第23卷第1期海洋水产研究Vol.23 No.1
.2002 2002年3月MARINE FIS~ERIES RESEARC~Mar
===================================================================
=文章编号:1000-7075(2002D01-0058-06
综述
16S rRNA在海洋微生物系统
分子分类鉴定及分子检测中的应用
洪义国孙谧张云波李勃生
(中国水产科学研究院黄海水产研究所青岛266071D
摘要16S rRNA序列分析作为微生物系统分类的主要依据已得到广泛认同随着微生物核糖体RNA数据库的日臻完善该技术成为细菌分类和鉴定的一个有力工具G本文总结了16S rRNA作为海洋微生物系统分子分类鉴定的理论基础和具体方法分析了用16S rRNA研究海洋微生物的进化关系并且对16S rRNA在海洋微生物分子检测中的应用作一评述G
关键词16S rRNA海洋微生物分子分类鉴定分子检测
中图分类号:G939;G522+.3文献识别码:A
The application of16S rRNA in molecular classif ication
identif ication and molecular examination in marine microbic system ~ONG Yi-guo SUN Mi Z~ANG Yun-bo LI Bo-sheng
(Yellow Sea Fisheries Research Institute Gingdao266071D
ABSTRACT The theoretical base and detailed method of16S rRNA application in molecu-lar classification identification and examination in marine microbic system were summarized. The evolutional relationship of marine bacteria studied with16S rRNA was analyzed the ap-plication of16S rRNA to molecular examination of marine microbe was reviewed.
KEY Wo R D S16S rRNA Marine microbe
Molecular classification and identification Molecular examination 随着分子生物学和分子遗传学的飞速发展16S rRNA在海洋微生物学的研究中起到越来越重要的作用作为海洋微生物系统分类和有害海洋微生物的分子检测的主要依据已得到广泛认同G随着微生物核糖体RNA 数据库的日臻完善该技术成为海洋细菌分类和鉴定的一个有力工具G本文对16S rRNA在海洋微生物系统分子分类鉴定及分子检测中的应用作一评述同时分析该技术在应用中存在的问题G
116S rRNA同源性分析对海洋微生物进行系统分子分类鉴定
国家O8639项目(863-819-06-01D资助
收稿日期:2001-10-19;接受日期:2001-12-20
lo l l 同源性分析作为海洋微生物系统分子分类鉴定的理论依据
目前从陆地微生物分离到的生物活性产物大部分是结构已知的化合物9而海洋微生物作为药物和酶制剂等的新来源正受到越来越多的关注O 但对大量菌种的分类鉴定是一项繁琐~费时的工作9而且由于海洋独特的环境9包括高盐~高压~低营养~低温等9造就了海洋微生物有别于陆地微生物的诸多特异性(如不易培养9形态多变且在保藏和移种过程中很容易死亡等)而导致对它们种类区分的困难(Robina 1968)9有碍于海洋微生物研究和开发的深入9因此迫切需要建立一种简单~方便~易于操作的分类鉴定方法对海洋微生物进行分析9使人们在一定程度上更科学~更精确~更快速地找到海洋微生物的分类地位9为海洋微生物资源的开发利用奠定基础O 传统的细菌系统分类的主要依据是形态特征和生理生化性状9采取的主要方法是对细菌进行纯培养分离9然后从形态学~生理生化反应特征以及免疫学特性加以鉴定O 本世纪60年代开始9分子遗传学和分子生物学技术的迅速发展使细菌分类学进入了分子生物学时代9许多新技术和方法在细菌分类学中得到广泛应用O 目前9FRNA 分子己成为一个分子指标(Delong 1982)9广泛地用于各种微生物的遗传特征和分子差异的研究9加上大量已知微生物的DNA 都被测定并输入国际基因数据库9成为对微生物鉴定分类非常有用的参照系统9从而可以通过对未知微生物DNA 序列的测定和比较分析9达到对其进行快速~有效的鉴定分类的目的O
核糖体的RNA 含有3种类型 23S ~16S 和5S FRNA 9它们分别含有的核苷酸约2900~1540和120个O 60年代末9Woese 开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类9他通过比较各类生物细胞的核糖体RNA (FRNA )特征序列9认为16S FRNA 及其类似的FRNA 基因序列作为生物系统发育指标最为合适O 其主要依据是 它们为细胞所共有9其功能同源且最为古老9既含有保守序列又含可变序列9分子大小适合操作 它的序列变化与进
化距离相适应(陈文新
1998)O 5S FRNA 虽易分析9但由于核苷酸少9没有足够的遗传信息用于分类研究O 而
23S FRNA 含有的核苷酸数几乎是16S FRNA 的两倍9分析较困难O 16S FRNA 的相对分子量适中9作为研究对象较理想O
细胞核糖体RNA 可将遗传信息得以表达9转译成蛋白质9因此可以想象这些分子具有作为种系发生的指示所必不可少的性质O 在相当长的进化过程中9FRNA 分子的功能几乎保持恒定9而且其分子排列顺序有些部位变化非常缓慢9以致保留了古老祖先的一些序列O 也就是说9从这种排列顺序可以检测出种系发生上的深远关系O FRNA 结构既具有保守性9又具有高变性O 保守性能够反映生物物种的亲缘关系9为系统发育重建提供线索;高变性则能揭示出生物物种的特征核酸序列9是属种鉴定的分子基础O 而且FRNA 在细胞中含量大9一个典型的细菌中含有10000~20000个核糖体9易于提取9可以获得足够的使用量供比较研究之用O 从图1可见9选用的PCR 扩增引物及测序引物对应的序列是16S FRNA 中高度保守的序列9其中PCR 引物8~27位的16(+)和1512~1492位的16(-)扩增分离物的16S FRNA 全基因9选择位于8~27位的16(+)~683~702N 3R 和1512~1492位的16(-)保守序列作为测序引物9可准确测定16S FDNA 的一部分序列O 根据核糖体16S FRNA 结构变化规律9在所测定的区域中包括了V 1~V 2~V 3和V 44个高变区9尤其是V 2这一高变区9由于进化速度相对较快9其中所包含的信息9足够用于物种属及属以上分类单位的比较分析O 因此9测定16S FD-NA 部分序列即可达到对分离物的分子鉴定的目的(GFay 1984)O 图1
16S FRNA 基因结构模式Fig o 1DiagFam of 16S FRNA gene stFuctuFe
95第1期洪义国等 16S
FRNA 在海洋微生物系统分子分类鉴定及分子检测中的应用
06海洋水产研究第23卷
1.216S PRNA序列分析的基本原理和技术步骤
通过比较各类生物16S rRNA的基因序列从序列差异计算它们之间的进化距离可以绘出生物进化树O 因此16S rRNA序列分析技术的基本原理就是从微生物样本中的16S rRNA的基因片段通过克隆~测序或酶切~探针杂交获得16S rRNA序列信息再与16S rRNA数据库中的序列数据或其他数据进行比较确定其在进化树中位置从而鉴定样本中可能存在的微生物种类O其技术主要包括以下3个步骤O
1.2.l基因组DNA的获得
首先从微生物样品中直接提取总DNA对易于培养的微生物可通过培养富集后再进行提取O另一种选择是提取微生物细胞中的核糖体RNA O一个典型的细菌含有10000~20000个核糖体而基因组DNA中rrn操纵子(即rDNA序列)的拷贝数相对较少(原核生物一般为1~10个左右)因此rRNA在细胞中的含量很高易于获得较多的模板但是RNA易于降解RNA的提取技术相对于DNA的提取较为复杂一般研究多采用提取细胞总DNA但也可根据情况选择提取rRNA O由于rRNA在死亡的细胞中很快降解提取rRNA通过反转录钓取16S rDNA序列的方法能够区分被检测的细胞是否为活体细胞(Kurabachew1998)O
1.2.216S rRNA基因片段的获得
过去常常将提取的总DNA经酶切后克隆到7噬菌体中建立DNA库进一步通过16S rRNA通用探针进行杂交筛选含有16S rDNA序列的克隆(鸟枪法)O由于PCR技术的产生和发展现在一般采用16S rRNA引物PCR扩增总DNA中的rRNA序列或通过反转录PCR获得CrDNA序列后再进行分析O采用PCR技术的优点在于不仅一次性从混合DNA或RNA样品中扩增出16S rRNA序列而且方便了后面的克隆和测序O但也同样会出现PCR所固有的缺点尤其是采用16S rRNA保守序列的通用引物对多种微生物混合样品进行扩增可能出现嵌合产物(Chimeric product)和扩增偏嗜性现象影响结果的分析O
1.2.3通过16S rRNA基因片段分析对微生物进行分类鉴定
16S rRNA基因片段的分析方法主要包括以下3种,一是将PCR产物克隆到质粒载体上进行测序与16S
rRNA数据库中的序列进行比较确定其在进化树中的位置从而鉴定样本中可能存在的微生物种类该方法获得的信息最全面但在样品成分复杂的情况下需要大量的测序工作O二是通过16S rRNA种属特异性的探针与PCR产物杂交以获得微生物组成信息O此外探针也可以直接与样品进行原位杂交检测通过原位杂交不仅可以测定微生物的形态特征和丰度而且能够分析它们的空间分布O该方法简单快速主要应用于快速检测但可能出现假阳性或假阴性结果O三是对PCR产物进行限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphisms RFLP)分析通过观察酶切电泳图谱~数值分析确定微生物基因的核糖体型再同核糖体库中的数据进行比较分析样品中微生物组成或不同微生物的种属关系O
目前国际上有许多核酸数据库能够检索核糖体核酸序列一些软件可用于序列对比分析和构建进化树如
Clustal w和Tree View软件O此外一些研究机构还建立了专门用于核糖体序列分析的数据库其中最著名的是美国密歇根州立大学的RDP(Ribosomal Database Project-II)库该数据库目前包括9700多个小亚基单位rRNA序列用户可以通过匿名FTP(ftp.cmG.ms M.edM)和www网(http,//https://www.doczj.com/doc/a480454.html,/ RDP/)使用这些数据和软件其中www网提供的主要服务包括,核糖体探针检测,用户委托序列在rMA分类系统中的大致位置分析;筛选可能的嵌合rRNA序列;自动序列对准比较;提供未知序列在系统发育进化树中的位置以及RFLP结果分析等多种功能(Madak1999)O此外欧洲还有一些核糖体数据库如比利时安特卫普(Antwerp)大学建立的数据库提供6000多种小亚基单位序列(Van de Peer Y.1997)其网址为,http,// rna.uia.ac.be/ssu/O德国幕尼黑技术大学的ARB(Arbor Tree Project)数据库(http,//www.Biol.chemie.tu-muenchen.de/pub/ARB/)提供自动序列对准比较二级结构检测和进化树构建等程序O
1.316S PRNA寡核苷酸编目分析
16S rRNA寡核苷酸编目分析所依据的基本原理是用一种核糖核酸酶水解rRNA可使其产生一系列寡核苷酸片段如果两种或两株微生物的亲缘关系越近则它们所产生的寡核苷酸片段的顺序也越接近反之亦
然0
实验的方法大体是:将要鉴定菌株的rRNA (一般事先用 2 进行标记)提纯 再用可专一性水解 上 端磷酸酯键的 1核糖核酸酶进行水解 产生以 为结尾的长度不一的寡核苷酸片段 接着将水解产物进行双向电泳 用放射自显影技术获得16S rRNA 寡核苷酸的指纹图谱 并确定不同长度寡核苷酸斑点在电泳图谱上的位置 然后将图谱中链长在6个核苷酸以上的寡核苷酸作顺序分析 其结果按长度不同进行编目 并列入表中0通过比较~计算和分析 就可定量地知道各被测菌株间的亲缘关系0
通过 1RNA 酶的水解 一般可使rRNA 形成含有1 2O 个核苷酸单位的寡核苷酸片段0如果形象地把只含一个核苷酸的片段称为6字母9的话 则含两个以上核苷酸的片段就成了6单词90将含有6个6字母9以上的所有6单词9双链测定其核苷酸序列 最后可把它们编成一部6词典90于是 两个菌株rRNA 的相似性就可通过查阅6词典9来作比较0比较和分析的具体方法有两种:一种是计算它们间的相似系数或缔合系数;另一种是序列印记法0
相似系数法:两个菌株的序列的相似系数S AB 可按下式计算:
S AB =2N AB /N A -N B
式中 N AB 是A ~B 两被测菌株所共同具有的6单词9的6字母9数 而N A 和N B 则是两株菌分别具有的6单词9的6字母9数0根据S AB 值进行数值分析 就可推知它们之间的亲缘关系0对所有菌株来讲 S AB 在1.O 到O.1之间0如果S AB 值是1.O 则两株菌完全相同 即使亲缘关系很远的两株菌 S AB 也不会等于零 因随机排列的序列总有相似处 所以S AB 最低为O.O S AB 值越高 两株菌的相似程度越大0将要比较的菌株S AB 值进行分类 可绘出各类群菌的树状谱 用来研究它们的进化关系0
序列印记法:以16S rRNA 的寡核苷酸序列特点作为分类指标将菌归类0它强调的是质的不同0而不象相似系数法那样强调量的不同 如果一群菌中所有菌种或其半数以上都具有一套寡核苦酸序列 而这些序列又未能在任何其他菌株发现 那么这群菌可归为一簇0这一套寡核苷酸序列就叫作这簇菌的序列印记0使用这一方法时 可采用短至三四个核苷酸片段的寡核苷酸0
序列印记法在研究菌种的进化关系上尤为重要0在很多情况下 有些菌种具有较快的进化速度 即较高的突变速率0这样就可能失去一些保守序列0为了准确分析它们的进化关系 需要用序列印记法对S AB 法进行补
充0序列印记法不仅可用于区别较低分类单位 而且也可用于对较高分类单位的鉴别0
2用16S PRNA 研究海洋微生物的系统进化关系
用16S rRNA 并结合限制性内切酶消化 获得的限制性片段长度多态性资料已广泛用于亲缘关系分析(Lauerre 1997;Brunel 1997;潭志远1998)0从7O 年代开始 Woese 和他的同事们用16S rRNA 寡核苷酸序列分析技术对4OO 多株原核生物和真核生物进行分析0依据16S rRNA 序列绘制的生命进化树 经过比较研究导致了古细菌界的建立0古细菌~真细菌和真核生物按相似系数各自成为一群 它们之间的相似系数只有O.1左右0古细菌主要包括在极端条件下生长的甲烷细菌~极端嗜盐菌和嗜热嗜酸菌 它们的细胞结构虽然与真细菌相似 但从生物化学和一些生物大分子结构上看 它们与原核生物的差异并不亚于它们与真核生物的差异0因而Woese 等认为 从系统发育来说 它们既不属于原核生物 也不属于真核生物 从而构成了新的古细菌界 即在生物进化史上不是原认为的两条进化路线的概念 而是按三条进化路线 分为古细菌~真细菌和真核生物三界进化而来0Woese 等(1991)基于进一步研究 建议将上述三界提为更高的分类单位 域(Domains )0Woese 的三域理论逐渐得到认同并得到了基因组研究结果的支持 1996年詹氏产甲烷球菌(MethanOLOL-L/sjannaLkzz )全部基因序列分析结果说明 甲烷球菌不同于任何已知细菌 表明了古生菌是一个独立的域016S rRNA 序列分析作为微生物分类系统的主要依据已得到了广泛认同 随着微生物核糖体数据库的日臻完善 该技术将成为研究细菌系统进化的一个有力工具0
16S rRNA 寡核昔酸序列分析法不仅发现和建立了古细菌界(域) 而且对一般真细菌之间的亲缘关系进行了比较深刻的揭示0Woese 等对大量的细菌和放线菌的菌株16S rRNA 寡核苷酸分析比较后 将整个真细菌分为1O 大组 革兰氏阳性菌属其中一组 或称为6门90革兰氏阳性细菌门下又分为两个亚门:一个亚门是以芽16第1期洪义国等:16S rRNA 在海洋微生物系统分子分类鉴定及分子检测中的应用
26海洋水产研究第23卷
孢杆菌及其相近菌株为代表的低十含量低于摩尔分数50%)的一类菌9包括乳杆菌属\链球菌属\利斯特氏菌属\环丝菌属\肉食杆菌属\肠球菌属\片球菌属\明串珠菌属等乳酸菌类群菌及梭状芽孢杆菌属等9此外尚有枝原体属也归入此亚门;另一亚门是十含量较高的革兰氏阳性菌G
生命起源于海洋9海洋中蕴涵着最丰富的生物类群G海洋微生物在海洋生态环境中具重要作用G由于海洋独特的生存环境9使海洋微生物具有与陆地微生物不同的进化关系G研究海洋微生物的系统进化关系9对于揭示生命进化过程\探索海洋生物资源具有重要的理论和现实意义G
3RNA在海洋微生物分子检测中的应用
海洋微生物中存在着大量的有害的病菌9尤其在海产品中的有害病菌对人类的健康危害很大G因此9建立简便\快速\高效的致病菌检测方法对于提高海产品质量9维护人类身体健康有重要的实际意义G由于rRNA 结构既具有保守性9又具有高变性9所以某一类微生物其16Sr RNA的结构具有其自身的特异性G依据其特异性为基础9对一些有害微生物进行鉴定9将为海产品的质量检测提供一种快速\有效的检测手段G 一些海洋致病菌的分离培养技术复杂或周期过长9利用16S rRNA序列分析这种非培养分析法可进行快速检测G如对于一些分支杆菌属的微生物9Arno1di等采用rRNA特异性探针通过原位杂交检测皮肤活检样本中的麻风分枝杆菌G国内外均有许多利用种属特异性16S rRNA序列引物PCR或探针杂交进行临床快速检测的研究报道9同利用其他基因序列进行检测相比9由于16S rRNA序列保守9因此假阳性率偏高G但在有些情况下16S rRNA序列PCR检测优于其他一些检测手段G Germani等对65名消化不良患者的胃组织活检样品进行分析9分别采用螺杆菌属Helicobactel)16S rRNA序列PCR\尿素酶试验\细菌分离培养和幽门螺杆菌H. pyloli)ureC/g m mo1/L基因序列PCR检测组织样品9并通过病理切片染色加以验证9结果表明16S rRNA序列PCR检测的特异性和敏感性均为100%9而生化分析和细菌培养的敏感性分别为86.4%和22.7%9幽门螺杆菌ureC/g m mo1/L基因序列PCR检测的特异性为100%9而敏感性为95.4%9这是由于少数患者感染的是螺杆菌属中的H.felis9而不是幽门螺杆菌G
3.合成特异性的探针检测有害海洋病菌
通过对海洋微生物16S rRNA的系统发育的研究9得到致病菌不同于其他菌的特异性的可变区保守序列G 按此序列设计引物9合成探针G探针的标记可通过酶学方法或化学修饰得以实现9根据标记物的性质又将探针分为放射性标记探针和非放射性标记探针G放射性标记探针一般用32P-ATP或32P-CTP标记9通过放射自显影即可检测G常用的非放射性标记探针有生物素-dUTP和地高辛-dUTP9可被非放射性标记物所取代目的选择特异的基因序列的细菌的16S rRNA可变区序列\编码毒素蛋白和编码特殊功能酶的基因片段G 选择作为探针的寡核苷酸序列的原则是:1)长度为18*30碱基的片段9过长所需的杂交时间长9合成量低9而过短特异性差G2)序列的十)含量范围是40%*60%摩尔分数)9高于此范围会增加非特异性杂交G3)其序列内不应存在自我互补区G4)序列内避免单一碱基的重复出现9如-GGGGGG-2G5)探针分子与非靶区域的同源性不能超过70%G目前最常用的是rRNA基因探针9原因之一是这些基因中含有保守程度不同的核苦酸区域9可作为鉴别不同分类单位的各级别种群的特异性探针;二是它们具有高拷贝数的优点9易于制备G
3.2RFLP分析检测有害海洋病菌
RFLP即是限制性片段长度多态性分析G从海洋环境中直接分离有害病菌的DNA9以细菌特异的引物扩增16S rRNA9构建质粒文库9用限制性内切酶消化获得16S rRNA基因型9用基因型的种类及频率对细菌进行鉴定吕志堂2000;李志岗2001)G
3.3PCR检测有害病原菌
细菌16S rRNA基因具有高度保守性9不同的科\种\属间的细菌16S rRNA基因的同源性达97%以上G
根据这一特性,可以设计针对某一类病原菌特异性的共同引物,以被检测的样品为模板,进行PCR 扩增,检测是否有病原菌的存在O 据报道该法检测细菌的最低浓度为0.3CFU /ml ,而细菌培养所需低细菌数为105CFU /ml O 严格的无菌操作,选择恰当的扩增循环次数,作好DNA 提取~扩增和产物分析的隔离以及一次性吸头的使用等各项措施,可提高检测的正确性和可靠性O
4结语
由于16S rRNA 序列的保守性和存在的普遍性,以及核酸序列本身的稳定性,序列分析的重现性极高,基于当今分析技术的改进,应用16S rRNA 作为分子指标,可以实现快速~微量~准确简便的对微生物进行分类鉴定O 分子分类正是在从研究的目的过度到研究的手段O 随着分子分类的理论和方法的日趋成熟,其已逐步成为微生物资源调查和环境生态研究的一种强有力工具O
参考文献
吕志堂,刘志横.2000.躺单胞菌16S rRNA 的PCR -RF P 分析.微生物学报,40(6):567*572
李志岗,杨官品,等.2001.水环境细菌16S rRNA 限制性片段长度多态性及群落结构分析.水生生物学报,25(2):111*114
陈文新.1998.细菌系统发育.微生物学报,38(3):240
谭志远,陈文新.1998.根瘤菌新类群的全细胞蛋白电泳及16S rRNA 全序列分析.应用与环境生物学报,4:65*69
Brunel B .,Givaudan A .et al ..1997.Fast and accurate identification of Xenorhabdus and Photorhabdus species by restriction analysis of PCR -am-plified 16S rRNA gene .Appl .Enui n . ic i l .,63:574*580
Delong E .F .et al ..1982.Phylogenetic stains :ribosomal RNA -base for the identification single cells .Science ,243:1360*1363
Gray M .W .et al ..1984.On the evolutionary desent of organelles :a global phylogeny based on a higly conserved structural core in small subunit ribosomal RNA .N cleic .Acid .Res .,12(14):5837*5851
Kurabachew M .et al ..1998.Reverse transcription -PCR detection of Mycobacterium leprase in clinical specimens .J .Clin . ic i l .,36:1352*1356
aguerre G .,Allard M .R .et al ..1997.Rapid identification of rhizobia by 16S rRNA gene analysis :Confirmation of novel taxa .Appl .Enui n . ic i l .,63:63*70
Maidak B .et al ..1999.A new version of the RDP (Ribosome Database Project ).N cleic .Acid .Res .,27:171*178
Robina B .S .,Shewan J .M ..1968.The present status of some aspect of marine microbiology .Adu .Bi l .,95*126
Van de Peer Y .et al ..1997.Database on the structure of small ribosomal subunit RNA .N cleic .Acids .Res .,25:111*124
36第1期洪义国等:16S rRNA 在海洋微生物系统分子分类鉴定及分子检测中的应用
16S rRNA在海洋微生物系统分子分类鉴定及分子检测中的应用
作者：洪义国， 孙谧， 张云波， 李勃生
作者单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所,青岛,266071
刊名：
海洋水产研究
英文刊名：MARINE FISHERIES RESEARCH
年，卷(期)：2002,23(1)
被引用次数：50次
参考文献(12条)
1.吕志堂;刘志横躺单胞菌16S rRNA的PCR-RFLP分析[期刊论文]-微生物学报 2000(06)
2.李志岗;杨官品水环境细菌16S rDNA限制性片段长度多型性及群落结构分析[期刊论文]-水生生物学报 2001(02)
3.陈文新细菌系统发育 1998(03)
4.谭志远;陈文新根瘤菌新类群的全细胞蛋白电泳及16S rRNA全序列分析[期刊论文]-应用与环境生物学报 1998
5.Brunel B;Givaudan A Fast and accurate identification of Xenorhabdus and Photorhabdus species by restriction analysis of PCR-amplified 16S rRNA gene[外文期刊] 1997(2)
6.Delong E F Phylogenetic stains:ribosomal RNA-base for the identification single cells 1982
7.Gray M W On the evolutionary desent of organelles:a global phylogeny based on a higly conserved structural core in small subunit ribosomal RNA 1984(14)
8.Kurabachew M Reverse transcription-PCR detection of Mycobacterium leprase in clinical specimens 1998
https://www.doczj.com/doc/a480454.html,guerre G;Allard M R Rapid identification of rhizobia by 16S rRNA gene analysis:Confirmation of novel taxa 1997
10.Maidak BL A new version of the RDP(Ribosome Database Project) 1999(27)
11.Robina B S;Shewan J M The present status of some aspect of marine microbiology 1968
12.Van de Peer Y Database on the structure of small ribosomal subunit RNA[外文期刊] 1997(1)
引证文献(50条)
1.张姝.张芳.刘媛.崔朝霞我国海域两种大型水母的分子鉴定[期刊论文]-海洋与湖沼 2009(1)
2.付晓艳.霍贵成利用16S rDNA部分序列聚类分析鉴定乳球菌[期刊论文]-中国乳品工业 2005(8)
3.丁君.李娇.王姮.王美庆.常亚青.丁丽利用16s rDNA方法检测刺参消化道细菌种类[期刊论文]-海洋环境科学2010(2)
4.贾晶.张小葵.郑凯.罗静海.杜宗军一株土壤琼胶降解菌QM64的16S rDNA序列分析[期刊论文]-湖北农业科学
2009(8)
5.刘文强.贾玉萍.赵宏坤16 S rRNA在细菌分类鉴定研究中的应用[期刊论文]-动物医学进展 2006(11)
6.付乔芳.邱军强.胡鲲.杨先乐.安健嗜水气单胞菌国内分离株的毒力因子分布与致病性相关性分析[期刊论文]-生物学杂志 2011(6)
7.付乔芳.邱军强.胡鲲.杨先乐.安健嗜水气单胞菌毒力基因在传代过程中的稳定性研究[期刊论文]-生物技术通报2011(9)
8.吴卿.赵新华应用PCR-DGGE研究饮用水中微生物的多样性[期刊论文]-南开大学学报（自然科学版） 2007(3)
9.罗俊成.胡佳.马莉.张宿义.张文学.沈才洪.胡承酒醅中芽孢杆属细菌的16S rDNA全序列系统学分析[期刊论文]-酿
酒科技 2007(2)
10.宋兵.李友发.林智敏.陈彬.郑伟文稻田固氮细菌分离物的PCR-DGGE及其序列同源性分析[期刊论文]-福建农业学报 2007(4)
11.张世秀.张新中.谢珍玉.周永灿PCR技术在水产养殖动物细菌性病原检测中的应用[期刊论文]-现代渔业信息
2006(7)
12.QING WU.XIN-HUA ZHAO.SHENG-YUE ZHAO Application of PCR-DGGE in Research of Bacterial Diversity in Drinking Water[期刊论文]-生物医学与环境科学（英文版） 2006(5)
13.仲禾.刘星.高祥刚.李云峰.赫崇波16S rRNA检测技术及其在水产增养殖中的应用[期刊论文]-水产科学 2009(4)
14.张婷.曲凌云.祝茜一株海洋细菌HZBN43的鉴定[期刊论文]-农业科学与技术(英文版) 2008(5)
15.张婷.曲凌云.祝茜一株海洋细菌HZBN43的鉴定[期刊论文]-安徽农业科学 2008(33)
16.李皎.杨国武.汪大敏.王琰.毛勇.邓媛β－环状糊精葡萄糖基转移酶发酵染菌的 分离和16srDNA分析[期刊论文]-中国食品添加剂 2011(3)
17.杨霞.陈陆.常洪涛.刘红英.杨影影.符峰.王川庆乳酸粪肠球菌的分离鉴定与系统进化分析[期刊论文]-中国农学通报 2009(10)
18.闵怀.黄备.刘小宇.许强芝.唐静亮.胡颢琰.王婕妤一株海洋细菌MZ0306A1的16S rDNA扩增及序列分析[期刊论文]-海洋科学 2008(10)
19.王凤兰.王晓东分子微生物生态学技术在中国油田开发中的应用[期刊论文]-应用与环境生物学报 2007(4)
20.曹波.杨红.许强华.刘榕磊基于16SrRNA技术的长江口微生物分子生物学鉴定与分析[期刊论文]-上海海洋大学学报 2011(2)
21.刘长远.赵奎华.傅俊范.苗则彦.梁春浩.王辉.王平黄瓜细菌性白枯病菌系统进化分析及PCR检测方法的建立[期刊论文]-沈阳农业大学学报 2009(4)
22.臧红梅.樊景凤.王斌.周一兵海洋微生物多样性的研究进展[期刊论文]-海洋环境科学 2006(3)
23.押辉远.易力.周胜利.张祥胜南阳油污土壤微环境分析及石油降解菌筛选[期刊论文]-湖北农业科学 2011(6)
24.荣光.王东劲.周汉林.侯冠彧.黄显州16S rRNA在兽医病原菌分类鉴定中的应用[期刊论文]-热带农业科学
2009(10)
25.杨秀霞南极细菌Moritella sp.低温脂肪酶基因的克隆与表达[学位论文]博士 2004
26.于学辉.程安春.王远微.王英.杨晓农规模化养鸭场鸭源大肠杆菌分离株的致病性及系统发育分析[期刊论文]-中国预防兽医学报 2011(12)
27.陈静交替假单胞菌（Pseudoalteromonas）CHS菌株产碱性蛋白酶的研究[学位论文]硕士 2005
28.刘年锋16S rDNA技术及在水产养殖细菌分析中的应用前景[期刊论文]-现代渔业信息 2004(12)
29.戴若曦.陈曦.冯希平研究口源性口臭患者舌背细菌的方法和进展[期刊论文]-口腔医学研究 2011(3)
30.李江.林学政.沈继红.王能飞.李光友南极放线菌NJ-F2萃取物的抗菌活性初步研究[期刊论文]-海洋科学进展2009(4)
31.衣丹.姜伟.林学政.石红旗.刘大磊16S rDNA技术在近海环境监测中的应用[期刊论文]-海岸工程 2005(4)
32.李斌一品红叶斑病病原学及其拮抗细菌的研究[学位论文]博士 2005
33.杨霞.陈陆.王川庆16S rRNA基因序列分析技术在细菌分类中应用的研究进展[期刊论文]-西北农林科技大学学报（自然科学版） 2008(2)
34.王慧杰.杨向科.马爱民rRNA同源性分析方法在微生物分类中的应用[期刊论文]-河南农业科学 2007(5)
35.李江.陈靠山.李莹玉.刘少芳.李光友南极细菌Pseudoalteromomas sp.S-15-13的分子鉴定及其胞外多糖促进小鼠脾淋巴细胞转化的作用[期刊论文]-中国海洋药物 2006(1)
36.张春辉.赵树欣.梁慧珍高温大曲中细菌总DNA提取方法比较[期刊论文]-酿酒科技 2008(10)
37.甄毓.于志刚.米铁柱分子生物学在微藻分类研究中的应用[期刊论文]-中国海洋大学学报（自然科学版） 2006(6)
38.王荻.李绍戊.刘红柏.尹家胜.卢彤岩东北三省9株嗜水气单胞菌16S rDNA序列比较研究[期刊论文]-水产学杂志2010(2)
39.包木太.肖生科.孔祥平.郭省学.李希明.李阳.王修林16S rRNA基因技术在油藏微生物生态研究中的应用[期刊论文]-应用基础与工程科学学报 2007(3)
40.ZHANG Shu.李喜莲.CUI Zhao-xia.王鸿霞.WANG Chun-lin.刘小林线粒体基因片段在梭子蟹系统发育及物种鉴定中的应用[期刊论文]-海洋科学 2008(4)
41.张世秀.张新中.谢珍玉.周永灿分子生物学技术在水产养殖动物细菌性病原检测中的应用[期刊论文]-海南大学学报（自然科学版） 2007(1)
42.张杰.康冀川.吴兴亮灵芝属分子系统学研究进展[期刊论文]-贵州科学 2006(2)
43.杨瑞先利用16S rDNA序列分析鉴定油菜内生细菌研究[学位论文]硕士 2005
44.季天荣.陈庄DGGE技术优化及其在肠道微生态研究中的应用[期刊论文]-广东农业科学 2008(6)
45.杨妤中国东海枯草芽孢杆菌321122的鉴定、发酵及其次级代谢产物的研究[学位论文]硕士 2006
46.汪安云.张玉玲.黄琼.祝明亮.柴家荣.林国平白肋烟自然调制期间优势菌株的分类鉴定[期刊论文]-甘肃农业大学学报 2009(2)
47.乌日娜.张和平.孟和毕力格酸马奶中乳杆菌Lb.casei.Zhang和ZL12-1的16S rDNA基因序列及聚类分析[期刊论文]-中国乳品工业 2005(6)
48.张新中.张世秀.李海平.谢珍玉.周永灿海水养殖动物致病性(Pathogenicity)鳗弧菌(Vibro anguillarum)的研究综述[期刊论文]-现代渔业信息 2007(1)
49.李斌一品红叶斑病病原学及其拮抗细菌的研究[学位论文]博士 2005
50.杨向科海洋细菌S-12-86的多相分类鉴定及其所产溶菌酶的性质和应用[学位论文]硕士 2005
本文链接：https://www.doczj.com/doc/a480454.html,/Periodical_hyscyj200201011.aspx
微生物常规鉴定技术 一、形态结构和培养特性观察 １、微生物的形态结构观察主要是通过染色，在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。 ２、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。，以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要容。 １）细菌的培养特征包括以下容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况。 ２）霉菌酵母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落。
革兰氏染色: 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。 该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色步骤： （1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。 （2）晾干：与简单染色法相同。 （3）固定，与简单染色法相同 （4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1分钟。 （5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。 （6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。 （7）水洗：用水洗去碘液。 （8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立即水洗。 （9）复染：滴加蕃红复染5min。 （10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。 （11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。 （12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。 （13）实验完毕后的处理： ①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦 去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。c.再用干净的擦镜纸将 镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。 ②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干
A B C D 高鹃 新版GMP 与快速微生物检测鉴定技术新版GMP 与 快速微生物检测鉴定技术 3.快速鉴定技术 4.法规与药典要求 第一部分引言无菌药品生产要求的大幅度提高 新版GMP 无菌药品附录 以上各级别空气悬浮粒子的标准规定如下表： 洁净度级别 悬浮粒子最大允许数静态 ≥0.5μm ≥5.0μm A 级(1) 352020B 级352029C 级3520002900D 级 3520000 29000 洁净级别 浮游菌cfu/m 3 沉降菌（φ90mm ）cfu /4小时 表面微生物 接触cfu /碟（φ55m m ） 5指手套cfu /手套A 级<1<1<1<1B 级10555C 级1005025 － D 级 200 100 50－ 洁净区微生物监测的动态标准 工业工程技术要求隔离装置隔离器Rabs RTP 公用工程 水系统空调系统氮气压缩 空气真空传送系统动态环境监测系统粒子监测沉降菌浮游菌
动态环境监测带来的新课题 １、大量数据的管理和分析 ２、面对细菌培养阳性结果发生争执 是生产管理方面的问题？ 是QC 的OOS ？３、细菌培养阳性结果的后续处理明确what where who how 革兰氏染色无法判定 无菌药品生产要求的大幅度提高 未污染 ？ 无菌药品生产要求的大幅度提高 无菌药品附录： 产品的无菌或其它质量特性绝不能只依赖 于任何形式的最终处理或成品检验（包括无菌检查）。 微生物检测技术的飞跃发展 快速检测技术（不需进行培养PAT ）快速鉴定技术（属种株）为无菌药品生产和质量管理提供了先进技术手段及时发现污染，追溯污染源 案例： 爱吃桔子的员工 一直难以去除的革兰氏阳性短棒状菌燃烧麦秸杆与无菌药品生产车间
微生物鉴定与药敏试验流程 1、实验原理 （1）微生物鉴定原理 微生物鉴定卡中含有几十种生化反应培养基，当微生物在培养基中代谢基质时导致pH值的改变而使指示剂发生变化；同时微生物生长产生各种酶，可与相应的荧光标记底物发生反应，使荧光强度发生改变。仪器通过检测这些变化得到待检微生物的生化特征，自动与数据库内几千种菌株的生化参数进行比对分析，并自动计算得出鉴定结果。 （2）药敏分析系统工作原理 药敏分析系统使用药敏测试板（卡）进行测试。将抗生素微量稀释在条孔或条板中，加入菌悬液孵育后放入仪器或在仪器中直接孵育，仪器每隔一定时间自动测定细菌生长的浊度，或测定培养基中荧光指示剂的强度或荧光原性物质的水解，观察细菌的生长情况。得出待检菌在各药物浓度的生长斜率，经回归分析得到最低抑菌浓度MIC值。 2、实验步骤 （1）取洁净菌液管，加3mL 0.45%的无菌盐水，将纯培养的待检菌配制成浓度为0.5~0.63麦氏单位的菌悬液，将菌液管放入带芯片的专用试管架，在紧挨待检菌液管的位置放入一空的菌液管（供药敏试验用）。 （2）打开检验信息录入工作站电源，仪器自检完毕后按F2键，仪器进入操作程序。将试管架放入工作站，芯片中的数据自动清零。 （3）手工输入待检菌样品编号，扫描输入鉴定卡和药敏卡的ID号，将鉴定卡和药敏卡放入相应的槽位，进样管插入相应的菌液管中。取下试管架，关闭工作站电源。 （4）打开鉴定仪，仪器自检完毕后自动进入检测程序，按要求设定好参数。（5）进样指示灯为绿色长亮时，打开进样盖，将试管架放到传送船上，关好进样盖。仪器自动检测并读取样品信息，自动完成稀释、进样、封口程序，并将卡片送入孵育监测单元。传送船回到进样口，指示灯闪烁时，取出试管架。 （6）由计算机控制的读数器定时对卡片进行扫描并读数，动态记录反应变化。一旦卡内的终点指示孔达到临界值，则表示整个实验已完成。 （7）微生物鉴定及药敏分析完成后，检测数据自动传入数据管理系统进行计算分析，结果经人工确认后即可打印报告。 1
全自动微生物鉴定/药敏系统VITEK 2 COMPACT 30 1、设备的主要用途、功能及特点 该系统为完整的全自动细菌鉴定和药敏分析系统,细菌鉴定采用生化反应数码鉴定原理。可以以最少的实验人员及最短的准备和处理时间，提供最准确的测定结果。数据库应涵盖革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、芽胞菌、酵母菌、奈瑟氏菌及嗜血杆菌、厌氧菌；必需有生物反恐菌的鉴定能力（鼠疫杆菌、霍乱弧菌、吐拉菌等） 2、技术参数及指标 ①系统组成：电脑主机为国际知名品牌原装PC；另有比浊仪、充填系统、读数 孵育系统、数据处理系统、废弃物收集系统、打印机等； ②检测原理：采用生化反应数码鉴定原理，结合终点法、阈值法、特别是动态 分析法的检测原理，24小时连续自动检测，并时时出报告； ③充填处理量：每批可同时填充10个试剂卡。 ④充填方式:：利用真空原理进行试剂卡的填充。 ⑤菌液用量：3ml。 ⑥试卡密封方式：自动热切割掉试剂卡上的菌液传送小管，进行密封。 ⑦鉴定速度：每15分钟对同一卡片进行1次光学检测。细菌5小时内鉴定率达95%， 一般3-5小时，酵母菌≤18小时，芽孢菌≤14小时。 ⑧鉴定准确率：90% 的试验将报告单一的鉴定结果。 ⑨鉴定范围：鉴定细菌种类齐全，含概革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母菌、芽孢 菌、奈瑟氏菌嗜血菌弯曲菌、厌氧菌，要求≥550种菌。 ⑩药敏功能：平均药敏检测时间7小时，专家规则同时符合美国CLSI、德国DIN、法国AFNOR标准。 ?自动化程序：自动接种、全封闭实验板、自动培养及判读、打印结果、自动收集废弃物。 ?试卡设计：试卡上有64微孔，内含有鉴定或药敏所用的生化或抗生素干燥底物； 实验过程中除需要从厂家购买鉴定卡和药敏卡之外无其他专用附加试剂和耗材，可
微生物自动化鉴定系统的工作原理 微生物鉴定的自动化技术近十几年得到了快速发展。数码分类技术集数学、计算机、信息及自动化分析为一体，采用商品化和标准化的配 套鉴定和抗菌药物敏感试验卡或条板，可快速准确地对临床数百种常见分离菌进行自动分析鉴定和药敏试验。目前自动化微生物鉴定和药 敏分析系统已在世界范围内临床实验室中广泛应用。 一、微生物数码鉴定法 早在七十年代中期，一些国外公司就研究出借助生物信息编码鉴定细菌的新方法。这些技术的应用，为医学微生物检验工作 提供了一个简便、科学的细菌鉴定程序，大大提高了细菌鉴定的准确性。目前，微生物编码鉴定技术已经得到普遍应用，并早已商品化和 形成独特的不同细菌鉴定系统。如、、、和等系统。这种鉴定系统是自动化鉴定系统的基础。 ( 一)数码鉴定法基本原理 数码鉴定是指通过数学的编码技术将细菌的生化反应模式转换成数学模式，给每种细菌的反应模式赋予一组数码，建立数据库或编成检索 本。通过对未知菌进行有关生化试验并将生化反应结果转换成数字（编码），查阅检索本或数据库，得到细菌名称。其基本原理是计算并 比较数据库内每个细菌条目对系统中每个生化反应出现的频率总和。随着电脑技术的进步，这一过程已变得非常容易。 1．简要介绍计算步骤： (1)出现频率（概率）的计算：将记录成阳性或阴性结果转换成出现频率：①对阳性特征，则除以100即得。②对阴性特征，除以1
00的商被1减去即可。③说明：对“0”和“100”，因这2个数太超量，为了使结果不出现过小或过大，而用相似值0.01或0 .99值代替。 (2)在每一个分类单位中，将所有测定项目的出现频率相乘，得出总出现频率。 (3)在每个分类菌群中的所有菌的总出现频率相加，除以一个分类单位的总出现频率，乘100，即得鉴定%（） (4)在每个菌群中，再按值大小顺序重新排列。将未知菌单次总发生频率除以最典型反应模式单次总发生频率，得到模式频率T 值，代表个体与总体的近似值。T值越接近1，个体与总体越接近，鉴定价值越大。按大小排序，将相邻两项的之比为R， 代表着首选条目与次选条目的差距，差距越大，价值越大。如果≥80，参考T及R值可作出鉴定。 2．在编码检索本中检索数据谱得出的结果有以下几种形式（以鉴定系统为例）。 (1)有此数码谱:①有一个或几个菌名条目及相应的鉴定值（和T值）。②对鉴定结果好坏的评价，最佳……等。 ③用小括号列出关键的生化结果及阳性百分率。④有时，鉴定结果不佳或有多条菌名条目,需进一步补充试验项目才能得出良好的鉴定结 果。⑤指出某些注意要点，需用“推测性鉴定”，并将此菌送至参考实验室；需用“血清学鉴定”，作进一步的证实等。 (2)无此数码谱：可能有以下原因：①此生化谱太不典型。②不能接受，鉴定值低(＜80.0)。③可疑。需进一步确认是否 纯培养，重新鉴定，可与供应商技术服务部联系。 3. 结果解释
竭诚为您提供优质文档/双击可除医学检验微生物实习自我鉴定 篇一：检验科细菌室实习小结 检验科细菌室实习小结 1、检验科细菌室实习小结 细菌是的工作中，无菌操作很重要，不管是在细菌接种、鉴定还是药敏的时候，必须严格进行规范操作，否则将导致交叉污染，同时无菌操作也能更好的保护好自己。 在实习和工作中一定要将理论联系实际，要善于思考，在观察菌落形态和细菌镜下形态时更应仔细认真，临床微生物的工作是一个经验积累的过程，要想成为一名优秀的检验医师，今后在微生物方面的学习中还得加倍努力。 在细菌室实习生活结束之际，我要特别感谢细菌室的每一位老师，感谢他们耐心、和蔼的教导，是他们严谨、一丝不苟的科学态度教育了我，是他们团结协作、融洽的工作气氛感染了我。他们循循善诱给我讲解，他们耐心规范了我的操作，他们给予我很大的信任与鼓励，放手让我操作。而我能做的是在今后的学习和工作中带着一颗感恩的心认真负
责地工作，培养高尚的职业道德、严肃的科学态度和一丝不苟的工作作风，使自己成为一名合格的检验专业的的优秀人员。 祝福细菌室每一位老师工作顺利、阖家幸福。 2、检验科细菌室实习小结 还记得，实习第一天的时候，老师就说，在细菌室，这短短的两个月时间是远远不够的。确实啊，我的细菌室实习是暂时告一段落了，但在微生物的学习之路还是很长的。现在我们所学到的仅仅只是入门啊！ 在实习和工作中一定要将理论联系实际，要善于思考，要严谨对待，临床微生物的工作即是一个不断积累经验的过程也是一个要随时更新知识的过程。要想成为一名合格的检验医师，今后在微生物方面的学习中还得加倍努力。 在细菌室实习生活结束之际，我要特别感谢细菌室的每一位老师，感谢他们耐心、和蔼而又严厉的教导，是他们严谨、一丝不苟的科学态度教育了我，是他们团结协作、融洽的工作气氛感染了我。他们循循善诱给我讲解，他们耐心规范了我的操作，他们给予我 很大的信任与鼓励，放手让我操作。也很谢谢你们包容我的错误，并给予我改正错误的机会，而我能做的是在今后的学习和工作中更认真负责地工作，培养高尚的职业道德、严肃的科学态度和一丝不苟的工作作风，使自己成为一名合
第三节微生物的分类鉴定方法 一、微生物鉴定的依据 获得纯化的微生物分离菌株后，首先判定是原核微生物还是真核微生物，这实际上在分离过程中所使用的方法和选择性培养基已经决定了分离菌株的大类的归属，从平板菌落的特征和液体培养的性状都可加以判定。然后，如是原核微生物，便可根据表14-3 所示的经典分类鉴定指标进行鉴定，如条件允许，可做碳源利用的BIOLOG-GN 分析和16S rDNA 序列分析。多项结果结合起来确定分离菌株的属和种。 表14-3 微生物经典分类鉴定方法的指标依据 二、微生物鉴定的技术与方法 根据目前微生物分类学中使用的技术和方法，可把它们分成四个不同的水平：①细胞形态和行为水平，②细胞组分水平，③蛋白质水平，④基因组水平； 在微生物分类学发展的早期，主要的分类鉴定指标是以在细胞形态和习性为主，可称为经典的分类鉴定法。其他三种实验技术主要是60 年代以后采用的，称为化学分类和遗传学分类法，这些方法再加上数值分类鉴定法，可称为现代的分类鉴定方法。 （一）、经典分类鉴定法 经典分类法是一百多年来进行微生物分类的传统方法。其特点是人为地选择几种形态生理生化特征进行分类，并在分类中将表型特征分为主、次。一般在科以上分类单位以形态特征、科以下分类单位以形态结合生理生化特征加以区分。最后，采用双歧法整理实验结果，排列一个个的分类单元，形成双歧检索表（图14-4 ）。 A. 能在60 o C 以上生长 B. 细胞大，宽度1.3~1.8mm ……………………………………… 1. 热微菌属 ( Thermomicrobium )
BB. 细胞小，宽度0.4~0.8mm C. 能以葡萄糖为碳源生长 D. 能在pH4.5 生长…………………………………………… 2. 热酸菌属 ( Acidothermus ) DD. 不能在pH4.5 生长………………………………………………… 3. 栖热菌属 ( Thermus ) CC. 不能以葡萄糖为唯一碳源……………………… 4. 栖热嗜油菌属( 栖热嗜狮菌属Thermoleophilum ) AA. 不能在60 o C 以上生长 图14-4 双歧法检索表例样 应用BIOLOG-GN 仪检测分离菌株对众多碳源的利用情况判断分离菌株的分类地位，近年来也时有应用。在BIOLOG-GN 仪上有96 个小孔，其中95 孔内分装有95 种不同碳源的缓冲液，1 孔为无碳源的缓冲液对照，各孔接入适宜菌浓度和液量的分离菌株培养物，定温培养，每日定时读取BIOLOG-GN 仪计算机上各碳源利用情况，一般为时1 周，BIOLOG-GN 仪可显示出该鉴定菌株的最可能归属。 （二）、数值分类法 又称阿德逊氏分类法() 。它的特点是根据较多的特征进行分类，一般为50 ～60 个，多者可达100 个以上，在分类上，每一个特性的地位都是均等重要。通常是以形态、生理生化特征，对环境的反应和忍受性以及生态特性为依据。最后，将所测菌株两两进行比较，并借用电子计算机计算出菌株间的总相似值，列出相似值矩阵( 图14-5) 。为便于观察，应将矩阵重新安排，使相似度高的菌株列在一起，然后将矩阵图转换成树状谱(dendrogram)( 图14-6) ，再结合主观上的判断( 如划分类似程度大于85 ％者为同种，大于65 ％者为同属等) ，排列出—个个分类群。 图14-5 显示6 个细菌菌株的遗传相似矩阵图
Biolog微生物鉴定步骤 一检测原理 Biolog微生物鉴定系统测试的是微生物在鉴定板中利用或氧化化和物的能力。测试会产生特征性的紫色孔模式，组成代谢指纹。所有必需的营养物质和生化试剂都预先加进96孔板中，四唑紫是一种氧化还原染料，指示碳源的利用情况。.鉴定步骤非常简单，纯化分离到的菌株经扩大培养，再制成接种液加到鉴定板中。在培养过程中，一些孔中的化学物质能被氧化并将显色物质成紫色，对照孔（A-1）和阴性孔仍然为无色。鉴定板在相应的培养条件下培养4-6小时或16-24小时即可形成代谢模式。系统软件自动和数据库对比，如果能找到合适的匹配，就可以得出一个鉴定结果。 二所需器材和消耗品： 培养基、接种液、巯基乙酸钠、长棉签、接种棒、储液槽、八道移液器、移液器头、浊度仪、浊度标准品、控温培养箱和相应的鉴定板。其中接种液自行配制，接种棒、储液槽可选用国产品牌代替。 三鉴定步骤：
第一步： 在用户自己的培养基上纯化菌株，如果菌株为冻干或冷冻样品，需要传代培养2-3代，让菌株恢复活力。 对纯化好的菌株做革兰氏染色，确定菌株是革兰氏阴性还是阳性。观察菌落外部形态或用显微镜观察菌株形态，确定是酵母还是丝状真菌，是球菌还是杆菌。 如果是革兰氏阴性菌，还需要最终确认是肠道菌、非肠道菌或苛生菌。方法是，氧化酶阳性或氧化酶阴性但三糖铁实验为K/K或K/A w，则该菌株为非肠道菌(GN-NENT)，氧化酶阴性以及三糖铁实验为A/A或K/A，则该菌株为肠道菌(GN-ENT)。如果菌株①需要在巧克力培养基上或需要6.5% CO2培养，②在BUG+B培养基上生长非
常差，形成针尖大小的菌落，那么可以认为这些菌是苛生菌(GN-FAS)。大多数苛生菌都是从哺乳动物的呼吸道里分离出来的，如Actinobacillus, Alysiella, Brucella, Capnocytophaga, CDC Group DF-3, CDC Group EF-4, Eikenella, Haemophilus, Kingella, Moraxella, Neisseria, Simonsiella, Suttonella,和Taylorella。 如果是革兰氏阳性菌，用革兰氏染色可以很容易的区分球菌和杆菌，推荐再做一个过氧化氢酶实验，最终确定是球菌还是杆菌。通过革兰氏染色或观察菌落形态可以区分出芽孢杆菌。 微生物的扩大培养应该用Biolog推荐的培养基和培养条件，以便使微生物达到最佳的代谢活性，进而准确的和数据库中的代谢模式匹配。 微生物应该是新鲜的，确保其处于指数增长期，因为一些菌株在达到稳定期时会失去生存能力或代谢活性，推荐的培养周期为4-24个小时。 如果扩大培养的量不足以配制相应的浊度，可以培养多个平板，培养时间可以延长到48个小时。 第二步： 首先确定浊度仪没开启电源的时候，指针应指在0%，如果没有，用螺丝刀调整。开启电源，取未开盖的装有接种液的试管，擦干净管壁，放入浊度仪，指针应指在100%，如果没有，旋动右方旋钮。然后用浊度标准管检验，读数在±2%都是正常的。要使用哪管接种液，就用相应的试管做100%校正，不要在浊度仪的光路中旋转试管。 在鉴定革兰氏阴性肠道菌和苛生菌的时候，在接种液里应该加准确三滴巯基乙酸钠。巯基乙酸钠的作用是抑制芽孢形成，并且可以部分或完全的抑制A-1或其它孔由于微生物利用自身分泌的聚多糖荚膜而出现的紫色。一些非肠道菌液需要添加巯基乙酸钠。 按照下列步骤制备均匀的菌悬液：用接种液将棉签稍微浸湿，用棉签在菌落上面轻轻的滚动可以将菌落取到接种液中，从而不会将培养基或其它营养物质带入接种液。先取单菌落，不够再取生长紧密的菌落。在试管内壁接种液液面的上方，旋转挤压棉签可以将菌落团分散。然后上下移动棉签，将分散的菌落和接种液充分混合形成均一，无菌团的菌悬液。如果菌悬液有菌团，可以让菌团沉到管底。 调整浊度直至达到允许的范围，增加接种液或添加菌落可以降低或升高菌悬液的密度。 将菌悬液接种到鉴定板上，不要超过20分钟。如果长时间部接种到鉴定板上，一些菌会失去代谢活性。 第三步： 将鉴定板编上相应的号码。把菌悬液倒入储液槽，不要全部倒入，因为试管底部可能有未分散的菌团。按照不同的鉴定板所需的加样量进行移液器的程序选择，将移液器头安放到移液器上，必要时可以用手加固，以免
第十章微生物的分类与鉴定 一、选择题 1.真菌的分类单元-门的词尾为（A ） 2.A、–mycota B、–mycetes C、–mycotina D、-mycetidae 3.下列传统分类指标中始终被用作微生物分类和鉴定的重要依据的是（A ） 4.A、形态学特征 B、生理特征 C、生态学特征 D、分子生物学特征 5.下列拉丁文哪个书写格式正确（ C ） 6.A、Fusarium oxysporium B、Aspergillus japonicus Saito 7. C、Bacillus amyloliquefaciens D、Clostridium Kluyveri 8.1978年，根据16S rRNA和18S rRNA的碱基序列将生物分为“三域”的科 学家是（D ） 9.A、Ainsworth B、Bergey C、Leedale D、Woese 10.1995年，Ainsworth分类系统把菌物列入真核生物域，将其分为3个界， 下面哪项不属于其中（ D ） 11.A、原生动物界 B、假菌界 C、真菌界 D、菌物界 12.有关菌株的说法，下列哪项说法不对（ B ） 13.A、菌株强调的是遗传型纯的谱系 B、菌株的名称不可随意确定 14.C、菌株与克隆相同，为一个物种内遗传多态性的客观反映 15.D、菌株实际上是某一微生物达到遗传型纯的标志， 二、是非题 1．微生物的种是微生物分类的基本单元，但是目前还没有一个公认的、明确的定义。（√） 2．两个微生物菌株具有相同G+C含量表明它们之间的亲缘关系一定很相近。（×）
3．亚种是进一步细分种时所用的单元，一般指除某一明显而稳定的特征外，其余鉴定特征都与模式种相同的种，其命名方法按“三名法”处 理。（√） 4．变种是亚种的同义词，在《国际细菌命名法规》中不主张使用。（√）5．在微生物分类中，DNA（G+C）mol%的比较只能做否定判断。（√）6．微生物DNA之间的同源性越高，说明它们之间亲缘关系就越近，反之亦然。（×） 7．菌株是一个物种内遗传多态性的客观反应，是遗传型纯的谱系，其名称可以随意确定。（√） 8．模式菌株是一个种的具体活标本。（√） 9．据科学家1992年估计，地球上生存的菌物约有150万种。（√）10．微生物自动化鉴定技术一般都是利用微生物的生理生化反应特性而设计的。（√） 11．细菌分子鉴定常用16S rRNA序列分析，而真菌分子鉴定常用ITS序列分析。（√） 12．所谓“模式菌株”通常是指一个细菌的种内最具代表性的菌株。（×）13．对微生物生理生化特征的比较也是对微生物基因组的间接比较，加上测定生理生化特征比直接分析基因组要容易得多，因此生理生化特征对于微生物的系统分类仍然是有意义的。（√） 14．现代微生物分类中，任何能稳定地反映微生物种类特征的资料，都有分类学意义，都可以作为分类鉴定的依据。（×） 15．DNA-DNA杂交主要用于种、属水平上的分类研究，而进行亲缘关系更远(属以上等级)分类单元的比较，则需进行DNA-rRNA杂交。（√）
9204
微生物鉴定指导原则
本指导原则为非无菌产品微生物限度控制菌检查中疑似菌的鉴定， 以及药物 原料、辅料、制药用水、生产环境、中间体和终产品中检出微生物的鉴定提供指 导。当微生物的鉴定结果有争议时，以《伯杰氏系统细菌学手册》 (《Bergey， s Manual of Systematic Bacteriology》)现行版的鉴定结果为准。 微生物鉴定是指借助现有的分类系统，通过对未知微生物的特征测定，对其 进行细菌、酵母菌和霉菌大类的区分，或属、种及菌株水平确定的过程，它是药 品微生物检验中的重要环节， 药典附录相应章节中对检出微生物的鉴定做了明确 规定，如“非无菌产品的微生物检查:控制菌检查” （通则 1106）中选择培养 基或指示培养基上发现的疑似菌落需进行鉴定； 对“无菌检查法” （通则 1101） 的阳性实验结果中分离的微生物进行鉴定，以判定试验是否重试；药品洁净实验 室微生物监测和控制指导原则（通则 9203）建议对洁净室和其他受控环境分离 到的微生物进行鉴定，以掌握环境微生物污染情况，有助于污染调查。此外，在 药品生产中，有时亦需对药物原料、辅料、制药用水、生产环境、中间产物和终 产品中检出的微生物进行适当水平的鉴定。 微生物鉴定需达到的水平视情况而定，包括种、属鉴定和菌株分型。大多数 非无菌药品生产过程和部分无菌生产环境的风险评估中， 对所检出微生物的常规 特征包括菌落形态学、细胞形态学(杆状、球状、细胞群、孢子形成模式等)、革 兰染色或其它染色法，某些能够给出鉴定结论的关键生化反应(如氧化酶、过氧 化氢酶和凝固酶反应)进行分析，一般即可满足需要；非无菌药品产品的控制菌 检查应达到种的水平；无菌试验结果阳性和无菌生产模拟工艺（如培养基灌装） 失败时，对检出的微生物鉴定一般需达到菌株水平。 一、微生物的鉴定程序 微生物鉴定的基本程序包括分离纯化和鉴定，鉴定时，一般先将待检菌进行 初步的分类。鉴定的方法有表型微生物鉴定和基因型微生物鉴定，根据所需达到 的鉴定水平选择鉴定方法。微生物鉴定系统是基于不同的分析方法，其局限性与 方法和数据库的局限性息息相关， 未知菌鉴定时通过与微生物鉴定系统中的标准 微生物（模式菌株）的特征(基因型和/或表型)相匹配来完成。如果数据库中没 有此模式菌株，就无法获得正确的鉴定结果。在日常的微生物鉴定试验中，用户
1
VITEK全自动微生物检测系统原理及其应用 近年来，微生物的检测鉴定技术已逐步由手工检测走向仪器化和电脑化，并力求简便、快速、准确。由生物梅里埃公司出品的全自动微生物鉴定/药敏分析系统VITEK是目前世界上最先进、自动化程度最高的细菌鉴定仪器之一。 近年来，微生物的检测鉴定技术已逐步由手工检测走向仪器化和电脑化，并力求简便、快速、准确。由生物梅里埃公司出品的全自动微生物鉴定/药敏分析系统VITEK是目前世界上最先进、自动化程度最高的细菌鉴定仪器之一。VITEK已被许多国家定为细菌最终鉴定设备，并获美国药品食品管理局（FDA）认可。该系统有高度的特异性、敏感性和重复性，还具有操作简便、检测速度快的特点，绝大多数细菌的鉴定在2～18 h内可得出结果。现将该系统的工作原理、主要结构、功能并结合我们使用后的一些体会介绍如下。 1工作原理 VITEK对细菌的鉴定是以每种细菌的微量生化反应为基础，不同种类的VITEK试卡（检测卡）含有多种的生化反应孔，可达30种。将手工分离的待检菌的纯菌落制成符合一定浊度要求的菌悬液，经充填机将菌悬液注入试卡内，封口后放入读数器/恒温培养箱，根据试卡各生化反应孔中的生长变化情况，由读数器按光学扫描原理，定时测定各生化介质中指示剂的显色(或浊度反应，然后把读出信息输入电脑储存并进行分析，再和预定的阈值进行比较，判定反应，再通过数值编码技术与数据库中反应文件进行比较，最后鉴定报告将在显示器上自动显示)并在打印机上自动打印。 2VITEK系统的结构组成 2.1检测卡 目前VITEK系统的检测卡有14种，微生物常用的有7种，即：革兰氏阳性菌鉴定卡（GPI）、革兰氏阴性菌卡（GNI+）、非发酵菌卡（NFC）、酵母菌卡（YBC）、厌氧菌卡（ANI）、芽胞杆菌卡（BAC）、奈瑟氏菌嗜血杆菌卡（NHI），以及药敏检测卡等。每张检测卡对应接种1份标本，检测卡为一次性消耗品。 2.2充填机将待测菌的菌悬液注入试卡内。 2.3读数器/恒温箱可在培养过程中定时读出细菌在试卡内培养基中的生长变化值。 2.4电脑主机/显示器/键盘/打印机用于储存和分析资料、系统的操作和结果分析鉴定，实验结果的自动显示报告和打印。 2.5电源稳压器和UPS在外围断电的情况下提供电脑主机约10 min持续电源。 3VITEK系统的功能
一、填空： 1．微生物菌种的命名采用"双名法",即由属名和种名加词构成。 2．来源于一个细胞在固体平板培养基上形成的群体称菌株。 3．1969年将生物界分成了五界，分别是动物界、植物界、原生生物界、真菌界、原核生物界。4．细菌的分类单元分为七个基本的分类等级，由上而下依次为_界、_门__、纲、目、科、属、种。 5．生物分类的传统指标为形态特征、生理生化反应、和生态特性。 6．形态学特征始终被用作微生物分类和鉴定的重要依据之一，其主要原因为具有相对稳定性_和易观察。 7．分类学的内容包括_细菌分类_、放线菌分类和真菌分类_三部分，目前进行细菌分类和鉴定的重要参考书目是_《伯杰氏细菌鉴定手册》。 8．微生物分类和鉴定的特征包括_形态特征_和_生理生化反应_，其中__形态特征_对鉴定微生物的系统发育有决定性作用，而_生理生化反应_可作为判断亲缘关系的参考而且对以实用为目的的分类鉴定仍有重要价值。 9．核酸分子杂交_和_rRNA寡核苷酸编目分析__是目前通过直接比较基因组进行生物分类最常用的两种方法。 10．1978年，Woese等提出新的生物分类概念，根据16SrRNA的碱基序列将生物清晰地划分为三原界，即细菌域、古生菌域和真核生物域。 11．对微生物命定学名的表示方法分双名与三名两种。 12．在生物的界级分类学说研究中,1978年由R．H．whittake和“提出了一个崭新的三域学说。13．填写以下10个数据：(1) 对牛奶等进行巴氏消毒时常用 63 ℃的温度；(2)用液氮保藏微生物的温度为 -196 ℃；(3)通常细菌的最适培养温度为 37 ℃：(4)用烘箱进行的干热灭菌温度一般为 150～170 ℃；(5)的代时一般为 17 min；(6)典型的酵母菌S．cerevisiae的代时一般为 120 min，其大小一般为～10 X ～21um 。（7）至今已记载的微生物约 20万种（1995）；(8)我国卫生部门规定自来水中所含的大肠菌群数不得超过 3个/L ；(9)细菌总数不得超过 100个/ml 。 14．血清学反应是抗原和抗体之间发生的反应。 15.在鉴定菌种的一些现代方法中，有核酸分子杂交，rRNA寡核苷酸编目分析，全基因组测定，数值分类等方法。 二、选择题： 1．同种菌不同来源的纯培养称为（ C ） （A）种 (B)变种 (C)菌株 (D)群 2．试排出生物分类等级的正确顺序（D） (A)目→纲→界→门 (B)界→纲→目→门 (C)目→纲→门→界 (D)界→门→纲→目 三、判断题 1．目前种是生物分类中最小的分类单元和分类等级。√ 2．具有相同G+C含量的生物表明它们之间一定具有相近的亲缘关系。× 四、名词解释 1.种：是一个基本分类单位,它是一大群表型特征高度相似、亲缘关系极其接近、与同属内其他种有着明显差异的菌株的总称。 2.新种：从自然界中分离得到的某一微生物的纯种，如果与文献上记载的典型种的特征有明显差异，即为新种。 3．培养物：根据一定的目的，在培养基上培养的微生物称为培养物。
微生物的快速检测与鉴定 微生物论文 学院：食品科学与工程学院 班级：生工091 学生：彭彩连 学号：42号
【关键词】微生物快速检测 随着人们生活水平不断提高，各种安全问题越来越受到人们的重视，微生物的污染问题也相应地备受关注。在食品和环境等各个方面都有微生物污染的可能，一旦污染，微生物将大量繁殖而导致食源性疾病或环境污染甚至医院内感染。特别是近年来随着环境污染的加剧和生态平衡的不断破坏，导致感染的致病菌的种类越来越多，病原微生物对人类的威胁越来越大。传统的检验方法，主要包括形态检查和生化方法，其准确性、灵敏性均较高，但涉及的实验较多、操作烦琐、需要时间较长、准备和收尾工作繁重，而且要有大量人员参与［1，2］。所以，迫切需要准确、省时、省力和省成本的快速检验方法。本文对微生物快速检测方法的进展情况及实际应用进行综述，以利于预防食源性疾病及公共卫生突发事件的发生。 1 即用型纸片法 3M公司的perrifilmTMPlate系列微生物测试片，可分别检测菌落总数、大肠菌群计数、霉菌和酵母计数［3］。由RCP Scientific Inc 公司开发上市的Regdigel系列，除上述项目外还有检测乳杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌的产品［4］，这两个系列的产品与传统检测方法之间的相关性非常好。如用大肠菌群快检纸片检测餐具的表面，操作简便、快速、省料，特异性和敏感性与发酵法符合率高，已经被列为国标方法。使用时应正确掌握操作技术和判断标准，从而达到理想的检测效果［5］。美国3M公司生产的PF(Petrifilm)试纸还加入了染色剂、显色剂，增强了菌落的目视效果，而且避免了热琼脂法不适宜受损细菌恢复的缺陷。霉菌快速检验纸片，应用于食品检验中的霉菌具有操作简便，仅需36℃培养，不需要低温设备；快速，仅需2 d就可观察结果，比现在的国家标准检验方法缩短3～5 d，大大提高了工作效率。纸片法与国标法在霉菌检出率上差异无统计学意义，且菌落典型，易判定。纸片荧光法利用细菌产生某些代谢酶或代谢产物的特点而建立的一种酶—底物反应法。只需检测时纸片可高压灭菌处理，4℃保存，简化了实验准备、操作和判断［6］。但由于它们价格昂贵，限制了在基层单位的实际应用。 2 生物化学技术 2.1 PCR技术PCR技术采用体外酶促反应合成特异性DNA片段，再通过扩增产物来识别细菌。由于PCR灵敏度高，理论上可以检出一个细菌的拷贝基因，因此在细菌的检测中只需短时间增菌甚至不增菌，即可通过PCR进行筛选，节约了大量时间，但PCR技术也存在一些缺点：食物成分、增菌培养基成分和其他微生物DNA对Taq酶具有抑制作用，可能导致检验结果假阴性；操作过程要求严格，微量的外源性DNA进入PCR后可以引起无限放大产生假阳性结果，扩增过程中有一定的装配误差，会对结果产生影响。由于以上原因，PCR技术对操作者的自身素质要求很高，对于基层单位而言难以做到。短时间内也不会有经济效益和社会效益，因此影响了这项技术在基层的应用。
微生物检验（二） 1.最先发现微生物的科学家是（A）。 A.列文虎克 B.巴斯德 C.弗莱明 D.科赫 E.李斯特 2.微生物学检验的任务，错误的是（A）。 A.专门研究代谢产物检测方法 B.消毒灭菌效果评价 C.监测医院内感染 D.进行病原学诊断 E.筛选抗菌药物 3.病原菌在局部生长繁殖，一过性侵入血流的是（B） A.毒血症 B.菌血症 C.脓毒血症 D.败血症 E.病毒血症 4.临床微生物实验室在医院感染监测中的作用，不包括（C）。 A.诊断病原 B.监测细菌耐药 C.负责建立院感防控体系 D.监测消毒灭菌质量 E.监测医院环境卫生 5.通常临床微生物实验室属生物安全几级实验室（B）。 A.BSL-1 B.BSL-2 C.BSL-3 D.BSL-4 E.BLS-5 6.对二级生物安全实验室的要求，以下说法错误的是（A）。 A.无关人员可随意进入实验室 B.应设置实施各种消毒方法的设施 C.实验室如有可开启的窗户，应设置纱窗 D.有可靠和充足的电力供应和应急照明 E.安全系统应包括消防,应急供电,洗眼器以及应急喷淋装置 7.二级生物安全实验室必须配备的设备是（C）。 A.生物安全柜,培养箱 B.生物安全柜和水浴箱 C.生物安全柜和高压灭菌器 D.离心机和高压灭菌器 E.离心机和培养箱 8.下列不属于实验室一级防护屏障的是（D）。 A.生物安全柜 B.防护服 C.口罩 D.缓冲间 E.手套 9.判断达到灭菌效果的指标是（A）。 A.杀灭细菌芽胞 B.杀灭细菌繁殖体 C.使细菌失去荚膜 D.破坏细菌鞭毛 E.破坏细菌质粒 10.除哪项外，下列结构可用于鉴别细菌（D）。 A.芽胞 B.鞭毛 C.荚膜 D.菌毛 E.异染颗粒 11.大多数细菌生长适宜的pH是（C）。 A.5.5~6 B.6.5~6.8 C.7.2~7.6 D.8.4~9.2 E.9.0~10.0 12.高压蒸汽灭菌器压力为103.4kPa时，其温度为（C）。 A.100.3℃ B.110.3℃ C.121.3℃ D.122.3℃ E.130.3℃ 13.含血清的培养基多用何种方法灭菌（D）。 A.烧灼法 B.巴氏消毒法 C.煮沸法 D.间歇灭菌法 E.高压蒸汽灭菌法 14.制备普通琼脂培养基，灭菌宜采用（D）。 A.煮沸法 B.巴氏消毒法 C.流通蒸汽灭菌法 D.高压蒸汽灭菌法 E.间歇灭菌法 15.实验室内空气的消毒灭菌常采用何种法（C）。 A.干烤法 B.流通蒸汽法 C.紫外线照射 D.间歇灭菌 E.以上均可
设备名称:全自动微生物鉴定及药敏分析系统 一、具体用途：对食品，环境中的微生物进行快速，全自动的鉴定及药物敏感性测试。 二、技术参数与性能要求： 1.系统可同时处理≥30个标本，系统具有扩容功能，至少可以两台联机； 2. 分析组件可对环境中和食品中的细菌进行全自动鉴定，种类包括革兰阴性菌、革兰阳性球菌、革兰氏阳性杆菌、酵母样真菌、假丝酵母类真菌、苛养菌、厌氧菌及棒状杆菌等的鉴定； 3. ★分析组件可对芽孢杆菌进行全自动鉴定； 4．★大于500种可鉴定细菌，鉴定结果通过美国FDA认证，细菌鉴定采用GB推荐生化鉴定显色法，药敏检测采用比浊法，并且鉴定方法原理可在GB4789中查询（提供具体细菌库）；5．★分析组件可自动进行革兰阴性菌、革兰阳性菌、酵母样真菌、肺炎链球菌等药敏试验，以上所有药敏试验均得到美国FDA批准用于临床应用（提供FDA证明资料）； 6. ★在对标本的鉴定及药敏试验过程中，无需添加任何额外附加试剂； 7．快速全自动对细菌进行鉴定和药敏试验，采用实时检测系统，系统每隔15分钟对试剂卡进行一次扫描读数，一旦确认结果，可马上出报告； 8．★细菌最快鉴定时间＜4个小时，平均鉴定时间不超过5小时； 9．最快药敏实验时间5小时，平均药敏实验时间不大于6小时； 10.★系统可同时进行鉴定和药敏实验，并且可同时上机的鉴定试剂卡种类不少于4种，可同时上机的药敏试剂卡的种类不少于6种； 11.★系统自动填充悬浮液至试剂卡，自动密封拭卡，并自动将拭卡装载于设备内置读数系统/孵育系统，测试结束时可自动丢弃拭卡，操作都在仪器内部自动进行，不需要额外设备； 12．卡片填充菌液后为封闭式卡片，不会造成污染； 13．★鉴定卡和药敏卡必须独立包装； 14.鉴定卡应至少提供3种不同试剂的SFDA注册证； 15.药敏卡应至少提供5种不同试剂的SFDA注册证； 16．测试完成后，经分析软件分析后得出结果并可自动打印报告，并保存结果； 17．具备中文报告软件系统； 18．双向联网软件，可传输报告结果； 19．具有三重售后服务保证体系（国内有分支机构、本地有生产厂家办事处、销售商有专职工程师），必须提供终身售后服务支持；
微生物检测鉴定中常用的生化反应 有些细菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶。淀粉酶可以使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，淀粉水解后遇碘不再变蓝色。 细菌产生的脂肪酶能分解培养基中的脂肪生成甘油及脂肪酸。脂肪酸可以使培养基pH 下降，可通过在油脂培养基中加入中性红做指示剂进行测试。中性红指示范围为 pH6.8(红)～8.0(黄)。当细菌分解脂肪产生脂肪酸时，则菌落周围培养基中出现红色斑点。 某些细菌分泌蛋白酶分解明胶，产生小分子物质。如果细菌具有分解明胶的能力，则培养基可由原来固体状态变成液体状态。 牛乳中主要含有乳糖、酪蛋白等成分。细菌对牛乳的利用主要是指对乳糖及酪蛋白的分解和利用。牛乳中常加入石蕊作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂。石蕊中性时呈淡紫色，酸性时呈红色，碱性时呈蓝色，还原时则部分或全部脱色。细菌对牛乳的利用可分三种情况： (1)酸凝固作用：细菌发酵乳糖后，产生许多酸，使石蕊牛乳变红，当酸度很高时，可使牛乳凝固，此称为酸凝固。 (2)凝乳酶凝固作用：某些细菌能分泌凝乳酶，使牛乳中的酪蛋白凝固，这种凝固在中性环境中发生。通常这种细菌还具有水解蛋白质的能力，因而产生氨等碱性物质，使石蕊变蓝。 (3)胨化作用：酪蛋白被水解，使牛乳变成清亮透明的液体。胨化作用可以在酸性条件下或碱性条件下进行，一般石蕊色素被还原褪色。 实验材料 1.活材料：大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、产气肠杆菌、黏乳产碱杆菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌。 2.培养基：淀粉培养基：牛肉膏蛋白胨培养基加0.2%的可溶性淀粉;油脂培养基：牛肉膏蛋白胨培养基加花生油10mL、0.6%中性红水溶液1mL;明胶液化培养基：蛋白胨5g，明胶100～150g，水1000mL, pH7.2～7.4，115℃灭菌20min;石蕊牛乳培养基：牛奶粉100g、石蕊0.075g、水1000 mL、pH6.8，121℃灭菌15 min 。 3.试剂：卢哥氏碘液。 实验耗材 平皿、接种环、酒精灯、试管、接种针等。 实验方法
1、主题内容与适用范围： 本规程规定了VITEK全自动微生物分析系统的操作规程、安全要求和注意事项。本规程适用于VITEK全自动微生物分析系统。 2、引用文件： 《VITEK全自动微生物分析系统操作手册》 3、操作规程： 3.1开机： 3.1.1先开电源、滤波器，然后开UPS、打印机、终端、读数器，最后开电脑。 3.1.2等待屏幕出现 biomerieux Login Password 3.1.3在Login处键入SUPV按enter（回车键），在password处键入SUPV按enter（屏不显示）。 3.1.4出现BioLIAISON主菜单（在主菜单的VITEK下点击），出现VITEKStatus状态框，点击Reader，出现Status和Print，点击Status。 3.1.5在读数状态窗口击processon钮。开始执行任务。 3.2测试标本 3.2.1标本的稀释：选取经纯培养18～24小时后，大小为3mm左右的待测菌落2～3个，置于装有1.8ml0.45%生理盐水的试管中进行稀释，用标准比浊计测菌液浓度（如浊度高加生理盐水，浊度低加菌落）。最后的菌液浓度必须达到测试卡所要求相应标准度。将试管放到样品架上。 3.2.2卡片标记： 3.2.2.1从冰箱中取出测试卡，放置2～3分钟，使温度与室温相同。 3.2.2.2用vitek记号笔在“日”形图上写上编号，并在外实验结果标记处标记上外部测试实验结果（如氧化酶、触酶或凝固酶标记）。 3.2.3卡片充样： 3.2.3.1将一弯曲的输样管装在测试卡上。 3.2.3.2将测试卡放在充样架上，输样管浸入装有待测菌液的标准管中。 3.2.3.3按充样器电源ON开关，约十秒钟后，READY灯亮，提示充样器为进入真空状态作好准备。 3.2.3.4将充样架插在充样板上，放入真空舱，关门。 3.2.3.5按FILL触点开关，约十秒钟后，READY灯灭，充样开始。 3.2.3.6充样完成后（约3分钟），READY灯再次亮。 3.2.3.7取出充样板，按充样电源OFF触点开关。 3.2.4封卡： 3.2. 4.1将封口塞的小圆头塞进孔中，旋转塞子的手柄端，使柄与头断开，小头留在孔中封住口。 3.2. 4.2检查测试卡的各小室是否有气泡排除。 3.2.5放卡入读数/恒温箱： 3.2.5.1检查一下阅读状态窗口，在确保读数器未进行卡片读数的情况下，打开读数/恒温箱的门，将测试卡按正确方向插入托架上的空位上，由高往下放（即最好按顺序依次排放），检查是否放正确。（必须确保测试卡位置正确，否则会损坏读数器）。 3.2.5.2关上读数/恒温箱的门。