新鲜感受态细胞及重组质粒DNA的转化
该方法适用于大多数大肠杆菌株。
2 用复合剂制备新鲜或冷冻的感受态细胞及重组质粒DNA的转化（略）
该方法由有Hanahan(1983年)提供，对于大肠杆菌菌株如DH1、DH5和MM294 效果好。用氯化六氨合高钴、DMSO、DTT（二硫苏糖醇）等试剂复合处理细菌可提高转化效率。在需要很高转化率的少数情况下考虑采用。
3 高压电穿孔转化法
该法可用于将DNA导入真核细胞，也可用于转化细菌。
（二）重组λ噬菌体DNA的体外包装与感染
1 包装提取物的制备
（1）用两个不同的溶源性菌株制备包装提取物
BHB2690菌株，用超声破碎法处理制备含前头部的包装提取物；
BHB268菌株，用冻融裂菌法处理，制备含D蛋白和其他必需成分的包装提取物。
两菌株的提取物分别含有包装反应的互补成分，混合起来就得到含有λ噬菌体DNA包装所需全部成分的混合物。将λ噬菌体DNA加入此混合提取物中，即可进行体外包装过程。
（2）只用一个溶源性菌株（大肠杆菌C菌株的非抑制性溶源菌SMR10）制备包装提取物
2 DNA的体外包装与感染
DNA与含有包装所需各种蛋白成分的包装提取物混合于试管中一起温育，在菌体外包装成有感染力的重组噬菌体颗粒，再由这些活性的重组噬菌体感染合适的宿主菌并将重组DNA导入宿主菌中。按照上述细菌包装提取物的两种不同来源和制备方法，有相应的两种体外包装方法。
（三）重组克隆载体导入哺乳动物细胞的转染
（1）磷酸钙和DNA共沉淀转染法
（2）DEAE－葡聚糖介导转染法
（3）利用Polybrene(聚季铵盐)的DNA转染法
（4）利用原生质体融合的DNA转染法
（5）电穿孔法DNA转染
电穿孔法：利用脉冲电场将DNA导入培养细胞的方法称为电穿孔法。
四含目的基因重组体的筛选、鉴定与分析
（一）重组体（菌）的筛选
1 抗生素抗性基因插入失活法
很多质粒载体都带有1个或多个抗生素抗性基因标记，在这些抗药基因内有酶的识别位点。当用
某种限制酶消化并在此位点插入外源目的DNA
以大肠杆菌质粒pBR322（外源基因插入Bam H Ⅰ位点）为例。P101
2β-半乳糖苷酶基因插入失活法
许多载体（如pUC系列）都带有一个来自大肠杆菌Lac操纵子DNA片段（见图2-3），其中含有β-半乳糖苷酶基因（LacZ'）的头146个氨基的编码信息和调控序列（Lac Ⅰ），还插入了一个多克隆位点（但不破坏读框）。这一区段编码β-半乳糖苷酶N端的一个片段（但无酶活力）。而宿主细胞可编码β-半乳糖苷酶C端部分片段（也无酶活力），但两者之间可以实现基因内互补（称为α互补），从而融为一体，形成具有酶学活力的蛋白质，由α互补而产生的Lac＋细菌在有诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）生色底物5-溴-4-氯-3' -吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）存在下形成（蓝）色菌落。然而，当外源DNA片段插入到质粒的（多克隆）位点后，使LacZ的（N）端片段失活，破坏了（α互补）作用。因此，带有重组质粒的细菌将产生（白）色菌落，从而仅仅通过目测就可轻而易举地识别并筛选出可能带有重组质粒的转化子菌落。
3 放射性标记核酸探针杂交筛选法
（1）原理
核酸分子杂交的原理就是根据单链的DNA或RNA能与另一单链DNA上和它互补的碱基顺序配对的特性，在一定的条件下，使它们的互补碱基之间形成氢键，从而使两单链连接起来成为一种DNA-DNA或DNA-RNA 的双链杂交分子。若两种杂交DNA之一（如目的基因DNA片段）是已知的并事先用放射性同位素（32P或3H）标记的，则可用它作为分子探针来识别或探知另一种DNA（如重组质粒DNA）中与其同源的部分（插入质粒DNA中的目的基因），从而筛选出带有特定DNA顺序（目的基因）的重组子来。
（2）原位杂交筛选的一般操作程序：
①将菌落或噬菌斑原位转移或影印到硝酸纤维素滤膜上
②裂解菌落或噬菌体并使释放的DNA原位结合于滤膜上
③固定于滤膜上的细菌DNA或噬菌体DNA与标记探针进行杂交
4 免疫化学筛选法
该法的特点是直接检测克隆基因所表达的蛋白质产物，应用时必须事先制备针对该蛋白质或多肽的抗血清或单克隆抗体，而最佳抗体应当是与目的蛋白（抗原）不同表位反应的一组单克隆抗体混合物，或者是不与宿主成分反应的高滴度多克隆抗体。
将筛选的菌落或噬菌斑复印于硝酸纤维素滤膜上，经裂解后，若含有抗原（表达蛋白），则在和抗体一起温育后，抗原便和其特异的抗体相结合，在滤膜表面形成抗原－抗体复合物。这种复合物可用
放射化学法检测或酶法检测。放射化学检测制剂可用抗第一抗体种特异性决定簇的125I标记抗抗体或125I标记金黄色葡萄球菌A蛋白；酶法检测制剂可用与辣根过氧化物酶（HRP）缀合的第二抗体或与碱性磷酸酶（AP）缀合的第二抗体(以上检测制剂均以商品化)。
（二）重组体的鉴定
1．凝胶电泳鉴定法
凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法。直接用溴化乙锭进行染色以确定DNA在凝胶中的位置，并直接于紫外灯下观察DNA条带。
采用该法鉴定重组转化细菌时，先对细菌进行小规模培养，采用煮沸法或碱裂解法小量制备重组质粒DNA，然后用原来的限制酶进行消化，通过凝胶电泳进行酶切片段的分析，并用同一限制酶切割的载体DNA和目的基因DNA片段或已知分子量的DNA片段作为对照。
重组质粒经凝胶电泳后应有两条带：—条是泳动速度较慢分子量较大的带(相当于质粒载体DNA)；另一条是泳动速度较快分子量较小的带(相当于目的基因DNA片段)。
2. Southern转移杂交法
(1) 琼脂糖凝胶电泳分离重组DNA的限制酶切片段用一种或多种限制酶消化重组质粒(或噬菌体)DHA成为各种大小不等的片段，通过琼脂糖凝胶(0.7％)电泳后，这些片段按其分子量大小分离并分布在凝胶片上。
(2) 将DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持体上，凝胶片上的DNA经过变性处理成为单链DNA 并经中和后，可采用两种方法将其转移到固体支持体(硝酸纤维素滤膜或尼龙膜)上。
A.一种是毛细管转移法．借助于一叠干吸水纸巾产生并维持毛细管作用，缓冲液被抽吸通过凝胶，凝胶上的DNA被洗脱和携带而从凝胶转移并聚集于覆盖在凝胶上面的滤膜上(各个DNA片段的相对位置保持不变)。转移的速率取决于DNA片段的大小和琼脂糖的浓度。
B.另一种是真空转移法，在真空转移装置(有商品供应)内，滤膜置于真空室上方的—多孔屏上，凝胶则放在与滤膜相接触的位置，在真空条件下，从装置上部一贮液槽中吸流出来的缓冲液，将DNA 从凝胶快速洗脱并定量地转移聚积于滤膜上，该法较之毛细管转移更为有效和快捷。
(3) 放射性标记探针与固着于膜上的DNA杂交
3．基因产物鉴定法
常用体外转译法对基因产物进行鉴定。从细胞中提取的天然mRNA或通过克隆化的DNA在体外转录产生的mRNA，在无细胞提取液中能被翻译而合成蛋白质，这些体外翻译反应产物可通过免疫沉淀或SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳加以分析鉴定，对原核生物的基因产物进行鉴定．常用大肠杆菌或枯草芽孢杆菌无细胞系统，而对真核生物基因产物进行鉴定，则常用兔网织红细胞裂解液或麦胚提取物，这两种翻译药盒均有厂商出售。
（三) 重组DNA的序列分析
目前应用的快速序列测定技术主要有两种：一种是Sanger双脱氧链终止法(酶法)测序，另一种是Maxam-Gilbert DNA化学降解法测序。
酶法DNA序列测定原理是：以单链DNA为模板，使用特异引物在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，若在反应物中加入一定量的2'，3'-双脱氧三磷酸腺苷酸(ddA TP)，则在正在增长的DNA链中应当掺入dA TP的位置上掺入了ddA TP。由于ddA TP在脱氧核糖的3' 位置缺少一个羟基．不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键．因此，正在增长的DNA链不可能继续延伸而终止。这样链延伸将与随机发生但却十分特异的链终止展开竞争，而反应产物则是一系列以ddATP结尾的长短不—的寡核苷酸。如果在4组独立的酶反应中分别采用4种不同的ddATP，结果将产生4组寡核苷酸混合物，它们将分别终止于摸板链的每一个A、每一个C、每一个G或每一个T的位置上。将反应物变性，在可以区分长度仅差一个核苷酸的不同DNA分子的条件下，对各组寡核苷酸进行凝胶电泳分析，只要把几组寡核苷酸加样于测序凝胶中若干个相邻的泳道上，即可以从凝胶的放射自显影片上直接读出DNA上的核苷酸顺
序。
五、目的基因在宿主细胞中的表达
RNA，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因产物——蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应的功能，从基因到有功能的产物这整个转录、转译以及所有加工过程就是基因表达的过程。
(一）目的基因在原核细胞中的表达
1在大肠杆菌中表达合成完整天然蛋白
（1）在细菌中表达原核蛋白时，首先必须选择带有可调控的强原核启动子的表达载体。如质粒载体pKC3D、pKKl77-3和pET-3分别带有λ噬菌体PL启动子、tac启动子和T7噬菌体Φ10启动子。
（2）若表达真核基因(或本身所含核糖体结合位点较弱的原核基因)，则必须从外部同时提供启动子和有效的核糖体结合位点。在大肠杆菌中，核糖体结合位点包括起始密码子(ATG)和Shine-D-algarno 序列，后者简称SD序列，是位于起始密码子上游3～11个核苷酸处，长度为9～11个核苷酸的DNA 序列。该序列与大肠杆菌16S rRNA的3'端4互补，因而mRNA 上的SD序列与16SrRNA上的3'端序列之间形成碱基配对，由此带动核糖体与mRNA的结合。
（3）在某些情况下，用上述方法并不能产生目标蛋白，或产生的蛋白质没有活性，此外有些外源蛋白产生后被细胞内的蛋白酶所降解，这些问题有时可采用下面两种表达系统得以解决。一种是可使克隆化目的基因表达为融合蛋白的一部分。另一种是外源蛋白的分泌型表达系统，这是通过将编码目的蛋白的DNA序列融合到编码信号肽的DNA中实现的。
（二）目的基因在真核细胞中的表达
1 真核细胞表达系统分类:
(1)采用病毒载体的表达系统；（2）转染DNA的表达系统。
2 基本的真核表达组件包括：启动子元件、增强子元件、加poly(A)信号、剪接信号以及用于复制和选择的元件。
第四节基因工程药物的生产实例
一基因工程菌株（细胞）的培养与发酵
1 常用的基因工程药物表达系统：大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞。
2 基因工程菌株发酵条件优化：
菌株的筛选或工程细胞的选用；培养基的选用；接种量；溶解氧（DO）水平；pH；温度；密度。（一) 工程细菌的培养与发酵
以重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)基因工程菌株发酵条件优化为例说明如下。
(1) 发酵用工程菌株的筛选
重组工程菌为E.coli DH5a/J1，具λP L启动子的热诱导表达工程菌株，低温保存于30％甘油中。用接种环取甘油管工程菌株划线接种于LB琼脂平板上，于30℃培养过夜，挑取单菌落分别接种于含5m1 LB(含50 μg/mL Amp)的试管中，30℃培养至OD600为0.2~0.8，分别取l mL于另一试管中于42℃培养3h，离心收集菌体，用SDS-PAGE分析后选取表达量最高的克隆作为发酵用种子。
(2) 发酵培养基的选用
将工程菌株分别接种于4种培养基(LB、M9、M9CA和D)中进行发酵，并比较其诱导表达。结果表明M9CA、D和LB培养基均适于DH5a/Jl的高效表达，结合考虑收菌量，选用D培养基作为发酵用培养基。
(3) 接种量对发酵的影响
以5％、10％和15％的接种量上罐发酵，结果表明：以10％或15％接种量上罐较适宜，延迟期极短，菌体生长繁殖迅速，很快进入对数生长期，适宜于表达外源目的蛋白产物。
(4) 溶解氧(DO)水平对发酵的影响
溶解氧(DO)浓度的高低对菌体的生长和产物的生成影响很大。在发酵时，随着DO浓度的下降，菌体生长减慢，维持较高的DO值，能促进带有重组质粒细胞的生长扩增，尤其是在高密度发酵的后期，由于菌体的密度很高，需氧量剧增。另—方面，在发酵时，外源基因的高水平转录和翻译，细胞需要高水平DO (＞40％)的供给以促进其能量和物质代谢，以利于外源蛋白产物的形成，否则，外源蛋白表达水平极差。
(5) pH对工程菌株生长和表达的影响
前期培养阶段着重于优化工程菌株的最佳生长条件，宜维持最适pH范围在6.8～7.4，后期培养阶段着重于优化外源蛋白的表达条件，其最适pH为6.0～6.5。采用pH自动调节程序，可避免因pH激烈变化对细胞生长和产物表达造成的不利影响。
(6) 热诱导时机对产物表达量的影响
一般在菌体对数生长期或对数生长后期进行升温诱导表达。对于分批发酵培养，控制在一定的菌体密度下进行热诱导(每升菌体湿重一般为8～10 g)，有利于外源蛋白的诱导表达。若采用流加工艺，通过补充必需营养及加大供氧量，可使菌体密度提高2～3倍，此时单位菌体表达量并不降低，而外源蛋白的总产量大幅度提高。
(7) 热诱导的升温时间对发酵的影响
热诱导表达的工程菌株，在温度突然升高10℃以上进行热诱导表达时，细胞内会迅速生成某些热激蛋白以适应变化的环境，但升温至一定范围后，热激蛋白的合成速度很快又下降，并恢复正常蛋白质的合成。因此，要求在2min内通过夹层升温迅速达到42℃。若升温时间过长，则热激蛋白合成量剧增，而外源蛋白表达量相应降低，同时也给后继的提取纯化增加困难。
(8) 高密度对发酵的影响
在高表达的前提下，适当提高菌体密度则是行之有效的。
如某批采用流加工艺的高密度发酵(发酵8h，其中生长5h，表达3h)，菌体湿重由原来分批发酵的8/gL提高到30g/L，外源蛋白表达量可由原来分批发酵的32％提高到48％。因此，只要能够满足工程菌株对氧、营养以及其他发酵条件的需求，高密度的菌体也能旺盛生长并高水平地表达外源蛋白，达到高密度表达的目的。
单纯追求高密度发酵的结果是徒然的，如曾获得230g/L的高密度发酵湿菌体量，但经SDS-PAGE 检测，没有明显的蛋白产物条带，发酵产物没有生产应用价值。
(二) 工程酵母的培养与发酵
以乙型肝炎疫苗基因工程酵母的培养与发酵为例说明如下。
基因工程乙肝疫苗通常可使用三种表达系统，即酵母系统、哺乳动物细胞系统及疫苗病毒载体系统，其中酵母乙肝基因疫苗在国外已应用多年并证明是安全有效的。
1. 基因重组酵母表达系统工业化生产乙肝疫苗有如下优点：
①酵母对培养基的要求低，价廉易得；
②酵母细胞生长快，生产效率高；
③不容易染菌，操作容易；
④生产容易放大。
2. 工程酵母的培养与发酵
(1) 乙肝基因工程酵母细胞
用于生产乙肝疫苗的工程酵母细胞是由人工构建的重组质粒转化酵母受体细胞(亮氨酸缺陷型，Leu-)而获得的。
重组质粒由三部分组成穿梭质粒：①乙肝表面抗原基因(HBsAg)的前面加上甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子，后面加上ADH-l终止子而形成一个基因盒。
②pBR322质粒的一部分(含Amp r基因)。
③酵母的2μDNA(含复制起点及亮氨酸基因）。
(2) 工程酵母菌株的制备与培养
将重组酵母原种进行1～2次的单细胞分离，筛选抗原表达水平高且稳定的克隆细胞(25～100个)，分别进行扩增并分装于小瓶中，于-70℃下贮存(称为母种库)。再由母种库取出一瓶母种，经扩增后分装于100～500个小瓶，同样贮存于-70℃作为生产菌种库。如一批生产菌种库用完后，可再从母种库取出一瓶母种制备另一批生产菌种库，这样可保证每个生产批的均一性和稳定性。用生产菌种进行扩大培养时，可以由摇瓶种子逐步放大到20L、300L，最后放大到1500L发酵罐。
(3) 工程酵母的发酵
大罐发酵培养基可采用全合成、半合成或复合培养基。对于带有Leu+重组质粒的Leu-宿主菌株，可以用亮氨酸缺陷型培养基以保持其选择压力，可采用分批补料或连续流加补料以保证最优生长，并维持细胞浓度、生长速度和营养供应之间的适当平衡，还可添加诱导剂(如乳糖)到发酵液中以诱导可调节启动子的表达。有人对培养基组分、发酵温度，pH、溶氧浓度对重组工程酵母（S.Cerevisiae DBY-745)表达HBsAg的影响进行过研究，发现：
①在碳源中降低葡萄糖浓度，补充甘油和蔗糖能较明显地改善比活值和HBsAg的相对浓度；
②将发酵前期、中期和后期温度分别控制在27℃、33℃和25℃；
③发酵pH从4.5开始，逐步上升到pH6.0；
④维持溶氧浓度在70％饱和度的最适水平。
以上措施都可以提高重组质粒的稳定性和HBsAg在细胞中的积累，重组酵母生产的HBsAg在细胞内以颗粒形式存在，其中的亚单位通过非共价键不紧密地结合在一起。
(三) 工程细胞的培养与发酵
以重组人红细胞生成素(rhEPO)基因工程细胞的培养与生产为例说明如下。
(1) 工程细胞株
C2细胞，为含有hEPO cDNA序列和dhfr基因的CHO细胞系。
(2) 工程细胞的扩增培养
C2细胞的扩增培养采用含5％胎牛血清(FBS)和2×10-7mol/L MTX的DMEM：F12(1：1)的完全培养基(GIBCO及BRL公司产品)，先在75mL T型细胞瓶(装注10 mL)于37℃无CO2条件下培养，然后转入850mL大培养瓶内培养，再转入容积为2L、生产面积670cm2的滚瓶(盛培养基150mL)中于细胞培养滚床(美国Bellco产品)上进一步扩增培养2～4天，至细胞全部覆盖于瓶内壁，即可用于接种反应器。
(3) 生物反应器的细胞培养与rhEPO的生产
采用填充床生物反应器，细胞贴附在圆形聚酯片上生长，培养基循环类似于滚瓶的温和培养条件和培养方式。填充床反应器(美国NBS公司产品)的容积为5L，工作容积为3.5L，每次填装聚酯片192～200g。聚酯片用无离子水浸洗2～3次后装填于反应器内，反应器在12l℃灭菌80min。在填充反应器中进行工程细胞培养时，采用细胞生长培养基(葡萄糖浓度为10g/L)，接种细胞密度为(0.5～1.0)×l06细胞/mL。起始搅拌速度为80r/min。30 min后，95％的细胞贴附在聚酯片上，搅拌速度上升为120 r/min，1h后上升为150r/min。溶氧为35％～55％空气饱和度。pH值开始控制在7.4左右，在灌注培养时，pH 值控制在7.0。调节pH值的酸碱溶液分别为0.5 mol/L Hepes溶液和2％～7％的NaHCO3溶液。接种细胞后缓慢升温到27℃，需1～2h。反应器的灌注速度以葡萄糖耗量来决定，以维持反应器内糖浓度在l.0～3.0g/L 范围为适宜，当葡萄糖耗量在l0g/(L·d)时，灌流体积为1.2～1.4个反应器培养体积。随着时间的延长，细胞密度不断增加，乳酸和氨等代谢产物逐渐增多，对细胞的表达会产生影响，必须加大灌流速度以降低代谢物的浓度。乳酸浓度控制在3.5g/L以下，氨浓度应控制在5 mmol/L以下。
rhEPO的表达水平与细胞浓度成正比，在培养8～10天后，更换自制无血清生产培养基SFM-P，细胞密度还不断地上升，表达水平也不断地提高。这时灌注体积适当提高，更有利于产物的表达。在培养上清液中，EPO含量从换成SFM-P培养基的12 μg/mL ，逐渐升高到28.4 μg/mL，反应器的产
率体积则提高到71mg/(L·d)。在填充反应器上使用自制无血清生产培养基SFM-P生产rhEPO，一般可维持生产20～25天，收集培养上清液80～87L，EPO含量由滚瓶的5.1μg/mL提高到14μg/mL以上，表达水平明显提高，降低了生产成本，提高了产率。
二基因工程药物的分离纯化
（一）影响基因工程产物分离纯化工艺设计的主要因素
1 产物的活性、纯度和杂质
活性的测定可以指导和评价整个分离纯化工艺中的单元操作，是分离纯化工作的前提。纯度和杂质分析不仅可以评价分离纯化单元操作的效率，而且也是作为产品质量控制的要求，需要灵敏的分析手段SDS-PAGE、HPLC、毛细管电泳、等电点聚集、肽谱分析和氨基酸分析等。
2 产物表达形式和表达水平
真菌和动植物细胞一般以分泌的形式表达，产物表达水平在1～100mg/L之间，差别很大。
E.coli表达基因产物的形式有胞内不溶性表达体（包涵体）、胞内可溶性表达、细胞周质表达等多种。由于不同的表达形式具有不同的表达水平及完全不同的杂质，因此分离纯化的策略有很大差别，其对工艺设计的影响是显而易见的。
3 产物本身的分子特性
蛋白产物分子的理化参数和生物学特性，包括分子量、等电点、溶解性、稳定性、疏水性、聚合性、特殊反应性和生物特异性等，对分离纯化工艺的设计分别具有各种不同的影响和意义。此外，真核表达系统中，糖基化可能会引起产物分子特性的改变，而糖基化程度的不同，则会引起分子理化性质的改变。
4 产物的用途和需求量
产物的用途决定了产品所要达到的纯度，如体外诊断试剂允许存在一定量的杂质，一般要求纯度在80％以上，而用于体内治疗的产品应具有较高的纯度，一般应达到98％以上。产品的需求量则决定了工艺应具有的规模。
（二）各种产物形式采用的分离纯化方法
1 细胞内不溶性表达产物――包涵体
（1）菌体细胞的收集和破碎
发酵完毕，离心收集的湿菌体细胞可采用物理、化学和酶学三种方法进行破碎，使包涵体释放出来。
物理方法包括超声波破碎、高压匀浆和加砂研磨；
化学方法常用的是碱和表面活性剂；
酶解法常用溶菌酶溶解菌体细胞壁。
（2）包涵体的分离、洗涤与溶解
菌体细胞破碎后，包涵体释放出来，通过离心法进行液固相分离，使包涵体与上清液中的碎片及杂蛋白分开。用TE缓冲液反复洗涤以除去可溶性蛋白、核酸及外加溶菌酶。在包涵体溶解前，为使其杂质含量降至最低水平，常用低浓度弱变性剂（如尿素）或温和的表面活性剂处理，可除去其中的脂质和部分膜蛋白，使用浓度以不溶解包涵体中的目的蛋白为原则。此外，硫酸链霉素沉淀和酚抽提可除去包涵体中大部分的核酸，从而降低包涵体溶解后抽提液的浓度，以利于色谱分析。
包涵体的溶解是在变性条件下进行，目的是使蛋白产物变成一种可溶形式，以利于分离纯化。溶解包涵体的试剂包括尿素、盐酸胍、SDS、碱性溶剂和有机溶剂等。一般很少使用碱性溶剂和有机溶剂。它们溶解包涵体的原理不同，变性剂尿素和盐酸胍是通过离子间的相互作用使蛋白变性并破坏高级结构，但分子内共价键和二硫键仍保持完整，而去污剂SDS主要是破坏蛋白质肽链之间的疏水作用。（3）变性蛋白质的纯化
通常可采用柱层析、凝胶过滤、离子交换层析和高效液相色谱（HPLC）等方法进行分离纯化。（4）重组蛋白质的复性
采用适当的条件使伸展的变性重组蛋白质重新折叠成为可溶性的具有生物活性的蛋白质，即为复
性。为获得高产率的复性蛋白，重折叠时应考虑下列因素：蛋白质浓度、杂质的含量、重折叠速度、氧化还原剂的用量和比例、重折叠配体的掺入以及温度、pH和离子强度。
2 分泌型表达产物
分泌型表达产物通常体积大、浓度低，必须在纯化以前进行浓缩处理，以尽快缩小溶液体积。超滤是最常用的蛋白质溶液浓缩方法。
3大肠杆菌细胞内可溶性表达产物
经细胞破碎后的可溶性离心上清液，如果有可以利用的单克隆抗体或相对特异性的亲和配基，可选用亲和层析分离法。对处于极端等电点的蛋白质。采用离子交换分离能除去大部分杂质。
4 大肠杆菌细胞周质表达蛋白
周质表达蛋白是介于细胞内可溶性表达和分泌型表达之间的一种表达形式，它可以避开细胞内可溶性蛋白和培养基中蛋白类杂质，在一定程度上有利于蛋白产物的分离纯化。为了获取周质蛋白，大肠杆菌细胞经低浓度溶菌酶处理后，一般用渗透压休克的方法获取。
三基因工程药物的质量控制
1 与传统药品生产的差异：
利用活细胞作为表达系统，所获得的蛋白质产品往往分子量较大，分子结构复杂；
许多基因工程药物都可参与人体机能的精细调节，微量情况下就会产生显著影响。
2基因工程药物质量控制主要包括以下要点：产品的鉴别、纯度、活性、安全性、稳定性和一致性。
思考题：
1 基因工程制药中常用的工具酶有哪些？常用的载体有哪些？
2 基因工程药物无性繁殖系构建的基本过程是什么？
3 获取基因工程药物目的基因的方法有哪些？
4. 目的基因DNA与质粒载体DNA的连接方法有哪些？
5. 重组体的筛选方法有哪些？
第一章绪论 1、生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为三类，分别是（）、（）、（) 2、生物技术制药发展历程经历了飞速发展的四个十年，分别是（）、（）、（）、（）。 3、生物技术所含的主要技术范畴有（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）和（）。 4、下列哪个产品不是用生物技术生产的（） A 青霉素 B 淀粉酶 C 乙醇 D 氯化钠 5、我国科学家承担了人类基因组计划（）的测序工作 A 10% B 5% C 1% D 7% 6、生物技术 7、生物技术药物 8、生物技术制药 第二章基因工程制药 1、基因工程药物制造的主要步骤是：（）、（）、（）、（）、（）、（）。 2、目的基因获得的主要方法是（）、（）、（）、（）。 3、基因表达的微生物宿主细胞分为2大类。第一类为（），目前常用的主要有（）；第二类 为（），常用的主要有（）。 4、基因工程药物的分离纯化一般不应超过5个步骤，包括（）、（）、（）、（）和（）。 5、在基因工程药物分离纯化过程中，基因重组蛋白的分离比较困难，可用（）、（）、（）、 （）的方法，达到初步分离的目的。 6、人工化学合成DNA新形成的核苷酸链的合成方向是（），合成的DNA 5’末端是（），3’ 末端是（）。 7、凝胶过滤法是依赖（）来分离蛋白组分 A、分子大小 B、带电状态 C、分子质量 D、解离状态 8、可用于医药目的的蛋白质和多肽药物都是由相应的（）合成的 A RNA B 基因 C 氨基酸 D 激素 9、用反转录法获得目的基因，首先必须获得（） P13cDNA文库法 A tRNA B cDNA C rRNA D mRNA 10、那一类细菌不属于原核细胞（） A 大肠杆菌 B 枯草芽孢杆菌 C 酵母 D 链霉菌 11、基因工程菌的生长代谢与（）无关 A 碳源 B RNA聚合酶 C 核糖体 D产物的分子量 12、基因工程菌的高密度发酵过程中，目前普遍采用（）作为发酵培养基的碳源 A 葡萄糖 B 蔗糖 C 甘油 D甘露醇 13、下列那种色谱方法是依据分子筛作用来纯化基因工程药物（） A 离子交换色谱 B 亲和色谱 C 凝胶色谱 D气相色谱 简答: 1、基因工程制药的概念？ 2、什么是载体？载体主要有哪几种？ 3、质粒载体的三种构型是什么？质粒载体的性质？用于克隆表达质粒载体的三个要素是 什么？ 4、目的基因常用的制备方法有哪四种？这四种方法的基本步骤是什么？
基因工程制药技术研究进展 信息检索课程（综述）中文摘要 以DNA重组技术为核心的现代生物技术是一个正在不断发展的高技术综合体系，也是国际上优先发展的高技术领域之一。自20世纪70年代基因工程诞生以来，最先应用基因工程且目前最为活跃的研究领域便是医药科学。DNA重组技术不仅直接提供干扰素、红细胞生成素（EPO）等基因工程药物，供临床治疗使用，提高对恶性肿肿瘤、心脑血管病、重要传染病和遗传病的防治水平，而且也广泛应用丁改造已有的抗生素和生物制品等传统医药工业。基因工程药物已形成一个巨大的高新技术产业 关键词基因工程，药物，研究，发展
信息检索课程（综述）外文摘要 Title Genetic engineering pharmaceutical technology Research progres Abstract With recombinant DNA technology as the core of modern biological technology is a continuous development of high technology integrated system, is also the international priority development of one of the high technology fields. Since the 1970 s genetic engineering since birth, the first application of genetic engineering and now the most active field of research is medical science. Recombinant DNA technology not only directly provide interferon, erythropoietin (EPO), and other genetic engineering drugs for clinical use, improve the malignant swollen tumor, cardio-cerebrovascular disease, important infectious disease and genetic disease prevention level, but also widely used in reconstruction of the existing antibiotics and biological products, and other traditional Chinese medicine industry. Genetic engineering drugs has formed a huge new and higl technology industries. Keywords Genetic engineering, medicine, research, development
基因工程原理练习题及其答案 一、填空题 1．基因工程是_________年代发展起来的遗传学的一个分支学科。 2．基因工程的两个基本特点是：(1)____________，(2)___________。 3．基因克隆中三个基本要点是：___________；_________和__________。 4．碱裂解提取溶液I中的葡萄糖的作用________________、_______________、______________________________。 5．同一质粒不同构型在电泳过程中迁移速率为。 6．部分酶切可采取的措施有：(1)____________(2)___________ (3)___________等。7．第一个分离的限制性切核酸酶是___________；而第一个用于构建重组体的限制性切核酸酶是_____________。 8．限制性切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是_________，它们属于_____________。 9．DNA聚合酶I的Klenow大片段是用_____________切割DNA聚合酶I得到的分子量为76kDa的大片段，具有两种酶活性：(1)____________；(2)________________的活性。10．为了防止DNA的自身环化，可用_____________去双链DNA__________________。11．EGTA是____________离子螯合剂。 12．测序酶是修饰了的T7 DNA聚合酶，它只有_____________酶的活性，而没有_______酶的活性。 13．切口移位(nick translation)法标记DNA的基本原理在于利用_________的_______和______的作用。 14．欲将某一具有突出单链末端的双链DNA分子转变成平末端的双链形式，通常可采用_________或_______________。 15．反转录酶除了催化DNA的合成外，还具有____________的作用，可以将DNA- RNA杂种双链中的___________水解掉。 16．基因工程中有3种主要类型的载体：_______________、_____________、______________。 17．就克隆一个基因(DNA片段)来说，最简单的质粒载体也必需包括三个部分：_______________、_____________、______________。另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子量。 18．琼脂糖凝胶的分辨力与胶浓度的关系是。 19．如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为________________。20．影响限制性切酶活性的因素________________、________________、________________、________________。 21．连接反应的实用温度为________________。 22．pUCl8质粒是目前使用较为广泛的载体。pUC系列的载体是通过 和两种质粒改造而来。它的复制子来自，Amp 抗性基因则是来自。
第一章、绪论 1. 生物技术制药：采用现代生物技术，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医药品，称为生物技术制药。 2. 生物技术药物：采用DNA重组技术或其他生物新技术研制的蛋白质或核酸类药物，称为生物技术药物。 3. 生物药物：指运用生物学、医学、生物化学等的研究成果，综合利用物理学、化学、生物化学、生物技术和药学等学科的原理和方法，利用生物体、生物组织、细胞、体液等制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。 4. 现代生物药物四大类型：⑴应用重组DNA技术制造的基因重组多肽，蛋白质类治疗剂； ⑵基因药物 ⑶来自动物、植物和微生物的天然药物； ⑷合成与部分合成的生物药物。 5. 生物药物功能用途分类：⑴治疗药物，⑵预防药物⑶诊断药物。 6. 生物技术制药的特征：⑴高技术⑵高投入⑶长周期⑷高风险⑸高收益 7. 生物技术在制药中的应用：⑴基因工程制药：①基因工程药物品种的开发、②基因工程疫苗、③基因工程抗体、④基因诊断与基因治疗、⑤应用基因工程技术建立新药的筛选模型、⑥应用基因工程技术改良菌种，产生新的微生物药物、⑦基因工程技术在改进药物生产工艺中的应用、⑧利用转基因动、⑨植物生产蛋白质类药物 ⑵细胞工程制药：①单克隆抗体技术、②动物细胞培养 ⑶酶工程制药 ⑷发酵工程制药 8. 我国生物技术制药现状和发展前景（自己阐述观点）
第二章基因工程制药 1．基因工程生产哪些药：⑴免疫性蛋白，如各种抗原和单克隆抗体。⑵细胞因子，如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子、表皮生长因子及凝血因子。⑶激素，如胰岛素、生长激素、心钠素⑷酶类，如尿激酶、链激酶、葡激酶、组织型纤维蛋白溶酶原激活剂及超氧化物歧化酶等。 2. 利用基因工程技术生产药品的优点在于： ⑴利用基因工程技术可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽（如胰岛素、干扰素、细胞因子等），为临床使用建立有效的保障。 ⑵可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围。 ⑶利用基因工程可以发现挖掘更多的内源性生理活性物质。 ⑷内源生理活性物质在作为药物使用时，存在不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程读起进行改造。 ⑸利用基因工程技术可以获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 3. 上游阶段：是研究开发比不可少的基础，主要是分离目的基因、构建工程菌（细胞）。上游阶段的工作主要咋实验室内完成。 4. 下游阶段：是从工程菌（细胞）的大规模培养直到产品的分离纯化、质量控制等。下游阶段是将实验室成果产业化、商品化。 5. 制备基因工程药物的基本过程：获得目的基因→组建重组质粒→构建基因工程菌（或细胞）→培养工程菌→产物分离纯化→除菌过滤→半成品检定→成品检定→包装 6. 宿主菌应该满足以下要求：⑴具有高浓度、高产量、高产率；⑵能利用易得廉价原料； ⑶不致病、不产生内毒素；⑷发热量低，需氧低，适当的发酵温度和细胞形态；⑸容易进行代谢调控；⑹容易进行重组DNA技术；⑺产物容易提取纯化 7. 宿主细胞分为两大类：⑴原核细胞：大肠杆菌、枯草杆菌、芽孢杆菌、链霉菌等；⑵真核细胞：酵母、丝状真菌 8. 表达载体必须具备以下条件（特点）： ⑴载体能够独立地复制 ⑵应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆、鉴定和筛选。而且克隆位点应位于启动子序列后，以使克隆的外源基因得以表达。 ⑶应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别。 ⑷应具有阻遏子，使启动子收到控制，只有当诱导时候才能进行转录。 ⑸应具有很强的终止子，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因，而不转录其他无关的基因，同时很强的终止子所产生的mRNA较为稳定。 ⑹所产生的mRNA必须具有反义的起始信号，即起始密码AUG和SD序列，以便转录后能顺利翻译。 ⒐密码子的偏爱性：在基因组中把使用频率高的同义密码子称为主密码子或偏爱密码子。此现象被称为密码子偏爱性 ⒑融合蛋白：由一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的，称为融合蛋白。 ⒒酵母的复制序列的几种不同载体：⑴YEp类（酵母附加体质粒） ⑵YRp类（酵母复制型质粒） ⑶YCp类(酵母着丝粒质粒) ⑷Yip类（酵母整合型质粒） ⒓基因工程菌的不稳定性：基因工程菌在传代过程中经常出现质粒不稳定的现象，质粒不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。
名词解释 1.基因工程基因工程是值在体外合成或重组特定的DNA，再与载体连接，最后导入到宿 主细胞内表达、扩增出人们需要的蛋白质，而且使这种性状可遗传给后代的技术。包括上游技术和下游技术。 2.基因工程制药基因工程制药是通过基因工程的方法生产药物，具体包括获得目的基因、 构建重组质粒、构建基因工程菌、培养工程菌、产物分离纯化、产品加工检验等步骤。 3.逆转录逆转录（reverse transcription）是某些RNA病毒由逆转录酶直接利用RNA为模 板合成DNA的过程。 4.CDNA以生物细胞的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA的第一条链，然后 在合成双链DNA，并将合成的cDNA双链重组到质粒载体或噬菌体载体上，倒入宿主细胞进行增殖。在这个过程中合成的双链DNA叫做cDNA。 5.引物引物是人工合成的单链DNA小片段，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的 5’端相同。是PCR的起始点。 6.表达载体所谓表达载体（expression vector）是指具有宿主细胞基因表达所需的调节控制 序列，能使外源基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。 7.克隆载体克隆载体（cloning vector)是把一个有用的制药DNA片段通过重组DNA技术， 送进受体细胞中进行繁殖的工具。 8.载体载体（vector），指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至 受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。 9.报告基因载体分子上有一种特殊意义的基因序列，它们表达的目的是为了证明载体已经 进入宿主细胞，并将含有外源基因的宿主细胞从其他细胞中区分并挑选出来。这种基因就是报告基因。 10.启动子启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能被RNA聚合酶识别并结合，具 有转录起始的特异性 11.PCR聚合酶链式反应是一种体外放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它主要包括 变性、退火、延伸三个过程，并且多次循环。 12.包涵体包涵体（inclusion body）是存在于细胞质中的一种不可溶的蛋白质聚集折叠而 形成的晶体结构物。通常包涵体虽然具有正确的氨基酸序列，但是空间结构却是错误的。 13.蛋白表达系统蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系，通过 这个体系实现外源基因在宿主细胞中表达的目的。 14.单克隆抗体由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为 单克隆抗体。 15.基因工程抗体基因工程抗体就是按不同的目的和需求，对抗体基因进行加工、改造和 重新装配，然后导入适当的受体细胞中表达得到的抗体分子。 16.改形抗体改性抗体（reshaped antibody,RAb）是指利用基因工程技术，将人抗体可变区 （V）中互补决定簇序列改换成鼠源单抗互补决定簇。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。 17.嵌合抗体在基因水平上将鼠源单克隆抗体可变区和人抗体恒定区连接起来并在合适的 宿主细胞中表达，这种抗体叫做嵌合抗体（chimeric antibody）。 18.镶面抗体将鼠源单抗可变区中氨基酸残基改造成人源的，消除了异源性且不影响可变区 的整体空间构象。 19.单链抗体单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)，是由抗体重链可变区和轻链 可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成。scFv能较好地保留其对抗原的亲
名词解释 1. 基因工程基因工程是值在体外合成或重组特定的DNA，再与载体连接，最后导入到宿 主细胞内表达、扩增出人们需要的蛋白质，而且使这种性状可遗传给后代的技术。包括上游技术和下游技术。 2. 基因工程制药基因工程制药是通过基因工程的方法生产药物，具体包括获得目的基因、构建重 组质粒、构建基因工程菌、培养工程菌、产物分离纯化、产品加工检验等步骤。 3. 逆转录逆转录(reverse transcription )是某些RNA病毒由逆转录酶直接利用RNA为模 板合成DNA的过程。 4. CDNA以生物细胞的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA的第一条链，然后 在合成双链DNA，并将合成的cDNA双链重组到质粒载体或噬菌体载体上，倒入宿主细胞进行增殖。在这个过程中合成的双链DNA叫做cDNA。 5. 引物引物是人工合成的单链DNA小片段，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的 5'端相同。是PCR的起始点。 6. 表达载体所谓表达载体(expression vector)是指具有宿主细胞基因表达所需的调节控制序列，能 使外源基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。 7. 克隆载体克隆载体(cloning vector)是把一个有用的制药DNA片段通过重组DNA技术，送进受 体细胞中进行繁殖的工具。 8. 载体载体(vector)，指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段(目的基因)转移至 受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。 9. 报告基因载体分子上有一种特殊意义的基因序列，它们表达的目的是为了证明载体已经进入宿 主细胞，并将含有外源基因的宿主细胞从其他细胞中区分并挑选出来。这种基因就是报告基因。 10. 启动子启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能被RNA聚合酶识别并结合，具 有转录起始的特异性 11. PCR聚合酶链式反应是一种体外放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它主要包括 变性、退火、延伸三个过程，并且多次循环。 12. 包涵体包涵体(inclusion body)是存在于细胞质中的一种不可溶的蛋白质聚集折叠而形成的晶体 结构物。通常包涵体虽然具有正确的氨基酸序列，但是空间结构却是错误的。 13. 蛋白表达系统蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系，通过这个体系 实现外源基因在宿主细胞中表达的目的。 14. 单克隆抗体由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗 体。 15. 基因工程抗体基因工程抗体就是按不同的目的和需求，对抗体基因进行加工、改造和重新装配， 然后导入适当的受体细胞中表达得到的抗体分子。 16. 改形抗体改性抗体(reshaped antibody,RAb )是指利用基因工程技术，将人抗体可变区 (V)中互补决定簇序列改换成鼠源单抗互补决定簇。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。 17. 嵌合抗体在基因水平上将鼠源单克隆抗体可变区和人抗体恒定区连接起来并在合适的宿主细胞中 表达，这种抗体叫做嵌合抗体( chimeric antibody )。 18. 镶面抗体将鼠源单抗可变区中氨基酸残基改造成人源的，消除了异源性且不影响可变区的整体 空间构象。 19. 单链抗体单链抗体(single chain antibody fragment，scFv),是由抗体重链可变区和轻链可变区 通过15?20个氨基酸的短肽(linker)连接而成。scFv能较好地保留其对抗原的亲 和活性,并具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。
《医用基因工程》复习思考题 第一章基因和基因组及基因工程的概念 一、名词概念 ①移动基因(插入序列；转位子)；②断裂基因；③RNA剪辑； ④内含子(间隔序列)与表达子；⑤重叠基因；⑥重复序列；⑦假基因；⑧启动子与终止子；⑨起始位点、终止位点。 二、讨论题 1.什么叫基因?何谓基因的新概念?基因的主要功能是什么? 2.一种基因一种酶的提法妥否？ 3.基因密码子三联体间是否存在着逗号？ 4.基因表达的产物中，氨基酸序列相同时，基因密码子是否一定相同？为什么？ 5.何谓转位子和转位作用?转位的后果如何? 6.基因中最小的突变单位和重组单位是什么？ 7.基因工程应包括哪些内容？何谓基因工程的四大里程碑和三大技术发明? 8.真核细胞基因组中常有内含子存在，能否在原核细胞获得表达？能，为什么？不能，为什么？ 第二章基因工程中常用的工具酶 1.什么是限制性核酸内切酶？ 2.什么是R/M现象？如何解释？ 3.II型核酸内切酶的基本特点有哪些？ 4.影响II型核酸内切酶活性的因素有哪些？如何克服和避免这
些不利因素？ 5.DNA连接酶有哪两类？有何不同？ 6.甲基化酶有哪两类？有何应用价值？ 7.什么叫同尾酶、同裂酶？在基因工程中有何应用价值？ 8.平末端连接的方法有哪些？(图示) 9.Klenow酶的特性和用途有哪些？举例说明。 10.反转录酶的特性有哪些？有何应用价值？ 11.列举碱性磷酸酶BAP/CAP的应用之一。 12.列举末端核苷酸序列转移酶的应用之一。 13.质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率？ 14.基因片段与载体的平末端连接的方法有哪些？ 15.用寡核苷酸和衔接物DNA的短片段连接时为使基因内部的切点保护，常用何种办法解决？ 第三章基因克隆载体 1.基因工程常用的载体有哪5种？其共同特性如何？ 2.什么是质粒？质粒分哪几种？有哪两种复制类型，质粒的分子生物学特性有哪些？ 3.质粒存在的三种形式是什么？ 4.分离质粒的基本步骤有哪些？ 5.分离纯化质粒的方法有哪几种？简述CsCl密度梯度(浮密度)分离法、碱变性法的原理，如何选择合适的分离方法？ 6.作为理想质粒载体的基本条件有哪些？ 7.什么叫插入失活，举例说明之。 8.构建pBR322质粒载体的亲本质粒有哪些？ 9.什么叫插入型和替换型噬菌体载体?插入型和替换型入噬菌体
基因工程原理复习题思考题 基因工程绪论 1、基因工程的定义与特征。 定义：在体外把核酸分子（DNA的分离、合成）插入载体分子，构成遗传物质的新组合（重组DNA），引入原先没有这类分子的受体细胞内，稳定地复制表达繁殖，培育符合人们需要的新品种（品系），生产人类急需的药品、食品、工业品等。 特征：1、具跨越天然物种屏障的能力。 2、强调了确定的DNA片段在新寄主细胞中的扩增。 2、试述基因工程的主要研究内容。 1）、目的基因的分离 2）、DNA的体外重组（载体、受体系统等） 3）、重组DNA分子转移到受体细胞及其筛选 4）、基因在受体细胞内的扩增、表达、检测及其分析。 3、基因工程在食品工业上有何应用发展？ 主要是通过基因重组，使各种转基因生物提高生产谷氨酸、调味剂、酒类和油类等有机物的产率；或者改良这些有机物组成成分，提高利用价值。 4、转基因是一把双刃剑，请客观谈谈对转基因及转基因食品安全性的认识。 转基因技术所带来的好处是显而易见的，在人类历史进步和发展中起到了积极作用。 首先，通过该项技术可以提供人们所需要的特性，改良培育新品种； 第二，延长食品保存时间或增加营养成分； 第三，将抗虫防菌基因转入到作物中，使作物本身产生抵抗病虫害侵袭的能力，减少了农药的使用量，有利于环境保护； 第四，转基因技术及基因食物在医学方面得到广泛研究和应用。 人们对转基因技术的主要担忧在于环境方面。外源基因的导入可能会造就某种强势生物，产生新物种或超级杂草、损害非目标生物、破坏原有生物种群的动态平衡和生物多样性，也即转基因生物存在潜在的环境安全问题。 转基因作物的大面积种植已有数年，食用转基因食品的人群至少有10亿之多，但至今仍未有转基因食品对生命造成危害的实例；更何况目前每一种基因工程食品在上市前，都要经过国家法律认可，食品卫生部门和环境部门的严格检测。只有测试合格了，才能投放市场。因此公众完全可以安全地消费、大胆地食用转基因食品。 第一章 DNA的分子特性与利用 1、原核生物和真核生物的基因表达调控有何差别？ 1）原核基因表达调控的三个水平：转录水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控原核基因表达调控主要是在转录水平上的调控。 2）真核生物基因表达的特点： ● 1．基因组DNA存在的形式与原核生物不同； ● 2．真核生物中转录和翻译分开进行； ● 3．基因表达具有细胞特异性或组织特异性； ● 4．真核基因表达的调控在多个水平上进行：DNA水平的调控、转录水平调控、转 录后水平调控、翻译水平调控、蛋白质加工水平的调控； 2、什么是基因？根据基因的产物，基因可分为哪三类？ 基因是具有生物学功能的、在染色体上占据一定位置的一段核苷酸序列，是分子遗传的功能
第一章绪论 1、生物技术药物：一般来说，采用DNA重组技术或其他生物技术研制的蛋白质或核酸类 药物。 2、生物药物按其功能用途可以分为三类：（1）治疗药物；（2）预防药物；（3）诊断药物。 3、生物技术药物的特性：（1）分子结构复杂；（2）具有种属特异性；（3）治疗针对性强， 疗效高；（4）稳定性差；（5）基因稳定性；（6）免疫原性；（7）体内的半衰期短；（8）受体效应；（9）多效性和网络效应；（10）检的特异性 4、生物技术制药的特性：高技术；高投入；长周期；高风险；高收益。 第二章基因工程制药 1、基因工程制药的药物都是用传统方法很难生产的珍贵稀有的药品，主要是医用活性蛋白 和多肽类，包括：(1)免疫性蛋白，各种抗原和单克隆抗体。(2)细胞因子，如各种干扰素,白细胞介素，集落刺激生长因子，表皮生长因子及凝血因子。（3）激素，如胰岛素，生长激素，心钠素。（4）酶类，如尿激酶，链激酶，葡激酶，组织型纤维蛋白溶酶原激活剂及超氧化物歧化酶等。 2、我国科学家经过8年刻苦攻关，成功地研制出世界上第一个采用中国健康人白细胞中克 隆的A1B型干扰素基因，组建杂交质粒，传染大肠杆菌使之高效表达的人A1B干扰素。 3、基因工程技术是将所要重组对象的目的基因插入载体，拼接，转入新的宿主细胞，构建 成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。 4、基因工程药物制造的主要步骤：获得目的基因—组建重组质粒—构建基因工程菌—培养 工程菌—产物分离纯化—除菌过滤—半成品检定—成品检定—包装。 5、简单叙事反转录法克隆基因的主要步骤：mRNA的纯化；CDNA第一链的合成；CDNA 第二链的合成；CDNA克隆；将重组体导入宿主细胞；CDNA文库的鉴定；目的CDNA 的分离和鉴定。 6、目前克隆真核基因常用的方法：化学合成和反转录法。 7、基因表达的微生物宿主细胞分为两类：原核生物，目前常用的有大肠杆菌，枯草芽孢杆 菌，链霉菌。真核生物，常用的有酵母，丝状真菌。 8、目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母。 9、影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素：（1）外源基因的剂量；（2）外源基因的表达效 率：启动子的强弱；核糖体结合位点的有效性；SD序列和起始密码的间距；密码子组成。（3）表达产物的稳定性；（4）细胞的代谢负荷；（5）工程菌的培养条件。 10、融合蛋白：融合蛋白的氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，这样的蛋白质是由 一条短的原核多肽和真核蛋白结合在一起的。 11、非融合蛋白：是指在大肠杆菌中表达的蛋白以真核的mRNA的AUG为起始，在 其氨基端不含任何细菌多肽序列。 12、质粒的不稳定分为分裂不稳定和结构不稳定。 13、质粒的分裂不稳定：是指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象，它 主要与两个因素有关，一是含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率，质粒丢失率与宿主菌，质粒特性和培养条件有关；二是这两种菌比生长速率差异的大小。 14、提高质粒稳定性的方法：选择合适的宿主菌；选择合适的载体；选择压力；分阶段 控制培养；控制培养条件；固定化。 15、接种量：是指移入的种子液体积和培养液的体积的比例。 16、基因工程药物的分裂纯化特点：（1）目的产物在初始物料中含量低；（2）含目的产 物的初始物料组成复杂；（3）目的产物的稳定性差；（4）种类繁多；（5）应用面广。17、分离纯化的基本过程的5个步骤：包括细胞破碎，固液分离，浓缩与初步纯化，高
第三节基因工程制药生产的基本过程 工具酶的分离纯化 载体的分离纯化 外源DN A 和目的基因的分离和获得 夕卜源DNA 与载体DNA 的切割与连接 宿主细胞的选择和基因导入操作 基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点 基因工程菌中试 基因工程菌的扩増和发酵生产 基因工程药物的分离和纯化技术 变性蛋白的复性 十一、基因工程药物的质量控 制 十二、基因工程药物的制 造实例 五、 六 、 七 、 八
六.基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点 （_）基因工程菌质粒的不稳定性 （二）质粒稳定性的分析方法 （三）质粒不稳定的原因（四）提高质粒稳定性的方法（五）基因工程菌的生长速率（六）蛋白质产量/菌体 数量比 （七）能量供应与菌体生长的关系 （八）小分子前体.催化剂供应与菌体生长的关系
■因工程菌在传代过程中常出现质粒不稳定的w. 现象,有分裂不稳定和结构不稳定。由于质粒不稳定导致的质粒丢失菌与含有质粒的菌之间生产速率不一致导致可能的生长优势,进而能在培养基中逐渐取代含质粒菌成为优势菌群,从而减少基因表达的产率,导致基因工程菌在生产过程中出现不稳定现象。 (二)质粒稳定性的分析方法
(1)将工程菌堵养液样品适当稀释,均匀涂于不含抗生素标记的平板培养基,培养10-12h ,统计所长出的菌落数A ； (2 )然后随机挑选100个菌落,接种到含有抗生素标记的平板堵养基,壇养10?12h , 统计所长出的菌落数B ； (3 )计算B/A的比值。该比值能反映质粒的稳定性?称为稳定性(stability.ST)
不稳定的原因 指基因工程菌在分裂的子代菌体中,出现一定比例不含质粒的现象。它主要与2个因素有关: (1)工程窗产生幺失质粒的概率,拷贝量低的工 程细菌,它所产生不含质粒的细菌变异株和概率较大。 (2 )丢失质粒的细菌.含有质粒的工程菌之间的 竞争力大小。 2、结构不稳定:指外源基因从质粒上丢失.或者发生 碱基重排.缺失现象,最终导致工程菌性能改变的现象。
基因工程制药
(一) 概述 (二) 基因工程药物生产的基本过程 (三) 目的基因的获得 (四) 基因表达 (五) 基因工程菌的稳定性 (六) 基因工程菌生长代谢的特点 (七) 基因工程菌发酵 (八) 基因工程药物的分离纯化 (九) 基因工程药物的质量控制 (十) 基因工程药物制造实例
表达系统：一个完整的表达系统通常包括配套的表达载体和表达菌株，如果是特殊的诱导表达还包括诱导 剂，如果是融合表达还包括纯化系统或者Tag检测等等。 表达载体：包括启动子，多克隆位点，终止密码，融合Tag（如果有的话），复制子，筛选标记/报告基因 等。表达菌株：不同的表达载体对应有不同的表达菌 株。
组成型表达：：表达载体的启动子为组成型启动子，也就是一 组成型表达 直努力不停表达目的蛋白的启动子，如pMAL系统。这类表达载体通常表达量比较高，成本低，但是不适合表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白。 诱导型表达：：表达载体采用诱导型启动子，只有在诱导剂存 诱导型表达 在的条件下才能表达目的产物。这种方法有助于解决有毒蛋白或者过量表达对细胞的影响。另外也有启动子是组成型的，但是启动子所依赖的转录酶是诱导表达的，也属于诱导表达系统。
融合表达：表达载体的多克隆位点上有一段融合表达标签（Tag），表达产物为融合蛋白（有分N端或者C端融合表达），方便后继的纯化步骤或者检测。对于特别小的分子建议用较大的Tag（如GST）以获得稳定表达；而一般的基因多选择小Tag以减少对目的蛋白的影响。His-Tag是最广泛采用的Tag。 分泌表达：在起始密码和目的基因之间加入信号肽，可以引导目的蛋白穿越细胞膜，避免表达产物在细胞内的过度累积而影响细胞生长，或者形成包含体，而且表达产物是可溶的活性状态不需要复性。通常这种分泌只是分泌到细胞膜和细胞壁之间的周质空间。 可溶性表达：大肠杆菌表达效率很高，特别是强启动子，目的蛋白来不及折叠而形成不溶的包含体颗粒，包含体容易纯化但是复性效率不高。分泌表达可以得到可溶的产物，也有部分融合Tag 有助于提高产物的可溶性，比如Thio，pMAL系统。
第一章基因工程的分子生物学基础 1、基因工程（遗传工程、基因操作、重组DNA技术等）：细胞外用各种方法产 生的核酸分子插入载体分子中，形成遗传物质的新组合，最终整合掺入到本来不含这些核酸分子的宿主生物中，并进行复制繁衍。 基因工程诞生的理论基础：①DNA双螺旋模型；②基因是可以转移的；③操作子模型的建立；④遗传密码子的破译。 基因工程的技术基础：①工具酶（DNA连接酶、内切酶、反转录酶）；②PCR 技术；③载体技术；基因转移技术。 2、DNA复制：①两条互补的反向平行的DNA单链之间由众多氢键连接（G-C、 A-T）形成稳定DNA双链分子；②DNA合成的起始需要引物提供3，羟基，DNA聚合酶按照5→3方向合成DNA。 3、限制性内切酶： I类酶II类酶III类酶 酶分子三亚基双功能内切酶与甲基化酶分 离 二亚基双功能识别位点二分非对称序列4-8bp序列，回文结构5-7bp非对称序列 切割位点距识别位点1000bp 在识别位点中或靠识 别位点在识别位点下游24-26bp 限制性反应与甲基化反应互斥分开反应同时竟争 限制作用需要需要不需要 限制酶剪切： 黏性末端：指DNA分子在限制酶的作用下形成的具有互补碱基的单链延伸末端
结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。（①5’突出的黏性末端；②3’突出的黏性末端。） ③平末端：两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心，形成的DNA片段 具有平末端。 产生黏性末端的酶： a、同尾酶：一组来源不同识别序列各异的，但能够切割形成相同粘性末端的核 酸内切限制酶。 b、同裂酶：有一些来源不同的限制性内切酶能识别并切割相同的核苷酸靶序列， 这类酶称为同裂酶。 4、连接酶：能够催化两条双链DNA链之间形成5′，3′磷酸二酯键的酶 ①E. coli DNA 连接酶（只连接粘末端） 利用NAD（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）作为能量供体，主要来源于原核生物。 ②T4 DNA连接酶（粘末端和平末端） 利用ATP作为能量供体，主要来源于真核生物，T4噬菌体也属于此类。 在基因工程的实验中主要用T4 DNA连接酶。 5、核酸的分离纯化：通过各种方法将生物材料破碎，释放DNA（RNA）至溶 液中，去除杂质（如用苯酚萃取蛋白质），再用乙醇沉淀核酸，通过离心，分离纯化核酸，最后用低浓度盐溶液溶解核酸。 细菌DNA的提取：细菌培养物的生长和收集→细胞提取物的制备→从细胞提取物中纯化DNA→DNA取样的浓缩→DNA浓度的测量（A260/A280=1.8）。凝胶电泳：（弱碱性条件）根据DNA或RNA 分子的大小，形状和拓扑结构，将DNA和RNA进行分离的技术。
第一章绪论 1.生物技术的定义与内容 生物技术是指应用自然科学和工程学的原理，依靠生物作用剂的作用将物料进行加工以提供产品或为社会服务的技术。 生物技术内容：基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程等。 生物技术的一个主要目标就是生物物质的高效生产。 2.什么是生物药物？生物药物可分为哪些类型？ 生物药物：利用生物体的初级或次级代谢产物、生物组织或整个生物体来生产用于预防、诊断或治疗疾病的医用品。 生物药物的分类（按来源与性质分类） 1. 天然生物药物：天然存在于动物、植物、微生物以及各种海洋生物等生物体内，直接通过提取、分离和纯化获得的有效的药理成分； 2. 重组药物：重组多肽、蛋白质 3. 基因药物：核酸类药物（基因治疗剂、基因疫苗、反义药物等） 4. 合成与半合成的生物药物 生物药物按功能与用途划分为： 1. 治疗药物 2. 预防药物（主要预防传染病，疫苗、类毒素） 3. 诊断药物（速度快、灵敏度高、特异性强） 3. 了解和熟悉一些常见的基因工程肽类药物。 细胞因子（cytokine）：细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白质的统称。在很多情况下，多种免疫细胞间的相互作用是通过细胞因子介导完成的。干扰素类(interferon，IFN)，白细胞介素类（interleukin，IL），集落刺激因子类（colony-stimulating facor, CSF)，表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF），神经生长因子（nerve growth factor，NGF ），肿瘤坏死因子类（tumor necrosis factor，TNF），红细胞生成素（erythropoietin，EPO），凝血因子VIII、IX。 激素:胰岛素(insulin)，生长激素（growth，GH），降钙素（calcitonin ），心钠素（atrial natriuretic factor, ANF ）。 药用酶及其他蛋白药物：链激酶（streptokinase,SK），尿激酶（urokinase），葡激酶（staphylokinase），组织型纤溶酶原激活剂（tissue-type plasminogen activator，t-PA ），超氧化物岐化酶（superoxide dismutases，SOD）。 第二章基因工程制药 1、写出基因工程的基本要素及制备基因工程药物的基本过程。 基因工程基本要素：工具酶，目的基因，载体，宿主
基因工程复习题 题型：名词解释（10个）30分；填空（每空1分） 20分；选择题（每题1分）10分；简答题（4个）20分；论述题（2个）20分。 第一章绪论 1.名词解释： 基因工程：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。 遗传工程广义：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。狭义：基因工程。 克隆：无性(繁殖)系或纯系。指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。 2．什么是基因克隆及基本要点? 3.举例说明基因工程发展过程中的三个重大事件。 A) 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）；B) 载体的使用； C) 1970年，逆转录酶及抗性标记的发现。 4.基因工程研究的主要内容是什么？ 基础研究： 基因工程克隆载体的研究 基因工程受体系统的研究 目的基因的研究 基因工程工具酶的研究 基因工程新技术的研究 应用研究：
基因工程药物研究 转基因动植物的研究 在食品、化学、能源和环境保护等方面的应用研究 第二章基因克隆的工具酶 1.名词解释： 限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。 回文结构：双链DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。 同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。 同裂酶：不同来源的限制酶可切割同一靶序列和具有相同的识别序列 黏性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。 平末端：DNA片段的末端是平齐的。 限制性核酸内切酶的酶活性单位（U）：在酶的最适反应条件下，在50μl容积中，60分钟内完全切割1g DNA所需的酶量为1个酶活性单位（unit 或U） 限制性核酸内切酶的星活性：指限制性内切酶在非标准条件下，对与识别序列相似的其它序列也进行切割反应，导致出现非特异性的DNA片段的现象。 连杆（linker）：化学合成的8～12个核苷酸组成的寡核苷酸片段。以中线为轴两边对称，其上有一种或几种限制性核酸内切酶的识别序列，酶切后可产生一定的粘性末端，便于与具有相同粘性末端的另一DNA片段连接。 衔接头（adaptor）：化学合成的寡核苷酸，含有一种以上的限制性核酸内切酶识别序列。其一端或两端具有一种或两种内切酶切割产生的黏性末端。 底物位点优势效应：酶对同一个DNA底物上的不同酶切位点的切割速率不同。 激酶：对核酸末端羟基进行磷酸化的酶。 2.说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。 用属名第一个字母和种名的头两个字母组成的3个字母斜体的略语表示寄主菌的物种名以
第一章：绪论 思考题 1.什么是生物技术？生物技术所包含的内容及定义。 答：1）生物技术又称生物工程，指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和 其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需 产品或达到某种目的的技术。2）包括基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程、抗体工程、糖链工程、海洋生物技术及生物转化等。（具体定义见P1）。 2.生物技术药物的概念及分类。 答：1）指采用DNA重组技术或其他生物技术生产的用于预防、治疗和诊断疾病的药物，主要是重组蛋白或核酸类药物。2）a.按照用途：预防、诊断、治疗；b.按作用类型：细胞因子类、激素类、酶类、疫苗、单克隆抗体类、反义核酸、RNA干扰类、基因治疗药物；c.按照生化特性：多肽类、蛋白质类、核酸类、聚乙二醇化多肽或蛋白质。 3.生物技术药物在理化性质、药理学与作用、生产制备和质量控制方面的特性。 答：1）理化性质（从药物多是蛋白质或核酸出发）：a.相对分子质量大；b.结构复杂；c.稳定性差；2）药理学作用：a.活性与作用机制明确；b.作用针对性强；c.毒性低；d.体内半衰期短； e.有种属特异性； f.可产生免疫原性；3）生产制备特性：a.药物分子在原料中含量低；b.原料 中常存在降解目标产物的杂质；c.制备工艺条件温和；d.分离纯化困难；e.产品易受有害物质 污染；4）质量控制特性：a.质量标准内容的特殊性；b.制造项下的特殊规定；c.检定项下的特殊规定。 4.生物技术制药的概念和主要研究内容与任务。 答：1）指利用基因工程、细胞工程等生物技术的原理和方法，来研究、开发和生产预防、治 疗和诊断疾病的药物的一门科学。2）主要研究内容与任务：a.生物制药技术的研究、开发与应用；b.利用生物技术研究、开发和生产药物。 第二章：基因工程制药 思考题 1.简述基因工程制药的基本原理和基本流程。 答：1）利用重组DNA技术将外源基因导入到宿主菌或宿主细胞进行大规模培养和诱导表达以获取蛋白质药物的过程称为基因工程制药。2）目的基因的获得、表达载体的选择、目的基因与载体的连接、重组DNA转入到宿主细胞、重组子的筛选与鉴定、工程菌的发酵表达重组蛋白、表达产物的分离纯化、重组蛋白制剂的生产。 2.与化学药物相比较，基因工程药物有什么特点？ 答：a.基因工程药物是由活细胞代谢产生的；b.基因工程药物的相对分子质量要远远大于一 般的小分子化学药物；c.在制备基因工程药物时，需要除去宿主蛋白和核酸残留，同时还要 防止其他物质的污染，而化学药物大多是通过组合合成的，杂质是原料残留及反应副产物 等。 3.原核与真核表达体系各有什么优缺点？哪些蛋白质需要用真核表达体系？ 答：1）原核表达体系优点：宿主遗传背景清楚，商品化菌种齐全，方便购买；原核细胞操作简便、繁殖快、周期短；大规模生产成本低，产量较高；下游纯化工艺简单，易于控制，生 产效率高；缺点：缺乏蛋白质折叠和翻译后加工系统；分泌能力不足，真核蛋白质常形成不 溶性的包含体，表达产物需经变性、复性才恢复活性；有的表达系统，如大肠杆菌有内毒素，很难除去；大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。