绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆和表达
背景知识
绿色荧光蛋白( green fluorescent protein ， GFP)是一类存在于包括水母、水螅
和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时， GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子。发色团是其蛋白质一级序列固有的。 GFP 由 3 个外显子组成，长 2.6kb ；GFP 是由 238 个氨基酸所组成的单体蛋白 ,相对分子质量为27. 0kMr ，其蛋白性质十分稳定，能耐受 60℃处理。 1996 年 GFP 的晶体结构被解
出，蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构，长 420 nm，宽 240 nm，由 11 个围绕中
心α螺旋的反平行β 折叠组成，荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的，桶的顶部由3 个短的垂直片段覆盖，底部由一个短的垂直片段覆盖，对荧光
活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内
部第 65-67 位的 Ser-Tyr-Gly 自身环化和氧化形成 .
实验一质粒DNA 的分离与纯化
一、实验目的
掌握一种最常用的质粒 DNA 提取方法：碱裂解法。该法用
于从小量培养物中抽提质粒 DNA ，比较方便、省时，提取的
质粒 DNA 质量较高，可用于 DNA 的酶切、 PCR 甚至测序。
二、基本原理
质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。迄今为止，从细菌中分离得到的质粒都是环型双链 DNA 分子，分子量范围从 1kb 到
200kb 。质粒 DNA 可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地
整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。在大多
数情况下质粒 DNA 复制中的酶体系和细菌染色体复制
10-200 个拷贝。当宿主细胞的蛋白
时所用的酶是相同的。有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制，因此每个细胞中只含一个或几个拷贝，称为严谨型质粒，有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严，称为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数目可达质合成受到抑制时（例如经氯霉素处理），细菌染色体虽不再增加，但松弛型质粒 DNA 可继续被复制，以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。
质粒具有一定的生物功能，它们往往带有一些抗药标记，当质粒 DNA 用人为的方法转化进细菌时，转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型，例如，把一个含有抗药基因的质粒转入细菌后，原来无抗药性的细菌则表现出抗药的新表型。借助转化菌获得的新表型特征，可证实质粒已转入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标记。
质粒作为基因克隆载体分子的重要的条件是获得批量的纯化的质粒 DNA 分子。目前已有许多方法可用于质粒 DNA 的提取，它们都包括三个基本的步骤：细菌的生长和质粒的扩增；菌体的收集裂解，质粒 DNA 的分离；质粒 DNA 的纯化。
1、细菌的生长和质粒的扩增从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。对于松弛型质粒（如 pUC 系列）来说，只要将培养物放到标准的 LB 或 2YT 培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒 DNA 。但对于严谨型质粒（如 pBR322 ）来说，则需在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行选择性扩增。
2、菌体的收集、裂解和质粒DNA 的分离质粒分离的基本原理是利用宿主菌（一般是大肠杆菌菌株） DNA 与质粒 DNA 之间的两种主要性质差异：（ 1）大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA 大得多。（ 2）从细胞中提取得
到的大肠杆菌 DNA 主体是变性的线性分子，而大多数质粒 DNA 是共价闭合的环状分子。这里主要介绍碱裂解法的基本原理：在细菌悬浮液中加入SDS（十二烷基硫酸钠）和NaOH 使菌体
裂解（有时需要先使用溶菌酶水解细胞壁）。此处理可破坏碱基配对，故可使细菌的线状染色体 DNA 变性，但闭环质粒 DNA 链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时（如加入酸性的 NaAc 或 Kac 中和碱性 NaOH ），质粒 DNA 链迅速得到准确配对，重新恢复成天然的超螺旋分子。通过离心，可以使染色体 DNA 与变性蛋白质、 RNA 分子一起沉淀下来，而质粒超螺旋分子仍滞留于上清中。
3、质粒 DNA 的提纯
胶电泳中不同构型的同一种质粒 DNA ，尽管分子量相同，但具有不同的电泳迁移率。其中走在
最前沿的是 SC DNA ，其后依次是 L DNA 和 OC DNA 。
三、实验材料、仪器及试剂
1. 在含有 pEGFP －N3质粒的DH5α平板上菌落上挑取菌种， 置于含有 5mL LB 培养基
的试管中。 摇晃过夜。 （DH5α是一种大肠杆菌的诱变菌株，主要表现对外源 D NA 的免疫缺乏，是用 于基因工程的菌种）
在含有 pET-28a 质粒的平板上挑取单菌落于另外一个试管中，同样摇荡培养过夜。 2、使用仪器 恒温培养箱，超净台，恒温摇床，制冰机，台式离心机，小型混合器，冰箱 四、实验步骤
1. 取1.5ml DH5 α培养液倒入 1.5mL eppendorf 管（一种离心管） 中, 13000rpm 离心1min 。
对于小量制备的质粒 DNA ，经过苯酚抽提、 蛋白质及 RNA ，达到纯化的目的。
质粒 DNA 分子具有三种构型：共价闭合环形 构型）和线性分子（ L 构型）。在细
RNA 酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去残
余
DNA （cccDNA ，SC 构型）、开环 DNA （
OC
2. 重复 1。
3.弃上清 ,将管倒置于卫生纸上数分钟 ,使液体流尽。
4.菌体沉淀重悬浮于 100 μL溶液Ⅰ中（需剧烈振荡）, 室温下放置 10min。
（溶液I ，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA ，pH 8.0 ；溶液I的作用；mM为mmol/L。
任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当 pH值的 Tris-Cl 溶液。50
mM葡萄糖最大的好处是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。EDTA是 Ca2+和Mg2+等二
价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物
生长。在溶液 I 中加入高达 10 mM 的 EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。）
5.加入新配制的溶液Ⅱ 200μ l, 盖紧管口，快速温和颠倒 eppendorf 管5次 ,以混
匀内容物（千万不要振荡）,冰浴 5min 。
（溶液 II ，0.2 M NaOH / 1% SDS ；溶液 II 的作用；这是用新鲜的 0.4 N 的NaOH和2％的 SDS等体积混合后使用的。要新从浓 NaOH稀释制备 0.4N的NaOH，保证 NaOH没有吸收空气中的 CO2而减弱碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是 SDS，所以才叫碱法抽提。事实上 NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer （双层膜）结构向micelle （微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的 0.4 N NaOH，即便是有 SDS也无法有效溶解大肠杆菌（不妨可以自己试一下），自然就难高效率抽提得到质粒。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为碱性条件下基因组 DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组 DNA也会断裂。）
6.加入 150 μL预冷的溶液Ⅲ ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡3次 ,使沉淀混匀 ,冰浴中 15分
钟,13000rpm 离心 5min。
（溶液 III ，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸。溶液Ⅲ含 3M 醋酸钾 / 2M 醋酸。溶液 III 加入后就会有大量的沉淀，这其实是 SDS遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（PDS），而 PDS是水不溶的，因
此发生了沉淀。而高浓度的盐，使得沉淀更完全。SDS易与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合
一个 SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀。大肠杆菌的基因组DNA也会一起被共沉淀，因为基因组 DNA太长，容易被 PDS共沉淀，注意SDS并不与 DNA分子结合。
2M的醋酸是为了中和 NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。基因组DNA一旦
发生断裂，只要是 50－100 kb大小的片断，就没有办法再被 PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以
观察到一条浓浓的总 DNA条带。很多人误认为是溶液 III 加入后基因组 DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。 NaOH
本来是为了溶解细胞而用的， DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。溶液 III 加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。）
7.上清液移入干净 eppendorf 管中,加入等体积的氯仿 /异戊醇（24 ： 1）,振荡混
匀 , 13000rpm离心 2min。
（PDS沉淀的形成后有些蛋白质不能被沉淀，因此要用酚 / 氯仿/ 异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质粒 DNA，不然时间一长就会因为混入的 DNase而发生降解。这里用 25： 24： 1的酚/ 氯仿/ 异戊醇是有很多道理的。酚（ Phenol ）
对蛋白质的变性作用远大于氯仿，但是水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如4M的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到
上层，不利于含质粒的水相的回收；加入氯仿后可以增加比重，使得酚 / 氯仿始终在下层，方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），而用酚 / 氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也方便了水相的回收。）
8.将水相移入干净 eppendorf 管中 ,加入等体积的氯仿 / 异戊醇（24： 1）振荡混
匀 , 13000rpm离心 2min。
9.将水相移入干净 eppendorf 管中,加入 2 倍体积的无水乙醇 ,振荡混匀后，置于室温
下 2min，然后 13000rpm离心 5min 。
（回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入 2倍体积的乙醇，在室温放置几分钟后离心就可以将质粒 DNA 沉淀出来。）
10.弃上清 ,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1mL 70 ％乙醇洗沉淀一次 , 振荡混
匀后， 13000rpm 离心 5min 。
（高浓度的盐会水合大量的水分子，因此DNA分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。
如果感觉发生了盐的沉淀，就用70％的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并用移液枪枪头（tip ）将沉淀打碎，就能得到好的样品。）
11.吸除上清液 ,将管倒置于卫生纸上使液体流尽 ,室温干燥。
12.将沉淀溶于 30μL TE缓冲液（pH8.0 ，含20μ g/mL RNaseA）中，保存在 -20℃冰
箱中。（溶解已经讲解的 RNA，防止未降解的 RNA会干扰电泳结果。）
13.按照同样的流程和方法将 pET-28a 的质粒也提出来，保存在 -20℃冰箱中。
五、实验结果
实验二质粒 DNA浓度的测定
、实验目的
学习利用核酸蛋白测定仪测算核酸的浓度和纯度。
、基本原理
核酸分子在 260nm 下有最大吸光值，因此可以通过 260nm 下核酸的吸光值计算核酸浓度mg/ml ），并通过测定与 280nm 和 230nm 的比值，估算 DNA 的纯度。
除了核酸浓度 , 分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度 ,如 A 260 / A 280
的比值 ,用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280 nm. 纯净的样品 , 比值大于
1.8 （DNA）
或者 2.0 （ RNA）。如果比值低于 1.8 或者 2.0 ，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。 A 230 表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物, 多肽 , 苯酚等，较纯净的核酸 A 260 / A 230 的比
值大于 2.0 。A 320 检测溶液的混浊度和其他干扰因子。纯样品， A 320 一般是
0 。）
三、实验材料与仪器
1、实验材料
pEGFP－ N3和pET-28a DNA
2.使用仪器
Eppendorf 核酸蛋白测定仪，移液枪
四、实验步骤
1.按下 Eppendorf 核酸蛋白测定仪 dsDNA ，比色皿中加入 100μl ddH2O，blank 空白对照。
2.取一 0.5ml 离心管，吸取质粒 DNA 5 μ l，然后再加入 95μl ddH 2O，混匀。
3.将 100μl 的溶液转移到比色皿中，注意不要出现气泡。
4.按下 sample ，记录 260nm 下 DNA 的浓度（ mg/ml ）。并同时记录 OD
260nm/280nm，
OD260nm/230nm 的比值，估测 DNA的纯度。
5.计算质粒 DNA 母液的浓度 =OD260nm 下的浓度× 20（ mg/ml ），
DNA的纯度： OD260nm/280nm=1.8±0.1（如果低于 1.7 ，说明样品中蛋白质去除的不完全，或样品中有苯酚的污染；如果高于 1.9 ，说明样品中 RNA去除的不完全。）正常 OD260nm/230nm 约为 2.5， OD 260nm/230nm 小于 2.0 ，表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物 , 多肽 , 苯酚等盐和小分子。
实验三琼脂糖凝胶电泳
一、实验目的
学习掌握一种最常用的分离、鉴定、纯化 DNA 片段的比较方便、省时的技术：琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。
二、基本原理
影响 DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素主要有：（ 1）DNA分子的大小双链 DNA 分子在凝胶基质中迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比。分子越大，迁移的越
慢，因为摩擦阻力越大，也因为大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。（2）琼脂糖浓度给定大小的线
状 DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。在 DNA电泳迁移速率的对数和凝胶浓度
之间存在线性相关。（ 3）DNA的构象超螺旋环状（Ⅰ型）、切口环状（Ⅱ型）和线状（Ⅲ型） DNA在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移。其相对迁移速率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型，其次是电流强度、缓冲液离子强度和Ⅰ型超螺旋绞紧的程度或密度。一些条件下，Ⅰ型DNA比Ⅲ型迁移得快；在另一些条件下，顺序可能相反。（4）所用的电压低电压时， DNA 片段迁移
率与所用的电压成正比。电场强度升高时，高分子量片段的迁移率遂不成比例的增加。所以，当电压增大时琼脂糖凝胶分离的有效范围反而减小。要获得大于2kb DNA 片段的良好分辨率，
所用电压不应高于 5-8V/cm 。（5）电泳缓冲液 DNA 的泳动受电泳缓冲液的组成和离子强度的影响。缺乏离子则电导率降低， DNA或者不动或者迁移很慢。高离子强度时（如
10×
buffer ），电
导率升高，使得应用适中的电压也会产生大量的热能，最严重时凝胶会熔化，DNA变性。
三、实验材料、仪器及试剂
1、实验材料
质粒 DNA
2、使用仪器
核酸电泳仪，小型混合器，冰箱，蓝盾可见光透射仪
四、实验步骤
1、1% 琼脂糖凝胶的配制
（1）加 20ml 1×TBE 缓冲液于三角瓶中。
（TBE缓冲液为 Tris 硼酸 -EDTA缓冲溶液，适合长时间电泳，但测得分子质量大于实际分子质量，； TAE缓冲液为 Tris 醋酸 -EDTA缓冲溶液，运用最广泛，较准确但不适合长时间； TPE缓冲液为 Tris 磷酸 -EDTA 缓冲溶液，磷酸盐易在乙醇沉淀
过程中析出，不适合DNA回收。）
（ 2）精确称取 0.2g 琼脂糖加到三角瓶中，于微波炉中加热至完全熔化，
（ 3）冷却至 60℃左右，
（4）轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中，静置冷却30 分钟以上，
（5）将胶板除去封胶带，放入电泳缓冲液（TBE ）中，使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm，轻轻拔除梳子，
（6）取 5μl 质粒 DNA 及 2μl Genefinder 混匀上样。（也可使用 GelRed荧光核酸凝胶染色试剂，用凝胶成像仪显影）
（7）50-100v 约电泳 0.5-1 小时。
（8）蓝盾可见光透射仪观察结果。
五、实验结果
实验四酶切及连接学习使用限制型内切酶进行 DNA酶切的原理和方法。
1. 实验目的
3.1 实验材料
2. 实验原理
迄今已发现了 3000 多种限制性内切酶。传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、 识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。 II 型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地 切开 DNA 链。它们产生确定的限制片段，因此是三类限制性内切酶中唯一用于 DNA 分析和克隆
的一类。
II 型限制性内切酶中最普遍的是象 EcoR I 、Hind III 、 BamHI 和 Not I 这样在识别序列中 进行切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合
到 DNA 上，因而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到 D NA 上，识别非对称序列。
一些酶识别连续的序列（如 EcoR I 识别 GAATTC ；Hind III 识别 AAGCTT;BamH 识I 别 G ↓ GATCC;
Not I 识别 GC ↓ GGCCG ）C ；而另一些识别不连续的序列（如 Bgl I 识别 GCCNNNNNG ）G 。C 限制
性内切酶酶切 DNA 后形成两种类型的末端： （i ） 两条链断裂的位置是交错地， 产生粘性末端，如
DNA 连接酶能够催化在两条 DNA 链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条 DNA 链的 3'-
EcoR I 酶切后产生
5' -G ↓AATTC-3'
3' -CTTAA ↓G-5' 末端；（ii ） 两条链的断裂位置处在一个对称结构 的中心，产生平末端，如 HaeIII 酶切后产生
5' -GG ↓ CC-3'
3' -CC ↓ GG--P ）。
3.实验材料、仪器及试剂
pEGFP－N3和pET-28a DNA 3.1 实验材料
3.2 仪器准备水浴锅、移液器、电泳槽、电泳仪、振荡器、制冰机、蓝盾可见光透射
仪、凝胶成像仪
3.3 试剂
BamH I（10U/ μ L）（TaKaRa公司）; Not I （10U/ μ L）（TaKaRa公司）,T4 ligase
4.操作步骤
4.1 酶切
按如下双酶切体系（ 30μL）混合：
反应物（μ L）pEGFP-N3 pET-28a
质粒18 18
BamH I 2 2
Not I 2 2
10×buffer K 3 3
0.1%BSA缓冲液 3 3
（BSA缓冲液为牛血清白蛋白，稳定酶的活性。）
1. 离心 10s，混匀。
2. 37℃水浴酶切 3-4h 。
3.配制 1.0%（ M/V）普通琼脂糖凝胶 30ml。
（1%（m/v）指：一般是固体溶于液体的， 1g 固体溶于 100mL水中。）
4.适当放置冷却， 45℃左右倒于电泳胶板上，插好梳子。
5.待凝胶凝固好以后，拨下梳子。
6.酶切样品中加入 5μl溴酚蓝 -GeneFinder 混合液混匀，上样。
7.1×TBE Buffer ， 80V（3-4V/cm）下电泳 30min。
8.荧光激发器观察质粒 DNA 条带的酶切情况，并照像。
4.2 回收酶切产物（采用天为时代 DNA回收试剂盒进行回收）
4.3 连接
1) 配30mL 1 ％进口琼脂糖凝胶，尽量长一些(用粗梳子)，对酶切产物进行电泳分离；
2) 将酶切产物全部加入加样孔中 3) 跑胶，观察结果，并且拍照。
4) 用干净的刀片将需要的 DNA 条带从凝胶上切下来，称取重量。 5) 以0.1g 凝胶对应 300μ L 的体积加入 PN(溶胶液) 。
6) 50℃水浴放置 10min ，期间不断温和上下翻动离心管至胶完全融解。 7) 将上一步得到的溶液加入到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管，
弃掉废液。
吸附柱，用于吸附层析)
8) 加入800μ L 漂洗液 PW ，13000rpm 离心 60s ，弃掉废液。 (PW 是去盐的洗脱液，目的是洗脱脂类、蛋白及盐类等杂质) 9) 加入500μ L 漂洗液 PW ，13000rpm 离心 60s ，弃掉废液。 10) 将离心吸附柱放回收集管， 13000rpm 离心 2min 。
11) 取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液
EB 30μL ，洗脱缓冲液先在 65℃水浴预热，室温放置 2min ，13000rpm 离心 1min ，然后将离 心的溶液重新加回离心吸附柱中， 13000rpm 离心 1min 。 12) 置于－ 20 ℃保存。 按照连接体系进行， 16℃连接过夜。
13000rpm 离心 60s ，
反应物体积 / μL
回收纯化的 pET-28a 质粒
5
gfp 基因片段12
T4连接酶 1
缓冲液（ 10×） 2
实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
一、实验目的
了解和掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法的原理和操作要点，以及质粒 DNA 转化大肠杆菌细胞的原理和方法。
二、基本原理
外源 DNA 只有转化到大肠杆菌细胞内才能得到扩增。感受态指细菌细胞具有的能够接受外源 DNA 的一种特殊生理状态。大肠杆菌的感受态可用 CaCl2 处理而诱导产生：将正在生长的大肠杆菌细胞在 0℃下加入到低渗的 CaCl2溶液中，便会使细胞膜的透性发生改变，此时的细胞即呈现为感受态。这一方法可以用于批量制备感受态细胞，其转化效率可达到5× 106-2× 107
个转化克隆子 /μg 超螺旋质粒 DNA 。制备好的大肠杆菌感受态细胞可在 -70℃冻存。
在 0℃下外源 DNA 可吸附到感受态细胞表面，短时间的热刺激（42 ℃， 90s）诱导细胞吸
收 DNA 。（Ca2+会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞。将该体系热激，细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。进入细胞的外源DNA分
子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。）转化了质粒DNA的大肠杆菌随后在培养基中 37℃培养1hr ，可使质粒DNA中编码
抗生素抗性的基因得以表达，因此，转化了质粒DNA的大肠杆菌细胞可在含有相应抗生素的培养基上
生长，而没有转化的细胞则无法生长。
三.实验材料、仪器 1. 实验材料
DH5α， BL21，pET-28a重组质粒 DNA
2. 使用仪器
水浴锅，高压灭菌锅、移液器、超净工作台、离心机、振荡培养箱，制冰机
四、操作步骤
1. LB （Luria-Bertain ）液体和固体培养基的配制（参考附录）
氨苄青霉素和卡那霉素等抗生素不抗热，如果培养基温度过高，容易导致抗生素失效，应
使培养基降温至 60℃左右后，再加入抗生素。但也不应使培养基的温度过低，否则容易出现气
泡。 75mm 直径的培养皿约需 15ml 培养基。
2．感受态细胞的制备（CaCl 2法）
（1）挑一大肠杆菌单菌落放入 3ml LB液体培养基（含 Kan+）， 37℃培养过夜。（2）活化大肠杆菌：取 3ml新鲜的 LB液体培养基加入 50-150 μ l 的过夜菌，培养2-3个小时。
（3）将昨夜摇出来的 DH5α 或BL21培养液转入离心管中 , 冰上放置 10min, 然后于4℃下
4000rpm离心 5min 。
（4）弃去上清 ,用预冷的 0.1mol/L 的CaCl2溶液600μL轻轻悬浮细胞 , 冰上放置20min, 4 ℃下 4000rpm离心 5min 。
（5）弃去上清 , 加入 300μ L预冷的 0.1mol/L 的CaCl2 溶液 , 轻轻悬浮细胞 , 冰上放置 5min, 即成感受态细胞悬液，可 -80 ℃长期保存。
3.转化涂板
（1）取2个无菌离心管，分别加入 100μL DH5α感受态细胞悬液，第 1管加5μl 无菌水，第 2管
加入质粒 DNA溶液 5μl, 轻轻摇匀 , 冰上放置 30min 。
（2）42℃水浴中热激 90s, 热激后迅速置于冰上冷却 5min。
（3）分别向管中加入 100μL LB液体培养基 ,混匀后在 37℃振荡培养 30min。
（4）从管1中取50μL涂布于含抗生素和不含抗生素的平板上 , 从管2中取50μL和100μL涂布
于含抗生素的平板上。正面向上放置约10分钟 , 待菌液完全被培养基吸收后倒置培养
皿 ,37 ℃培养 20小时。
（生物科技行业）功能基因的克隆及生物信息学分析
功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structuralgenomics）转向功能基因组学(functionalgenomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多
控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。 1.2同源序列克隆目的基因 首先根据已知的基因序列设计PCR引物，在已知材料中扩增到该片段，并经克隆测序验证，利用放射性同位素标记或其他非同位素标记该PCR片段作为探针，与待研究材料的cDNA文库杂交，就可以获得该基因cDNA克隆，利用克隆进一步筛选基因组文库，挑选阳性克隆，亚克隆并测序，从中就可以筛选到该基因的完整序列。 1.3结合连锁和连锁不平衡的分析方法 结合连锁和连锁不平衡的分析方法是未知基因克隆研究领域发展的新方向[6]。(Linkagedisequilibrium,LD)。与连锁分析不同,连锁不平衡分析可以利用自然群体中历史发生的重组事件。历史上发生的重组使连锁的标记渐渐分布到不同的同源染色体上,这样就只有相隔很近的标记才能不被重组掉,从而形成大小不同的单倍型片段(Haplotypeblock)。这样经过很多世代的重组,只有相隔很近的基因,才能仍处在相同的原始单倍型片段上,基因间的连锁不平衡才能依然存在。所以基于连锁不平衡分析,可以实现目的基因的精细定位。林木大多为自由授粉的异交物种,所以连锁不平衡程度很低,林木基因组中的LD可能会仅局限于非常小的区域,这就为目的基因的精细定位提供了可能,结合SNP检测技术,科学家甚至可以将效应位点直接与单个的核苷酸突变关联起来,进行数量性状寡核苷酸
一、组织总RNA的提取 相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入 液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min； 4.4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管， 加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min 晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝，TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机） 相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒） （1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。
基因克隆及转基因 一、基因克隆及转基因过程 1、设计引物 软件是https://www.doczj.com/doc/a04060918.html,sergene.v7.1，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。 一般原则：1、长度：18-25； 2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%； 3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大 于5； 4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A； 5、正反向引物连续配对数小于4； 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何； （如果克隆的话不能满足条件也没办法。） 不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。 步骤： 一、打开PrimerSelect和EditSeq。 二、在EditSeq中输入你的序列。 引物有一对F和R 1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。 2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter New Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。 3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。、 4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。 5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。 7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。一般在引物上游还要加上两个保护碱基。 2、提取醋栗DNA 3、PCR扩增与目的基因回收 PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。回收完可以再跑电泳检测一遍。 PCR： 20ul体系：灭菌水13.8ul，若模板为质粒灭菌水14.3ul； 2.5mMdNTP2.0ul；
绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆 南方医科大学学院 摘要 本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α(克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。 关键词：绿色荧光蛋白克隆表达 实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆 2015- ~ 实验日期 实验地点 2015- 合作者指导老师 评分教师签名批改日期 一、实验目的 1.学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。 2.学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。 3.掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。 4.学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。 5.了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方 法。
6.掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原 理和方法。 7.掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤 二、实验原理 1.pEGFP-N1质粒 2.T载体
三、材料与方法： 1.实验材料： 质粒：pEGFP-N1 T载体：pUCm-T 菌种：DH5(克隆菌) PCR引物： F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC Tm=56 实验试剂： 即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit） 快速DNA连接试剂盒 限制性内切酶：EcoR I（Fermentas） Axygen质粒提取试剂盒 抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan) X-gal、IPTG等 实验仪器： 超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等 2.方法 分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子 四、实验具体流程 1.获取外源基因 1)碱裂解法提取质粒 使用Axygen质粒提取试剂盒
绿色荧光蛋白G F基因 的克隆表达和粗提取 SANY标准化小组 #QS8QHH-HHGX8Q8-GNHHJ8-HHMHGN#
绿色荧光蛋白(G F P)基因的克隆、表达和粗提取 南方医科大学 2011预防医学（卫生检验检疫） 摘要 目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。方法：从 DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞 BL-21中，用LB培养基对转化后的进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。 关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取 目录
1 前言 绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿
色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。1962 年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现一种绿色的荧光蛋白。1974 年，他们分离得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白(GFP)[1] GFP 作为一种新的报告基因，其优点在于①荧光强度高，稳定性高；②GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害，安全可靠；③不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光，尤其适用于体内的即时检测； ④GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；⑤通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域[ 2～3]。采用GFP 作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段[ 4、5 ]。采用基因工程手段生产GFP标记的方法，可建立一种简便、快速的免疫诊断技术[6]。 质粒转化进入大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞是分子克隆的关键步骤[7]，是基因克隆以及DNA文库构建等研究中一项重要的常规操作。目前，感受态 法，该方法操作简单、容易掌握、重复性好、转化率 细胞的制备主要采用CaCl 2 高，可广泛应用于一般的实验室。其原理是Ca2+ 破坏细胞膜上的脂质阵列，并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源DNA的渗入[8]。 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产
基因克隆载体上的各种常用蛋白标签 蛋白标签(proteintag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。 美国GeneCopoeia(复能基因)为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等;也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。 以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。 TrxHIS His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测;二是构成独特的结构特征(结合配体)利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 标签的量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能; His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性; His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究; His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。 可应用于多种表达系统，纯化的条件温和; 可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。 Flag标签蛋白 Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽(DYKDDDDK)，同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。 融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。 FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。
毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校
华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告
癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 [实验原理]（供参考，试剂盒的Solution SS成分未知） 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA 或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。[仪器、材料与试剂] (一)仪器1．小型高速离心机2．恒温摇床3．恒温箱4．‐20℃冰箱5．恒温水浴器 (二)材料1．氨苄青霉素2．大肠杆菌DH5a3．pUC194．1.5mL 离心管5．枪头、枪6．试管、培养皿 (三)试剂1．快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）2．LB 培养液在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨(tryptone) 10g酵母提取物(yeast extract) 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。 3．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL 溶液，置‐20℃冰箱保存。 [实验步骤]
1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。 2．取50mL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。 3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。注意：1mL的取液器设定在500mL。悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。 4．将上述细胞分装于1.5mL离心管(离心管要在放在冰上预冷) 中，每管0.1mL。细胞可以立即使用或储存。 5．将感受态细胞迅速转移到‐20℃或更低的低温冰中。注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。 转化：1．新鲜制备的或‐20℃下保存的100mL感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。 2．加入5mL pUC19质粒，DNA浓度为10pg/mL，轻轻混匀。 3．冰上放置30分钟。 4．42℃水浴热激60秒。 5．冰上放置2分钟。 6．加400mL LB培养液，37℃ 250转／分振荡培养30分钟。 7．室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400mL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。
功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structural genomics）转向功能基因组学(functional genomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1 图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2 基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。
植物基因克隆实验规则 一、植物基因克隆实验课的目标 根据基因克隆实验操作的整体性和连贯性特点, 将该实验设计为综合性实验课程，实验内容设计上完全抛弃了原来分散的、孤立的单纯学习某一实验技术的缺陷, 将单个实验综合为系统的、连贯的系列型大实验，注重科研成果在教学中的应用，我们从以往的科研项目中选取了部分研究内容用于学生的综合性实验教学，这是基于教学实验与实际科学研究实验之间的新的实验教学模式。 整套实验围绕洋甘菊倍半萜生物合成途径中关键酶基因HMGR的克隆这一研究课题进 行操作, 设计的实验内容具有极强的连续性和综合性，让学生在独立实践操作中学习基因克隆的基本研究方法和体会科学研究的严密逻辑和培养科研理念。 我们将实验内容设置为8个部分, 实验内容前后衔接紧密, 环环相扣, 不可分割, 前一个实验的结果是下一个实验的材料。该课程使学生获得了整个类似科研实践过程的训练和体验, 学习了从事科研工作的基本功, 对完成自己的毕业论文及将来从事生命科学研究奠定了科 研基础。 二、实验的进行程序和要求 1、预习学生在课前应认真预习实验指导以及教材有关章节，必须对该次实验的目的要求、实验内容、基本原理和操作方法有一定的了解。 2、讲解教师对该实验内容的安排及注意事项进行讲解，让学生有充分的时间按实验指导的要求进行独立操作与观察。 3、独立操作与观察除个别实验分组进行外，一般由学生个人独立进行操作和观察。在实验中要按实验指导认真操作，仔细观察，作好记录。有关基本技能的训练，要按操作程序反复练习，以达到一定的熟练程度。
4、演示每次的实验都备有演示内容，其目的是帮助学生了解某些实验中的难点，扩大在实验课有限时间内获得更多感性知识的机会。 5、作业实验报告参照硕士毕业论文的格式写，必须强调科学性，实事求是地记录、分析、综合。在实验结束时呈交。 6、小结每次实验结束后，由师生共同小结本次实验的主要收获及今后应注意的问题。 三、实验规则和注意事项 1、每次上课前，必须认真阅读实验指导，明确本次实验的目的要求、实验原理和注意事项，熟悉实验内容、方法和步骤。 2、上实验课时必须携带实验指导、记录本及文具等。进入实验室要按规定座位入座。 3、实验时要遵守纪律，听从教师指导，保持肃静。有问题时举手提问，严禁彼此谈笑喧或随意走动，也不得私自进行其他活动。 4、实验时要遵守实验操作规程，严格按照教师的安排和实验指导的要求进行。操作观察要认真仔细，边做、边看、边想，认真做好实验记录。 5、要爱护仪器和器材设备，注意节约实验材料、药品和水电。如有损坏器材应立即报告并主动登记、说明情况。 6、实验结束后，应清理实验台面，认真清理好仪器、药品及其他用品，放回原处，放好凳子，方可离开实验室。值日生要负责清扫地面，收拾实验用品，处理垃圾，关好水、电、门窗后再离开。
3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果
整个基因克隆实验流程(完 整) -标准化文件发布号：（9456-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
一、组织总RNA的提取 相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研 钵中，加入液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置 3min； 4.4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相； RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个 新的离心管，加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心 5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室 温放置5min晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝， TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机） 相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒） （1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，
题目：绿色荧光蛋白（GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达 李宏远 2014236053 立题依据： 随着分子生物学和基因工程技术的迅速发展和广泛应用, 人们根据自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地将外源基因导入动物细胞内, 使外源基因进行表达、阐明基因表达的调控机理或者通过与染色体基因组进行稳定整合，将生物性状传递给子代动物的研究方兴未艾[1]。 1.选材：大肠杆菌 大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30 %，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统。 2.基因标记技术 基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而引起了科学家的广泛关注，现已被普遍应用到分子生物学研究的各个方面。荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白[2]。
3.绿色荧光蛋白 从水母(Aequorea victoria)体内发现的发光蛋白。分子质量为 26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团，是主要发光的位置。其发光团的形成不具物种专一性，发出荧光稳定，且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光。绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因。 【实验目的】 研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 【研究意义】 研究绿色荧光蛋白在大肠杆菌体内的基因克隆和表达。通过质粒重组形成所需要的重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入大肠杆菌体内，通过酶切、PCR及用IPTG诱导检测是否在大肠杆菌体内诱导表达成功。根据电泳结果及荧光现象得出结论，重组质粒在大肠杆菌体内成功诱导表达。 GFP的应用特点 检测方便：不需要外加底物和辅助因子，用内眼就可以观察到，在长紫外光照射下特别漂亮，以此作为标记，观察表达产物。
山羊基因克隆实验方案设计 第五组 1. 提取DNA 2. DNA检测（电泳） 3. 目的DNA片段基因扩增（PCR） 4. DNA检测（电泳） 5. 目的基因片段与载体连接 6. 大肠杆菌感受态细胞的制备 7. 导入受体细胞与蓝白斑筛选 8. 阳性克隆鉴定 9. DNA测序 一、DNA提取 【实验目的】 指导DNA提取原理（羔羊片），熟悉DNA提取步骤。 【实验原理】 组织细胞被PK消化后，经过萃取漂洗获得纯净DNA。 【实验步骤】 1. ＜30 mg组织，用眼科剪剪碎，加入200 TL buffer＋20 μL PK，55℃水浴1-3 h。 2. 加入220 μL buffer BL，振荡15 s，70 ℃放置10 min，溶液变清亮。 3. 10000 r离心2 min，移上清液至新离心管。 4. 加220 μL无水乙醇，充分振荡15 s，可能会出现絮状沉淀。 5. 将溶液和絮状物加入到吸附柱中，12000 r离心30 s，弃废液。 6. 向吸附柱加入500 μL WB，12000 r离心30 s，弃废液。 7. 向吸附柱加入500 μL wash buffer，12000 r 离心30 s，弃废液，空滤一次。 8. 将吸附柱转入干净离心管，加入50 μL TE，放置5 min，12000 r离心2 min，备检。 二、DNA电泳检测 【实验原理】 琼脂糖凝胶电泳技术是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。凝胶分辨率决定于使用材料的浓度，并由此决定凝胶的孔径。琼脂糖凝胶可分辩0.1~6.0kb的双链DNA片段。琼
脂糖凝胶电泳是一个电场作用。它首先利用琼脂糖的分子筛效应，此外，在弱碱性条件下，DNA分子带负电荷，从负极向正极移动。根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同，它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。借助溴化乙锭（EB）能与双链DNA结合的作用，利用EB染色，并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。 【仪器与试剂】 琼脂糖、10×TAE电泳缓冲液（40mMTris，20mMNaAc，1mMEDTAPH8.0）、载体缓冲液（0.25%溴酚蓝，30%甘油）、溴化乙锭水溶液（10mg/ml）、凝胶槽、电泳仪 【实验步骤】 1．取琼脂糖0.9g，加入100ml1xTAE电泳缓冲液于250ml烧瓶中，100℃加热溶解。 2．平衡凝胶槽，放好两侧挡板，调节好梳子与底板的距离（一般高出底板0.5~1mm）。 3．铺板：在溶解好的凝胶中加入终浓度为0.5ug/ml的溴化乙锭水溶液，轻轻混匀，待冷至50℃左右倒入凝胶槽，胶厚一般为5~8mm。 4．待胶彻底凝固后，去掉两侧挡板，将凝胶放入盛有电泳液的槽中（加样孔朝向负极端，DNA由负极向正极移动），使液面高出凝胶2~3mm，小心拔出梳子。 5．DNA样品与载体缓冲液5：1混合并加入凹孔中（样品不可溢出）。 6．打开电源，调节所需电压，电压与凝胶的长度有关，一般使用电压不超过5v/cm。 7．据指示染料移动的位置，确定电泳是否终止（溴酚蓝的涌动距离在5sRNA和0.3kbDNA 带之间）。 8．电泳完毕关闭电源。将凝胶放紫外灯下观察并拍照。 三、目的DNA片段基因扩增（PCR） 方案1：遗传学实验31，PCR扩增基因片段 方案2： 【实验目的】 了解多聚合酶链反应DNA 扩增技术的基本原理和实验应用，掌握PCR反应基本技术。【实验原理】 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应是1986 年由Kallis Mullis 发现。这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病诊断，肿瘤机制探查，法医鉴定等方面。PCR技术已成为方法学上的一次革命，它必将
Cloning and expression of peroxisomal Ascorbate Peroxidase gene from wheat Yaping Chen,Huazhong Wang,Xiue Wang,Aizhong Cao&Peidu Chen* State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,People’s Republic of China;*Author for correspondence(Phone:+86-25-84396026;E-mail: pdchen@https://www.doczj.com/doc/a04060918.html,) Accepted24October2005 Key words:peroxisomal ascorbate peroxidase,powdery mildew,SSH,wheat Abstract A full-length cDNA encoding wheat peroxisomal ascorbate peroxidase(pAPX)was cloned by Suppression Subtractive Hybridization(SSH)and in silico approach.The cDNA was1027bp in length and contained a complete ORF of876bp,which encodes a protein of292amino acid residues.Its deduced amino acids sequence had84%identity with that of pAPX from barley.The gene was designated as Ta-pAPX.The Ta-pAPX homologous genes were mapped on wheat chromosome7A and7D using Chinese Spring nulli-tetrasomic lines analysis.Northern analysis indicated that,after inoculation by Erysiphe graminis Dc.f.sp. tritici,the expression of Ta-pAPX gene in Yangmai5was enhanced,but its expression in wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation lines changed a little.The results implied that Ta-pAPX may be related to susceptibility of wheat to powdery mildew.The complete coding sequence of Ta-pAPX was cloned into an expression vector pET32(a+)and a protein with the same deduced molecular weight(MW)was expressed in E.coli BL21(DE3),which showed ascorbate peroxidase activity. Abbreviations:APX–ascorbate peroxidase;ESTs–expressed sequence tags;IPTG–isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside;MW–molecular weight;ORF–open reading frame;pAPX–peroxisomal ascorbate peroxidase;SSH–Suppression Subtractive Hybridization. Introduction Ascorbate peroxidase(APX),found in higher plants,cyanobacteria,and algae[1],is the key enzyme in degradation hydrogen peroxide.So far, at least?ve APX isoforms have been identi?ed in plants:cytosolic isoforms,mitochondria isoforms, peroxisomal/glyoxysomal isoform and two chlo-roplastie isoforms,one in stroma and the other associated with the thylakoid membranes,all of which catalyze the reaction: 2ascorbate peroxidasetH2O2! 2monodehydroascorbatet2H2O APXs activity increased in response to a num-ber of stress conditions,such as drought[2],salt [3],high temperature[4]and pathogen infection [5].Relationship between di?erent stress condi-tions and changes of APX activity were observed. Powdery mildew caused by E.graminis DC.f.sp.tritici is one of the most serious diseases of common wheat in China and many other countries.The Triticum aestivum(‘‘Yangmai5’’)–Haynaldia villosa6VS/6AL translocation line carrying powdery mildew resistance gene Pm:21 confers e?ective resistance to all current powdery mildew races.To investigate the mechanism of Molecular Biology Reports(2006)33:207–213 DOI10.1007/s11033-005-4536-1óSpringer2006