螺旋课堂第一课－－荧光定量PCR 技术
PCR 技术的发明极大地推动了分子生物学的发展，而且迅速被推广和应用到生命科学的各个领域，可以说它是目前核酸分子水平的基础及应用研究中使用最广泛的一项技术。
常规PCR 中，在扩增反应结束之后，我们一般通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，无法对PCR 扩增反应进行实时检测，也无法对起始模板准确定量，而很多情况下，我们所感兴趣的是起始模板量，如转基因动植物中插入某种外源基因的拷贝数或者病人中某种病毒DNA/RNA 的精确copy 数等，如此，荧光定量PCR 技术便应运而生。
本文将分为三大部分向大家介绍，首先是理论篇：首先了解荧光定量PCR 的理论知识，如荧光定量PCR 技术的原理、方法等；随后为实践篇：如实验的操作流程、注意事项、方法选择、结果分析与处理等；第三部分为问题分析与解答篇：荧光定量PCR 过程中有哪些常见问题，我们如何避免和解决。
荧光基团第一章理论篇
一、荧光定量PCR 技术发展史
1993 年，日本Higuchi 等人首次采用动态PCR 方法和封闭式检测方式对
目的核酸数量进行定量分析，首次提出了荧光定量PCR 技术的概念。当时他使
用了EB（溴乙锭）作为荧光标记染料，采用一台经过改良的热循环仪，用UV
射线照射样品然后通过CCD 相机检测产生的荧光值，利用了PCR 反应中的数
学函数关系，再结合加入标准品的方法，达到了对检测样品进行准确定量的目的，但
由于这种方法由于有着在实验仪器资金上巨大的耗费，一些非特异的PCR 产物
同样能被检测到并包含在被测的荧光信号值总量之中而导致定量不准确等因素，最终使这种实验技术在当时没能成为主流的实验技术。
1995 年美国PE 公司成功研制了TaqMan 技术，1996 年又推出了首台荧光
定量PCR 检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，并使用Ct 值进行分析，
荧光定量PCR 才很快得到大家的接受，并广为应用。
近年来，荧光定量PCR 技术不断完善，取得了突飞猛进的发展。由于其具
有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等优点，而被广泛应用于
基础科学研究、药物研发、临床诊断、转基因研究、基因检测等各个领域研究当中。
二、荧光定量PCR 概述
1、荧光定量PCR 概念
所谓定量PCR技术（r eal-time PCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR 进程，最后通过特定数学原理对未知
模板进行定量分析的方法（图1）。
图1 荧光定量PCR 反应原理
荧光检测元件
Ct值
2、荧光定量PCR 与普通PCR 的主要区别
常规PCR 中，PCR 产物通过凝胶电泳，然后进行成像分析，常规PCR 只能通过终点法对扩增产物进行定性分析，而不能进行定量分析（图2）；荧光定量PCR 中，PCR 反应体系中加入了荧光分子，通过荧光信号的变化来反应扩增产物的变化，使PCR 产物的实时检测成为可能。相对常规PCR 而言，荧光定量PCR 的主要优点使准确地确定初始模版拷贝数和较高的检测灵敏度；荧光定量PCR 不仅可用于定性，如判断一段序列的有无，也可用于定量，如确定起始模版的拷贝数；
图2 终点法定量PCR 的缺陷
理论上PCR 是一个指数增长的过程，但是实际的PCR 扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S 形曲线。这是因为随着PCR 循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq 酶、dNTP、引物，甚至DNA 模板等各种PCR 要素逐渐不敷需求，PCR 的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq 酶都被饱和以后，PCR 就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR 反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是96次PCR重复实验，各种条件基本一致，所得结果有很大差异（图2）。
常规PCR 的定量方法，测定的都是PCR 的终产物，而不是起始DNA 拷贝数。由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系（图2），所以不能根据最终PCR 产物的量直接计算出起始DNA 拷贝数。虽然加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
而从图2 也可以看出，虽然相同模版在同一台PCR 仪上进行96 次扩增，终点处检测产物量不恒定，但96 次PCR 扩增曲线都有一个共同的拐点，即荧光定量PCR 中Ct 值的重现性，恒定的Ct 值为荧光定量PCR 的分析提供了理
论依据。
前面我们对荧光定量PCR 的历史、荧光定量PCR 概念和与常规PCR 区别有了大致的了解，但你可能心中存在许多疑惑：什么是扩增曲线？什么是Ct 值？它们有什么特点？我们如何来判定荧光定量PCR 反应中的Ct 值，原理是什么？。。。。。。
为了使大家更好的理解、掌握荧光定量PCR 技术，在介绍荧光定量PCR 检测方法、动力学原理和数据分析方法前，有必要先介绍几个最基本的概念。3、荧光定量PCR 的几个基本概念
3.1 扩增曲线
为了更好的理解荧光定量PCR 原理，我将用样品扩增曲线来进行说明。描述PCR 动态进程的曲线即扩增曲线。PCR 的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是呈S 型曲线（图3）。图3中，X－轴表示PCR循环数，Y－轴表示扩增反应的荧光值，与反应管中扩增产物的量有比例关系。
图 3 荧光定量PCR 扩增曲线示意图
荧光阈值
从图3 可以很直观的看出，荧光定量PCR 扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期），荧光信号指数扩增阶段（对数期）和平台期。在基线期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR 产物量不能计算出起始DNA 拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。
3.2 荧光阈值
在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任在介绍荧光阈值之前，先了解一下荧光本底信号（图3），我们一般把荧光PCR 的前15 个循环信号作为荧光本底信号（baseline，基线期），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。荧光阈值是
（机器自动设置）。我们在做荧光定量PCR 实验时，经常采用手动设置，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号是荧光信号超过域值（图4）。
图4 手工调整荧光阈值示意图
3.3 Ct 值
了解了荧光阈值的概念后，Ct 值就很好理解了。C 代表Cycle，t 代表threshold，所谓Ct 值就是在荧光PCR 扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。如图3 所示，黑色的线显示的是荧光阈值，当信号超过黑色线时所经历的循环数即为Ct 值。从这也可以了解到Ct 值是可以变化的，我们实验时带有一定的人为因素。而荧光定量PCR 后面的数据处理要用到Ct 值来计算，所以有关荧光阈值的设置就显得尤为重要。一般说来，新手按荧光PCR 仪的自动设置为好，而如果你非常有经验，一般会手动设置荧光阈值。因为Ct 值即达到荧光阈值所经过的循环数，所以它就与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，经过的循环数就越少，Ct 值也就越小，反之亦然。正常的CT 值范围在18-30 之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。
前面也提到过，同一模板经过96 次PCR 扩增，扩增产物虽然不恒定，但Ct 值极具重现性。根据这个特点，我们可以利用已知起始拷贝数的标准样品的Ct 值做出标准曲线，只要在同一次PCR 实验中得到未知样品的Ct 值，就可以根据曲线算出该未知样品的起始拷贝数。
接下来我们就来看看通过Ct 值算出拷贝数的数学原理是怎样的：
首先我们来回顾一下PCR扩增原理（图5），从PCR原理图中我们也可以很清意位置上，荧光域值的缺省设置是3 ～15 倍
10
个循环的荧光信号的标准偏差的
楚的知道理想的PCR反应是以2n次方增长的方式扩增，即：
X=X0×2n
但由于PCR 反应体系是一个有限的体系，也就是我们加入到PCR 反应体系中的物质是有限的，例如酶、引物、Buffer 等，只有在对数增长期时，PCR 的扩增效率才等于1，大部分时候扩增效率小于一，有时甚至等于零。因此PCR 扩增的真正情况是：
X=X0 (1+Ex)n
其中n：扩增反应的循环次数；X：第n 次循环后的产物量
X0：初始模板量；E x：扩增效率
在扩增产物达到阈值线时所经历的循环数为Ct个循环，此时的产物量为
X Ct=X0 (1+Ex)Ct =M
其中X Ct：荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量，在阈值线设定以后, 它是一个常数，我们设为M，
对方程式两边同时取对数得logM=logX0 (1+Ex)Ct，我们对该方程式做简单的数学运算后得到：
log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M
其中M 为常数，Ex 为常变数，也就是说Ex 在PCR 反应中的某一个循环中是一个常数，但不同的循环数中，Ex 的数值会发生变化。因此从上式可以推出：Log 浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct 值就可计算出样品中所含的模板量。
图 5 PCR 原理图
3.4 标准曲线
在绝对定量中，未知样本的量如基因拷贝数可通过梯度稀释的已知量的标准品的Ct 值推算出。在实验过程中，我们可以将已知浓度的标准品进行梯度稀释个（5－6
稀释梯度），将未知样品和梯度稀释的标准品在同一荧光PCR 实验中
2
得n＝Ct
，
3.32 值差3.32。
进行反应，将稀释标准品得到的Ct 值构建标准曲线，通过标准曲线可以推算出未知样品的量（图6）。标准曲线的制作不需要人工操作，由仪器自动完成。
理论上，一系列稀释样品的扩增曲线之间有均匀的间距（图6 左），如果PCR 反应呈理想的方式扩增，产物在每一循环都加倍，荧光曲线之间的间距则符合等
式“ n＝稀释倍数”，n为2 样本间Ct值差。例如：10 倍稀释的样本，2n＝10，可
图 6 荧光定量PCR 标准曲线示意图
3.5 扩增效率
在绝对定量中，我们将已知模板稀释成一系列浓度梯度进行荧光PCR 实验，利用拷贝数和Ct 值做成标准曲线，利用递减的直线关系等式和相关系数（r）或可信度来计算扩增效率。
扩增效率与标准曲线的斜率相关，计算方程为：扩增效率（E -1/斜率。理论上，在每个指数扩增循环中，PCR产物的量加倍，即PCR产物2 倍增加，反应效率为2，扩增效率就为2，就可得2＝10-1/斜率，标准曲线得斜率就为-3.32，斜率得绝对值与荧光曲线间距相同。
如果将扩增效率用百分率来表示，即：E%=(E-1)×100%，对于理想的 PCR 反应，E=2，即：扩增效率E%=(2-1)×100%=100%
如果E＝1.92，带入方程(1.92-1)×100%=92%，表示每个循环的终点，扩增产物的拷贝数增加1.92 倍，或每次循环有92％的模板被扩增。
一般说来，扩增效率接近100％是优化的重复性好实验的最好标志，实际操作时，反应的扩增效率应该在90％－105％之间，如果扩增效率低，可能的原因是引物设计不当，或者反应条件未优化；扩增效率大于100％时，可能的原因是系列稀释样品加样错误，或者有非特异性产物扩增，如引物二聚体产生。用上述方法确定扩增效率时，反应体系中的抑制剂的出现也可能导致扩增效率明显增加，原因是高浓度模板样本中抑制剂的浓度低，导致反应的Ct 值延迟出现，而低浓度模板样本中抑制剂浓度高，反应的Ct 值延迟程度小，导致斜率的绝对值以及计算所得的扩增效率会增加。如果扩增效率小于90％或大于105％，建议重新设计引物或探针。
10
）＝
法和 Taqman 水解探针的特异性方法，在这里主要介绍这 2 种方法，其它方法请参考其它荧光定量 PCR 资料。
1、非特异性SYBR Green I 染料
法
SYBR Green I 是一种结合于所有dsDNA 双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料（图7），在游离状态下，SYBR Green I 发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强（图8）。因此，SYBR Green I 的荧光信号强度与双链DNA 的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA 数量。SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。
图8 SYBR Green I 作用机理示意图
三、荧光定量PCR 的方法
荧光定量PCR 所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。而荧光定量PCR 的方法相应的可分为特异类和非特异类两类，特异性检测方法是在PCR 反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物；而非特异性检测方法是在在PCR 反应体系中，加入过量荧光染料，荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射出荧光信号。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。
荧光定量PCR 最常用的方法是DNA 结合染料SYBR Gree nⅠ的非特异性方
应。
溶解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。扩增反应
完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生溶解曲线，随着反应
中双链DNA 变性，荧光染料又回复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号
改变的负的一次导数与温度作图，在扩增产物的溶解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50％的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引
物二聚体区分开，因为它们在不同的温度溶解（图9）。
图9 SYBR Green I 扩增产物溶解曲线分析
2、特异性Taqman 水解探针法
Taqman 荧光定量技术是以Taqman 荧光探针为基础，Taqman 荧光探针为
SYBR Green I 的优点：实验设计简单，仅需要设计上下游一对引物，不需
要设计探针，无需设计多个探针即可快速检验多个基因，通用性好；成本低；能够
通过溶解曲线分析检验扩增产物的特异性。因而在低通量实验和单重实验时一般
优先考虑使用SYBR Green I 染料法。
SYBR Green I 的缺点：由于SYBR Green I 与所有的双链DNA 相结合，
因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的
精确性，SYBR Green I 方法对PCR 扩增特异性要求较高。实验过程中通过熔解
曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green I 得到定量结果。另外，
因为SYBR Green I 不能区分不同扩增子发出的荧光而导致它不能用于多重反
一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光发射基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，发射基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq 酶的5’－3’ 外切
酶活性将探针酶切降解，使荧光发射基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测
系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA 链，就有一个荧光分子形成，实现
了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步。从而实现定量。当探针与靶序
列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭基团接近而被淬灭。在进行延
伸反应时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭基团分离，发出荧光。一分子产物生成伴随一分子荧光信号产生（图10）。随着扩增产物
的增加，荧光增强。PCR 扩增程序通常将复性与延伸合二为一。常用的
荧光基团是FAM, TET, VIC, HEX。
图10 Taqman 探针工作原理
由于Taqman 探针法中，除引物外，还使用了一条特异的探针，因此此方法可以特异的检测目标序列，防止非特异产物的干扰影响定量的准确性，同时它也可以用于多重反应，但探针设计成本较高，有时探针设计困难。
）中核酸的量（拷贝数、微 第二章 实践篇
我们在设计实验的时候通常对下列事情更感兴趣：1）测定未知样品的绝对量：如给定的血样中的病毒颗粒数，食品中某一种转基因成分的含量；2）未知样品与已知样品相比，基因的表达量改变了多少倍：如相当量的肿瘤组织和正常组织相比，p53mRNA 改变了多少倍。分析这两种假设的方法就分别叫绝对定量和相对定量。
绝对定量是通过样品的 Ct 值和标准曲线进行比较实现的。分析的结果是给定数量的样品中（给定数量的细胞，每微克总 RNA 克）。
相对定量的分析结果是在相当量的试验组（样品 A 一个靶基因的相对比率（倍数差异）。
接下来我们就来看看我们在实验过程中如何来使用绝对定量和相对定量的分析方法。
一、绝对定量分析
1、绝对定量分析方法的使用条件
在这里我将举例来说明我们在实验过程中，何种实验需要用绝对定量来进行分析。医生对一个乙肝病人的每毫升血液中 HBV DNA 的精确拷贝数感兴趣。首先医生要从病人血液中提取 DNA ，然后通过荧光定量 PCR 实验来确定 HBV 病毒 DNA 的 copy 数。通过病人样品的 Ct 值和设置梯度稀释的已知 HBV 对照样品的标准曲线进行比较，医生就能确定病人血液中 HBV 病毒 DNA 的 copy 数。从这个例子，我们也可以看出，在实验过程中，如果最终的结果是对未知样品的定量描述，并不依赖别的样品的性质的时候，就应该使用绝对定量进行分析。 2、引物和探针的设计
使用 Taqman 探针法要同时考虑探针和引物的质量。首先要寻找合适的探针位置，再设计引物，并使引物尽可能靠近探针。 2.1 引物设计原则
引物的设计大家应该非常清楚了，在这里就不再赘述，但荧光定量 PCR 引物的设计还是与普通 PCR 引物设计有所差别和要求。 2.2 探针设计原则
?
?
探针的 5’端应避免使用碱基 G 。
65－70℃，通常比引物 Tm 高
）中 B ）和对照组（样品 探针长度通常在 20－30bp ，Tm 值在 GC 含量在 40%－70%。
目的基因PCR 扩增
目的基因克隆 重组质粒筛选
?
探针内部或探针与 2 条引物之间避免 3 个碱基以上的互补序列。 ?
整条探针中，碱基 C 的含量要明显高于 G 的含量。
? 为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在 blast 中核实一次，如果发现
有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。
3、标准品的制作： 3.1 标准品制作流程
梯度稀释制作标准品
计算质粒DNA
拷贝数
质粒DNA 提取、重组质粒鉴定
3.2 标准品拷贝数的计算
待测样本浓度（ng/ul ）＝OD 260×40×稀释倍数样本分子量=碱基数×324
待测样本拷贝数（copies/ul ）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014 3.3 标准品的梯度稀释：
1v 原液(标准品 i) +9v 稀释缓冲液，得标准品 ii 1v 标准品 ii+9v 稀释缓冲液，得标准品 iii 1v 标准品 iii +9v 稀释缓冲液，得标准品 iv 1v 标准品 iv +9v 稀释缓冲液，得标准品 v
注意：稀释的时候，1v 体积不要只加 1ul ，体积最好加大，如 10ul ，这样有助于保证标准品稀释是均一的 10 倍梯度.
4、荧光定量 PCR 模板的制备
请查阅 DNA/RNA 提取、逆转录的相关资料。 5、荧光定量 PCR 体系准备 PCR 条件摸索：
不加探针的常规 PCR 反应，验证引物是否合适、模板是否降解、模板纯度是否合适。同时确定最佳反应体系和反应条件。由于当前大部分实验为使用 mix ，所以只用摸索模板、引物条件即可。
模板浓度：如果是首次实验，那么应选择一系列稀释浓度的模板来进行实验条件摸索，以选择出最合适的模板浓度，条件困难时，也至少要选择两个稀释度（高
或中、低浓度）来进行实验。一般而言，Ct 值在 15－30 范围内比较合适，若大于 30 则应加大模板使用量，如果 Ct 小于 15 则应对模板进行稀释后再进行实验。 引物的浓度：引物的浓度是一个影响 PCR 反应的关键因素，若浓度太低，会致使反应不完全，若引物太多，则发生错配以及产生非特异的产物的可能性会大大增加。对于大多数 PCR 反应，可在 0.1－1.0uM 之间进行选择，直至得到满意的结果。
探针浓度：初次实验每个探针用 0.2uM ，如果信号强度达不到要求，可以适当增加至 0.4uM
将已知浓度的HBV 阳性标准品做系列浓度稀释，分别含有 5×103、5×104、5×105、5×106 copies /ml ，建立 20ul 反应体系（参照优化体系），3 次重复（荧光PCR 一般进行 3 次以上重复，有的甚至达到了 6 次以上重复）。
以某病人的血液提取的 HBV 病毒 DNA 为模板，建立 20ul 荧光定量 PCR 反应体系（参照优化体系），每个样品 3 次重复，同时设置不加模板的阴性对照。 6、荧光定量 PCR 体系配制及仪器程序设置
请参照各公司荧光定量PCR 试剂、荧光定量 PCR 仪器说明书进行。
7、实验结果与数据处理
PCR 反应结束后，得到如下数据：
copies/ml Ct1 Ct2 Ct3 Mean Ct STD
5×103 27.61 27.58 27.84 27.67667 0.13 5×104 24.25 24.42 24.55 24.40667 0.08 5×105 21.11 21.04 21.16 21.10333 0.06 5×106 18.05
18.06
18.21 18.10667
0.08 BLANK None None None
sample
23.25 23.46 23.39 23.36667
0.05
注：平行样的 Ct 值之间的差<0.5 时表示重复性较好
直接从荧光 PCR 仪上就可以得到标准曲线：
29 y = -3.2013x + 30.827
27 R 2
= 0.9995
25
23 21
19 17 15
5×104拷贝数
5×105
5×106
理想的标准曲线的优劣有两个指标，相关系数（r 2）和斜率（slope ）。相关
C t 值
系数反映标准曲线的直线性，理想值应大于 0.98，越接近 1 说明直线性越好，定量越准确。斜率反映PCR扩增效率（E），理想的PCR扩增效率在 90％－105％之间，如果PCR扩增效率低，必须重新设计引物或探针；如果扩增效率高于理想值，可能是系列稀释样品加样错误，或者非特异性产物扩增，或反应体系中可能存在着对反转录反应或PCR反应阻害的物质，需要相应的解决办法。
从标准曲线可以看出： r2＝0.9995，大于 0.98，标准差都在 0.2 范围内，而E=10-1/-3.2013=2.04，扩增效率＝（2.04－1）×100%=104%，表示定量准确，可将未知样品的Ct值带入方程：
23.36667= -3.2013 X + 30.827 可得 X＝2.33
所以copies＝(5×104/2) ×2.33＝5.825×104
但我们需要注意的是，标准曲线只可能用于推算稀释梯度范围内的未知样本的量，而不能外推稀释梯度外的未知样本的含量。所以，我们在实验过程中尽可能使未知样品的浓度在标准品的稀释范围内。
二、相对定量分析
1、相对定量分析方法的使用条件
同绝对定量分析类似，我将举例来说明我们在实验过程中何种实验需要用相对定量来进行分析。我们如果想知道经过药物处理过的组织和未处理的组织中某一目的基因的表达水平是否有差异，相差多少倍？我们可以选择以下2 种方式：1)我们可以从等量的2 种组织中提取RNA，分别进行目的基因的反转录特异性荧光定量PCR 实验来确定目的基因在2 种组织中的表达量，结果可以反映等量的2 种组织中目的基因表达量的比率。
2）如果我们之前已经确定2 种组织中看家基因如GAPDH 的表达量相等，那么，我们就可以从大约等量（不需要等量）的2 种组织中分别提取RNA，通过RT-q P CR 实验来确定2 种组织中目的基因和看见基因的表达水平。药物处理组织的目的基因的表达量可由 2 种组织中看家基因和未处理组织中目的基因的表达量共同来确定。
2 种分析方法的差异就在于用的标准有所不同，方法1）中的标准是2 种组织的量相等；方法2）中的标准是2 种组织中看家基因如GAPDH 的表达量恒定不变；
2、相对定量数据处理方法：
对于不同的实验需求，我们可以采用不同的方法进行实验设计和数据分析，一般常用的方法有双标准曲线法、△Ct、2-△△Ct、用参照基因的△Ct法和Pfaffi 法，应用每种方法都有适应条件。
如为检测 A 基因在某因子干预下的表达，我们得到一组数据见下表：
待测基因（Ct 值）参照基因（Ct 值）待测基因扩增效率（E）参照基因扩增效率（E）干预前 A B C D
干预后 E F C D
根据实验要求我们可以选择相应的方法，如下表：
数据处理方法参考条件计算方法△Ct 法扩增效率为100%，仅需目标基因即可表达水平＝2-△Ct=2-(E-A)
2-△△Ct 目的基因和参照基因扩增效率都接近100％，且相
对偏差不超过5％，需要目标基因和参照基因。
表达水平＝2-△△Ct
＝2-[(E-F)-(A-B)]
参照基因的△Ct 同2-△△Ct 表达水平＝2(F-B)-(E-A)
Pfaffi 法目标基因和参照基因扩增效率不同，但目标基因间
的扩增效率相同，需目标基因和参照基因，以及扩
增效率。
表达水平＝C(A-E)/D(F-B)
而目前相对定量普遍采用操作简便的2-△△Ct分析方法，下面就以此分析方法为例进行分析，应用SYBR Green方法对不同样本间X基因表达分析的详细说明和举例。
3、引物的设计
在这里不再赘述，但需要提醒大家再设计扩增片段长度时，最好在100－200bp 范围内，在这范围内，扩增片段越短，有效扩增反应越容易实现，同时较短的扩增片段也可保证分析的一致性。
4、模板的制备
请查阅DNA/RNA 提取、逆转录的相关资料。
5、PCR 体系准备
PCR 条件摸索：
同绝对定量分析条件摸索，只是值得注意的是由于SYBR 染料法对引物要求要比探针法高，在荧光定量实验前，我们可通过普通PCR 实验来评价引物质量。
以RT－PCR 获得的cDNA 为模板，建立20ul 荧光定量PCR 反应体系，每个样品6 次重复（药物处理和未处理），对X基因和GAPDH基因进行扩增，同时设置不加模板的阴性对照。
6、荧光定量PCR 体系配制及仪器程序设置
请参照各公司荧光定量PCR 试剂、荧光定量PCR 仪器说明书进行。
7、实验结果与数据处理
7.1 溶解曲线绘制与分析
SYBR Green 染料没有序列特异性，可以结合到包括非特异产物和引物二聚体在内的任何dsDNA 上，因此有必要区分目标信号和假信号。内嵌染料可以在反应末尾对扩增产物进行溶解，称为溶解曲线分析。在溶解曲线分析过程中，随
体的干扰。
GAPDH X
7.2
值△Ct △△Ct 2-△△Ct
6.18
4.06 -2.12
数据处理
4.35
着温度从低于产物溶解点缓慢升到高于产物溶解点，实时仪器连续监测每个样品
的荧光值。基于产物长度和G/C 含量的不同，扩增产物会在不同的温度点解链。
随着产物的解链，可以看到荧光值的降低并被仪器所测量。对溶解曲线进行微分可
以计算出溶解峰。溶解峰反映了反应中扩增到的产物。这些峰与凝胶电泳中条带类似。
熔解曲线的设置是在整个PCR 完成后进行，从60℃升至95℃，每升高1℃ 仪器会自动收集荧光信号，得到的熔解曲线是逐渐下降的过程，且在 Tm 值下降
最快，为方便分析，我们将温度与荧光强度的变化求导，即得到单峰的熔解曲线，这
样我们就可以证明引物的特异性良好，实验结果不受非特异性扩增和引物二聚
样品
未处理
X 基因Mean Ct 值GAPDH 基因Mean Ct
26.52 20.34
24.18 20.12
样品
药物处
理样品
BLANK None None
下面我们来看看上面表格中差异倍数是如何得来的：
首先，分别求出6 个重复样品X 基因和GAPDH 基因平均Ct 值后，应用参
照基因GAPDH 对未处理样品和药物处理样品进行校正：
△Ct（未处理样品）＝X基因Mean Ct值－GAPDH基因Mean Ct值＝26.52－20.34＝6.18
△Ct
（药物处理样品）
＝
20.12＝4.06
然后，对未处理样品和药物处理样品的△Ct 进行归一化：
24.18－
X基因Mean Ct值－G APDH基因Mean Ct值＝
此药物处理样本的
.12
最后，我们就可以根据△△Ct 算出药物处理样品与未处理样品间X 基因的表达差异：
因
此结果是通过参照基因表达水平校正的待测样本中的目标基因相对于校准样本，用参照基因校准目标基因表达的目的是弥补样本组织量的差异。
为了更直观的表示样品间的表达差异，最后我们可以将计算得到的相对量用图表来表示，如下图：
未处理样品药物处理样品
样品名称
2-△△Ct法的修正：
如果目标基因可参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于2，那么，2-△△Ct法的公式可以修正为用实际扩增效率值代替等式中的2。例如，如果目标基因和参照基因的扩增效率都为1.98，计算公式可以修正为1.98-△△Ct。
2-△△Ct＝2－(－2.12)＝4.35
△△Ct
基因的表达水平是未处理样品的4.35
X
＝-2
6.18
－
4.06
＝
（未处理样品）
Ct
－△
（药物处理样品）
Ct
＝△
倍。
相
对
表
达
量
第三章常见问题与解答篇
一、无 Ct 值（信号）出现
1、反应循环数不够：一般都要在 35 个循环以上，可根据实验情况增加循环，但
高于 45 个循环会增加过多的背景信号；
2、检测荧光信号的步骤有误：一般采用72℃延伸时采集荧光，Taqman 方法则一
般在退火结束或延伸结束采集信号；
3、引物或探针降解：可通过 PAGE 电泳检测其完整性；
4、探针设计不佳：设计探针温度低于引物，造成探针未杂交上而产物已延伸；
5、模板量少：对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起；
6、模板降解：避免样品制备中杂质的引入以及模板反复冻融的情况发生。
二、如何确认模板中是否含有 PCR 反应阻害物质
有时 RNA 或 cDNA 模板中存在对反转录和荧光 PCR 反应的阻害物质。为了确认这样的阻害物质的有无，我们可以使用高浓度的模板按 3－4 个梯度稀释，并使用其进行荧光定量 PCR 反应。如果无阻害物质存在，得到的 Ct 值就会依模板浓度的变化而变化；而如果模板中有阻害物质的存在，实验过程中我们就会发现高浓度的模板有反应性能下降的现象。
三、Ct 值出现过晚
1、反应条件不佳：未最佳反应条件，可重新设计引物或探针，适当降低退火温
度，增加镁离子浓度等；
2、PCR 各种反应成分的降解或加样量不够；
3、扩增产物片段过长：一般采用 100－200bp 的扩增长度。
四、标准曲线的线性关系不佳
1、加样存在误差，标准品稀释不呈梯度；
2、标准品降解：标准品尽量避免反复冻融；
3、引物或探针不佳：重新设计；
4、模板中存在抑制物，或模板浓度过高。
五、阴性对照也出现明显的扩增
1、荧光 PCR mix 或水被污染；
2、引物二聚体的出现：在 35 循环后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合溶解
曲线进行分析；
3、反应过程中探针降解：用 PAGE 电泳对探针进行检测；
六、溶解曲线不止一个主峰
1、引物设计不佳：避免二聚体和发夹结构的出现；
2、引物浓度不佳：适当调整引物浓度；
3、退火温度低：提高退火温度；
4、镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度；
5、模板中有基因组的污染：RNA 提取过程中避免基因组 DNA 的污染，或通过引
物设计避免非特异扩增。
七、如果避免荧光定量PCR 中基因组DNA 扩增？
1、引物设计时避免基因组DNA 扩增；
2、在 RNA 提取过程中使用DNaseⅠ处理去除 RNA 中混有的基因组 DNA。
八、扩增效率低
1、反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解；
2、反应条件不佳：适当降低退火温度或改为三步扩增法；
3、反应体系中有抑制物：一般为模板中引入，应先把模板适当稀释，再加入到
体系中，减少抑制物的影响；
九、重复性不好
1、加样不准确；
2、仪器在样品上温度条件有差异，温度均一性不好；
3、模板浓度低：样品初始浓度越低，重复性越差，应减少样品的稀释倍数。
十、扩增曲线不正常，刚进入指数期就很快进入平台期并向右下弯曲
1、基线等设置不当：按仪器说明书重新操作；
2、模板量过多：当扩增曲线在 10 个循环内起峰时，应将模板稀释 100－1000
倍后使用。
十一、各孔间的荧光信号如何进行校正
由于加样操作的误差、离心管透光性能的差异、荧光激发效率的差异等偶然误差不可避免，因此仪器收集到的原始信号必须进行归一化校正，以消除这些因素对定量结果的影响。这种校正可以通过在反应体系中添加额外的荧光染料来实
现，一般采用红色 ROX 荧光，称为阳性参比信号。ROX 在反应缓冲液中的浓度是固定的，因此其信号的强度与反应体系的总体积和总的荧光激发效率正相关。ROX 校正可以提高定量数据的精度和重现性，减少孔间差异。
十二、荧光定量 PCR CT 值一般在多少后认为模板没扩增？
当进入对数期的循环数大于 35 时，RealTime RT-PCR 检测无效，基因没有表达；当进入对数的循环数在 32-35 个循环时，需要有至少 3 个重复才能判断是否能检测到基因的表达。
荧光定量PCR的原理及使用 荧光定量PCR(FQ-PCR)是新近出现的一种定量PCR检测方法。其基本特点是：1、用产生荧光信号的指示剂显示扩增产物的量。2、荧光信号通过荧光染料嵌入双链DNA，或双重标记的序列特异性荧光探针或能量信号转移探针等方法获得，大大提高了检测的灵敏度、特异性和精确性。3、动态实时连续荧光检测，免除了标本和产物的污染，且无复杂的产物后续处理过程，高效、快速。下面介绍常用的几种检测方法： 1、双链DNA内插染料 某些染料如SYBR Green Ⅰ能选择性地与双链DNA结合，同时产生强烈荧光。在PCR过程中SYBR Green Ⅰ可与新合成的双链DNA结合，产生的荧光信号与双链DNA成正比。 SYBR Green I荧光染料技术原理SYBR Green I是一种只与DNA双链结合的荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链DNA分子的数量。SYBR Green荧光染料法定量PCR的基本过程是：1、开始反应，当SYBR Green染料与DNA双链结合时发出荧光。2、DNA变性时，SYBR Green染料释放出来，荧光急剧减少。3、在聚合延伸过程中，引物退火并形成PCR产物。4、聚合完成后，SYBR Green染料与双链产物结合，定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。
SYBR Green I荧光染料与DNA双链的结合 SYBR Green I荧光染料能与所有的DNA双链相结合，对DNA模板没有选择性，所以特异性不如TaqMan探针。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果，对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。在此前提下，本法是 一种成本低廉的选择。 2、TaqMan探针技术原理 TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术，其核心是利用Taq酶的3′→5′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有报告基团(Reporter, R)，如FAM、VIC等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher, Q)，如TAMRA等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的
实时荧光定量PCR原理和实验 陈云地 作者单位：200030 美国应用生物系统公司(Applied Biosystems) 无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。 根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR 又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I 荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更
为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。 定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。 1 为什么终点定量不准确？ 我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大（图1）。
实时荧光定量PCR（Real-Time PCR）实验流程 一、RNA的提取(详见RNA提取及反转录) 不同组织样本的RNA提取适用不同的提取方法，因为Real-Time PCR对RNA样品的质量要求较高，所以，正式实验前要选择一款适合自己样品的提取方法，在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。 在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；取2ug进行RNA的甲醛变性胶电泳检测，如果存在DNA污染时，要用DNase I进行消化（因为在处理过程中RNA极易降解，建议体系中加入适量RNA酶抑制剂）。 二、DNase I 消化样品RNA 中的DNA 用DNase I 消化DNA 组份加量 模板(RNA) 10ug RNase Inhibitor 4ul DNase I buffer 10ul DNase I 10ul DEPC处理H2O 至100ul 混匀，37℃ 90min 三、RNA琼脂糖凝胶电泳 1．1%的琼脂糖凝胶电泳凝胶的配制： 1）称取琼脂糖0.45g放入三角瓶中，向其中加入4.5ml的10×MOPS缓冲液和39.5ml 的DEPC水，放微波炉里溶化。 2）待冷却到60摄氏度左右时，加入1ml甲醛，摇匀（避免产生气泡）。倒入凝胶板上凝固30min。 2．取各个RNA样品4μl，加入6×RNA电泳上样缓冲液2μl混匀，加入变性胶加样孔中。3．120V电压下电泳25min。用凝胶紫外分析仪观察，照相保存。 4．RNA电泳结果如下图所示。可见28S和18S两条明亮条带，无DNA条带污染。 四．RNA反转录为cDNA 反转录程序(以MBI的M-MLV为例) 组份加量(20ul体系) 加量(40ul体系) 模板(RNA) 0.1~2.5ug(根据条带的亮度适当调整) 3ug(根据条带的亮度适当调整) 引物T18(50uM)(或其他引物) 2.0ul 4.0ul DEPC处理H2O 至12.5ul 至25ul
实时荧光定量PCR原理 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1. Ct 值的定义 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-- Ct值。C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如图1所示）。 2. 荧光域值（threshold）的设定 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-15 3. Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 荧光化学 荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下：1）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。2）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 内标在传统定量中的意义 1．几种传统定量PCR方法简介： 1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR 产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。2）竞争法：选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。3）PCR－ELISA法：利
实时荧光定量PCR方法简介 一．实时荧光定量PCR的基本原理 理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR 扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。 为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。 Ct值是如何得到的 在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。 Ct值的定义 Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数；也可以理解为扩增曲线与阈值线交点所对
应的横坐标。 Ct值与样品中模板的对应关系 Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系（y=ax+b，x代表起始模板拷贝数的对数，y代表Ct值）。 与终点法相比利用Ct值的优势 由于Ct值是反映实际PCR反应过程中扩增即将进入指数期的参数，该参数几乎不受试剂消耗等因素的影响，因此利用Ct值判断的起始模板拷贝数更加精确，重复性也更好。传统的终点检测法是在PCR扩增经历了指数扩增期进入平台期后利用EB等染料染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量，这种方法的精确度不高、重复性也不好。 下图中是96个复孔的实时扩增曲线（完全相同的反应体系、相同的反应protocol、相同的样品起始浓度），可以看到Ct值具有很好的重复性，而终点的荧光信号强度差异达到300个单位。 此外，采用实时荧光定量PCR还能从方法学上有效的防止PCR实验中交叉污染的问题。因为荧光定量PCR中模板的扩增与检测是同时进行的，当实验完成后即可获得定量结果，
实时荧光定量PCR仪ViiA 7 操作步骤 ——以RNase P示例实验为例 一、定义384孔样品模块的实验属性 打开电脑访问ViiA 7 软件，然后打开左侧仪器开关。单击Experiment Setup图标。单击Experiment Properties以访问Experiment Properties屏幕。 在ViiA 7 软件中设计RNase P实验示例时，请输入： 二、使用Define屏幕定义RNase P示例实验的目标基因、样品。 1. 单击Define以访问Define屏幕。 2. 定义目标基因 a. 单击New以增加和定义目标基因。 b. 在目标基因表中，单击Target Name列中的一个单元格，并输入： c. （可选）单击Save以便将新增或原有的正在编辑的目标基因保存到Target Library。 d. 单击Add Saved从目标基因库添加目标基因。 3. 定义样品 a. 单击New以增加和命名样品。 b. 在样品表中，单击Sample Name列中的一个单元格，并输入： c. （可选）单击Save以将新增或原有的正在编辑的样品保存到Sample Library。 d. 单击Add Saved从样品库添加样品。 4. （可选）定义生物学平行测定 a. 在Define Biological Replicates Groups表中，单击New以增加和命名生物学平行 测定组。 b. 从下拉菜单选择Color。 c. 单击Comments列，以便为该生物学平行测定组添加注释。 注：实验示例不使用生物学平行测定组。保留Biological Replicate Groups空白。 5. 选择用作参比荧光的染料ROX。
实时荧光定量PCR技术的原理及应用(图) 一、实时荧光定量PCR原理 （一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 （二）实时原理 1、常规PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。 2、实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析 3、如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析. 4、几个概念： （1）扩增曲线： （2）荧光阈值：
（3）Ct值： CT值的重现性：
5、定量原理： 理想的PCR反应：X=X0*2n 非理想的PCR反应：X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 5、标准曲线 6、绝对定量 1）确定未知样品的C(t)值 2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量
7、DNA的荧光标记： 二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍 方法一：SYBR Green法 （一）工作原理 1、SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 2、SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光
3、变性时，DNA双链分开，无荧光 4、复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。
PCR反应体系的建立及优化: 1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 4、反应Buffer 体系的优化 5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定 6、其他与常规PCR相同 （二）应用范围 1、起始模板的测定； 2、基因型的分析； 3、融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer 的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。 （三）优点及缺点 优点：对DNA模板没有选择性；适用于任何DNA；使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏；便宜。 缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；对引物特异性要求较高。
实时荧光定量pcr步骤： 荧光定量PCR 实验步骤：①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA 酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。⑥溶解RNA 沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA 溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm 处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。① 浓度测定A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：RNA溶于40 μl DEPC
实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。· Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA 沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl 用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL 试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm 离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA 溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板
实时荧光定量PCR操作步骤 以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放臵5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75% O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心乙醇（75%乙醇用DEPCH 2 5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml 的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
实时荧光定量PCR： 实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。· Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。 原理： 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 检测方法 1.SYBRGreenⅠ法： 在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。 SYBR定量PCR扩增荧光曲线图 PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性） 2.TaqMan探针法：
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。 服务流程 1.客户认真写好订单，提供待检基因相关信息； 2.签订技术服务合同，支付预付款（30-50%)； 3.设计合成定量PCR引物（或客户提供文献引物委托本公司合成）； 4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录； 5.PCR预实验，主要检测引物的特异性和扩增效率； 6.正式定量实验：对所有样品上机检测； 7.实验结果和数据分析，形成报告。 收费标准 优惠包干价：120元/样/基因（SYBRgreenI法，相对定量） （含RNA提取，反转录，引物合成费用，上机测试费用（3个重复）；一个内参免费（内参3个重复） 技术原理 将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系
CFX96 实时荧光定量PCR仪器的操作流程及注意事项1、开始运行仪器 1.1打开电脑 1.2打开定量PCR仪底座开关 1.3启动CFX Manager软件 2、放置样品 2.1将PCR反应体系加入到0.2ml底缘八联管，盖上管盖；或加入底缘96孔板，用光学级封膜封好。注意，必须戴一次性塑料手套，不要让手指接触到反应管表面。将反应管按顺序放入仪器的加热孔中。 3、设置程序，运行试验 3.1定量PCR软件操作基本步骤为：a.设置热循环程序文件（protocol tab）b.设置反应板文件（plate tab）。c.点击‘‘start run’’键，运行程序。 3.2热循环程序文件（protocol tab）设置指南：点击edit（编辑）或create new （创建新程序）。 3.3反应板设置文件（plate tab）设置指南：选择本次试验所需要使用的荧光染料种类；单机样品类型；如要某些反应孔第一荧光染料对应的样品类型为标准品（standard），点击‘‘dilution series’’键可设置其标准品浓度及稀释倍数。 3.4点击‘‘start run’’键。单击open lid（打开热盖）或close lid（关闭热盖）放置样品；单击start run，保存文件，开始运行程序。 4、结果分析 4.1PCR反应结束后，软件会自动计算标准曲线和CT值等。 4.2如需进行表达量分析、等位基因分析等，在软件窗口选择相应分析功能。 4.3点击右上方的“Report”键，还可输出结果报告单。 5、关闭运行仪器 5.1实验结束后取出反应管，顺序关闭CFX Manager软件、定量PCR仪电 源，关闭电脑。注意！CFX仪器上盖部分为全自动控制，在通电状态，严禁任何人为干涉上盖开启或关闭的行为，此类行为会导致上盖故障，危及仪器使用。
确认文件 类别：确认方案编号： 部门：质量部页码：共11页，第1页 DA7600PCR扩增仪 方案与报告 版次：新订替代： 起草：年月日 审阅会签： （确认小组） 批准：年月日
目录 1.概述 (2) 2.确认目的 (2) 3.确定确认范围 (3) 4.确定确认小组成员及职责 (3) 确认小组成员及确认小组负责人 (3) 人员 (3) 评价方法： (3) 标准： (3) 5.风险评估 (4) 评估概述 (4) 评估方法 (4) 6.确认内容 (7) .安装确认 (7) 安装信息 (7) 仪器放置检查 (7) 操作规程等资料确认 (8) 运行确认 (8) 基本称重功能确认 (8) 校正功能确认 (9) 性能确认 (9) 准确度 (9) 天平重现性检查： (10) 四角偏差检查： (11) 7确认计划安排 (11) 9.确认结果评定与结论 (11) 10.拟订日常监测程序及确认周期 (12)
1.概述 DA7600实时荧光定量PCR仪，是中山大学达安基因公司推出的具有全自动、实时监测、定量分析的DNA荧光检测系统。结合半导体致冷器实现PCR扩增过程，并通过高灵敏度的光电系统和高通量光纤导光系统对荧光信号进行实时监测，实现同时对样品的扩增和检测。友好的全中文计算机界面，可满足不同PCR实验的需求。其反应速度及准确性、操作实用性和使用灵活性均有较好的提高，能满足科研工作者对于定量PCR系统高通量方面的要求，是特异性靶基因检测与定量的一体化平台。它主要有一台DA7600和PC计算机及显示器组成。 2.确认目的 通过用HCV荧光PCR检测试剂盒来确认DA7600实时荧光定量PCR仪的扩增和检测体系精密度、线性、准确度等，验证仪器能否正常准确运行，给出可靠的分析结果，以及48孔孔间差异是否在允许范围内。 3.确定确认范围 本方案适用于DA7600实时荧光定量PCR仪运行确认及性能确认。 4.确定确认小组成员及职责 确认小组成员及确认小组负责人 列出参加DA7600确认的所有人员名单，评价培训情况是否符合操作的要求。 评价方法： 查阅培训档案，确认是否对有关操作者进行了相关培训，包括：
实时荧光定量PCR实验操作步骤 以下实验步骤仅供参考： 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75% O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心乙醇（75%乙醇用DEPCH 2 5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数×40 μg/ml。具体计算如下： RNA溶于40 μl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或0.84 μg/μl 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 μl，剩余RNA总量为： 35 μl ×0.84 μg/μl = 29.4 μg ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml 的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度成分 0.4M MOPS，pH 7.0 0.1M 乙酸钠 0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 μl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
实时荧光定量PCR具体实验步骤 1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。 ①浓度测定 A260下读值为1表示40 μg RNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 μg/ml。具体计算如下：
实时荧光定量PCR原理和实验
实时荧光定量PCR原理和实验 无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。 根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。 定量实验与定性实验最大的不同，是要考虑统计学要求并对数据进行严格的校正，以消除偶然误差。因此重复实验和设立内对照非常重要。由于各种各样的客观原因，这一点在实践中往往被轻视或忽视，需要着重强调。当然，与定性实验一样，定量PCR也要设立阴性和阳性对照，以监控试剂和实验操作方面可能出现的问题。 1为什么终点定量不准确？ 我们都知道理论上PCR是一个指数增长的过程，但是实际的PCR扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S形曲线。这是因为随着PCR循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq酶、dNTP、引物，甚至DNA模板等各种PCR要素逐渐不敷需求，PCR的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。当所有的Taq酶都被饱和以后，PCR就进入了平台期。由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。所以，即使是重复实验，各种条件基本一致，最后得到的DNA拷贝数也是完全不一样的，波动很大（图1）。