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荧光定量PCR常见问题解析（一）1、普通PCR与荧光定量PCR技术区别？①荧光定量PCR能够实时监测PCR反应的全过程，对每一个循环进行定量或定性分析；而普通PCR只能对反应的终产物进行半定量或定性分析。
②荧光定量PCR的结果分析可以直接通过电脑读出，而普通PCR的结果必须通过下一步的电泳进行条带分析。
2、荧光定量PCR技术的特点①灵敏度高、特异性强。
② PCR实验过程全封闭，仪器自动分析和获取实验结果，无后续实验操作。
③实时监测反应过程，定量更准确。
④定量范围宽，可达到10个数量级。
⑤可以实现一次反应检测多个样本。
3、实时荧光定量PCR实验操作注意事项①应该带一次性乳胶手套并经常更换，在试剂准备室和样本处理室应该配备负压式生物安全柜，以防止对环境或对样品的污染。
②要严格防止气溶胶交叉污染。
采取的措施有：使用一次性带滤芯移液枪吸头；不使用吸头吹打液体进行混匀；在生物安全柜中进行离心操作；尽量减少在生物安全柜以外开启试剂或PCR管；禁止在荧光定量PCR结束后打开PCR管盖。
③实验中牵涉的有毒有害及有污染的样本及试剂应该严格按照生物安全相关规定操作和处理。
④荧光探针应该避光保存，加入反应液后应尽快上机，以防探针粹灭。
⑤在进行RNA相关操作时，必须使用无RNase的实验器具及耗材，并加样后立即上机操作，以防RNA的降解。
⑥所有试剂在开启之前都要瞬时离心；试剂配制完成后要瞬时离心以去除气泡。
⑦不要在荧光定量PCR管上做任何标记，不能用手接触PCR管盖上采光部位。
4、实时荧光定量PCR实验无CT值出现或无扩增信号的问题及解决方案①实验的循环数不够，设计的循环数应该在35以上，可增加至45个循环，但不可高于45个循环。
②通道选择不对，应该仔细阅读产品说明书，根据说明书的要求选择采光通道。
③荧光采集位置设计有误，应该仔细阅读产品说明书，根据说明书的要求设置荧光信号采集位置。
④引物或探针降解，要求厂家重新发货验证。
荧光定量PCR常见问题1.定量PCR仪的开关机顺序是怎样的？按照正确的开关机顺序操作，有助于延长仪器的使用寿命，减少仪器出故障的频率。
开机顺序：先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。
关机顺序：确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。
2.哪些种类的反应管和盖子适合定量PCR实验使用？有何需要注意的地方？定量PCR实验可以使用以下耗材：96孔光学反应板配合光学膜，0.2 ml 光学八联反应管配合光学膜，0.2 ml光学八联反应管配合平盖的光学八联管盖。
ABI公司生产的定量PCR耗材的具体使用方法和货号见下表：3.为什么要定期对电脑进行磁盘碎片整理？怎样整理？当运行实时定量PCR仪及使用软件分析实验结果时，计算机会删除并创建若干文件，计算机硬盘的空闲空间会被分割成越来越多的小块。
当硬盘驱动器上文件以分解的碎片存储时，程序需要更长的时间才能存取文件，因为必须多次寻找文件碎片以存取不同的片断。
碎片整理实用程序将一个文件分解开的多个碎片合并在一起，并存储到硬盘的同一个位置，从而清除文件碎片，进而优化系统性能。
碎片整理的方法如下：∙在Windows桌面上，选择开始(start),我的电脑(My computer)。
∙在(我的电脑)窗口中，用鼠标右键单击硬盘驱动器，并选择(属性)property。
∙在(属性)对话框中选择工具(Tools)选项卡，单击开始整理(Defragment now)。
∙单击碎片整理(Defragment)。
∙当显示“碎片整理完毕”对话框时，单击（确定）。
∙在“本地磁盘属性”对话框中，单击（确定）。
为计算机机中剩余的驱动器重复如上步骤。
4.何时执行windows service pack更新？不要执行该操作。
除非美国应用生物系统公司代表通知您更新操作系统，否则请不要更新控制定量PCR 仪的计算机的操作系统。
荧光定量PCR问题疑难解答荧光定量PCR问题疑难解答（一）Q：1. 这两天我做标准曲线，线性关系还行，R平方0.998。
但是扩增效率只有80%，另外扩增曲线也不是太光滑。
2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的，只有100-200左右。
A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大看看，或者就是扩增产物太少了。
1. PCR反应效率差：引物，试剂PCR条件的原因。
做realtime-pcr优化体系很重要，你的扩增效率低。
可以增加Mg离子的浓度，如果其他条件都好了，还不行，那就是引物的原因，那你就只能重新设计引物了。
2. PCR中混入影响反应的物质：模板提取方法需要改进3. 样品稀释不准确：这很重要，做标准曲线很多不好的时候，很多都是倍比稀释的问题，正常情况10倍比稀释时，前后是相差3.32个循环。
Q：荧光定量PCR的灵敏度A：对于染料法的荧光定量来说，Ct值在13~30之间比较准确，30~33之间需要再次确认，在以上范围内的置信度比较差。
Q：标准曲线要重复两三次吗?A：没有人说做定量PCR标准曲线要重复两三次，只是用来做标准曲线的梯度点最好不要少于4个，否则标准曲线准确性不高。
Q：关于荧光定量标准曲线的制作A：一般的仪器虽然声称能进行单拷贝检测，但如果不是特别设计的体系，很难做到100拷贝以下的准确定量，一般用来做标准曲线的最小浓度为1000拷贝，再往下可靠性就降低了，这不是稀释或其他什么问题，而是本身你选作标准曲线的浓度以及定量浓度最好不要低于1000拷贝，如果再低一点，100拷贝也勉强可以接受，否则即使你做出来，认可度也不会太高。
Q：溶解曲线高矮A：Tm值相同，而峰高低有差异是表达丰度不同，同样的扩增产物也会出现Tm值有微小差异，一般差异在1度以内都可以接受。
融解曲线的纵坐标表示荧光信号对温度的一阶负导数。
Q：定量PCR没有扩增A：把定量PCR的产物跑个电泳，看看有无产物，如果电泳有条带，说明PCR是成功的，只是荧光信号没有读取到，这时要调整染料或探针的浓度（看你是染料法还是探针法）；如果电泳没有条带，那么还要在定量PCR仪上优化实验条件。
荧光定量PCR技术的使用中常见问题引言：荧光定量PCR技术作为一种高效、灵敏和准确的基因定量方法，广泛应用于分子生物学、医学诊断、环境监测等领域。
然而，在使用荧光定量PCR技术的过程中，常常会遇到一些问题和挑战。
本文将就荧光定量PCR技术的使用中常见问题进行探讨和解答，旨在帮助读者更好地应对和解决实验中的困惑。
一、引物设计问题1. 引物设计原则荧光定量PCR实验的关键是引物的设计。
引物应具备特异性、高度选择性以及适当的配对特性，以确保PCR反应的准确性和灵敏度。
引物设计建议遵循以下原则：- 引物长度：一般选择长度在18-30个碱基对之间。
- 碱基组成：应尽量避免引物末端含有连续的鸟嘌呤（G）或鸟嘧啶（C）。
- 碱基序列：引物两端应该尽量避免含有重复的碱基序列，以防止不特异扩增。
- 温度计算：引物的Tm（解离温度）应该在50-60摄氏度之间，同时引物间的Tm差异应不大于5摄氏度。
2. 引物设计工具引物设计可以利用一些在线引物设计工具，如Primer3、NCBI Primer-BLAST 等。
这些工具能够根据用户提供的序列信息，自动生成符合上述引物设计原则的引物。
二、荧光探针选择和优化1. 探针选择荧光定量PCR常用的探针有TaqMan探针、Molecular beacon探针等。
选择合适的探针取决于实验需要和目标基因的特点。
TaqMan探针适用于高度特异性检测，而Molecular beacon探针则适用于检测低浓度的目标序列。
2. 探针的优化为了提高PCR反应的灵敏度和特异性，有时需要对探针进行优化。
以下是一些优化探针的建议：- 探针浓度优化：需根据实验条件和目标基因的特性进行探针浓度的优化。
- 探针长度：一般探针的长度限制在15-30个碱基对之间。
三、荧光定量PCR反应体系问题1. 反应体系的组成荧光定量PCR反应体系基本组成包括：模板DNA、引物、荧光探针、聚合酶、缓冲液和核苷酸等。
其中，重要的是要根据实验需要和试剂盒的要求确定各组分的浓度。
荧光定量PCR常见问题及解答更新時間：2010-12-10 10:43:37一、无 Ct 值（信号）出现：1.反应循环数不够：一般都要在 35 个循环以上，可根据实验情况增加循环，但高于45个循环会增加过多的背景信号；2.检测荧光信号的步骤有误：一般采用 72℃延伸时采集荧光，Taqman 方法则一般在退火结束或延伸结束采集信号；3.引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；4.探针设计不佳：设计探针温度低于引物，造成探针未杂交上而产物已延伸；5.模板量少：对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起；6.模板降解：避免样品制备中杂质的引入以及模板反复冻融的情况发生。
二、如何确认模板中是否含有 PCR 反应阻害物质：有时RNA或cDNA模板中存在对反转录和荧光PCR 反应的阻害物质。
为了确认这样的阻害物质的有无，我们可以使用高浓度的模板按 3－4 个梯度稀释，并使用其进行荧光定量 PCR 反应。
如果无阻害物质存在，得到的 Ct 值就会依模板浓度的变化而变化；而如果模板中有阻害物质的存在，实验过程中我们就会发现高浓度的模板有反应性能下降的现象。
三、Ct值出现过晚：1.反应条件不佳：未最佳反应条件，可重新设计引物或探针，适当降低退火温度，增加镁离子浓度等；2.PCR各种反应成分的降解或加样量不够；3.扩增产物片段过长：一般采用 100－200bp 的扩增长度。
四、标准曲线的线性关系不佳：1.加样存在误差，标准品稀释不呈梯度；2.标准品降解：标准品尽量避免反复冻融；3.引物或探针不佳：重新设计；4.模板中存在抑制物，或模板浓度过高。
五、阴性对照液出现明显的扩增：1.荧光 PCR mix 或水被污染；2.引物二聚体的出现：在 35 循环后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合溶解曲线进行分析；3.反应过程中探针降解：用PAGE电泳对探针进行检测。
六、溶解曲线不止一个主峰：1.引物设计不佳：避免二聚体和发夹结构的出现；2.引物浓度不佳：适当调整引物浓度；3.退火温度低：提高退火温度；4.镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度；5.模板中有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组 DNA 的污染，或通过引物设计避免非特异扩增。
荧光定量PCR常见问题及解答更新時間：2010/12/10 10:43:37--------------------------------------------------------------------------------一、无Ct 值（信号）出现：1.反应循环数不够：一般都要在35 个循环以上，可根据实验情况增加循环，但高于45个循环会增加过多的背景信号；2.检测荧光信号的步骤有误：一般采用72℃延伸时采集荧光，Taqman 方法则一般在退火结束或延伸结束采集信号；3.引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；4.探针设计不佳：设计探针温度低于引物，造成探针未杂交上而产物已延伸；5.模板量少：对未知浓度的样品应从系列稀释样品的最高浓度做起；6.模板降解：避免样品制备中杂质的引入以及模板反复冻融的情况发生。
二、如何确认模板中是否含有PCR 反应阻害物质：有时RNA或cDNA模板中存在对反转录和荧光PCR 反应的阻害物质。
为了确认这样的阻害物质的有无，我们可以使用高浓度的模板按3－4 个梯度稀释，并使用其进行荧光定量PCR 反应。
如果无阻害物质存在，得到的Ct 值就会依模板浓度的变化而变化；而如果模板中有阻害物质的存在，实验过程中我们就会发现高浓度的模板有反应性能下降的现象。
三、Ct值出现过晚：1.反应条件不佳：未最佳反应条件，可重新设计引物或探针，适当降低退火温度，增加镁离子浓度等；2.PCR各种反应成分的降解或加样量不够；3.扩增产物片段过长：一般采用100－200bp 的扩增长度。
四、标准曲线的线性关系不佳：1.加样存在误差，标准品稀释不呈梯度；2.标准品降解：标准品尽量避免反复冻融；3.引物或探针不佳：重新设计；4.模板中存在抑制物，或模板浓度过高。
五、阴性对照液出现明显的扩增：1.荧光PCR mix 或水被污染；2.引物二聚体的出现：在35 循环后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合溶解曲线进行分析；3.反应过程中探针降解：用PAGE电泳对探针进行检测。
荧光定量系列常见问题及解决方法1)、扩增曲线形状异常a)、扩增曲线不光滑：信号太弱，经系统矫正后产生。
提高模板浓度重复实验。
b)、扩增曲线断裂或下滑：模板浓度较高，基线的终点值大于Ct值。
减小基线终点(Ct值- 4)，重新分析数据。
c)、个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡，由于温度升高后气泡破裂，使仪器检测到的荧光值突然降低所致。
进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。
2)、反应结束无扩增曲线出现a)、反应循环数不够：一般设置循环数为40，但需要注意的是过多的循环会增加过多的背景信号，降低数据可信度。
b)、确认程序中是否设置了信号采集步骤：两部法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。
c)、确认引物是否降解：长时间未用的引物应先通过PAGE电泳检测完整性，以排除引物降解的可能性。
d)、模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
e)、模板降解：重新制备模板，重复实验。
3)、Ct值出现太晚a)、扩增效率极低：优化反应条件，尝试三步法扩增程序，或者重新设计引物。
b)、模板浓度太低：减少稀释度重复实验，一般未知浓度的样品先从最高浓度做起。
c)、模板降解：重新制备模板，重复实验。
d)、PCR产物太长：一般将PCR产物长度设计为100 bp-150 bp之内。
e)、反应体系中存在PCR反应抑制剂：一般为加入模板时带入，加大模板稀释倍数或者重新制备模板重复实验。
4)、阴性对照也出现明显扩增a)、反应体系或者水被污染：更换新的Mix或者水重复实验。
反应体系在超净工作台内配制，减少气溶胶污染。
b)、引物二聚体的出现：一般在35循环以后阴性对照出现扩增属正常情况，可配合融解曲线进行分析。
5)、绝对定量时标准曲线线性关系不佳a)、加样误差：加大模板稀释倍数，提高加样体积。
b)、标准品降解：重新制备标准品，重复实验。
c)、模板浓度太高：增加模板稀释倍数。
荧光定量PCR常见问题解析荧光定量PCR是目前分子生物学研究中最常使用的技术手段之一，但很多初学者在做荧光定量PCR实验时都会遇到一些问题，为了更好地指导研究生的实验教学，结合我们实验室的经验，特将常见问题总结如下：一、什么样的试剂盒性能较好？性能较好的试剂盒熔解曲线出现单一峰，扩增特异性高，扩增“S”型曲线典型，CT 值较早出现。
目前Roche、ABI、Biog等的试剂盒性能都不错，反应特异性高，有效避免非特异扩增，提高实验效率。
二、熔解曲线出现多峰是什么原因？怎么解决？较为理想的熔解曲线是单峰曲线，如出现多峰有以下原因：1）非特异性扩增：主要原因为引物特异性不好、Tm值较低或模板质量不高，可以根据设计原则设计新引物或者通过梯度PCR 对引物退火温度（Tm值）进行优化，上调Tm值，选购质量较好的离心柱法核酸提取试剂，提高核酸提取质量，等等。
2）引物二聚体可通过琼脂糖凝胶电泳确认引物二聚体。
引物二聚体在凝胶的底部形成扩散条带，通常位于100 bp以下。
引物二聚体在熔解曲线内峰值一般位于75℃左右，如该峰显著请按照以下方面进行优化：A.优化扩增条件，如提高退火温度，可利用梯度PCR，摸索最佳的Tm值。
通常两步循环(由95℃变性步骤直接进入60℃退火和延伸步骤) 有利于强效扩增，因此引物设计时设定的成功退火温度为60℃。
B.引物浓度太高，适当降低引物浓度。
通常引物的Tm低于目的基因，熔解曲线上峰值在目的基因峰的左边。
大多数情况下，每条引物的理想最终浓度为200 nM，但如有需要，可将浓度降至60nM。
C.cDNA模板带有基因组DNA污染：重新制备cDNA模板。
在RNA提取完成后加入DNase对RNA进行处理，然后逆转录为cDNA。
如果排除以上原因还是出现熔解曲线多峰的情况，就要考虑及时更换试剂盒，避免耽误实验进度。
三、扩增曲线形状异常，如“S”型曲线反应体系引起的扩增曲线不光滑---扩增效率偏差（过高或过低）A. 扩增效率过高出现非特异扩增或引物二聚体：反应体系内模板浓度太高以及模板核酸质量较差，可能导致出现抑制PCR 反应的现象。
螺旋课堂第一课－－荧光定量PCR 技术PCR 技术的发明极大地推动了分子生物学的发展，而且迅速被推广和应用到生命科学的各个领域，可以说它是目前核酸分子水平的基础及应用研究中使用最广泛的一项技术。
常规PCR 中，在扩增反应结束之后，我们一般通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，无法对PCR 扩增反应进行实时检测，也无法对起始模板准确定量，而很多情况下，我们所感兴趣的是起始模板量，如转基因动植物中插入某种外源基因的拷贝数或者病人中某种病毒DNA/RNA 的精确copy 数等，如此，荧光定量PCR 技术便应运而生。
本文将分为三大部分向大家介绍，首先是理论篇：首先了解荧光定量PCR 的理论知识，如荧光定量PCR 技术的原理、方法等；随后为实践篇：如实验的操作流程、注意事项、方法选择、结果分析与处理等；第三部分为问题分析与解答篇：荧光定量PCR 过程中有哪些常见问题，我们如何避免和解决。
荧光基团第一章理论篇一、荧光定量PCR 技术发展史1993 年，日本Higuchi 等人首次采用动态PCR 方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析，首次提出了荧光定量PCR 技术的概念。
当时他使用了EB（溴乙锭）作为荧光标记染料，采用一台经过改良的热循环仪，用UV射线照射样品然后通过CCD 相机检测产生的荧光值，利用了PCR 反应中的数学函数关系，再结合加入标准品的方法，达到了对检测样品进行准确定量的目的，但由于这种方法由于有着在实验仪器资金上巨大的耗费，一些非特异的PCR 产物同样能被检测到并包含在被测的荧光信号值总量之中而导致定量不准确等因素，最终使这种实验技术在当时没能成为主流的实验技术。
1995 年美国PE 公司成功研制了TaqMan 技术，1996 年又推出了首台荧光定量PCR 检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，并使用Ct 值进行分析，荧光定量PCR 才很快得到大家的接受，并广为应用。
近年来，荧光定量PCR 技术不断完善，取得了突飞猛进的发展。
由于其具有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等优点，而被广泛应用于基础科学研究、药物研发、临床诊断、转基因研究、基因检测等各个领域研究当中。
二、荧光定量PCR 概述1、荧光定量PCR 概念所谓定量PCR技术（r eal-time PCR），是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR 进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法（图1）。
图1 荧光定量PCR 反应原理荧光检测元件Ct值2、荧光定量PCR 与普通PCR 的主要区别常规PCR 中，PCR 产物通过凝胶电泳，然后进行成像分析，常规PCR 只能通过终点法对扩增产物进行定性分析，而不能进行定量分析（图2）；荧光定量PCR 中，PCR 反应体系中加入了荧光分子，通过荧光信号的变化来反应扩增产物的变化，使PCR 产物的实时检测成为可能。
相对常规PCR 而言，荧光定量PCR 的主要优点使准确地确定初始模版拷贝数和较高的检测灵敏度；荧光定量PCR 不仅可用于定性，如判断一段序列的有无，也可用于定量，如确定起始模版的拷贝数；图2 终点法定量PCR 的缺陷理论上PCR 是一个指数增长的过程，但是实际的PCR 扩增曲线并不是标准的指数曲线，而是S 形曲线。
这是因为随着PCR 循环的增多，扩增规模迅速增大，Taq 酶、dNTP、引物，甚至DNA 模板等各种PCR 要素逐渐不敷需求，PCR 的效率越来越低，产物增长的速度就逐渐减缓。
当所有的Taq 酶都被饱和以后，PCR 就进入了平台期。
由于各种环境因素的复杂相互作用，不同的PCR 反应体系进入平台期的时机和平台期的高低都有很大变化，难以精确控制。
所以，即使是96次PCR重复实验，各种条件基本一致，所得结果有很大差异（图2）。
常规PCR 的定量方法，测定的都是PCR 的终产物，而不是起始DNA 拷贝数。
由于PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系（图2），所以不能根据最终PCR 产物的量直接计算出起始DNA 拷贝数。
虽然加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。
但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。
而从图2 也可以看出，虽然相同模版在同一台PCR 仪上进行96 次扩增，终点处检测产物量不恒定，但96 次PCR 扩增曲线都有一个共同的拐点，即荧光定量PCR 中Ct 值的重现性，恒定的Ct 值为荧光定量PCR 的分析提供了理论依据。
前面我们对荧光定量PCR 的历史、荧光定量PCR 概念和与常规PCR 区别有了大致的了解，但你可能心中存在许多疑惑：什么是扩增曲线？什么是Ct 值？它们有什么特点？我们如何来判定荧光定量PCR 反应中的Ct 值，原理是什么？。
为了使大家更好的理解、掌握荧光定量PCR 技术，在介绍荧光定量PCR 检测方法、动力学原理和数据分析方法前，有必要先介绍几个最基本的概念。
3、荧光定量PCR 的几个基本概念3.1 扩增曲线为了更好的理解荧光定量PCR 原理，我将用样品扩增曲线来进行说明。
描述PCR 动态进程的曲线即扩增曲线。
PCR 的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是呈S 型曲线（图3）。
图3中，X－轴表示PCR循环数，Y－轴表示扩增反应的荧光值，与反应管中扩增产物的量有比例关系。
图 3 荧光定量PCR 扩增曲线示意图荧光阈值从图3 可以很直观的看出，荧光定量PCR 扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段（基线期），荧光信号指数扩增阶段（对数期）和平台期。
在基线期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。
而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。
PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR 产物量不能计算出起始DNA 拷贝数。
只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。
3.2 荧光阈值在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任在介绍荧光阈值之前，先了解一下荧光本底信号（图3），我们一般把荧光PCR 的前15 个循环信号作为荧光本底信号（baseline，基线期），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。
荧光阈值是（机器自动设置）。
我们在做荧光定量PCR 实验时，经常采用手动设置，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号是荧光信号超过域值（图4）。
图4 手工调整荧光阈值示意图3.3 Ct 值了解了荧光阈值的概念后，Ct 值就很好理解了。
C 代表Cycle，t 代表threshold，所谓Ct 值就是在荧光PCR 扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。
如图3 所示，黑色的线显示的是荧光阈值，当信号超过黑色线时所经历的循环数即为Ct 值。
从这也可以了解到Ct 值是可以变化的，我们实验时带有一定的人为因素。
而荧光定量PCR 后面的数据处理要用到Ct 值来计算，所以有关荧光阈值的设置就显得尤为重要。
一般说来，新手按荧光PCR 仪的自动设置为好，而如果你非常有经验，一般会手动设置荧光阈值。
因为Ct 值即达到荧光阈值所经过的循环数，所以它就与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，经过的循环数就越少，Ct 值也就越小，反之亦然。
正常的CT 值范围在18-30 之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。
前面也提到过，同一模板经过96 次PCR 扩增，扩增产物虽然不恒定，但Ct 值极具重现性。
根据这个特点，我们可以利用已知起始拷贝数的标准样品的Ct 值做出标准曲线，只要在同一次PCR 实验中得到未知样品的Ct 值，就可以根据曲线算出该未知样品的起始拷贝数。
接下来我们就来看看通过Ct 值算出拷贝数的数学原理是怎样的：首先我们来回顾一下PCR扩增原理（图5），从PCR原理图中我们也可以很清意位置上，荧光域值的缺省设置是3 ～15 倍10个循环的荧光信号的标准偏差的楚的知道理想的PCR反应是以2n次方增长的方式扩增，即：X=X0×2n但由于PCR 反应体系是一个有限的体系，也就是我们加入到PCR 反应体系中的物质是有限的，例如酶、引物、Buffer 等，只有在对数增长期时，PCR 的扩增效率才等于1，大部分时候扩增效率小于一，有时甚至等于零。
因此PCR 扩增的真正情况是：X=X0 (1+Ex)n其中n：扩增反应的循环次数；X：第n 次循环后的产物量X0：初始模板量；E x：扩增效率在扩增产物达到阈值线时所经历的循环数为Ct个循环，此时的产物量为X Ct=X0 (1+Ex)Ct =M其中X Ct：荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量，在阈值线设定以后, 它是一个常数，我们设为M，对方程式两边同时取对数得logM=logX0 (1+Ex)Ct，我们对该方程式做简单的数学运算后得到：log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M其中M 为常数，Ex 为常变数，也就是说Ex 在PCR 反应中的某一个循环中是一个常数，但不同的循环数中，Ex 的数值会发生变化。
因此从上式可以推出：Log 浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct 值就可计算出样品中所含的模板量。
图 5 PCR 原理图3.4 标准曲线在绝对定量中，未知样本的量如基因拷贝数可通过梯度稀释的已知量的标准品的Ct 值推算出。
在实验过程中，我们可以将已知浓度的标准品进行梯度稀释个（5－6稀释梯度），将未知样品和梯度稀释的标准品在同一荧光PCR 实验中2得n＝Ct，3.32 值差3.32。
进行反应，将稀释标准品得到的Ct 值构建标准曲线，通过标准曲线可以推算出未知样品的量（图6）。
标准曲线的制作不需要人工操作，由仪器自动完成。
理论上，一系列稀释样品的扩增曲线之间有均匀的间距（图6 左），如果PCR 反应呈理想的方式扩增，产物在每一循环都加倍，荧光曲线之间的间距则符合等式“ n＝稀释倍数”，n为2 样本间Ct值差。
例如：10 倍稀释的样本，2n＝10，可图 6 荧光定量PCR 标准曲线示意图3.5 扩增效率在绝对定量中，我们将已知模板稀释成一系列浓度梯度进行荧光PCR 实验，利用拷贝数和Ct 值做成标准曲线，利用递减的直线关系等式和相关系数（r）或可信度来计算扩增效率。
扩增效率与标准曲线的斜率相关，计算方程为：扩增效率（E -1/斜率。
理论上，在每个指数扩增循环中，PCR产物的量加倍，即PCR产物2 倍增加，反应效率为2，扩增效率就为2，就可得2＝10-1/斜率，标准曲线得斜率就为-3.32，斜率得绝对值与荧光曲线间距相同。
