大肠杆菌和大肠菌群计数方法
Enumeration of Escherichia coli and the coliform
章节内容：
?传统检测大肠菌群和大肠杆菌的方法
?LST-MUG法检测冷藏和冷冻食品中的大肠杆菌
（除双壳类软体动物制品外）
?瓶装水检测方法
?贝类和贝类肉制品检测方法
?柑桔类水果汁中大肠杆菌检测方法
?大肠菌群和大肠杆菌计数的其他方法
?参考文件
大肠埃希氏菌，以前常称大肠杆菌，于1885年由德国儿科医生Theodor Escherich 发现，广泛存在于人类和温血动物的肠道中，是人类和动物肠道中需氧性共生菌的优势菌群，维持宿主健康部分生理功能必需的肠道菌。
大肠埃希氏菌属肠杆菌科，肠杆菌科包括许多种细菌，致病菌有沙门氏菌、志贺氏菌、和耶尔森氏菌。虽然大多数的大肠埃希氏菌为非致病菌，但是当宿主免疫力降低或细菌侵入肠道的外组织或器官时，可引起肠外感染。某些血清型可产生毒素，为致病性大肠埃希氏菌，可引起人类腹泻。
1892年，Shardinger建议把大肠杆菌作为粪便污染的指标。由于大肠杆菌广泛存在于人类和动物中，而在其他地方少见。再者，大肠杆菌能发酵葡萄糖（以后改为为乳糖）产生气体。与已知的非产气致病菌容易区别开来。
因此，大肠杆菌的检测已成为水和食品的近期粪便污染指标，表明可能含有致病菌。肠道中柠檬酸盐菌，克雷伯氏菌和肠杆菌能发酵乳糖，与大肠杆菌的生物型非常相似，使得把大肠杆菌作为健康威胁的指标，在实际应用中很复杂。于是，大肠菌群这个术语用来描述这类肠道菌，大肠菌群不是一个分类学上的定义，而是一个工作定义，指的是一群在35℃培养48h，产酸产气的，革兰氏阴性的芽孢杆菌。1914年，每国公共健康协会把大肠菌群作为一个重要的卫生标准。
虽然大肠菌群很容易检测到，但不一定与粪便污染有关系，因为在自然环境样品中也常存在。于是，粪大肠菌群就作为粪便污染的指标。首先由Eijkman提出，指的是在高温下发酵乳糖，是总大肠菌群的亚群，同时也称为耐热大肠菌群。粪大肠菌群的检测，除水、贝类、贝类养殖水在44.5℃进行，其他所有食品都在45.5℃进行。粪大肠菌群包含绝大部执蟪Ω司? 克雷伯氏菌也作为粪大肠菌群,但克雷伯氏菌的检出被认为与粪便污染并无关系。因此,大肠杆菌又被作为一个重要指标。快速鉴定大肠杆菌的新方法采用，使检测大肠杆菌相对容易了。
现在,在不同的应用中,大肠杆菌,大肠菌群和粪大肠菌群这三种类型作为污染指标。大肠菌群常用于水或食品加工过程中卫生状况的指标。粪大肠菌群用于贝类和贝类养殖水的标准指标。大肠杆菌用于近期粪便污染或不卫生的处理过程指标。几乎所有的检测方法都是基于发酵乳糖。最可能数值法(MPN)是一种统计学方法,包括近似确证和完全验证。在检测过程中,样品要进行系列稀释。实验操作要记录发酵乳糖产气的阳性管数,然后进行另外两步实验,利用阳性结果查统计表(见附录2),估计细菌的数量,仅前两步用于检测大肠菌群和粪大肠菌群,所有三步用于检测大肠杆菌。3管 MPN法用于检测大部分食品,5管 MPN法用于检测水,贝类和贝类养殖水。10管MPN法用于检测瓶装水或估计本样品为受到严重污染.
另外还有一种固体平板计数法,使用VRBA培养,其含有中性红作指示剂,当发酵乳糖时产生红色菌落。还有一种膜过滤法检测大肠菌群和粪大肠菌群,主要根据发酵乳糖产酸形成不同的菌落颜色。本章节也介绍荧光法检测大肠杆菌；检测贝类的特殊方法；一种简单的瓶装水检测方法；和一种与HACCP法规中相关的检测柑桔类水果汁
中大肠杆菌的方法.
1. 传统方法检测大肠菌群、粪大肠菌群、和大肠杆菌
A．设备和材料
1.水浴箱：44.5±0.2℃，水浴箱中的水应高于试管中的培养基液面。
2.插入型温度计：1-55℃，大约长55cm，精度为0.1℃，必须经NIST或相关部门检
测合格
3.培养箱：35±1.0℃
4.电子天平：感量0.1g，称量范围大于2Kg
5.均质器或均质瓶（见第1章）
6.无菌吸管：1.0ml和10.0ml
7.无菌器皿：（用于样品处理）
8.无菌稀释用带盖玻璃瓶
9.菌落计数器或同等产品
10.长波紫外灯:（-365nm）不超过6w
11.PH计
B．培养基和试剂
煌绿乳糖胆盐肉汤，2% （M25）
LST肉汤（M76）
EC肉汤(M49)
L-EMB琼脂（M80）
胰蛋白胨（色氨酸）肉汤（M164）
MR-VP肉汤（M104）
Koser枸橼酸盐肉汤（M72）
PCA（标准方法）（M124）
Butterfield`s磷酸盐缓冲液（R11）或同等稀释液（贝类除外）
Kovacs`试剂（R38）
V-P试剂（R89）
革兰氏染色液（R32）
甲基红指示剂（R44）
结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）（M174）
VRBA-MUG琼脂（M175）
EC-MUG培养基（M50）
LST-MUG肉汤（M77）
0.1%蛋白胨水稀释液（R56）
C、MPN法—用于大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌的计数
称取50g样品加入高速捣碎杯中，见第1章或现在FDA器械。冷冻样品在2-5℃解冻(≤18h)，但不要融化。加入450ml 磷酸盐缓冲液，搅拌2分钟，如果样品量小于50g，称取一半样品加入足够体积的无菌稀释液，制成1：10的样品液，在捣碎杯中的液体应完全覆盖刀片。稀释倍数根据大肠菌群对样品的污染情况，用稀释液将样品制成一系列十倍递增的样品稀释液，以30cm幅度于7s内将样品振摇25次（或以器械振摇器震荡）。选择适宜的三个连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种3管LST，每管接种1ml，以一定的角度，使吸管的尖部在试管壁上停留2-3s，从制备样品匀液至稀释完毕，全过程不要超过15min。
（注意：用5管MPN法检测贝类食品和贝类养殖水）将接种的LST管放置35℃培养，检查和记录在24±2h时倒管内产气的试管，未产气的试管继续培养24h，在48±2h 时检查和记录产气情况，对所有产气的试管进行确证试验。
D、MPN法—大肠菌群确证试验
将所有LST肉汤产气管，用接种环接种一环到煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤中。置BGLB 试管于35℃培养48±2h，记录所有BGLB肉汤管的产气管数。按BGLB肉汤产气管数，查MPN表（见附录2 ），计数出大肠杆菌的最可能数值。
E、MPN法—粪大肠菌群和大肠杆菌确证试验
从产气LST肉汤管中接种一环培养物到EC肉汤管中（木制接种棒也可以使用）。将所有接种的EC肉汤管放入带盖水浴箱中，45.5℃培养24±2h，检查产气情况。如果不产气，继续培养至48±2h，检查产气情况。按产气管数，查MPN表计数出粪大肠菌群MPN值。继续大肠杆菌分析，按以下F部分进行。EC肉汤MPN方法可用于海
水和贝肉类的粪大肠菌群检测。
注意：除水、贝类和贝类养殖水中的粪大肠菌群检测的培养温度为44.5±0.2℃外，其他所有食品中粪大肠菌群的培养温度为45.5±0.2℃。
F、MPN法—大肠杆菌的完全测定
进行大肠杆菌完全测定前，轻轻摇匀产气的EC肉汤试管，取产气管的培养物划线接种于伊红美蓝平板（L-EMB），35℃培养18-24h，检查L-EMB平板上有无具黑色中心的有金属光泽或无金属光泽的扁平菌落。挑取5个典型菌落接种到PCA斜面培养基上，35℃培养18-24h，进行进一步检测。
注意：检测5个可疑菌落中任何一个为大肠杆菌，都可以确证EC肉汤管为阳性。因
此，并非5个菌落都必须检测。
革兰氏染色：所有为革兰氏染色阴性短杆菌的培养物，都应进行IMVIC生化反应检测和重新接种到LST肉汤进行产气确证试验。
吲哚试验：将PCA斜面纯培养物接种到胰蛋白胨肉汤中，35℃培养24±2h，加Kovacs 氏试剂0.2-0.3ml。上层出现明显红色为靛基质阳性反应。
VP试验：将纯培养物接种到MR-VP肉汤中，35℃培养48±2h，以无菌操作称取培养物1ml至13*100mm试管中，加入0.6mlα-萘酚溶液，0.2ml 40%KOH溶液和少许肌酸结晶。振摇试管后静置2h。如出现伊红色，为VP阳性反应。
甲基红试验：在VP试验完后，试管中MR-VP培养物剩余部分继续在35℃培养48±2h；滴加5滴甲基红溶液，培养物变为明显红色为甲基红试验阳性，若变为黄色则为阴
性反应。
柠檬酸盐试验：接种纯培养物到Koser’S枸橼酸盐肉汤中清澈液体，避免接种量过量产生浑浊。35℃培养96h，培养物为明显浑浊为阳性反应。
发酵乳糖产气试验：接种纯培养物到LST肉汤中，35℃培养48±2h，产气或轻轻摇
动试管产生气泡为阳性反应。
结果报告：所有培养物（A）在35℃培养48±2h内发酵乳糖产酸产气（B）革兰氏阴性无芽孢杆菌（C）IMVIC试验为+ + - -或- + - -为大肠杆菌。再根据EC肉汤中阳性管数（连续3个稀释度）查MPN表（见附录2）计算出每克（毫升）样品大
肠杆菌MPN值。
注意：可以选用API20E或VITEK生化分析，鉴定大肠杆菌，替代IMVIC生化试验。
G．大肠菌群固体培养基测定法
按照生产厂家说明制备结晶紫中性红琼脂（VRBA）冷至48℃时备用。样品制备按照
以上I.C部分制备。
每个稀释度分别移取2个1ml样品液到2个灭菌平皿中,根据细菌受损和挤压的程度。取10ml冷至48℃的VRBA培养基加入平皿中，小心旋转平皿，将培养基与样品液充分混匀。待琼脂凝固后，再加入5mlVRBA培养基覆盖平板表层，以防止细菌蔓延生长。如果细菌细胞受损严重，需要复苏修复，取8-10ml冷至48℃的胰蛋白胨大豆琼脂，将培养基与样品液充分混匀，在室温中放置2±0.5h，再加入8-10ml冷
至48℃的VRBA培养基覆盖平板表层。
把凝固后的平板，35℃倒置培养18-24h，检测乳制品时，放置32℃培养18-24h，用带光源的放大镜下检查平板。选用有25-250个菌落的平板，计数平板上出现的典
型大肠菌群，典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5mm 或更大。为了确证大肠菌群，从VRBA平板至少挑取10个典型菌落，接种于BGLB 肉汤内，35℃培养24h和48h，观察产气情况。
注意：将出现产气的BGLB肉汤管判为大肠菌群阳性。对形成菌膜的阳性管应进行革兰氏染色，以便挑除革兰氏阳性杆菌。每克样品中的大肠菌群数量等于经最后证实为阳性的试管百分比乘以VRBA上的可疑菌落，再乘以稀释倍数。
另外一种方法：大肠杆菌可以与大肠菌群进行区别，在每毫升VRBA覆盖琼脂中加入100ug MUG，经培养后，大肠杆菌在长紫外灯下出现蓝色荧光。（详见LST-MUG部分
Ⅱ）
H、膜过滤法(MF)检测大肠菌群：见部分Ⅲ，瓶装水检测。
注意：由于大多数食品容易粘在膜上，因此，MF法最适合于检测水样品，MF法也可
用于含微量颗粒少的液体食品。
Ⅱ.LST-MUG法检测冷藏和冷冻食品中大肠杆菌(除双壳类软体动物制品外) LST-MUG法原理基于β-葡萄糖苷酶能降解MUG成4-MU，在长紫外灯下时（365nm），MU在菌落周围培养基显示出蓝色荧光，非常容易辨别。95%以上的大肠杆菌产生β-葡萄糖苷酶（包括一些不产气的菌株），而大肠杆菌O157：H7不产生此酶。经常通过β-葡萄糖苷酶来区别大肠杆菌与大肠杆菌O157：H7，虽然β-葡萄糖苷酶阳性的O157：H7确实存在。肠杆菌科中除了一部分志贺氏菌（44-58%）和沙门氏菌（20-29%）含有此酶以外，其他细菌都不含有此酶。
因此，从公共卫生角度来分析，并不认为通过β-葡萄糖苷酶来检测致病菌出现疏
忽是一个缺点。
β-葡萄糖苷酶的活性是受催化抑制影响的，有些大肠杆菌为β-葡萄糖苷酶阴性，甚至有时携带有编码这个酶的Vida基因。然而，在研究表明，大约96%的大肠杆菌为β-葡萄糖苷酶阳性而不需要此酶的诱导。除一些培养基外，例如EMB培养基，含有一些荧光物质，会掩盖MU荧光，MUG能加入几乎任何培养基中进行大肠杆菌检测。当MUG加入LST中后，大肠菌群可以通过发酵乳糖产气进行检测，大肠杆菌可以在长紫外灯光观察荧光进行检测，这样可以在24h内进行大肠杆菌近似鉴定。LST-MUG培养基已经被AOAC作为对除贝类外的冷藏和冷冻食品的大肠杆菌检测。对于MUG分析的方法可联系Peter Feng博士、FDA、CFSAN、大学公园、MD、20740、
301-436-1650
注意：观察LST-MUG试管的荧光时，应在黑暗处长紫外灯（365nm）下，手提式6w 的紫外灯完全可以满足要求且非常安全。当使用更大功率的紫外灯时，例15w紫外灯，应带上防紫外线的眼镜和手套。同时，在采用MUG方法前，检测所有玻璃试管是否本身含有荧光，有时二氧化铈加入玻璃中进行质量控制检测，在紫外灯下会产生荧光，干扰MUG检测。因此，在MUG检测方法中，把阳性菌株和阴性菌株进行对
照非常必要。
1、设备和材料：见前面部分I.A
玻璃试管：新的、一次性（100*16mm）
玻璃试管：新的、一次性（50*9mm）
长紫外灯6w或相当的。
2、培养基和试剂：见前面部分I.B
3、 LST-MUG法近似检测大肠杆菌
除了LST-MUG肉汤代替LST肉汤外,样品制备和检测过程与前面部分I相同,需用β-葡萄糖苷酶阳性大肠杆菌(ATCC25922)和阴性肠杆菌(ATCC13048)作对照。35℃培养24至48±2h,检查产气和浑浊的试管，然后在长紫外灯下(365nm)观察荧光，呈现蓝色荧光的为大肠杆菌假定阳性。Moberg研究表示，使用荧光方法，24h判定大肠杆菌的准确度为83-95%，48h后判定准确度为96-100%。进一步证实实验，接种一环假定阳性试管的培养物到L-EMB培养基上，35℃培养24±2h，接着往下的操作方法
与前面部分I相同。
Ⅲ.瓶装水大肠菌群和大肠杆菌检测方法
瓶装水的消耗量在全球范围内迅速升高，仅在美国，1988年就消耗了36亿加仑的瓶装水(国际瓶装水协会，Alexandria，VA)不象常用水，是由美国EPA监管，瓶装水在美国法律上定义为食品，是由FDA监管。FDA定义瓶装水为装在密封瓶中或其他容器中的水，不含有任何添加剂，除一些安全抗菌剂外，在限制范围内，有些被添加了氟化物。瓶装水本身就是一种饮料或作为其他饮料的一种成分。这些法规不适合于软饮料或其他相似饮料，除瓶装水或饮用水外，在FDA CFR103节也定义了不同类型的瓶装水来满足一定的标准。这些定义包括“自流井水”、“地下水”、“矿物质水”、“纯化或纯净水”、“苏打瓶装水”、“泉水”和“井水”。另外“无菌水”美国药品局定义为经无菌检测后合格的水.
在瓶装水中，大肠菌群并不一定是致病菌，而且很少检测出，但是作为一个卫生指标或可能受到微生物污染的指标，大肠菌群作为瓶装水质量控制是一个非常有用的指标。但有些国家也检测其他的微生物数量作瓶装水的质量指标。在现有瓶装水质量标准下，FDA已经建立了一套检测大肠菌群的方法，可通过膜过滤法或10管MPN 法。详细的标准方法可联系Peter Feng博士、FDA、CFSAN、大学公园、MD、20740、
301-436-1650
1. 设备和材料
a. 培养箱,35±0.5℃
b. 滤器：玻璃的,塑料的或不锈钢的
c. 紫外灭菌室,进行滤器灭菌
d. 过滤管或真空瓶
e. 真空源(电动真空泵或其他)
f. 滤膜:无菌白色或隔栅直径47mm,孔径0.45um
g. 平皿:无菌塑料的大小50*12mm 带盖
h. 无齿镊子
2. 培养基
a. LST肉汤(M76)
b. BGLB肉汤(M25)
c. M-ENDO培养基或LES ENDO琼脂
3. 10管近似MPN法检测和确证大肠菌群
在线瓶装水的检测：取100ml样品水，从中取10ml加入2 倍浓度的LST肉汤管中，共10管。35℃培养24±2h，观察是否产气(含有小导管)，或轻轻摇动试管，产生气泡为阳性管。如果为阴性管，继续培养24h，观察是否产气。
确证实验
把产气的LST管轻轻摇匀，用直径为3.0-3.5mm的无菌接种环接种一环或几环到BGLB肉汤中，也可用木制小钩接种，插入液面下2.5cm处。
把接种的BGLB肉汤放置35℃培养48±2h，检查产气情况。根据10管MPN表
(9221.III)P.9-52(水和污水的标准检测方法)计数出大肠菌群的MPN数。
4. 膜过滤法检测大肠菌群
过滤样品液100ml，把膜转移到M-Endo培养基中或LES Endo培养基上，35℃培养22-24h低倍显微镜计数, 大肠菌群为红色菌落或暗红色菌落,并有绿色金属光泽,
有时菌落中心或整个菌落显金属光泽.
确证实验:
滤膜上的有金属光泽的菌落在5-10之间，则分别挑取所有菌落，接种到LST肉汤中，35℃培养48h。滤膜上的有金属光泽的菌落10个以上时,随机选取10个菌落,分别接种到LST肉汤中,任何LST肉汤产气的培养物,再转接到BGLB肉汤中, 35℃培养48h,任何BGLB肉汤中产气的试管,确证为大肠菌群,计数出每100ml样品液中所有大
肠菌群数.
注意:1998年第20版P.9-60允许同时接种到LST肉汤或BGLB肉汤中培养.由于BGLB 有强抑制性,因此,此方法规定从LST产气,再转接到BGLB中培养是有更好灵敏度的.
Ⅳ.贝类和贝肉中大肠菌群检测方法.
官方FDA检测国产和进口的双贝类全部参考APHA1970年第四版,<<海水和贝类的检测方法>>.此方法包括传统的5管MPN法检测大肠菌群和粪大肠菌群,和标准细菌总数计数法,本方法适用于检测双贝类、鲜无壳肉、鲜无壳冷冻肉和半壳中冷冻双贝类,不适合于检测螃蟹、龙虾和虾米，或经预处理的双贝类肉制品,例烘烤、预炒和热处理的。许多其他方法用于检测环境水和双贝类养殖水此处不包括。美国EPA进行环境水的检测，贝类养殖水的质量控制，分别由各个州自行检测。
1. 样品的制备：
随机挑选10-12个贝类，从中称取200g贝肉液体或贝肉，用200ml无菌磷酸盐缓冲
液或0.5%蛋白胨水进行样品1∶2稀释均质2min。泥土中贝类样品的分析需在均质后2min内开始，用0.5%无菌的胰胨水或无菌的磷酸盐缓冲液进行系列样品稀释。
2. MPN法-大肠菌群近似检测和确证
取分装有乳糖肉汤（M74）或LST肉汤（M74）的试管，进行以下实验：
a. 取5支试管，每管加入2ml均质液（相当于1g贝类）
b. 取5支试管，每管中加入2ml 1∶10稀释液（相当于0.1g贝类）
c. 取5支试管，每管中加入2ml 1∶100稀释液（相当于0.01g贝类）
d. 取5支试管，每管中加入2ml 1∶1000稀释液（相当于0.001g贝类）
若结果不准确时，需进一步稀释。放置于35℃培养，余下的实验方法与1.C部分和
上面的1.D相同。
但结果报告时，此处是每100g样品中的MPN数，而不是1g样品中的MPN数。
3、MPN法-贝肉中粪大肠菌群的近似计数和确证实验
近似的检验方法同前面的第2部分。
确证实验：从阳性的LST肉汤中，接种一环到EC肉汤中，置于带盖的水浴箱中，44.5±0.2℃培养24±2h。EC肉汤中产气的管为确证的粪大肠菌群，根据前面的方
法计算出MPN数。
4、 MPN法————EC-MUG法检测贝肉中大肠杆菌
前面章节的MUG法也可用检测贝鱼肉中的大肠杆菌，但需稍做修改，由于贝鱼肉中含有天然的β-葡萄糖苷酶活性，例如：牡蛎肉样品加入LST-MUG培养基会产生假阳性。因此，贝类肉中大肠杆菌检测，加MUG到EC肉汤中，44.5℃培养，按传统
5管进行粪大肠菌群确证实验。
通过在紫外灯下可以进行大肠杆菌的MPN计数。
贝类中粪大肠菌群的检测，以EC-MUG肉汤替代EC肉汤，其他的操作方法与部分3相同。检测EC-MUG肉汤中荧光，还需做3个对照，一管为大肠杆菌阳性菌，一管为肺炎克雷伯氏菌作荧光阴性对照，一管为空白对照，水浴培养。
待检测样品、阳性对照同时置44.5±0.2℃培养24h，按上面LST-MUG法检测荧光。注意有些大肠杆菌不产气，但荧光阳性。计数每个稀释度的所有产荧光的阳性管数，根据MPN表，计数出大肠杆菌的MPN数。
材料和试剂部分见上面的1.A和1.B，可用商品化的脱水的培养基。也可配制培养基，把MUG（0.05g/L）加入EC肉汤中（M50），以下的几个厂家的MUG可以使用。分装新玻璃试管（100*16mm）每管5ml，并加入一个新的倒管，121℃高压灭菌15min，室温下可保存一周，冰箱可保存一个月以上。
V. 柑桔类水果汁中大肠杆菌检测
检测大肠杆菌可做果汁受到污染与否的指标，和没有灭菌的果汁在HACCP过程中影响效果。通常用于大肠杆菌检测的MPN标准法，由于果汁偏酸性（PH3.6-4.3），干扰实验，因此检测果汁中的大肠杆菌并不是那么令人满意，而且仅允许取样品
3.33ml。并不象大多数检测大肠杆菌的方法，需许多步骤，以下方法很简单，可检测10ml样品，命名为改良Colicomplete（cc）法，是AOAC管方方法992.30的改良，用MUG法检测大肠杆菌（LST-MUG法）
1. 设备和材料
水浴箱：44.5±0.2℃ 水平面高于培养基表面
培养箱：35.5±0.5℃
长紫外灯（-365nm） <6w
2. 培养基和试剂
UPEB肉汤（M188）
EC培养基（M49）
Colicomplete（CC）碟——Biocontrol，Bellview，WA
3. 样品准备、增菌和鉴定
取10ml果汁加90mlUPEB增菌液，混匀，35℃培养24h，做2个重复。接种1mlUPEB 增菌液到9ml含CC碟的EC肉汤中，放置水浴箱中44.5℃培养24h，同时以MUG阳性的大肠杆菌和MUG阴性的肺炎克雷伯氏菌试管作对照，在暗处检查是否有荧光，
大肠杆菌为蓝色荧光。
Ⅵ.其他检测大肠菌群和大肠杆菌的方法
附录I表中列出一些可用的检测方法，许多方法都是使用荧光试剂，例如MUG或显色产物用于近似检测食品中的大肠菌群和大肠杆菌。大部分检测方法前后被AOAC 官方采纳，例如：Petrifilm法、HGMF/MUG法、CC法等。许多改良的膜过滤法用于检测大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌，其中一部分用于牛奶和乳制品中检测，大部分用于饮用水、环境水和贝类养殖水的检测。
大肠菌群是经常用来衡量食品卫生情况的重要指标，绝大部分食品都会要 求检测的项目。在食品微生物实验室里，大肠菌群和菌落总数的检测频次应该是最高的，但检测过程中总会有一些小问题困扰着大家，以下来讲解一下大肠 菌群平板计数法的注意事项。 方法选择 相比于MPN计数法，平板计数法更适用于大肠菌群含量较高的食品。但大肠菌群多少算是含量较高呢国标里没有明确规定，但通常认为，产品大肠菌群以100CFU/g（mL）为界，超过这个含量一般认为是含量较高。但具体什么时候选用平板计数法进行大肠菌群的检测，大部分情况还是要看你的产品执行的标准。假如产品标准要求大肠菌群含量的单位为CFU/g（mL），那必须选用平板计数法。若是/g(mL)或者MPN/100g(mL)，就应选择MPN计数法，MPN法具体选用哪版国标 此处不再赘述。因此，根据自己产品的情况选择适当的检测方法。 培养基的要求 平板计数法使用的培养基为结晶紫中性胆盐琼脂培养基，简称VRBA。无论是国标，还是培养基的使用说明中都明确表示，VRBA是不需要进行灭菌的，煮沸2min即可使用。特地点出这一点是因为很多朋友都在问VRBA的灭菌条件，对不灭菌的培养基不信任，害怕出现检测异常，那是因为这些小伙伴们对其中的原理不清楚。大肠菌群的定义是在一定培养条件下能够在发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，因此大肠菌群是不能形成芽孢的，在VRBA培养基煮沸的过程中，即使有大肠菌群存在也会被杀灭，所以从培养基带入污染的可能性是没有的。当然盛装培养基的容器是需要进行灭菌的，以免容器引入污染。另外，VRBA是一种选择性的培养基，含有的结晶紫对革兰氏阳性菌有比较强的抑制作用而对革兰氏阴性菌几乎没有作用，而且平板培养产生的菌落还需要进行复发酵的验证，因此VRBA培养基就不需要进行灭菌了。但值得注意 的是，VRBA需要现配现用，配制出的培养基应当在3h之内使用完毕。 稀释度的确定 国标中要求选择2-3个适宜的连续稀释度。什么样的稀释度是合适的呢这要根据计数来决定。计数环节要求选择菌落数在15CFU-150CFU的平板进行计数，
食品微生物检验技术课程综述 大肠杆菌的检测（MPN计数法） 院系：食品科学与药学学院 班级：食科114 姓名：张花 学号： 114031431 组长：张军玲 成员：张花 赵晶郁 朱娟娟 大肠杆菌Petrifilm测试片计数法 摘要 食品检测是反映食品加工、贮藏、运输、等环节的卫生与安全状况的重要手段，而大肠菌群检测则是食品检测的重要指标均之一。根据定义大肠菌群是在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和碱性厌氧的革兰氏阴性芽胞杆菌。其主要检测意义在于反映食品卫生状况并推测其在肠道致病菌的可能性。Petrifilm大肠菌群测试片是由美国3M生产的一种预先制备好的VRB平板培养基系统，并添加了TTC作为菌落指示剂便于菌落判读，而上层薄膜可以起到对大肠菌群发酵产生的气体截留的作用。该方法目前已被多数权威机构认可，并在国内很多实验室开展运用。 关键词大肠杆菌 Petrifilm测试法
1设备和材料 1.1恒温培养箱：36±1℃。 1.2冰箱2~5℃。 1.3恒温水浴箱:44.5±0.2℃。 1.4天平：感量0.1g。 1.5均质器 1.6振荡器。 1.7无菌吸管：lmL(具0.01 mL刻度)、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 1.8无菌锥形瓶：容量500mL。 1.9 玻璃珠:直径约5mm。 1.10pH计或pH比色管或精密pH试纸 1.11试管架。 2. 培养基和试剂 2.1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（ LST ）肉汤。 2.2EC肉汤。 2.3蛋白胨水。 2.4缓冲葡萄糖蛋白胨水（MP-VP实验用）。 2.5磷酸盐缓冲液。 2.6无菌生理盐水:称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高 压灭菌15min。 2.71mol/L氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠溶于1000ml蒸馏
菌落总数(c f u)和大肠菌群(m p n)的区别
摘要：菌落总数和大肠菌群是食品中安全性指标，针对食品微生物检测中茵落总数结果很高但大肠菌群很低进行分析。 关键词：菌落总数；大肠菌群；食品 我国的国家标准绝大多数食品都制订了菌落总数和大肠菌群的指标，并对其数量做了详细的规定，菌落总数和大肠菌群是食品中安全性指标，是影响产品质量问题的常见指标，常常受到生产企业和消费者的高度父注，菌落总数的报告单位是cfu／g (ml )，大肠菌群的报告位是mpn／100g ( ml)，那么cfu，mpn 是什么含义呢，有的食品微生物检测中菌落总数结果很高但大肠菌群很低，有关企业对此不太理解，现在将做一下解释说明。 L菌落总数(cfu) 菌落总数是用来判定食品在被加工过程中被污染的程度及卫生质量的重要指标，食品的生产加工过程叶中，卫生质量的高低首先决定食品原料的来源．原料的卫生与否，是否被污染过，这是根本原因，其次是环境卫生水平的高低，再次就是加工人员和加工工具的卫生状况，要保证食品卫生安全就必须保证所加工的原料来源，环境，加工工具和人员符合卫生标准，但是如何判定食品生产加工过程中是否符合卫生要求，以便对被检产品做出一个科学的评价，菌落总数的多少在一定程度上反映出卫生质量的优劣，也可以用这一方法观察出食品中细菌的繁殖动态，以便于对被捡样品进行卫生评价时提供科学依据。 菌落总数中的菌落英文意思是(colony)，定义为细菌和其他几种做微生物在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼所识别的生长物，它是由数以万计的相同细菌聚集而成的，故又有细菌集落之称。各种细菌的菌落各自具有一定的特征，按其特征的不同可以在某种程度上鉴别某种细菌，为卫生检验提供依据，菌落总数是指在被检样品的单位重量( g )．体积(m1) 或表面积(clni) 内所含能于某种固体培养基上在一定条件下培养后所生成的细菌集落的总数。其培养的原理是以检样在被稀释到一定体积后，吸取一定量的检样，检样中的细菌细胞和培养基混合后，每个细菌细胞部形成一个肉眼可见的菌落的假设为基础的．由于检验中采用的是37℃有氧条件下培养。因而并不能测出每克或每毫升样品内的实际活菌数，其中的微嗜氧菌，厌氧菌，冷营养菌在此条件下都不能生长，有特殊营养要求的一些细菌的生长也受到了限制，因此培养的只是一群能在普通营养琼脂中发育中发育的嗜中温的需氧兼性厌氧的细菌总数，只有具备每种细菌生长要求的特定的环境条件，才能将所有细菌全部培养出来，因此要的到全部的茼落总数应将检样接种到不同的培养基上，但国家的食品卫生标准对食品中菌落总数的规定并不需要接种不同的非选择性培养基，原因就是标准所规定的数值全部是在37℃有氧条件下测定得出的。 Cfu是colong forming units的英文缩写，意思是菌落形成单位数，鉴于食品检样的细菌
https://www.doczj.com/doc/a13088854.html,/asphtml/GB071.htm https://www.doczj.com/doc/a13088854.html,/ 粪大肠菌群计数步骤GB/T 4789.39-2008 一、设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃ 。 2 冰箱：2℃~ 5 ℃ ． 3 恒温水浴箱：44.5 ℃±0.2 ℃ 。 4 天平：感量0.1g 。 5 均质器。 6 振荡器。 7 无菌吸管：1 mL （具0.01 mL 刻度）、10 mL （具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 8 无菌锥形瓶：容量500 mL 。 9 无菌培养皿：直径90 mm 。 10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 二、培养基及试剂 1月桂基硫酸盐胰蛋白胨（lauryl sulfate tryptose , LST ）肉汤 2 EC 肉汤（E.coli broth ) 3 无菌生理盐水：称取8.5g 氯化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中，121 ℃ 高压灭菌15 min。 4 4mol/L 氢氧化钠（NaOH ) ：称取40g 氢氧化钠溶于1 000 mL 蒸馏水中 5 1 mol/L 盐酸（HCl ）：移取浓盐酸90 mL ，用蒸馏水稀释至1 000 mL
操作步骤 6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品：称取25g 样品，置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min ~10000r/min 均质1 min ~2 min ，制成1：10 样品匀液，或置225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍打式均质器拍打1 min ~2 min ，制成1 : 10 的样品匀液。 6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取样品25 mL 置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1 : 10 的样品匀液。 6.1.3 样品匀液的pH 值应在6.5 ~ 7.5 之间，必要时分别用1 mol/L 氢氧化钠（NaOH ）或1 mol/L 盐酸（HCI ）调节。 6.1.4 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1：10 样品匀液1 mL ，沿管壁缓缓注人盛有9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1：100 的样品匀液。 6.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成10 倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1 支1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过巧min 。 6.2 初发酵试验 每个样品，选择3 个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3 管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST ）肉汤，每管接种1 mL （如接种量需要超过1 mL ，则用双料LST 肉汤）, 36 ℃±1 ℃ 培养24h±2h ，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h 。记录在24h 和48h 内产气的LST 肉汤管数。未产气者为粪大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。 6.3 复发酵试验 用接种环从所有48h±2h 内发酵产气的LST 肉汤管中分别取培养物1 环，移种于45 ℃ EC肉汤管中。
滤膜法-粪大肠菌群的测定 1、适用范围 本标准适用于地表水、地下水、及水中粪大肠菌群的测定。用于检验加氯消毒的水样时，在滤膜法之前，先做试验，证实它所得的数据资料与多管发酵试验所得的数据资料具有可比性。 2、原理 滤膜是一种微孔性薄膜。将水样注入已灭菌的放有滤膜（孔径0.45微米）的滤器中，经过抽滤，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜贴于M-FC培养基上，44.5℃温度下进行培养，计数滤膜上生长的此特性的菌落数，计算出每1L水样中含有粪大肠菌群数。 3仪器： 滤膜（孔径0.45微米）、滤器、接液瓶、垫圈、无菌镊子夹 3、培养基和试剂 本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂，实验室用水为新制备的去离子水。 M-FC培养基： 胰胨10g 蛋白胨5g 酵母浸膏 3.0g 氯化钠 5.0g 乳糖12.5g
胆盐三号 1.5g 1%苯胺蓝水溶10ml 1%玫瑰色酸溶液（溶于0.2mol/L氢氧化钠液中）10ml 蒸馏水1000ml 制法：将上述培养基中的成分（除苯胺蓝和玫瑰色酸外），置于蒸馏水中加热溶解，调节PH为7.4，分装于小烧瓶内，每瓶100ml，于115℃灭菌20min。储存于冰箱中备用，临用前，按上述配比，用灭菌吸管分别加入已煮沸灭菌的1%苯胺蓝溶液1ml及新配制的1%玫瑰色酸溶液（溶于氢氧化钠溶液）1ml，混合均匀。加热溶解前，加入1.2%～1.5%琼脂制成固体培养基。如培养物中杂菌不多，则培养基中不加玫瑰色酸亦可。 4、步骤 水样的选择：水样量的选择根据细菌受检验的特征和水样中预测的细菌密度而定。理想的水样体积是一片滤膜上生长20～60个粪大肠群菌落，总菌落数不超过200个。 滤膜及滤膜灭菌：将滤膜放入高压蒸汽灭菌锅里在121℃灭菌10min，滤器、接液瓶、垫圈分别用纸包好，在使用前经121℃灭菌20min，滤器也可用点燃的酒精棉球火焰灭菌。 过滤：用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，稳妥的固定好滤器。将适量的水样注入滤器中，加盖，开动真空泵即可抽滤除菌。培养：使用M-FC培养基。培养基含或不含琼脂，不含琼脂的培养基使已用M-FC 培养基饱和的无菌吸收垫。将滤过水样的滤膜置于琼脂或吸收垫表面。将培养皿紧密盖好后，置于能准确恒温于44.5℃±0.5℃的恒温培养箱或恒温水浴中，经
食品中大肠菌群计数测定的标准操作规 程 1目的 规范食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程。 2范围 本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms ）计数的方法。 本标准适用于食品中大肠菌群的计数。 3术语和定义 大肠菌群coliforms 在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 最可能数most probable number ，MPN 基于泊松分布的一种间接计数方法。 4责任 质量部组织制订、化验室负责实施。 5内容 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下: 恒温培养箱：36 C± 1 Eo 冰箱：2 E?5 Eo 恒温水浴箱：46 E± 1 Eo 天平：感量g o 均质器。 振荡器。 无菌吸管：1 mL （具mL刻度）、10 mL （具mL刻度）或微量移液器及吸头。 无菌锥形瓶：容量500 mLo
无菌培养皿：直径90 mm
pH 计或 pH 比色管或精密 pH 试纸。 菌落计数器。 培养基和试剂 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose , LST ）肉汤：见附录A 中。 煌绿乳糖胆盐（ Brilliant Green Lactose Bile 结晶紫中性红胆盐琼脂（ Violet Red Bile Agar 磷酸盐缓冲液：见附录 A 中。 无菌生理盐水：见附录 A 中。 无菌1 mol/L NaOH :见附录A 中。 无菌1 mol/L HCl ：见附录 A 中。 大肠菌群MPN 计数法 检验程序 大肠菌群MP 计数的检验程序见图1。 图1大肠菌群MPN 计数法检验程序 操作步骤 样品的稀释 固体和半固体样品：称取 25 g 样品,放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水 的无菌均质杯内，8000 r/min ?10000 r/min 均质1 min ?2 min,或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min ?2 min ,制成1:10的样品匀液。 液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水 的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的 样品匀液。 样品匀液的pH 值应在? 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调 节。 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL ,沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液 面），振摇试管或换用 1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成 1:100 ,BGLB 肉汤：见附录A 中。 ,VRBA :见附录A 中。
大肠菌群计数实验 MPN计数法 一、设备和材料 250ML锥形瓶3个 100ML烧杯1个 250ML量筒1个 1000ML烧杯1个 15*150mm试管3个 1ML刻度吸管4个 18*180mm试管20个杜氏小管 玻璃棒1个接种环1个 剪刀1把药匙2个 均质器天平（感量0.1g） 电炉洗耳球 二、实验准备 1、配制培养基： LST培养基的配制： 用天平称取17.8gLST培养基于锥形瓶中 加入500ML蒸馏水 加热煮沸至完全溶解 分装于装有杜氏小管的大试管中，每管10ML，共10管高温灭菌备用 BGLB培养基的配制： 用天平称取20gBGLB培养基于锥形瓶中 加入500ML蒸馏水
加热煮沸至完全溶解 分装于装有杜氏小管的大试管中，每管10ML，高温灭菌备用 2、生理盐水 取4.25g氯化钠于大烧杯中 加入500ML蒸馏水溶解 取225ML生理盐水于锥形瓶中 分别取9ML生理盐水于3只小试管中 将分装好的生理盐水进行高温灭菌 3、灭菌：将均质杯、100ML烧杯、刻度吸管、剪刀、接种环、洗耳球高温灭菌备用 三、取样 在提交的产品中随机抽取三箱，从每箱中随机抽取未打开包装的产品1袋~3袋，抽取不低于250g的样品作为微生物指标检验试样。 四、检验程序
五、操作步骤 初发酵试验 1、称取25g 样品，放人盛有225m生理盐水的无菌均质杯内，8 00or/min-10 000r/min 均质1 min-2 min ，制成1:10 的样品匀液。 2、用1ml无菌吸管吸取1:10 样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人9ml生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 3、换一只新的1ml无菌吸管吸取1:100样品匀液1ml，沿管壁缓缓注人9ml生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，使其混合均匀，制成1:1000 的样品匀液。 4、将三个连续稀释梯度的样品原液在进行10倍递增稀释时，吸取1 ml样品匀液于LST肉汤，每个稀释度接种三管。 5、同时做一组空白，在一支LST肉汤中接种1ml生理盐水。 6、 36℃±1℃培养24h±2h ，观察倒管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48h±2h 。记录在24h 和48h 内产气的LST 肉汤
食品安全国家标准 食品微生物学检验大肠菌群计数 1范围 本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。 本标准适用于食品中大肠菌群的计数。 2术语和定义 2.1 大肠菌群coliforms 在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 2.2 最可能数most probable number，MPN 基于泊松分布的一种间接计数方法。 3检验原理 3.1 MPN法 MPN法是统计学和微生物学结合的一种定量检测法。待测样品经系列稀释并培养后，根据其未生长的最低稀释度与生长的最高稀释度，应用统计学概率论推算出待测样品中大肠菌群的最大可能数。 3.2 平板计数法 大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸，在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色，带有或不带有沉淀环的菌落。 4 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 4.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 4.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。 4.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。 4.4 天平：感量0.1 g。 4.5 均质器。 4.6 振荡器。 4.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
4.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。 4.9 无菌培养皿：直径90 mm。 4.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 4.11 菌落计数器。 5 培养基和试剂 5.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中A.1。 5.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中A.2。 5.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中A.3。 5.4 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.4。 5.5 无菌生理盐水：见附录A 中A.5。 5.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中A.6。 5.7 无菌1 mol/L HCl：见附录A 中A.7。
实验一食品中大肠菌群的测定
大肠菌群(M.R.N.)的测定 一、实验目的： （1）了解大肠菌群在食品卫生检验中的意义 （2）学习并掌握大肠菌群的检验原理和方法，以判别食品的卫生质量 二、实验原理： 大肠菌群系指一群能在37℃经24h能发酵乳糖，产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义。它反映了食品是否被粪便污染，同时间接地指出食品是否有肠道致病菌污染的可能性。 食品中大肠菌群数系以每100g（或ml）检样内大肠菌群最近似数（the mo st probable number-简称MPN）表示。最近似数（most probable number-简称M PN）法是一种将样品“多次（管）稀释至无菌”的计数方法。将3个稀释梯度的检样稀释液接种于9支或15支试管培养基中，每个稀释度接种3支或5支。经培养后，根据结果查阅MPN检索表，就可得到原样品中微生物的估计数量。M PN测定方法尤其适用于带菌量极少、其他方法不能检测的食品。如水、乳制品及其他食品中大肠菌群的计数。 三、材料 1、样品 乳、肉、禽蛋制品、饮料、糕点、发酵调味品或其他食品。 2、菌种 大肠埃希氏菌（Escherichia coli） 产气肠杆菌（Enterobacteria aerogenes）
3、培养基及试剂 单料乳糖胆盐发酵管、双料乳糖胆盐发酵管、乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂（EMB）、革兰氏染色液、蛋白陈水、靛基质试剂、麦康凯(MA) 4、其它设备和材料 温箱(36土1)℃、水浴锅(44土0.5)℃、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针。 四、实验步骤 (一)检验程序 大肠菌群检验程序见图 (二)操作步骤
大肠菌群计数检验操作规程 一、目的 建立大肠菌群计数检验的标准操作程序，使操作过程规范化。 二、适用范围 适用于大肠菌群计数的检验操作。 三、职责 1.检验人员 严格按检验操作规程进行检验。 2.QC主管 监督检查执行情况。 四、程序 1.范围 本方法适用于大肠菌群计数（coliforms）的测定 2.术语和定义 2.1 大肠菌群：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性 无芽胞杆菌。 3. 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 3.1 恒温培养箱：36℃±1℃，30℃±1℃。 3.2冰箱：2℃～5℃。 3.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。 3.4天平：感量为0.1 g。 3.5均质器。 3.6振荡器。 3.7无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸
头。 3.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。 3.9无菌培养皿：直径90 mm。 3.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。 3.11菌落计数器。 4.培养基和试剂 4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A中A.1。 4.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A中A.2 4.3磷酸盐缓冲液：见附录 A中 A.3。 4.4无菌生理盐水：见附录 A中 A.4。 4.5无菌 1 mol/L NaOH：见附录 A中 A.5。 4.6无菌 1 mol/L HCl：见附录 A中 A.6。
5.检验程序 大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。 图1大肠菌群MPN计数法检验程序 6.操作步骤 6.1 样品的稀释 6.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1 min～2 min，或放入盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。 6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。 6.1.3样品匀液的pH值应在6.5～ 7.5 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl 调
大肠杆菌及菌落总数检测方法 为了对鸡精产品的微生物指标进行有效的控制，对微生物的检测就显的十分重要。 下面是鸡精产品的大肠杆菌及菌落总数实验检测方法。 一、大肠杆菌： 1）培养基准备（以3.5g乳糖胆盐发酵琼脂为例） 双料试管配制 A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。 B、用0.1g称量天平秤取7g乳糖。 C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入三根装有小导管的试管中（此三根为双料试管，即双倍原料）。 单料试管配制 A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。 B、用0.1g称量天平秤取3.5g乳糖。 C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入六根装有小导管的试管中（此六根为单料试管，即单倍原料）。 2）将配制好的试管放入灭菌锅进行115℃进行灭菌10min。3）将灭菌过后的试管放置在无菌室，常温保存一周。
4）若要对生产的样品检测其大肠杆菌，其步骤如下：A、量取灭菌后的蒸馏水225ml加温后与25g样品混合均匀。（样品需要在无菌室中，有封盖的塑料杯中进行混合） B、取三个玻璃培养皿，分别标上-1、-2、-3标记。 C、取两根新试管取9ml蒸馏水分别标为a、b。 D、用吸管吸取1ml样品液体，注入-1培养皿中，并盖上盖子。 E、用吸管吸取1ml样品液体，注入a试管中，记为-2培养基液。 F、用吸管吸取1ml a试管中的液体，注入到b试管中，记为-3培养基液。 G、用1ml吸管取样品液体分别注入3根单料试管中，用10ml吸管取样品液体分别注入双料试管中 H、用1ml吸管取-2培养试管液体，分别注入到单料试管中。 I、装好液体的试管，用试管塞封好，放到36℃±1℃的恒温培养箱中24小时培养。 J、24小时培养后，取出并用肉眼观察试管的颜色及冒气泡情况，若有其中的任意状况，说明有大肠杆菌，需要通过美兰做进一步的检测。 二、菌落总数的测定 1、取平板计数琼脂23.5g与100ml灭菌后的蒸馏水混合均
食品微生物学检验大肠菌群计数 1、范围：适用于食品中大肠菌群的计数 2、定义：在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。 3、设备和材料： 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 3.1 恒温培养箱：36℃±1℃。 3.2 冰箱：2℃~5℃。 3.3 恒温水浴箱：46℃±1℃。 3.4 天平：感量0.1g。 3.5 均质器。 3.6 振荡器 3.7 无菌吸管：1ml、10ml或微量移液器及吸头。 3.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。 3.9无菌培养皿：直径 90 mm。 3.10 pH计或pH比色管或pH试纸。 3.11菌落计数器。 4、培养基和试剂： 4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤； 4.2 煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤； 4.3结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）； 4.4磷酸盐缓冲液； 4.5无菌生理盐水； 4.6无菌1moL/L NaoH； 4.7 无菌1moL/L HCL。 第一法：大肠菌群 MPN计数法 5、操作步骤： 5.1样品的稀释 固体和半固体样品：称取 25 g 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质 1～2 min，制成 1:10 的样品匀液。 液体样品：以无菌吸管吸取 25 mL 样品置盛有 225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 1:10 的样品匀液。 样品均液的pH值应在6.5~7.5之间，必要时分别用1moL/L NaoH或1moL/L HCL调节。
大肠杆菌紫外线诱变及抗药性菌株筛选 0740063 阿噟兰 1.前言 抗生素能破坏细菌细胞壁的结构，使细菌的繁殖和生长受到抑制。但某些细菌对抗生素表现出抗性，原因是其基因发生了改变，产生能抵抗抗生素的性状。在自然情况下，细菌的基因突变率很低，而且突变是不定向的，因此在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。当给与适当的物理条件时，其突变率会大大增加。如当用α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等物理因素辐射时，能够促进遗传物质突变。DNA 对紫外线（UV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA 结构变化的形式有DNA 链断裂、碱基破坏、胸腺嘧啶二聚体等。因此，紫外线通常作为诱变剂，用于微生物菌种选育。一般细胞分裂越旺盛，诱变剂量越大，突变率高，诱变最有效的波长253~265 nm。选择合适的诱变剂量对于获得较高突变率十分关键，过高或过低的辐射剂量会导致菌株死亡或诱变不充分而降低诱变效果。 在紫外线诱变下，菌株发生不定向的突变，想要得到需要的特向变异必须对诱变后的菌株做筛选。本实验想要得到的是能够抵抗抗生素的菌株，因此可以用抗生素培养基作为筛选培养基对菌种进行筛选。若菌株没有发生定向突变，则该菌株不能在抗性培养基上正常生长，只有发生了定向突变才可能在筛选培养基上正常生长。 紫外线对于菌株有诱变作用外，对菌株还有较强的致死作用，因为紫外线改变了菌株的基因结构导致菌株无法正常生长繁殖。 因此，通过本实验的操作，在合适的照射剂量的设置下，比较不同不同照射剂量下的致死效果和突变率，并初步分析两者的相关性。在分析死亡曲线和诱变率曲线的基础上，能了解诱变育种的机理和方法，为做进一步的诱变实验做准备。 2.材料和方法 实验材料、仪器和试剂 菌种：大肠杆菌 仪器：超净台、离心机、高压灭菌锅、培养箱、磁力搅拌器、培养皿、涂布器、移液管、移液器 试剂：牛肉膏蛋白胨培养基相关试剂、硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml）、生理盐水 实验方法 2.2.1制备培养基 普通培养基——牛肉膏蛋白胨培养基（400ml）： 牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml 按配方配制好培养基后置于灭菌锅中115℃15min，倒平板，4皿*15ml*5组+2皿*15ml=22皿*15ml=330ml 筛选培养基(200ml)：含抗生素50mg/L。（卡那霉素属于氨基糖苷类抗生素，能结合细菌核糖体的30S亚基上的16SrRNA，阻断细菌蛋白质的合成。） 牛肉膏5g 蛋白胨10g Nacl 5g 琼脂20g 蒸馏水1000ml 硫酸卡那霉素水溶液（50mg/ml），按配方先不要加硫酸卡那霉素配制然后115℃15min灭菌，取出培养基后冷却至60℃时将硫酸卡那霉素加入培养基中，充分震荡混匀，倒平板，2皿*15ml*5组+2皿*15ml=12皿*15ml=180ml 2.2.2制备菌悬液（106 ~ 108个/mL） ①固体培养：大肠杆菌划线或涂布接种于固体培养基，37℃培养24-48h。 ②菌悬液：用适量生理盐水刮洗菌落，倒入一个无菌小三角瓶（或试管）中，充分振荡使菌
实验六食品中大肠菌群的测定一、概述 (一)大肠菌群的定义及范围 根据国家1994年颁布的食品卫生检验方法微生物学部分，大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在37℃、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属，其生化特性分类见表5-4。 表5-4 大肠菌群生化特性分类表
注：+，表示阳性；—，表示阴性；+/-，表示多数阳性，少数阴性。 由上表可以看出，大肠菌群中大肠艾希氏菌I型和Ⅲ型的特点是，对靛基质、甲基红、v-P和拘橼酸盐利用四个生化反应分别为“十十一一”，通常称为典型大肠杆菌；而其他类大肠杆菌则披称为非典型大肠杆菌。 (二)大肠菌群的测定意义 1、粪便污染的指标细菌 早在1892年，沙尔丁格(Schardinger)氏首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。一年后，塞乌博耳德“斯密斯(Theobold．Smith)氏指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的；从此，就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。 据研究发现，成人粪便中的大肠菌群的含量为：108个／g一109个／g。若水中或食品中发现有大肠菌群，即可证实已被粪便污染，有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。根据这个理由，就可以认为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不安全的。所以目前为评定食品的卫生质量而进行检验时，也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。当然，有粪便污染，不一定就有肠道病原菌存在，但即使无病原菌，只要被粪便污染的水或食品，也是不卫生的，不受人喜欢的。 2．粪便污染指标菌的选择 作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性，才能起到比较正确
规范食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程。 2范围 本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。 本标准适用于食品中大肠菌群的计数。 3术语和定义 大肠菌群coliforms 在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 最可能数most probable number，MPN 基于泊松分布的一种间接计数方法。 4责任 质量部组织制订、化验室负责实施。 5内容 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 冰箱：2 ℃～5 ℃。 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。 天平：感量 g。 均质器。 振荡器。 无菌吸管：1 mL（具 mL 刻度）、10 mL（具 mL 刻度）或微量移液器及吸头。无菌锥形瓶：容量500 mL。 无菌培养皿：直径90 mm。
pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 菌落计数器。 培养基和试剂 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中。煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中。结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中。 磷酸盐缓冲液：见附录A 中。 无菌生理盐水：见附录A 中。 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中。 无菌1 mol/L HCl：见附录A 中。 大肠菌群MPN 计数法 检验程序
大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。 图1 大肠菌群MPN 计数法检验程序 操作步骤 样品的稀释 .1 固体和半固体样品：称取25 g 样品,放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min,或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2
大肠菌群平板计数法的注意事项 大肠菌群是经常用来衡量食品卫生情况的重要指标，绝大部分食品都会要求检 测的项目。在食品微生物实验室里，大肠菌群和菌落总数的检测频次应该是最高的，但检测过程中总会有一些小问题困扰着大家，以下来讲解一下大肠菌群 平板计数法的注意事项。 方法选择 相比于MPN计数法，平板计数法更适用于大肠菌群含量较高的食品。但大肠菌群多少算是含量较高呢？国标里没有明确规定，但通常认为，产品大肠菌群以 100CFU/g（mL）为界，超过这个含量一般认为是含量较高。但具体什么时候选用平板计数法进行大肠菌群的检测，大部分情况还是要看你的产品执行的标准。假如产品标准要求大肠菌群含量的单位为CFU/g（mL），那必须选用平板计数法。若是/g(mL)或者MPN/100g(mL)，就应选择MPN计数法，MPN法具体选用哪版国标 此处不再赘述。因此，根据自己产品的情况选择适当的检测方法。 培养基的要求 平板计数法使用的培养基为结晶紫中性胆盐琼脂培养基，简称VRBA。无论是国标，还是培养基的使用说明中都明确表示，VRBA是不需要进行灭菌的，煮沸2min 即可使用。特地点出这一点是因为很多朋友都在问VRBA的灭菌条件，对不灭菌的培养基不信任，害怕出现检测异常，那是因为这些小伙伴们对其中的原理不清楚。大肠菌群的定义是在一定培养条件下能够在发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，因此大肠菌群是不能形成芽孢的，在VRBA培养基煮沸的过程中，即使有大肠菌群存在也会被杀灭，所以从培养基带入污染的可能性是没有的。当然盛装培养基的容器是需要进行灭菌的，以免容器引入污染。另外，VRBA是一种选择性的培养基，含有的结晶紫对革兰氏阳性菌有比较强的抑制作用而对革兰氏阴性菌几乎没有作用，而且平板培养产生的菌落还需要进行复发酵的验证，因此VRBA培养基就不需要进行灭菌了。但值得注意的是，VRBA 需要现配现用，配制出的培养基应当在3h之内使用完毕。 稀释度的确定 国标中要求选择2-3个适宜的连续稀释度。什么样的稀释度是合适的呢？这要根据计数来决定。计数环节要求选择菌落数在15CFU-150CFU的平板进行计数，因此培养后菌落数在这个范围内的稀释度就是适宜的稀释度。实验室经常检测的产品的大肠菌群的水平检测人员可以预计的，但是对盲样，我们能做的只有根据实
实验六食品中大肠菌群的测定 一、概述 (一)大肠菌群的定义及范围 根据国家1994年颁布的食品卫生检验方法微生物学部分，大肠菌群(coliform bacteria)系指一群在37℃、24h能发酵乳糖，产酸、产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。 大肠菌群主要是由肠杆菌科中四个菌属内的一些细菌所组成，即艾希氏菌届、拘橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属，其生化特性分类见表5-4。 表5-4 大肠菌群生化特性分类表 由上表可以看出，大肠菌群中大肠艾希氏菌I型和Ⅲ型的特点是，对靛基质、甲基红、v-P和拘橼酸盐利用四个生化反应分别为“十十一一”，通常称为典型大肠杆菌；而其他类大肠杆菌则披称为非典型大肠杆菌。 (二)大肠菌群的测定意义 1、粪便污染的指标细菌 早在1892年，沙尔丁格(Schardinger)氏首先提出大肠杆菌作为水源中病原菌污染的指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。一年后，塞乌博耳德“斯密斯(Theobold．Smith)氏指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染造成的；从此，就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌。 据研究发现，成人粪便中的大肠菌群的含量为：108个／g一109个／g。若水中或食品中发现有大肠菌群，即可证实已被粪便污染，有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。根据这个理由，就可以认为这种含有大肠菌群的水或食品供食用是不安全的。所以目前为评定
食品的卫生质量而进行检验时，也都采用大肠菌群或大肠杆菌作为粪便污染的指标细菌。当然，有粪便污染，不一定就有肠道病原菌存在，但即使无病原菌，只要被粪便污染的水或食品，也是不卫生的，不受人喜欢的。 2．粪便污染指标菌的选择 作为理想的粪便污染的指标菌应具备以下几个特性，才能起到比较正确的指标作用。 ①存在于肠道内持有的细菌，才能显示出指标的特异性。 ⑧在肠道内占有极高的数量，即使被高度稀释后，也能被检出。 ⑧在肠道以外的环境中，其抵抗力大于肠道致病菌或相似，进入水中不再繁殖。 ④检验方法简便，易于检出和计数。 在食品卫生微生物检验中，可作为粪便污染指标菌依据的上述条件，粪便中数量最多的是大肠菌群，而且大肠菌群随粪便排出体外后，其存活时间与肠道主要致病菌大致相似，在检验方法上，也以大肠菌群的检验计数简便易行。因此，我国选用大肠菌群作为粪便污染指标菌是比较适宜的。 另外，作为粪便污染的指标细菌还有：分叉杆菌(Bifidobacterium)、拟杆菌(Bacteroides)、乳酸菌、肠杆菌科中的梭状芽胞和底群链球菌等，据报道，拟杆菌是人体肠道内第二个较大的菌群；厌气性乳酸菌占人体肠道内细菌组分的50％以上，一般粪便中该菌量为109个／g —1010个／g。肠道内属于肠杆菌科的细菌，除上述的细菌外，还有克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌和副大肠杆菌等，也可以充当粪便污染指标菌。很多研究者认为，在冷踪食品或冷冻状态照射处理过的食品中，大肠杆菌可比其他多种病原菌容易死亡，因此，像这类食品，用大肠菌群作为指标菌就不够理想，而底群链球菌对低温抵抗力强，作为这类食品的粪便污染指标菌就比较适宜。上述的这些肠道内的其他细菌，虽与粪便有关，因均比不上大肠菌群所具备的指标特异性，所以目前还没有列入作为公认的粪便污染的指标细菌。 当然，大肠菌群作为粪便污染指标菌也有一些不足之处： ①饮用水中含有较少量大肠菌群的情况下，有时仍能引起肠道传染病的流行。 ⑧大肠菌群在一定条件下能在水中生长繁殖。 ②在外界环境中，有的沙门氏菌比大肠菌群更有耐受力。 3．大肠菌群作为粪便污染指标菌的意义 粪便污染的食品，往往是肠道传染病发生的主要原因，因此检查食品中有无肠道菌，这对控制肠道传染病的发生和流行，具有十分重要的意义。 许多研究者的调查证明，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主
大肠杆菌菌落总数检测 步骤 集团标准化工作小组 [Q8QX9QT-X8QQB8Q8-NQ8QJ8-M8QMN]
大肠杆菌及菌落总数检测方法 为了对鸡精产品的微生物指标进行有效的控制，对微生物的检测就显的十分重要。下面是鸡精产品的大肠杆菌及菌落总数实验检测方法。 一、大肠杆菌： 1）培养基准备（以3.5g乳糖胆盐发酵琼脂为例） 双料试管配制 A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。 B、用0.1g称量天平秤取7g乳糖。 C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入三根装有小导管的试管中（此三根为双料试管，即双倍原料）。 单料试管配制 A、用量杯量取加热的100ML蒸馏水（实验前需对蒸馏水进行高压灭菌处理，处理方法详见注一）。 B、用0.1g称量天平秤取3.5g乳糖。 C、将A、B混合均匀，并用10ml吸管各取10ml混合液分别注入六根装有小导管的试管中（此六根为单料试管，即单倍原料）。2）将配制好的试管放入灭菌锅进行115℃进行灭菌10min。 3）将灭菌过后的试管放置在无菌室，常温保存一周。 4）若要对生产的样品检测其大肠杆菌，其步骤如下：
A、量取灭菌后的蒸馏水225ml加温后与25g样品混合均匀。（样品需要在无菌室中，有封盖的塑料杯中进行混合） B、取三个玻璃培养皿，分别标上-1、-2、-3标记。 C、取两根新试管取9ml蒸馏水分别标为a、b。 D、用吸管吸取1ml样品液体，注入-1培养皿中，并盖上盖子。 E、用吸管吸取1ml样品液体，注入a试管中，记为-2培养基液。 F、用吸管吸取1ml a试管中的液体，注入到b试管中，记为-3培养基液。 G、用1ml吸管取样品液体分别注入3根单料试管中，用10ml吸管取样品液体分别注入双料试管中 H、用1ml吸管取-2培养试管液体，分别注入到单料试管中。 I、装好液体的试管，用试管塞封好，放到36℃±1℃的恒温培养箱中24小时培养。 J、24小时培养后，取出并用肉眼观察试管的颜色及冒气泡情况，若有其中的任意状况，说明有大肠杆菌，需要通过美兰做进一步的检测。 二、菌落总数的测定 1、取平板计数琼脂23.5g与100ml灭菌后的蒸馏水混合均匀。 2、分别取15ml平板琼脂液到-1、-2、-3培养皿中，待培养皿液体凝固后将培养皿放入36℃±1℃的恒温培养箱中培养48小时。 3、取出培养皿，用肉眼计数菌落总数。 实验基本完成。