(2):3322337.
[9]T anasijevic M J ,Canon CP ,A n tm an E M ,et al .M yo 2
glob in creatine 2k inase 2M B and cardiac tropon in 2I 60m inu te rati o s p redict infarct 2related patency after th rom bo lysis fo r acu te m yocardial infarcti on [J ].J Am Co ll Cardi o l ,1999,34(3):7392747.
[10]H irsch R ,D en t CL ,W ood M K ,et al .Pattern s and
po ten tial value of cardiac tropon in I elevati on s after pediatric cardiac operati on s [J ].Am T ho rac Su rg ,1998,65(5):139421399.
[11]Ro sen T ,Bengtson BA .P rem atu re mo rtality due to
cardi ovascu lar disease in hypop itu itaris m [J ].L ancet ,
1990,336:2852288.
[12]Giu stina A ,L o ru sso R ,Bo rghetti V ,et al .I mpaired
spon taneou s grow th ho rmone secreti on in severe di 2alated cardi om yopathy [J ].Am H eart J ,1996,131(3):6202622.
[13]H averkate F ,T homp son SG ,Pyke SD ,et al .P roduc 2
ti on of C 2reactive p ro tein and risk of co ronary even ts in stab le and un stab le angina [J ].L ancet ,1997,349(9050):4622465.[14]周万兴.神经肽Y 与高血压[J ].国外医学内科学分
册,2000,87(8):3422344.
The cl i n ica l appl ica tion s of labell i ng i m m unoa ssay i n the card iova scular d isea se and its progress
YAN G Yong 2qing
(D ep art m ent of nuclear M ed icine ,S uz hou N O 2.P eop le ’s H osp ital ,S uz hou J iang su 215002,Ch ina )
Abstract :T he disadvantage of radi o i m m unoassay are radi o com tam inati on and can’t autom atied .In the date,the labelling i m 2
m unoassay (enzym e i m m unoassay ,fluo rescent i m m unoassay .lum inescent i m m unoassay )w ill eventually rep lace radi o i m 2
m unoassay .T h is article review s the clinical app licati on of in the cardi ovascular disease by labelling i m m unoassay thyro id ho rmone (TH ),endo thelin (ET ),cytok ine (CK ),co llagen ,am ino term inal p ropep tide of type p roco llagen (P N P ),telopep tide of type I co llagen (I CT P ),m yoglobin (M b ,cytok ine isoenzym e cardi om uscle troponin I ),grow th ho rmone (GH ),c 2reactive p ro tein (CR P ),
tumo r necro sis facto r 2Α(TN F 2Α
),carbo thydrate antigen 2125(CA 2125),neuropep tide Y (N PY )and it’s p rogress .Key words :labelling i m m unoassay ; ho rmone ; p ro tein ; po lypep tide ; cardi ovascular disease
文章编号:1001-098X (2000)05-0196-06
收稿日期:2000208217
作者简介:韩佩珍(19422),女,浙江慈溪人,中国医学科学院中国协
和医科大学放射医学研究所研究员,博士生导师,主要从事分子核医学尤其是体外免疫诊断试剂的开发研究。
化学发光免疫分析
韩佩珍
(中国医学科学院中国协和医科大学放射医学研究所,天津 300192)
摘 要:化学发光免疫分析技术基于放射免疫分析的基本原理,其特点是以化学发光物质为示踪物,灵敏度高,快速,简便,主要试剂包括氧化剂、发光剂和催化剂等,测试中不使用有害的试剂,因此成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法。
关键词:化学发光免疫分析; 酶免疫分析; 放射免疫分析中图分类号:R 446.6 文献标识码:A
H al m an [1]在1977年基于放射免疫分析的基本原理,将酶的化学发光与免疫反应结合起来,建立了化学发光免疫分析(chem ilum inescence i m m unoas 2say ,CL I A )方法。目前,不同类型的化学发光免疫分
析系统虽已在常规临床检验中应用,但由于每个系统都有着方法、仪器、试剂三位一体的特定要求,在
研究与生产上的难度较大,故而有必要对化学发光
免疫分析有个概要的了解。1 化学发光免疫分析原理
化学发光免疫分析包含两个部分,即免疫反应系统和化学发光分析系统[2]。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化,形成一个激发态的中间体,当这种激发态中间体
回到稳定的基态时,同时发射出光子(h Μ
),利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将
发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体)直接标记在抗原(化学发光免疫分析)或抗体(免疫化学发光分析)上,或酶作用于发光底物。其反应原理如下:
起动发光试剂+L →电子激发态中间体→基态+h Μ
A g +A g 2L +A b →A g 2A b +A b 2A g 2L
起动发光试剂
h Μ
(或Sp 2A b +A g →Sp 2A b 2A g )Sp 2A b 2A g +A b 2L →Sp 2A b 2A g 2A b
起动发光试剂
h Μ
A b 2酶+A g →A g 2A b 2酶起动发光试剂
h Μ
其中:L 为发光标记物或发光底物,A g 为抗原,A b 为抗体,
Sp 为固相。
2 化学发光免疫分析的类型
化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为
两种,即化学发光标记免疫分析法和酶标记、以化学发光底物作信号试剂的化学发光酶免疫分析法。2.1 化学发光标记免疫分析
化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CL I A ),是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物——acridin ium ester (A E ),是有效的发光标记物[3],其通过起动发光试剂(N aO H 2H 2O 2)作用而发光,强烈的直接发光在一秒钟内完成,为快速的闪烁发光(见图1)。吖啶酯作为标记物用于免疫分析,其化学反应简单、快速、无须催化剂;检测小分子抗原采用竞争法(见图2),大分子抗原则采用夹心法(见图3),非特异性结合少,本底低;与大分子的结合不会减小所产生的光量,从而增加灵敏度
。
图1 acr id i n iu m ester 的化学发光反应
美国拜耳公司最新诊断产品——A CS :180系列全自动化学发光免疫分析系统[4]即以吖啶酯作为标记,量度A E 标记物化学反应所产生的光量为基础,灵敏度可达10-15
g mL 。
该系统采用顺磁性微粒作固相载体,反应物形成类均相悬浮溶液,有效增大
反应面积,加速免疫反应,便于自动洗涤、快速分离,
方法中不用酶和催化试剂,避免了许多影响因素,只需改变pH 即可发生发光反应,A E 试剂稳定,有效期长达一年。目前,已有甲状腺功能、生殖生理、肿瘤标志物、药物监测及心血管等四十余个检测项目可供临床应用
。
图2 化学发光免疫技术—
—竞争法
图3 化学发光免疫技术——夹心法
2.2 化学发光酶免疫分析
从标记免疫分析角度,化学发光酶免疫分析(chem ilum inescen t enzym e i m m unoassay ,CL E I A ),应属酶免疫分析,只是酶反应的底物是发光剂,操作步骤与酶免分析完全相同[5]:以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体)进行免疫反应,免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物,在信号试剂作用下发光,用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HR P )和碱性磷酸酶(AL P ),它们有各自的发光底物。2.2.1 HR P 标记的CL E I A
常用的底物为鲁米诺(32氨基邻苯二甲酰肼,lum ino l ),或其衍生物如异鲁米诺(42氨基邻苯二甲酰肼),是一类重要的发光试剂。其结构如图4所示。
鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行,在过氧化物酶及活性氧[过氧化阴离子(O 2-),单线态氧(1O 2),羟自由基(O H ?),过氧化氢(H 2O 2)]存在下,
生成激发态中间体,当其回到基态时发光,其波长为425nm 。
早期用鲁米诺直接标记抗原(或抗体),但标记后发光强度降低而使灵敏度受到影响。近来用过氧化物酶标记抗体,进行免疫反应后利用鲁米诺作为
发光底物,在过氧化物酶和起动发光试剂(N aO H 2H 2O 2)作用下,鲁米诺发光,发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。Kodak Am erlite TM 半自动分析系统就是利用这一体系专门设计的
。
图4 鲁米诺和异鲁米诺的化学结构式
2.2.2 增强发光酶免疫分析(enhanced lum ines 2
cence enzym e i m m unoassay ,EL E I A )
在发光系统中加入增强发光剂,如对2碘苯酚等,以增强发光信号,并在较长时间内保持稳定,便
于重复测量,从而提高分析灵敏度和准确性。在全自动分析仪上,还可通过计算机严密控制,进行自动操作,如加试剂,混合,温育,洗涤,加发光试剂,发光计数,数据处理,绘制标准曲线,直至完成病人血清样品的分析并打印出结果[6]。Am erlite TM 发光增强酶免分析系统[7,8]用荧光素、噻唑等增强剂,其发光时间可持续长达20m in ,试剂盒有甲状腺功能检测的促甲状腺素、三碘甲腺原氨酸、甲状腺素、甲状腺素结合球蛋白、游离甲状腺素,与性激素有关的有促黄体激素、促卵泡激素、人绒毛膜促性腺激素、甲胎蛋白、雌二醇、睾酮,以及其他方面的如癌胚抗原、铁蛋白、地高辛等。2.2.3 AL P 标记的CL E I A
所用底物为环1,22二氧乙烷衍生物,这是一类很有前途的发光底物[9],用于化学发光酶免分析底物而设计的分子结构中包含起稳定作用的基团——金刚烷基,其分子中发光基团为芳香基团和酶作用
的基团,在酶及起动发光试剂作用下引起化学发光。最常使用的底物是AM PPD [32(2’2sp iroadam an 2
tane )42m ethoxy 242(3’2p ho sp ho ryloxy )2p henyl 21,
22di oxetane ],中文名为:32(2’2螺金刚烷)242甲氧基242(3’2磷酰氧基)2苯基21,22环二氧乙烷)。在碱性磷酸酶(AL P )作用下,磷酸酯基发生水解而脱去一个磷酸基,得到一个中等稳定的中间体AM PD (半寿期为2～30m in ),此中间体经分子内电子转移裂解为一分子的金刚烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子,当其回到基态时产生470nm 的光,可持续几十分钟(如图5)。AM PPD 为磷酸酯酶的直接化学发光底物,可用来检测碱性磷酸酯酶或
酶和抗体、核酸探针及其它配基的结合物。可检测到碱性磷酸酯酶的浓度为10-15m o l L 。
美国D PC 公司的I mm u lite 全自动酶放大发光免疫分析仪,以碱性磷酸酶为标记物,以金刚烷作发光底物,测定灵敏度相当于10-21m o l mL 的酶,采用聚苯乙烯珠作载体,其检测水平已能达到10-12
g
mL
。
图5 A M PPD 发光反应原理
3 其他发光免疫分析技术(lu m i nescence i m m un -oa ssay ,L I A )
L I A 开始用于临床诊断在80年代中期,经历了
荧光发光、生物发光和电发光等,从采用lum ino l 、
acridin ium esters 、
胶乳颗粒为载体的技术,到以di oxetase 作发光标记物经历了10年,以微粒子为
载体的化学发光技术、电发光技术和激光发光技术
的推出,使发光免疫分析技术得到进一步的发展和完善。
3.1 微粒体发光免疫分析(m icrop article lum ines 2
cence enzym e i m m unoassay ,M L E I A )
该项技术的原理基于AL P 标记的CL E I A ,用于标记的di oxetase 是一超灵敏的AL P 和发光底物(AM PPD ),具有反应快、发光连续稳定、线性范围大的特点。应用磁性铁微粒作为载体,用以包被抗体,因其表面积增大,捕捉抗原多,使标本量减少,反应时间缩短。此项技术已用于固相竞争技术。
美国贝克曼库尔特公司推出的A CCESS ○R
全自动微粒子化学发光免疫分析系统[10],是由法国巴斯德研究所将微粒子化学发光技术发展应用设计的。其采用AM PPD 2AL P 发光系统,以微粒子(0.7Λ)作载体,表面积大、结合快、达到最大发光信号时间短、反应及分离速度快,缩短了分析时间,有效提高了灵敏度和准确性。该系统可全自动控制整个测定和数据分析处理,具有批量和任选测定24个项目的能力和急诊插入功能,平均检测速度100 h ,冷藏试剂盘可放24种试剂,探针直接插入试剂盒,并自动封闭,直至试剂用完,不污染不浪费。超声波技术被用于搅拌使微粒悬混均匀并加速反应,用于探针取
样液面检查保证取样准确,用于洗涤时减少交叉污染。使用A CCESS○R的用户还可以申请In ternet全球通讯网络,进行通讯查询。A CCESS○R独特的塑压智能化外形设计,使其从外观到内在品质,给人们留下深刻的印象。
由美国雅培公司生产的A xSY M全自动免疫发光分析仪[11]将三种技术于一机,可用于非均相标记微粒子酶免发光分析(M E I A)、离子捕捉发光分析(I C I A)和均相标记荧光偏振免疫发光技术(FP I A),目前已有83个检测项目可供临床应用。
3.2 电化学发光免疫分析(electrochem ilum inesc2
ence i m m unoassay,ECL I A)
电化学发光(ECL)的反应在电极表面进行,发光底物为三联吡啶钌(R u(byp)32+),用另一反应物三丙胺(T PA)来激发光反应。在阳极表面,这两种物质可同时失去电子,发生氧化反应。在电极板上二价的R u(byp)32+迅速被氧化成三价R u(byp)33+,与此同时T PA也在电极板上被氧化成阳离子自由基(T PA+3),T PA+3自发地释放一个质子而变成非稳定分子(T PA3),将一个电子递给R u(byp)33+,形成激发态的R u(byp)32+3。R u(byp)32+3在衰减的同时发射一个波长为620nm的光子,重新回到基态R u(byp)32+。这一过程在电极表面反复进行,产生高效、稳定的连续发光,并不断增强。
瑞士罗氏诊断公司[与德国Boeh ringer M annhei m(BM)公司携手合作]拥有最先进的电化学发光免疫分析仪E2cl1010 2010。该系统将ECL 与链霉亲和素包被磁珠的微粒子技术以及链霉亲和素2生物素放大系统结合起来,形成一种均相免疫分析,检测灵敏度<1pm o l mL,线性范围很宽,例如检测促甲状腺激素的灵敏度<0.005ΛI U mL,测定范围高至100ΛI U mL。标准曲线储存在二维条码中,每次测定只需两点标定。三联吡啶钌为非放射性物质,稳定性极好,在室温的半寿期达1年。标记物分子小,所以一分子抗体可标记多至20个标记物,使灵敏度增高而不影响抗体的免疫活性,且发光时间长、强度更高。ECL也可用于DNA、RNA等扩增产物的检测。
3.3 时间分辨荧光免疫分析(ti m e2reso lved fluo2
rescen t i m m unoassay,T rF I A)
荧光的时间分辨技术是利用荧光发射体的荧光寿命差别,将其荧光分开的荧光光谱技术。以镧系元素为示踪剂代替放射性同位素,用具有双功能基团的镧系元素来标记抗原或抗体,当解离下来的镧系元素与特制的扩增液形成新的螯合物时,其荧光明显增强而持久。用延迟测量的办法可消除样品自身的本底荧光,从而大大提高检测灵敏度。按其免疫反应原理,可分为时间分辨荧光免疫分析(T rF I A)和时间分辨免疫荧光分析(T r IFM A)。
法国C IS公司以其肿瘤标志物为特色,于1996年在欧洲推出KR YPTO R全自动时间分辨荧光免疫分析系统:用三价镧系元素铕(Eu3+)与TB P (trisb i p yridine diam ine,一种空穴结构物)的螯合物(TB P2Eu3+)标记抗体或抗原,另一特异抗体或二抗与增强荧光剂XL665联接,反应体系生成的免疫复合物在337nm处激发荧光,经能量增强后放大了的荧光在655nm处测得C665,在620nm处测定荧光C620进行本底校正,作为双道(665,620)时间分辨荧光分析,以C665 C620为纵坐标,标准品浓度为横坐标,得到剂量校准曲线。近年来,该系统已可供临床实验室应用的试剂盒有肿瘤标志物,唐氏症筛查指标,性功能激素检查,心血管疾病,骨代谢,甲状腺自身免疫性疾病等。
T rF I A可做双标记和多标记分析,美国PE公司的1420V icto r多标记免疫分析系统集时间分辨免疫荧光分析、化学发光免疫分析、荧光分析及酶联免疫吸附分析于一机,实现一次反应多项结果,一台仪器多种功能。
我国学者从80年代开展T rF I A技术的研究工作,并发表有关报道[12],但未见有相关产品面市。3.4 激光免疫分析(laser i m m unoassay,L I A)
作为激光技术在医学诊断学的新应用,美标公司医学集团D iaSo rin已研究开发了CO PAL IS多项检测系统[13]。国内首次见到该系统是在1998年5月的全军后勤装备展览会上,接着6月份的Sino2 M ed也展示了该系统
。
图6 Copa lis光学系统
CO PAL IS即偶联颗粒光散射(coup led p article ligh t scattering)技术,其偶联颗粒是由抗原2抗体、
受体2激素或核酸的相互作用,在聚苯乙烯微颗粒存在下,或自身聚集,或与胶态金颗粒聚集,形成单一的和 或聚集的均相配体颗粒,当它们逐个流过一个由半导体激光形成且精确聚焦的入射光束时,会产生一个散射光脉冲,信号被光电二极管探测器记录下来,直行的激光光束则被探测器上的中央光束隔栅阻断(见图6)。
该系统一次可同时、自动地检测4种不同的分析指标,如弓形体、风疹、巨细胞和EB(非洲淋巴细胞瘤)病毒等,12m in内报告全部结果;第五个通道用来放置内部参照物,作为系统的质控检查,以确保准确性和可靠性。目前,D iaSo rin正在开发可以同时检测6项指标的第二代产品,从出生前的围产医学到老年医学,它将为您提供贯穿整个生命周期的健康服务。
4 展望
化学发光免疫分析技术具有灵敏度高、所需时间短、无放射性污染等特点,现已从实验室研究进入常规临床诊断应用。随着各种自动发光分析仪器的面市,以及不同类型的化学发光免疫分析试剂盒的不断推出,势必进一步推动化学发光免疫分析技术的迅速发展。另外,发光分析在用于DNA探针及蛋白印迹分析等方面也将越来越显示其优越性。用葡萄糖氧化酶、葡萄糖262磷酸脱氢酶作为标记物的化学发光免疫分析在生物学研究中也具有广泛的用途。
化学发光检测仪的类型较多,如有的带有自动注射起动发光试剂系统,也有单管计数和微孔板计数的仪器,尚有X线照像底片感光和电子偶合显像系统(CCD cam era i m aging)等。因此,化学发光免疫分析这一领域在自动化仪器推广普及后将会得到更快的发展。
参考文献:
[1]A rakaw a H,M acdaM and T su jiA.Enzym e i m m unoas2
say of co rtiso l by chem ilum inescence reacti on of lum jno l2perox idase[J].Bun sek i Kagaku,1977,26:
3222326.
[2]李美佳.化学发光免疫分析[A].当代免疫学技术与应
用[M].北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1998,549～561.
[3]W eek s I,Behesh ti I,M ccap ra F,et al.A cridin ium es2
ters as h igh2specific2activity labels in i m m unoassay [J].C lin Chem,1983,29(8):147421479.
[4]M o ra2B rugues J,Gascon2Rocche N,Rodriguz2E sp ino sa
J,et al.Evaluati on of ciba co rn ing A CS:180au tom ated
i m m unoassay system[J].C lin Chem,1994,40:4072
410.
[5]N ish izono I,Iida S,Suzuk i N,et al.R ap id and sen sitive
chem ilum inescen t enzym e i m m unoassay fo r m easu ring tumo r m arkers[J].C lin Chem,1991,37(9):16392 1644.
[6]T ho rpe GH and K ricka L J.Inco rpo rati on of enhanced
chem ilum inescen t reacti on s in to fu lly au tom ated en2 zym e i m m unoassay[J].B i o lum in Chem ilum in,1989,3:
972100.
[7]W ilk in son E,R ae P W H,T hom son KJT,et al.Chem ilu2
m inescen t th ird2generati on assay(Am erlite T SH230) of thyro id2sti m u2lating ho rmone in serum o r p las m a assessed[J].C lin Chem,1993,39(10):216622173. [8]Ch ristofides ND and Sheehan CP.Enhanced Chem ilu2
m inescence labeled2an tibody i m m unoassay(Am erlite2 M AB)fo r free thyrox ine:design,developm en t,and techn ical valiati on[J].C lin Chem,1995,41(1):17223.
[9]B ru stein I,Edw ards B and V oyta JC.1,22D i oxetances:
novel chem ilum inescen t enzym e sub strates.A pp lica2 ti on s to i m m unoassay[J].J B i o lum in Chem ilum in,
1989,4:992111.
[10]Patterson W,W erness P,Payne W,et al.R andom and
con tinuou s2acess i m m unoassays w ith chem ilum i2 nescen t detecti on by acess au tom ated analyzer[J].C lin Chem,1994,40:2042.
[11]D avid HW,et al.R ap id,au tom ated assay fo r p roges2
terone on the A bbo tt A xSY M analyzer[J].1998,44
(1):86.
[12]胡天喜,陈杞,陈克明,等.发光分析与医学[M].上海:
华东师范大学出版社,1990,1672186.
[13]Bodner A J and B ritz JA.Copalis T echno logy[A].Chan
DW.I mm unoassay A u tom ati on:A n U pdated to Sys2 tem s[M].San D iago:A cadem ic P ress,1996,2532257.
Chem ilu m i nescence i m m unoa ssay
HAN Pei2zhen
(Institu te of R ad ia tion M ed icine,Ch inese A cad e m y of M ed ica l S ciences&P ek ing
U n ion M ed ica l Colleg e,T ianj in300192,Ch ina)
Abstrct:A n updated i m m unoassay techno logy,chem ilum inescence i m m unoassay(CL I A)is p resen ted.T he p rinci2 p le of CL I A is based on it of R I A that the i m m uno reacti on is resu lted u sing a tracer labeled by chem ilum inescen t.
CL I A is b ringing the clin ical labo rato ries in to a new generati on on h igher sen sitivity ,faster ,mo re conven ien t ,au 2tom atic and less hazardou s than radi o i m m unoassay .Key words :chem ilum inescence i m m unoassay ; enzym e i m m unoassay ; radi o i m m unoassay
文章编号:1001-098X (2000)05-0201-05
收稿日期:1998211220
作者简介:许 杨(19702),女,北京人,中国医学科学院协和医大肿
瘤研究所核医学基础室助理研究员,硕士,主要从事肿瘤标志物免疫分析。
审校者:中国医学科学院协和医科大学肿瘤研究所核医学基础室
范振符 陈智周
前列腺特异性抗原及其临床应用
许 杨
(中国医学科学院肿瘤医院核医学基础室,北京 100021)
摘 要:前列腺特异性抗原(PSA )是一种单链糖蛋白,它由前列腺上皮细胞产生,分泌至前列腺管,因此精液中PSA 含量很高,而正常人血清中含量很少。癌变时,患者PSA 在血中的浓度升高。近年来,人们对PSA 的生物学特征、检测方法、临床应用进行了大量的研究,取得了很大进展。PSA 已成为最具有临床价值的肿瘤标志物之一,被应用于前列腺癌的临床诊断和监测。
关键词:前列腺特异性抗原; 前列腺癌; 肿瘤标志物中图分类号:R 730.45;R 817.4 文献标识码:A
自1971年由H aram 等人第一次从精液中发现前列腺特异性抗原(PSA )后,1979年W ang 等人用免疫沉淀法成功地从前列腺组织中分离和提纯了PSA ,Pap sidero LD 等人于1980年发现前列腺癌患者的血清中PSA 明显升高,使人们已经认识到PSA 对诊断前列腺癌的重要性,成为前列腺癌研究中涉及最多的肿瘤标志物之一。本文对PSA 的生物学特征、检测方法及临床应用方面的有关问题作一综述。
1 PSA 的分子生物学
人们所认识的PSA 的生化特性,大多来自于对精液中纯化的PSA 的研究。在精液中,PSA 浓度可达0.5～5m g mL ,是血中浓度的百万倍,血中PSA 的浓度小于4ng mL 。PSA 是由前列腺上皮细胞分泌的一种单链糖蛋白,分子量为30000～36000。经测定,PSA 分子中含有一寡聚糖,PSA 分子的等电点为6.8～7.5。由于唾液酸化的不同,PSA 分子至
少有五种异构体[1]。Evaco rey 等人[2]
采用十株单抗,与PSA 顺序合成的十五肽反应,发现N 端50～70的序列、C 端的155
～174的序列为两个序列表位,并位于PSA 分子三级结构的外缘。
PSA 基因(H KL K 3)属于人类组织激肽释放酶基因族成员,1987年已获得了PSA 的c DNA 克隆,1989年得到了PSA 基因定位及结构。人类组织激肽释放酶基因族除了包含H KL K 3,还包括H KL K l 和H KL K 2,此基因族位于19号染色体的q 13.22
q 13.4。PSA 基因包含5个外显子、
4个内含子,可转录成1.6kb 含5个外显子的m RNA [3]。在正常和良性的前列腺上皮细胞内,该基因的表达相当均匀,但在前列腺癌中PSA 的表达不均匀。另一些文献认为,在男性体内,前列腺柱状上皮细胞和尿道周腺可生成大量的PSA ,实际上在正常的前列腺上皮细胞和良性增生组织中,此蛋白的m RNA 含量更高,认为PSA 并不是一种由肿瘤细胞大量产生的肿瘤标志物,而是源于损伤或疾病造成前列腺结构异常,并导致PSA 从前列腺管中渗漏到基质中,然后通过毛细淋巴管进入血液循环,导致血中浓度升高。一些研究认为,前列腺癌患者的血清中PSA 分子结构异常,推测前列腺癌细胞中PSA 基因转录后发生异常剪切。但新近研究表明[4],从正常人、前列腺增生、前列腺癌细胞中所获得的PSA c DNA 进行测序表明,在转录水平尚未发现差异,但也不能排除PSA 分子结构的差异是由于蛋白质翻译加工形成的。
随着R T 2PCR (逆转录2多聚酶链反应)技术的出现,广泛的研究表明,PSA 并非是前列腺组织所特有的,在多种非前列腺组织及体液中也存在,如乳
荧光和化学发光免疫分析方法 免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应， 应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。 一、免疫 免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。 特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制，针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体，只能对同一种抗原发挥免疫功能。而对变异或其他抗原毫无作用。 1、抗原 1.1抗原的定义 抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答(免疫原性) ，并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。 抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。 1.2抗原的分类
完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。 半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性， 1.3抗原的性质 决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。 抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。 因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。 2、抗体 2.1抗体的定义 抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。 2.2抗体的结构 抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。 人免疫球蛋白有五类，分别为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。 3、抗原抗体的结合
化学发光免疫分析技术原理简介 20 世纪60 年代即有人利用化学发光法测定水样中细菌含量和菌尿症患者尿液检查。1977 年Halman 等将化学发光系统与抗原抗体反应系统相结合，创建了化学发光免疫分析法，保留了化学发光的高度灵敏性，又克服了它特异性不足的缺陷。近年来对技术与仪器的不断改进，使此技术已成为一种特异，灵敏，准确的自动化的免疫学检测方法。1996 年推出的电化学发光免疫技术，在反应原理上又具有一些新的特点。这两种技术目前已在国内一些大型医院实验室用于常规免疫学检验。 一、化学发光免疫分析法 化学发光免疫分析法( chemiluminescence immunoassay , CLlA) 是把免疫反应与发光反应结合起来的一种定量分析技术，既具有发光检测的高度灵敏性，又具有免疫分析法的高度特异性。在CLIA中，主要有两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。免疫反应系统与放射免疫测定中的抗原抗体反应系统相同化学发光系统则是利用某些化合物如鲁米诺( luminol) 、异鲁米诺(isolu-minol) 、金刚烷( AMPPD) 及吖啶酯( AE) 等经氧化剂氧化或催化剂催化后成为激发态产物，当其回到基态时就会将剩余能量转变为光子，随后利用发光信号测量仪器测量光量子的产额。将发光物质直接标记于抗原(称为化学发光免疫分析)或抗体上(称为免疫化学发光分析) ，经氧化剂或催化剂的激发后，即可快速稳定的发光，其产生的光量子的强度与所测抗原的浓度可成比例。亦可将氧化剂(如碱性磷酸酶等)或催化剂标记于抗原或 抗体上，当抗原抗体反应结束后分离多余的标记物，再与发光底物反应，其产生的光量子的强度也与待测抗原的浓度成比例。发光免疫分析的灵敏度高于包括RIA 在内的传统检测方法，检测范围宽，测试时间短，仅需30 - 60min 即可。试
罗氏电化学发光免疫分析 技术是罗氏公司开发的,但全自动机械制造却由日本的日立公司承担,所以仪器上还有Hitachi的标志。这个仪器让大家吃惊的一大原因就在于一直在实验室研究的电致化学发光居然已经真正地产业化了,其中我们一直无法解决的诸多问题(尤其是重现性均已得到解答,看来罗氏的确花了不少心血开发这款仪器。 罗氏电化学发光免疫分析技术的性能特点——创新的技术,与众不同 一、最先进的检测原理 电化学发光免疫测定,是目前最先进的标记免疫测定技术,是继放射免疫、酶免疫、荧光免疫、化学发光免疫测定以后的新一代标记免疫测定技术,具有敏感、快速和稳定的特点,在固相标记免疫测定中技术上居领先地位。 电化学发光(ECL是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应,实际上是电化学和化学发光两个过程的完美结合。电化学发光与普通化学发光的主要差异在于前者是电启动发光反应,循环及多次发光,后者是通过化合物混合启动发光反应,是单次瞬间发光。因此ECL反应易精确控制,重复性极好。 电化学发光免疫测定是电化学发光(ECL和免疫测定相结合的产物,直接以[Ru(bpy3]2+标记抗体,反应时标记物直接发光。且[Ru(bpy3]2+在电极表面的反应过程可以周而复始进行,产生许多光子,使光信号得以增强。 二、专利的包被技术 链霉亲和素(streptoavidin,SA和生物素(biotin,B是具有很强的非共价相互作用的一对化合物,特异性强且结合紧密。一分子SA可与四分子B 相结合,增大了抗体结合量,达到放大效果。在ECL的试剂中,SA通过特殊的蛋白结合物均匀牢固地包被在磁性微粒上,形成通用的能与B结合的固相载体,另一试剂为活化的B衍生物化合的抗原或抗体。两种试剂混合时,抗原或抗体即包被在磁性微粒上。 三、独特的载体
化学发光免疫分析技术题库1-0-8
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]化学发光剂必须具备的条件错误的是（） A.其物理、化学特性要与被标记或测定的物质相匹配 B.能与抗原或抗体形成稳定的耦联结合物 C.其化学发光常是还原反应的结果 D.在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性 E.发光的量子产量高 能作为化学发光剂的有机化合物必须具备下列条件：发光的量子产量高；它的物理、化学特性要与被标记或测定的物质性匹配；能与抗原或抗体形成稳定的耦联结合物；其化学发光常是氧化反应的结果；在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]下列不会影响标记的因素是（） A.被标记蛋白质的性质 B.原料比 C.温度 D.湿度 E.标记率 影响标记的因素包括：①发光剂的选择。②被标记蛋白质的性质。抗原作为被标志物时，应具有较高的纯度和免疫学稳定性；抗体作为被标志物时，则要求具有较高的效价，应用提纯的IgG来代替全血清。③标记方法的选择应正确选择与发光剂和被标志物结构相适应的耦联方式。④原料比。在制备发光剂-IgG抗体结合物时，IgG：发光剂：交联剂的克分子比mol：mol：mol会影响结合物的发光效率。⑤标记率。是指结合物中IgG与发光剂之间的克分子比。由于每一种发光剂对应于被标志物都有特定的最佳标记率，标志物选择不好，会出现不易保存等现象。⑥温度。控制标记时的反应温度极为重要，对于较稳定的小分子被标志物，温度可稍放宽些；而当被标志物是抗原或抗体蛋白质时，由于蛋白质对热的不稳定性，应在保证标记反应进行的前提下，尽量选择较低的温度，以避免蛋白质在标记过程中活性的丧失。⑦纯化与保存。多数经耦联反应制备的结合物，使用前都需进行纯化，除去未结合的发光剂和交联剂。结合物一般可分装保存在-70℃条件下，最好冷冻干燥保存。
常见化学发光免疫分析技术比较 1、化学发光免疫分析 化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)，英音：[,kemi,lju:mi'nes?ns] [,imju:n?u?'sei] 是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 CLIA是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 1.1、化学发光免疫分析原理 化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hv) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。 1.2、化学发光免疫分析类型
化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种: (1)化学发光标记免疫分析法; (2)酶标记、以化学发光底物作信号试剂的化学发光酶免疫分析法 1.2.1化学发光标记免疫分析 化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CL IA ) , 是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物-acridiniumester (AE) , 是有效的发光标记物，其通过起动发光试剂(NaOH-H2O2) 作用而发光, 强烈的直接发光在一秒钟内完成, 为快速的闪烁发光。吖啶酯作为标记物用于免疫分析, 其化学反应简单、快速、无须催化剂; 检测小分子抗原采用竞争法, 大分子抗原则采用夹心法, 非特异性结合少, 本底低; 与大分子的结合不会减小所产生的光量, 从而增加灵敏度。 1.2.2化学发光酶免疫分析 从标记免疫分析角度, 化学发光酶免疫分析(chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA ) , 应属酶免疫分析, 只是酶反应的底物是发光剂, 操作步骤与酶免分析完全相同: 以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体) 进行免疫反应, 免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物, 在信号试剂作用下发光, 用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP) 和碱性磷酸酶(AL P) , 它们有各自的发光底物。 12.2.1HRP 标记的CLEIA
本科毕业论文 题目：化学发光免疫分析技术 及在临床检验中的应用 学院：化学与环境工程学院 班级：2011级应用化学2班 姓名：王俊烽 指导教师：李小花职称：讲师 完成日期：2015年05 月 22 日
化学发光免疫分析技术及在临床检验中的应用 摘要：化学发光免疫分析技术（CLIA）是把免疫反应和化学发光检测方法结合的一种分析技术。其中免疫反应的特异性和灵敏度都很高。CLIA是在酶联免疫分析、放免疫分析和荧光免疫分析后面发展起来的一种检测技术。由于其具有操作简单，标记方便，稳定度和检测灵敏度高，速度快，对环境没有污染等优点因此CLIA在临床上受到医学检验者和医生的一致好评。 关键词：化学发光免疫分析技术；基本原理；临床；医学检验 CLIA Technology And Its Application in The Clinical Laboratory Abstract：Chemiluminescence immunoassay (CLIA) is an analytical technique the immune response and chemiluminescent detection methods combined. Which the immune response is very high specificity and sensitivity. CLIA is the enzyme-linked immunoassay, put immunoassay and fluorescence immunoassay later developed a detection technology. Because of its simple, easy to mark, high stability and sensitivity, speed, no environmental pollution, etc. Therefore CLIA praise medical tests and doctors at the clinic. Key words :chemiluminescent immunoassay; fundamental; clinical; medical laboratory
IMMULITE ? 2000 全自动化学发光免疫分析仪 标准操作程序 本文件仅供参考，各实验室需根据各自情况建立自己的操作规程 IMMULITE?2000全自动化学发光免疫分析系统标准操作规程
SOP编码：页数： 制定人签名：日期： 审核人签名：日期： 批准人签名：日期： 生效日期：颁发日期：周期性审查：年一次 修订登记： 审查登记：
[目的]描述IMMULITE?2000全自动化学发光免疫分析系统的使用和维护。 [范围] 适用IMMULITE?2000全自动化学发光免疫分析系统的操作。 [仪器工作原理和检测过程] 1 IMMULITE 2000使用包被特定抗体的聚苯乙烯珠子作为固相，包被珠放在一个特定的反应杯中，从而进行温育，清洗以及信号发生。
2. 样本与结合了碱性磷酸酶的试剂温育反应结合之后，通过高速离心将剩余试剂甩到与反应杯同轴的废液管路中。系统在几秒钟内完成四次离心清洗，以便与系统的其他同步。去除未包被试剂的包被珠仍然保留在反应杯中。 3. 包被珠上的结合标记随后同发光底物进行定量发光。当包被珠上结合的碱性磷酸酶标记同化学发光底物反应时，就产生发光。发光强度同样本中待测物的含量有关。仪器通过光电倍增管检测发光强度，随后计算出每个样本的结果。 4. 操作者在IMMULITE 2000上运行测试时，需要做下列操作：： 4.1进行每日探针清洗工作。 4.2 选择RUN IMMULITE 2000按钮。 4.3 查系统状态指示，加满或者清空耗材或者废物。 4.4 初始化样本和试剂加样器、蒸馏水喷嘴和底物喷嘴。 4.5 使用图像扫描器扫描试剂转盘上的过敏原试剂楔。 4.6在样本转盘上装载病人血清、质控、校正液和稀释液。 注意: 运行仪器需要用到的试剂都在 IMMULITE 2000试剂盒中。只有需要预稀释的测试项目才会有稀释液。 4.7 在工作列表列表界面为样本指定测试项目以及编号。 4.8 检查试剂以及与之匹配的包被珠是否足够完成所需测试。 4.9选择RUN开始实验。 5. 仪器自动检测过程: 在操作者按下 RUN 按钮之后，Immulite 2000 自动开始检测并输出检测结 果。 5.1 在反应杯中加入一个包被珠。 5.2 样本，特定的试剂和水加入到包被珠上。 5.3 反应杯运到温育圈，在37°C (98.6°F)的环境中震荡温育。 5.4 清洗测试杯。 5.5 加入底物，发光。 5.6 光电倍增管(PMT)检测光子强度，计算结果并打印。 [免疫分析原理] 1.双抗体夹心法：双抗体夹心法使用ALP标记的抗体在检测单位中进行反应。 1.1 标记的抗体的液相试剂加到检测单位中，标记有ALP的特异性抗体(Ab※ALP)与样品中的相应抗
全自动化学发光免疫分析仪 主要由主机（包含样本架输送模块、反应杯配备模块、加样模块、试剂处理模块、温育反应模块、清洗分离模块、光学检测模块、电路控制模块）、软件（发布版本：V1.0）、电源线、串口线及附件（包含样本架、液路管）组成。 该产品基于间接化学发光法，与配套的检测试剂共同使用，在临床上用于对来源于人体血清、血浆或者其他体液样本中的被分析物进行体外定性或定量检测。 1.1产品型号划分说明 1.2结构组成 主要由主机（包含样本架输送模块、反应杯配备模块、加样模块、试剂处理模块、温育反应模块、清洗分离模块、光学检测模块、电路控制模块）、软件（发布版本：V1.0）、电源线、串口线及附件（包含样本架、液路管）组成。 1.3软件信息 1.3.1 软件名称：利德曼化学发光免疫分析仪器软件平台 1.3.2 发布版本：V1.0 1.3.3 版本命名规则 发布版本号：VX.Y 其中：VX.Y由version缩写V，主版本号及次版本号构成：表示正式发布的第一版程序。 X为主版本号，表示全功能集成第一个版本； Y为次版本号，表示此版本程序发布后暂时未发生变更。 1.3.4 运行环境 硬件配置：
CPU：主频1.7GHz以上。 内存：1G以上内存。 硬盘空间：40G以上均可。 软件配置：操作系统：WINDOWS 7 或WINDOWS 10。 2.1加样正确度与重复性 对仪器标称的样品最小加样量和最大加样量、试剂最小加样量和最大加样量进行检测，应符合表1的规定。 表1 加样正确度与重复性要求 2.2 反应区温度控制的正确度和波动度 反应区温度的偏倚应在：37.0℃±0.5℃，波动度不超过0.5℃。 2.3 光检测装置部分 2.3.1仪器噪声 检测空反应管的发光值应不大于200RLU。 2.3.2发光值的线性 在不小于3个发光值数量级范围内，线性相关系数（r）应≥0.99。 2.3.3发光值的重复性 采用发光剂法，变异系数（CV）不超过5％。 2.3.4发光值的稳定性 采用发光剂法，发光值的变化不超过±10％。 2.4 携带污染率 携带污染率应≤10-5。 2.5临床项目的批内精密度
全自动化学发光免疫分析仪 技术审查指导原则 （第一次征求意见稿） 一、前言 本指导原则旨在指导注册申请人对全自动化学发光免疫分析仪注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的技术审评提供参考。 本指导原则是对全自动化学发光免疫分析仪的一般要求，申请人应依据产品的具体特性确定其中内容是否适用，若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。 本指导原则是对申请人和审查人员的指导性文件，但不包括注册审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但需要提供详细的研究资料和验证资料，相关人员应在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。 本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将适时进行调整。
二、适用范围 化学发光免疫分析根据化学发光物质的类型和发光特点，可分为电化学发光免疫分析和化学发光免疫分析，其中化学发光免疫分析根据发光剂的不同，可分为直接化学发光免疫分析、酶促化学发光免疫分析和鲁M诺氧途径免疫分析。目前，各类型化学发光免疫分析的常见发光剂包括：电化学发光剂为三联吡啶钌[（）]，直接化学发光剂为吖啶酯（），酶促化学发光剂为辣根过氧化物酶（）催化鲁M诺（氨基苯二甲酰肼，）及其衍生物或者碱性磷酸酶催化（′螺旋金刚烷）甲氧基（″磷酰氧基）苯二氧杂环丁烷（），鲁M诺氧途径发光剂为酞箐、二甲基噻吩衍生物及螯合物。 化学发光免疫技术根据反应过程中标记物是否需要分离可分为均相反应和非均相反应。均相反应主要应用于鲁M 诺氧途径免疫分析中，而非均相反应则应用于其他类型化学发光免疫分析中，通过采用固相分离、过滤分离、珠式分离、顺磁性颗粒分离等方式实现游离标记物和免疫复合物标记物的分离，其中顺磁性颗粒分离较其他分离方式更为常用。目前，基于鲁M诺氧途径免疫分析原理的产品还比较少，临床常用的全自动化学发光免疫分析仪更多地采用非均相反应模式。 本指导原则适用于采用上述化学发光免疫技术和反应
本文由：华夏学术传媒网提供https://www.doczj.com/doc/a09510406.html, 摘要：本文根据各化学发光免疫分析方法所使用标记物质的不同，将化学发光免疫分析方法分为化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法，并对各方法经典标记物质及分析方法原理进行了分析。同时，介绍了化学发光免疫分析方法在医学检验、食品安全及环境科学方面的应用进展情况。 关键词：化学发光免疫分析；分类；研究进展 化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。其发光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激发态，当中间体由激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而实现定量分析［1］。 化学发光免疫分析方法是将化学发光与免疫反应相结合的产物，因化学发光具有荧光的特异性，但与荧光产生需要激发光不同，化学发光由化学反应产生光强度，并不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响。化学发光免疫分析包含了免疫化学反应和化学发光反应两个部分。免疫分析系统是将化学发光物质或酶标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体特异性反应形成抗原－抗体免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。待测物质浓度因为与发光强度成一定的关系而实现检测目的［2］。 一、化学发光免疫分析方法的类别化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为3 大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。（一）化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。 1. 鲁米诺类标记的化学发光免疫分析。鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光，其中H2O2最为常用。因发光反应速度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。酶类主要是辣根过氧化物酶（HRP），无机类包括O3、卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它们的配合物。鲁米诺在碱性溶液下可在催化剂作用下，被H2O2等氧化剂氧化成3－氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子。鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射波长为425 nm。 2. 吖啶酯类标记的化学发光免疫分析 吖啶酯用于化学发光免疫分析方法（ChemiluminescentImmunoassay，CLIA）由于热稳定性不是很好，Klee 等研究合成了更稳定的吖啶酯衍生物。在含有H2O2的碱性条件下，吖啶酯类化合物能生成一个有张力的不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N－甲基吖啶酮，当其回到基态时发出一最大波长为430 nm 的光子。吖啶酯类化合物量子产率很高，可达0.05。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，发光体系简单、快速，不需要加入催化剂，且标记效率高，本底低。吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物应用于CLIA，通常采用HNO3+H2O2和NaOH 作为发光启动试剂，有些在发光启动试剂中加入Triton X－100，CTAC，Tween－20等表面活性剂以增强发光。（二）化学发光酶免疫分析化学发光酶免疫分析（Chemiluminescent Enzyme Immunoassay,CLEIA）是以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），它们有各自的发光底物。HRP 最常用发光底物是鲁米诺及其衍生物。在CLEIA 中，使用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH和H2O2）作用下鲁米诺发光，酶免疫反应物中酶的浓度决定了化学发光的强
化学发光免疫分析法(CLIA) A、管式磁性微粒子化学发光免疫分析法: (竞争法:用标记抗原与待检抗原竞争性结合固相抗体,待检抗原与检测信号成反比) 一、原理:本实验采用竞争法,酶标抗原与标准品抗原竞争抗体,标准品抗原浓度越大,结合到抗体上的酶标抗原越少,RLU越小,B/B 值越小。例:A为一种抗原 小分子,有免疫反应性。实验中采用竞争法对尿液中的A进行分析,使待测A、辣根过氧化物酶标记的A(A-HRP)在均相体系中与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的兔抗A 抗体(FITC-A抗体)发生竞争性免疫反应,再加入用羊抗FITC抗体包被的磁微粒,反应生成物结合在磁微粒上,在磁场经分离、洗涤后加发光底物,用冷光分析仪检测发光强度(RLU),测定尿液中A的含量。 二、仪器: 1、Flash’n glow LB955 30 管全自动进样冷光分析仪(Berthold 公司); 2、高速离心机(Beckman 公司), 转速13000 r/min 3、磁性分离器(北京科美生物技术有限公司定制, 磁场强度2800 高斯) 4、XW80 旋涡混合器(上海精科实业有限公司)
5、试管12 × 60 mm(浙江拱东医用塑料厂) 6、磁性微粒子(磁性分离剂, Adaltis 公司) 三、试剂 1、A标准品 2、A单克隆抗体 3、A-BSA结合物 4、抗FITC抗体包被的磁性微粒子(5mg/mL) 5、FITC标记的A单克隆抗体 6、HRP标记的A 7、PBST 洗涤液(0、05mol/L PBS, 含0、05% Tween-20) 8、分析缓冲液(0、05 mol/L 的PBS 缓冲溶液, pH 7、4, 含2、0%BSA、0、5 %的水解明胶、0、1%的Proclin-300) 9、发光底物液(鲁米诺、过氧化氢与对碘苯酚溶液) 实验用水为二次蒸馏水 四、试剂处理 1、用分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释标准品; 2、取A-BSA-HRP溶液, 以分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000 的A-BSA-HRP 溶液,4 ℃保存、 FITC-A单克隆抗体溶液的配制: 取FITC-A单克隆抗体溶液, 以分析缓冲液为稀释液,梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000、1:10000、1:12000 的FITC-A单克隆抗体溶液, 4 ℃保存。(具体分析) 五、数据处理 通过测量标准品与样品溶液的发光强度(RLU),使用Fl ash’n glow LB955 发光分析仪自带软件中的数据处理程序对测得的数据进行处理、线性方程采用的就是logit(Y)-log(X)的线性回归数学模型, 以logitY 为纵坐标, logX 为横坐标, 其线性方程表达式为logit(Y) = a + blog(X), 线性方程中 X 为标准品(或待测样品)溶液的浓度, logit(Y) =ln(y/1-y),y=B/B0,式中, B 为标准品(或待测样品)溶液的发光强度, B0 为不加标准品(或待测样品)而加分析缓冲液的发光强度、根据标准品的浓度与发光强度值, 经线性回归得标准曲线, 代入样品
化学发光免疫分析技术题库1-1-8
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]下列不会影响标记的因素是（） A.被标记蛋白质的性质 B.原料比 C.温度 D.湿度 E.标记率 影响标记的因素包括：①发光剂的选择。②被标记蛋白质的性质。抗原作为被标志物时，应具有较高的纯度和免疫学稳定性；抗体作为被标志物时，则要求具有较高的效价，应用提纯的IgG来代替全血清。③标记方法的选择应正确选择与发光剂和被标志物结构相适应的耦联方式。④原料比。在制备发光剂-IgG抗体结合物时，IgG：发光剂：交联剂的克分子比mol：mol：mol会影响结合物的发光效率。⑤标记率。是指结合物中IgG与发光剂之间的克分子比。由于每一种发光剂对应于被标志物都有特定的最佳标记率，标志物选择不好，会出现不易保存等现象。⑥温度。控制标记时的反应温度极为重要，对于较稳定的小分子被标志物，温度可稍放宽些；而当被标志物是抗原或抗体蛋白质时，由于蛋白质对热的不稳定性，应在保证标记反应进行的前提下，尽量选择较低的温度，以避免蛋白质在标记过程中活性的丧失。⑦纯化与保存。多数经耦联反应制备的结合物，使用前都需进行纯化，除去未结合的发光剂和交联剂。结合物一般可分装保存在-70℃条件下，最好冷冻干燥保存。
问题： [单选,A2型题,A1A2型题]不需酶催化反应即可发光的发光底物是（） A.吖啶酯 B.三联吡啶钌 C.鲁米诺或其衍生物 D.4-MUP E.AMPPD 吖啶酯化学发光特点：①推动发光的氧化反应简单快速，不需要催化剂，只要在碱性环境中即可进行；②反应体系中加入H2O2和NaOH溶液后，发光迅速，背景噪声低，保证了测定的敏感性；③吖啶酯可直接标记抗原或抗体，结合稳定，不影响标志物的生物学活性和理化特性；④吖啶酯发光为瞬间发光，持续时间短，因此对信号检测仪的灵敏度要求比较高。
化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。其发光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激发态，当中间体由激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而实现定量分析。 化学发光免疫分析方法是将化学发光与免疫反应相结合的产物，因化学发光具有荧光的特异性，但与荧光产生需要激发光不同，化学发光由化学反应产生光强度，并不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响。化学发光免疫分析包含了免疫化学反应和化学发光反应两个部分。免疫分析系统是将化学发光物质或酶标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体特异性反应形成抗原－抗体免疫复合物。化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。待测物质浓度因为与发光强度成一定的关系而实现检测目的。 一、化学发光免疫分析方法的类别 化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为 3 大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。 （一）化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。 1. 鲁米诺类标记的化学发光免疫分析。 鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光，其中H2O2最为常用。因发光反应速度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。酶类主要是辣根过氧化物酶（HRP），无机类包括O3、卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它们的配合物。鲁米诺在碱性溶液下可在催化剂作用下，被H2O2等氧化剂氧化成3－氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子。鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射波长为425 nm。 2. 吖啶酯类标记的化学发光免疫分析 吖啶酯用于化学发光免疫分析方法（ChemiluminescentImmunoassay，CLIA）由于热稳定性不是很好，Klee 等研究合成了更稳定的吖啶酯衍生物。在含有H2O2的碱性条件下，吖啶酯类化合物能生成一个有张力的不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N－甲基吖啶酮，当其回到基态时发出一最大波长为430 nm 的光子。吖啶酯类化合物量子产率很高，可达0.05。吖啶酯作为标记物用于免疫分析，发光体系简单、快速，不需要加入催化剂，且标记效率高，本底低。吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物应用于CLIA，通常采用HNO3+H2O2和NaOH 作为发光启动试剂，有些在发光启动试剂中加入Triton X－100，CTAC，Tween－20等表面活性剂以增强发光。 （二）化学发光酶免疫分析 化学发光酶免疫分析（Chemiluminescent Enzyme Immunoassay,CLEIA）是以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），它们有各自的发光底物。HRP 最常用发光底物是鲁米诺及其衍生物。在CLEIA 中，使用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH和H2O2）作用下鲁米诺发光，酶免疫反应物中酶的浓度决定了化学发光的强度。此传统的化学发光体系（HRP－H2O2－lumi-nol）为几秒内瞬时闪光，存在发光强度低、不易测量等缺点。后来，在发光系统中加入增强发光剂，以增强发光信号，并在较长时间内保持稳定，便于重复测量，从而提高分析灵敏度和准确性。碱性磷酸酶（ALP）已广泛用于酶联免疫分析和核酸杂交分析。 碱性磷酸酶和1，2－二氧环己烷构成的发光体系是目前最重要、最灵敏的化学发光体系。这类体系中具有代表性的是Bronstein 等提出的ALP－AMPPD 发光体系。AMPPD 为1，
化学发光免疫分析技术题库1-2-10
问题： [单选]标本为组织切片的细胞表面粘附分子最常用的测定方法是（） A.酶免疫组织化学方法 B.免疫荧光方法 C.流式细胞仪 D.化学发光免疫测定方法 E.时间分辨荧光免疫测定方法
问题： [单选]细胞外可溶性粘附分子的最常用的测定方法是（） A.原位PCR B.原位RT－PCR C.化学发光免疫测定方法 D.RT－PCR E.ELISA
问题： [单选]下列有关化学发光错误的说法是（） A.化学发光是指伴随着化学反应过程所产生的光的发射现象 B.化学发光与荧光形成激发态分子的激发能相同 C.化学发光是吸收了化学能使分子激发而发射的光 D.大多数化学发光反应为氧化还原反应 E.化学发光必须提供足够的化学能 化学发光是吸收了化学能使分子激发而发射的光，而荧光是吸收了光能使分子激发而发射的光。https://www.doczj.com/doc/a09510406.html,/ 电竞之家
问题： [单选]化学发光免疫测定的发光剂不包括（） A.鲁米诺 B.吖啶酯 C.碱性磷酸酶 D.异鲁米诺 E.三联吡啶钉 除选项C外，其余均可作为化学发光免疫测定的发光剂。
问题： [单选]下列关于化学发光效率说法错误的是（） A.又称化学发光反应量子产率 B.发光效率决定于生成激发态产物分子的化学激发效率 C.发光效率决定于激发态分子发射效率 D.发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质决定 E.所有的发光反应都具有相同的化学发光效率 每一个发光反应都具有其特征性的化学发光光谱和不同的化学发光效率。
化学发光免疫分析法（CLIA） A、管式磁性微粒子化学发光免疫分析法： （竞争法：用标记抗原与待检抗原竞争性结合固相抗体，待检抗原与检测信号成反比） 一、原理：本实验采用竞争法，酶标抗原与标准品抗原竞争抗体，标准品抗原浓度越大，结合到抗体上的酶标抗原越少，RLU越小，B/B0值越小。例：A为一种抗原小分子，有免疫反应性。实验中采用竞争法对尿液中的A进行分析，使待测A、辣根过氧化物酶标记的A(A-HRP)在均相体系中与异硫氰酸荧光素（FITC）标记的兔抗A抗体（FITC-A抗体）发生竞争性免疫反应，再加入用羊抗FITC抗体包被的磁微粒，反应生成物结合在磁微粒上，在磁场经分离、洗涤后加发光底物，用冷光分析仪检测发光强度（RLU），测定尿液中A的含量。 二、仪器：
1、Flash’n glow LB955 30 管全自动进样冷光分析仪(Berthold 公司); 2、高速离心机(Beckman 公司), 转速13000 r/min 3、磁性分离器(北京科美生物技术有限公司定制, 磁场强度2800 高斯) 4、XW80 旋涡混合器(上海精科实业有限公司) 5、试管12 × 60 mm(浙江拱东医用塑料厂) 6、磁性微粒子(磁性分离剂, Adaltis 公司) 三、试剂 1、A标准品 2、A单克隆抗体 3、A-BSA结合物 4、抗FITC抗体包被的磁性微粒子（5mg/mL） 5、FITC标记的A单克隆抗体 6、HRP标记的A 7、PBST 洗涤液(0.05mol/L PBS, 含0.05% Tween-20) 8、分析缓冲液(0.05 mol/L 的PBS 缓冲溶液, pH 7.4, 含2.0%BSA、0.5 %的水解明胶、0.1%的Proclin-300) 9、发光底物液(鲁米诺、过氧化氢和对碘苯酚溶液) 实验用水为二次蒸馏水 四、试剂处理 1、用分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释标准品； 2、取A-BSA-HRP溶液, 以分析缓冲液为稀释液, 梯度稀释, 配制1:1000、1:2000、1:5000 的A-BSA-HRP 溶液,4 ℃保存. FITC-A单克隆抗体溶液的配制:
引进全自动化学发光免疫分析仪可行性报告书 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT
引进全自动化学发光免疫分析仪可行性报告书尊敬的各位领导： 随着检验技术快速的发展，在免疫检测项目方面也取得了很多优秀的成果。全球临床的实践验证，化学发光免疫分析技术由于其检测速度快、检测结果性能好、操作简单、等优点目前已成为全球最经典最先进的检测技术。 随着未来医院的不断发展壮大，考虑到医院的长期效益，我科需求一台全自动化学发光免疫分析系统，更好的满足临床诊疗工作的需要。 一、引进理由 1、引进先进医疗设备、提高医疗市场竞争力的需要，并且周边医院都有同类似的仪器（大英、河边镇中心卫生院、安居区人民医院）。 2、根据多数医院的了解，该设备都能取得良好的经济效益和社会效益。因此引进全自动化学发光仪是提高工作效率和检验质量的必需条件。 3、据统计，医院临床科室许多诊断依据来自，现在医学非常强调循证医学，作为窗口科室，先进的检验仪器有助于提高临床诊断率，提升医院在本地区的档次和地位，树立良好的社会形象。 4、提升经济效益、促进医院整体发展的需要
是个含金量极高的科室。据统计分析，收入普遍占医院总收入的8-12％，如引进全自动化学发光仪后，据了解，纯利可达45％左右。增大了临床要求和目前激烈的市场竞争需求 5、为临床快速提供检验结果的需要 全自动化学发光免疫分析仪测试速度高达100---180测试/小时，回报及时准确，并且对急诊项目设有急诊功能。 6、为临床提供全面检测项目的需要 全自动化学发光免疫分析仪可提供全面的检测项目，项目包涵：肿瘤、激素、甲状腺功能、心肌梗塞等多项。可灵活方便地分系统设置项目组合，大大方便临床诊断。 7、检验质量质控的需要 全自动化学发光免疫分析仪由仪器自动采样、加样并自动检测，采用独立试剂包，最大限度减少手工加样、试剂线性、交叉污染等因素对检验结果的影响，精密度、准确度都非常高。 二、经济效益分析 简单测算如下： 在收费价格方面，了解本地的情况是：我院每年住院病人是3000多人，每人只做两对半，年收入达30多万元，成本预计55%，年纯收入：150000元左右通过上述测算估计，引进全自动化学发光免疫分析仪效益可观。
化学发光免疫分析法概述 化学发光是物质在氧化还原过程中发光的现象。能产生化学发光的物质称为化学发光剂。 化学发光免疫分析法是用化学发光剂包括发光物质或者发光反应催化剂等直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应结合起来，藉以检测抗原或抗体的分析技术。将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，免疫反应后，通过化学发光反应来测定发光标记物或酶标记物的化学发光信号，从而确定待测抗原或抗体的浓度.化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，clia）兴起于20世纪80年代，由于方法成熟，目前已经成为临床免疫诊断的主要方法。化学免疫分析是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。临床上所用的化学发光试剂盒包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。免疫反应系统，其基本原理同酶联免疫技术（elisa）。 根据标记物的不同可分为三大类:1.标记酶的化学发光免疫分析，其中应用 最多的是三种酶：依据HRP-Luminol-H 20 2 -对碘苯酚(PIP)增强型化学发光反应体 系进行检测的辣根过氧化物酶(HRP)；能催化AMPPD的分解反应从而产生化学发光进行抗原抗体定量分析的碱性磷酸酶(ALP)；另一种是虫荧光素酶，能催化氧化虫荧光素产生发光而实现对ATP、各种激素、药物以及抗原抗体的定量分析。2.标记直接化学发光物质的化学发光免疫分析，最典型的是标记氨基异鲁米诺(ABEI)和吖啶酯类的化学发光免疫分析。3.标记荧光物质，通过过氧化草酸酯化学发光体系进行检测的化学发光免疫分析。按照标记反应的过程和形成结合物的结构特点，可以将标记分子分为“直接偶联”和“间接偶联”两种方式。间接偶联可以在原有结构中引进新的活性基，增加反应活性。 下面就鲁米诺、光泽精等几种化学底物发光原理作一简要评述。 1 常见的发光物质 1.1 鲁米诺和其衍生物鲁米诺（luminol）和其衍生物是最早在化学发光免疫分析中使用而且被临床较广泛应用的一种常用的化学发光物。吴秋华等［1］对2003年以前鲁米诺在化学发光反应的进展以及应用做过详细的概述。 在碱性溶液中，鲁米诺可以被多种氧化剂氧化（H 2O 2 ）而发光，发光底物在 酶（辣根过氧化物酶、过氧化氢酶和黄嘌呤氧化酶等）的作用下，发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态的中间体，当激发态中间体回到稳定的基态时，可同时发射出光子。
化学发光免疫分析技术及厂家简介 2017.01.16
目录 第一部分化学发光简介第二部分化学发光类型第三部分进口化学发光系统简介 第四部分国产化学发光系统简介
--发光原理 激发态ν 发光：是指分子或原子中的电子吸 收能量后，由基态（较低能级）跃 能量h.ν迁到激发态（较高能级），然后再 回到基态，并释放光子的过程。 基态ν0
--发光类型 形成激发态分子的能量来源不同 指发光剂（荧光素）经短波长的入射光照射后，电子吸收能量跃迁到激发态，在其回复至基态时，发射出较长波长的可见光（荧光）。发生在生物体内的发光现象。如萤 火虫的发光，反应底物为萤火虫荧 光素，在荧光素酶的催化下，利用 ATP能，生成激发态氧化型荧光素， 它在回复基态时多余的能量以光子 的形式释放出来。 指伴随化学反应过程所产生的光的 发射现象。某些物质(发光剂)在化学 反应时，吸收了反应过程中所产生 的化学能，使反应的产物分子或反 应的中间态分子中的电子跃迁到激 发态，当电子从激发态回复到基态 时，以发射光子的形式释放出能量。 光照发光生物发光化学发光
--化学发光分类——发光剂不同 酶促（间接）化学发光 ?用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（ALP）来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物（发光剂），酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。 ?优势：发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗，发光信号强而稳定，且发光时间较长； 检测方式简单、成本较低； ?代表厂家：贝克曼-库尔特Access、DPC、三联、安图等。