华中科技大学
硕士学位论文
液相色谱-串联质谱联用技术在食品安全分析中的应用
姓名：朱宽正
申请学位级别：硕士
专业：环境科学
指导教师：梅素容
20070122
华中科技大学硕士学位论文
摘要
对复杂基质中痕量成分的多残留组分分析和确证分析已成为食品安全分析的重大难题。传统的仪器检测方法对这一问题难以解决，如气相色谱法（GC）、液相色谱法（LC）、气相色谱质谱法（GC-MS）等。液相色谱-串联质谱联用技术（LC-MS/MS）结合了液相色谱、串联质谱两者的优点，不仅分离能力强，选择性好，灵敏度高，而且还可以对复杂基质样品中的痕量成分进行确证分析，已成为食品安全分析手段中必不可少的组成部分。
本论文主要内容如下:
（1）本文对食品安全问题和食品分析的现状进行了概述，并对液相色谱-串联质谱联用技术的基本原理和发展以及其在食品分析中的应用进行了综述。
（2）采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）进行了水产品中三苯甲烷类药物的残留分析研究。同时测定了水产品中的孔雀石绿、结晶紫以及它们的隐色代谢物残留。将匀质后的水产品样品，用乙腈和乙酸铵缓冲液提取，合并提取液，用二氯甲烷反提取，经中性氧化铝柱和PRS柱固相萃取净化，没有使用氧化铅柱在线氧化，色谱分离后直接进入串联质谱检测器。采用电喷雾正离子，多反应检测（MRM）模式检测。方法的检测限可达0.5ng/g，添加样品平均回收率为77.6%～98.1%,相对标准偏差均小于8.2％。
（3）采用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）同时测定了蜂王浆中氯霉素，甲砜霉素和氟甲砜霉素残留。样品加入阴性蜂蜜和水均质后，采用乙酸乙酯提取，蒸发浓缩，C18固相萃取净化。HPLC分离后, 串联质谱法以电喷雾负离子多反应监测方式(MRM)进行定性定量分析。通过对固相萃取条件的优化，大大减小了基质的干扰。氯霉素，氟甲砜霉素和甲砜霉素的检出限分别为0.1ng/g，0.2ng/g和0.5ng/g，平均回收率为79.9%～88.4%，相对标准偏差（RSD）均小于8.2%。
关键词：液相色谱-串联质谱食品分析三苯甲烷氯霉素
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Abstract
Confirmatory multiresidue analysis for organic compounds at trace levels in complex matrixes is required in food analysis. Conventional techniques in food analysis, such as Gas chromatography (GC), Liquid chromatography (LC), Gas chromatography mass spectrometry (GC-MS), etc., can’t meet the demands. Liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technique frequently provides specific, selective and sensitive quantitative results, and allows unequivocal identification of traces of contaminants in complex food matrices, which has become one of the major tools in food analysis.
The main contents in this thesis are described as follows:
(1)The paper reviews the importance of food safety and the status of food analysis, and introduces the basic principle, characteristics of LC-MS/MS and its application in food analysis.
(2)A liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method was described for Simultaneous determination of residues of malachite green (MG),leucomalachite green（LMG）,rystal violet（CV）and leucocrystal violet（LCV）in aquatic products. The targeted analytes were extracted from homogenized samples with a mixture of acetonitrile and ammonium acetate buffer, partitioned against methylene chloride, and purified on tandem neutral alumina and PRS SPE cartridges. Chromatographic Separation was achieved by using ZORBAX SB-C18 column with an isocratic mobile phase consisting of ammonium acetate (0.05mM) and acetonitrile（10/90，V/V）without the need for in-line post-column oxidation with PbO2. Identification and quantification were performed using multiple reaction monitoring (MRM) with one precursor ion and two product ions for each analyte and electrospray ionization in positive mode. Limits of detection were 0.5ng/g. Recoveries were in the range of 77.6％～98.1％, and the RSDs were less than 8.2%.
(3)A method was presented for simultaneous determination residues of Chloramphenicol (CAP),Thiamphenicol (TAP) and Florfenicol (FF) in royal jelly by using
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high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC–MS/MS).After a preliminary homogenization in negative honey and water, samples were extracted with ethyl acetate, and evaporated to dryness; the following clean up was carried out on a C18 SPE cartridge. After reversed-phase HPLC separation, identification and quantification were performed using multiple reaction monitoring (MRM) and electrospray ionization in negative mode. In order to dispel the matrix interference, the conditions of solid phase extraction were optimized. The detection limits of the method were 0.1ng/g，0.2ng/g and 0.5ng/g for CAP, FF and TAP, respectively. The average recoveries were 79.9%~88.4%, and the RSD were lower than 8.2.%.
Keywords：LC-MS/MS Food analysis Triphenylmethane Chloramphenicol
独创性声明
本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承担。
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日期：年月日
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本论文属于
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日期：年月日日期：年月日
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1 绪论
1.1 食品安全问题
食品安全问题是关系到人体健康和国计民生的重大问题。近年来, 全球性的食品安全事件接连不断。从1996 年英国疯牛病到1998 年东南亚猪脑炎事件、1999 年比利时二恶英事件, 2001 年欧洲口蹄疫事件, 再到至今仍给人们留下深深阴影的东南亚“非典”风波, 每一件都引起了全球性的恐慌。这一系列食品安全问题, 不仅造成巨大的经济损失，而且极大地影响了社会的稳定。
我国的食品安全问题也相当突出，随着我国经济和社会的持续较高速度的发展，食物的安全问题越来越引起全社会的关注。农作物种植和动物养殖中，运用各种农药、抗生素、激素，提高了食物产品的产量，满足了人口增长的需要，同时，由于各种农药、抗生素、环境干扰素、激素的使用，造成食物链中农药残留、抗生素污染、激素、重金属污染，影响消费者的身体健康；尤其我国成为WTO的新成员后，与世界各国间的贸易往来日益增加，食品安全已变得没有国界，世界某一地区的食品问题很可能会波及全球，从而对我国食品安全带来巨大影响。
食品安全问题也是我国食品出口受到制约的重要因素。许多国家，尤其是发达国家，为了加大对本国的贸易保护，制订苛刻的技术标准，如美国FDA和欧盟委员会的食品卫生标准以及日本的肯定列表等[1]。这些标准对食品中化学添加剂，残留化合物，污染物等物质的含量越来越严格地限定，构筑起难以逾越的技术壁垒，从而对我国的食品出口造成严重的负面影响。据《中国食品安全战略研究》报告指出，近年来，技术贸易壁垒已成为我国农产品和食品出口的重要制约因素。为了消除技术壁垒，增强我国的企业国际竞争力，提高食品分析检测技术能力是其有力的技术保障之一[2]。
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1.2 食品分析的现状
食品分析的困难很多，包括：（1）食品种类繁多，样品基质复杂，背景干扰很大；（2）需要检测的有毒有害目标物的种类和组分繁多；（3）需要检测的目标物含量很低，在样品中目的物的浓度常为ppm (mg) ,ppb (μg) 级甚至ppt (pg) 级；（4）需快速、简便地定性、定量；（5）除需检测目的物的主体之外，还常涉及衍生物和降解物的检测以及区别同位异构体等。
随着人们对疾病防治的重视和有关毒理学和病理学研究的深入,对有毒有害物检测的种类、组分和最低检出限等方面的认知将不断地深入, 将对检测方法和仪器的要求日趋严峻，如何解决这些问题，是当今食品安全检测中的分析测试技术的研究方向。
为了适应绝大多数样品中多残留共存的现实，开发多残留分析方法已成为食品分析的重要趋势[3]。然而由于待测物质性质上的差异，单一的检测方法已经难以满足要求，各种联用技术和仪器的应用，是解决这些问题的最好方法。根据欧盟委员会2002/ 657/ EC 决议的规定[4],对于禁用农药、兽药等有害物质的阳性结果必须经过质谱确证，以确保可靠地进行定性、定量检测,降低假阳性率。将各种分离分析方法与质谱仪联用产生的各种联用技术(如气相色谱质谱GC-MS,液相色谱-质谱LC-MS,毛细管电泳-质谱CE-MS等)已成为食品分析中多组分化合物的定性和定量分析方面不可缺少的工具。
1.3 LC-MS/MS联用技术的基本原理和特点
1.3.1 LC-MS/MS的基本原理
待测物质经LC进行分离后，通过联用接口完成溶液的气化和样品分子的电离，串联质谱采用不同的操作模式对电离离子进行定性定量分析。将被分析物电离产生碎片离子，选择某一个碎片离子作为母离子，再在适合的激发电压下将母离子二次电离，产生子离子，收集并根据这些特征子离子对对化合物进行定性定量分析。MS/MS的操作模式有以下四种模式：子离子扫描、母离子扫描、中性丢失扫描和多
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反应离子检测（MRM ）。多反应离子检测模式主要用于痕量分析，灵敏度高于上述三种模式，在食品分析中也应用最为广泛。 1.3.2 LC-MS/MS 的特点
高分离能力的LC 与高选择性、高灵敏度的MS/MS 结合,使得LC-MS/MS 联用的优点非常显著。与气相色谱一质谱法(GC-MS)及HPLC 法相比具有明显优势(见表1.1)。
LC-MS 虽然有足够的灵敏度,但遇到LC 难以分离的组分,其应用受到限制。串联质谱的优势在于能够提供足够的化合物结构信息用于定性分析，准确可靠；可对复杂样品进行实时分析,即使在LC 难分离的情况下, 通过MS/MS 的多反应检测模式(MRM)，MS1及MS2对目标化合物进行中性碎片扫描,特征母离子和子离子的一一对应性使之排除干扰能力强,定量时本底值低，检测灵敏度高。因此，特别适用于分析背景干扰严重、定性困难、被测化合物含量很低的样品，是对复杂基质样品中痕量化合物进行定性、定量分析最有效的方法，也是权威检测机关进行仲裁分析的有效手段。
表1.1 LC-MS/MS ，GC-MS, HPLC 技术的比较
待测物条件
样品前处理
色谱分离与检测
LC-MS/MS
无分子量限制，水溶性极性小
分子，热不稳定化合物，肽，蛋白，DNA 等生物大分子
样品处理简单，时间消耗少 对分离要求不高，几种物质
共同洗脱也不影响定量分析。定性准确。 GC-MS
分子量<800，热稳定，非极性，易挥发化合物或处理后可挥发的物质
需衍生，复杂而且繁琐
由于定量碎片无法用单一m/z 来确定，需要高分辨能力GC 。定量困难。
HPLC-UV(或DAD) 具有UV-发光团
特异性低，灵敏度不高，待测物需要基线分离 HPLC-FLD
具有荧光-共轭双键 特异性较强，但不能对峰识别定性
HPLC-ECD
具有特征性氧化还原功能 复杂而且繁琐，待测物需要进
行净化和浓缩
特异性较强，分析不够稳定
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根据欧盟委员会2002/ 657/ EC 决议的规定,禁用农药、兽药的确证检测方法必须能
提供结构方面的信息, 且要达到法规规定的4个确证点[4]。质谱技术与鉴定点数的关系
如表1.2所示。由于GC-MS和LC-MS缺乏足够的质谱结构信息，很难达到规定标准。
表1.2 质谱技术与鉴定点数的关系
实验技术离子个数鉴定点（分数）
GC-MS(EI or CI) N N
GC-MS(EI or CI) 2(EI)+2(CI) 4
GC-MS(EI or CI)2个衍生物 2(衍生物A)+2（衍生物B） 4
LC-MS N N GC-MS/MS 1个母离子+2个产物离子 4
LC-MS/MS 1 个母离子+2 个产物离子 4
GC-MS/MS 2 个母离子各有一个产物离子 5
LC-MS/MS 2 个母离子各有一个产物离子 5
5.5
LC-MS/MS/MS 1 个母离子，1个产物离子，
2个次级产物离子
H R M S N 2n
GC-MS+LC-MS 2+2 4
GC-MS+HRMS 2+1 4 1.4 LC-MS/MS联用技术的发展
LC-MS联用是继GC/MS 联用之后又一新兴的分离检测技术。LC/MS 的联用始
于70 年代,90 年代以来,由于大气压电离的成功应用以及质谱本身的发展,液相色谱
与质谱的联用,特别是与串联质谱(MS/MS) 的联用得到了极大的重视和发展。
1.4.1 常用MS/MS质量分析器
实际应用中有两种实现方式：空间序列质谱-质谱仪和时间序列质谱-质谱仪。
（1）空间串联型MS/MS仪
这类仪器是两个以上的质量分析器联合使用，两个分析器间有一个碰撞活化室，
目的是将前级质谱仪选定的离子打碎，由后一级质谱仪分析。空间串联型MS/MS仪
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又分为磁扇型串联，四极杆串联，混合串联等类型。若用B表示扇形磁场，E表示扇形电场，Q表示四极杆，TOF表示飞行时间分析器，磁扇型串联MS/MS仪有BEB、EBE、BEBE等；四极杆MS/MS仪的典型代表是三级四极杆质谱仪(简称Q-Q-Q)；混合型MS/MS仪有BE-Q、Q-TOF、EBE-TOF。
（2）时间串联型MS/MS仪
这类仪器只有一个质量分析器，前一时刻选定离子，在分析器内打碎后，后一时刻再进行分析。时间串联型MS/MS仪的典型代表是离子阱质谱仪和回旋共振质谱仪。
基于优越的定量能力和抗干扰能力（采用MRM检测模式），三级四极杆串联在食品分析中最常用。但是不同类型的质谱检测器具有各自的优点和局限性[5]，如表3所示，将这些不同类型的质谱检测器进行线性联用，使MS/MS具有多样性的性能，扩大LC-MS/MS 联用技术的使用范围，更加有利于多残留分析[3]。如四极杆-离子阱（QIT）、四极杆线性离子阱（QLIT）、四极杆-飞行时间质谱（QqTOF）和离子阱-飞行时间质谱（IT-TOF）等，其中飞行时间质谱(TOF)作为第二个质量分析器具有广阔的前景[6]。
表1.3 常见质量分析器的比较
质量分析器原理优点缺点
四极杆带电粒子射入高频电场中，在一定的电压和频率下，只有一种质荷比的离子可以通过四
极杆达到检测器，其余离子则因振幅不断增
大，撞在电极上而被“过滤”掉。扫描速度快，分
辨率高，定量较
强
质量范围窄，结
构信息较少，定
性能力差
离子阱离子阱捕获一定数量的离子,通过改变电场,所有的离子按照时间序列依次从阱中排出。
离子被依次弹出离子阱检测器,较小的离子
先被检测具有MS n的功
能，定性能力强，
有助于对未知结
构化合物的解析
空间电荷效应，
碰撞效率低，定
量能力差
飞行时间质谱利用相同能量的带电粒子,由于质量的差异
而具有不同速度的原理,不同质量的离子以
不同时间通过相同的漂移距离到达接收器。扫描速度快，质
量范围宽，分辨
率高
定量较差，在飞
行过程中离子丢
失较多，灵敏度
低于四极杆
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1.4.2 常见大气压接口
液-质联用是通过一个“接口”来实现的。在接口研制方面,前后发展了有20多种,其中主要有直接导入界面、传送带界面、渗透薄膜界面、热喷雾界面和粒子束界面,但这些技术都有不同方面的限制和缺陷,直到大气压电离技术成熟后,液-质联用才得以迅速发展,成为科研和日常分析的有力工具。目前主要采用大气压电离(API) 技术,API 包括电喷雾电离( ESI)、大气压化学电离(APCI) 和大气压光离子化(APPI)。
（1）电喷雾电离(ESI)
图1.1为ESI示意图。溶液中样品流出毛细管喷口后,在雾化气(N2)和强电场(3～6kV)作用下,溶液迅速雾化并产生高电荷液滴。随着液滴的挥发,电场增强,离子向液滴表面移动并从表面挥发,产生单电荷或多电荷离子。通常小分子得[M+ H]+或[M-H]-单电荷离子,生物大分子产生多电荷离子,由于质谱仪测量的是质/荷比(m/z) ,可测定的生物大分子的质量数高达几十万。ESI 是很软的电离,可直接测定热不稳定的极性化合物,多电荷形成可分析蛋白质和DNA 等生物大分子,调节离子源(源内ID) 电压可以控制离子的断裂,给出结构信息。
图1.1 电喷雾电离示意图
（2）大气压化学电离(APCI)
图1.2为一种新型APCI 示意图。溶液中样品流出毛细管后仍由氮气流雾化到加热管中被挥发,在加热管端的Corona尖端放电电极使溶剂分子形成反应气等离子体。样品分子与等离子体通过氢质子交换被电离,形成[M+H]+或[M-H]- ,并进入质谱仪。APCI 也是很软的电离,只产生单电荷峰,适合测定弱极性的小分子化合物。另外,它适
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应高流量的梯度洗脱/高低水溶液变换的流动相。通过调节离子源电压,可以得到不同断裂的质谱图。
图1.2 大气压化学电离示意图
（3）大气压光离子化(APPI)
图1.3为一种新型APPI示意图。大气压光离子化(APPI)[7]是一种新型的大气压离子源，是基于一种高通量气体放电灯，产生10和10.6eV 能量的真空-紫外(VUV)光子。溶液中样品由氮气流雾化到加热管中被挥发后，接收放电灯释放的光子能量产生电离，形成[M+H]+或[M-H]- ,并进入质谱仪。该放电灯的能量通常大于被分析物的第一电离能(IP)，因为许多有机化合物的IP 值范围在7 ～10eV 。另一方面，大多数用作LC流动相的溶剂有较大的IP值(水, IP = 12.6eV；甲醇，IP= 10.8eV；乙腈，IP=12.2eV)。这样，许多具有较低IP 值的被分析物的离子化将不受流动相的干扰。APPI 也是很软的电离,适合测定非极性的小分子化合物，并且APPI源可以有效的克服基质对离子化的抑制，具有高效的离子化效率，相对ESI和APCI也具有更高的灵敏度[8,9]。
图1.3 大气压光离子化电离示意图
华中科技大学硕士学位论文作为LC-MS/MS 联用技术的一个重要组成部分，离子源接口一直制约其发展，
开发更加方便、快捷的接口技术，已成为LC-MS/MS 联用技术的发展方向之一。例
如正负离子化方式可以互换的离子源，能够同时对不同性质的物质进行离子化，以
及在ESI和APCI的基础上发展的离子源ESCI源，这种结合源可以同时得到±ESI 和
±APCI四种谱，对于确定电离条件非常方便。
1.4.3 与其它技术的联用
与其它技术的在线联用，开发快速、高效的检测方法，也是LC-MS/MS技术的
发展方向之一。超高效色谱（ultra-performance liquid chromatography UPLC TM）是一
种新型的液相分离技术。它采用1.7μm的多孔颗粒固定相填料和高压系统，相比传
统的HPLC提供了更高的峰容量，分辨率和灵敏度，并且降低了每个样品的分析时间，提高了分析周期[10]。在这个基础上发展了一种超高效液相色谱-串联质谱联用技
术（ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry UPLC TM-MS/MS）, 在食品分析中的多残留检测具有广阔的前景[11]。由于UPLC TM超
高效的分离能力，减小了共流出物质的干扰，降低了离子抑制效应，明显提高了MS/MS的灵敏度。 LC-MS/MS与先进的样品前处理技术的在线联用也越来越受到
关注，如固相萃取[12]、固相微萃取[13]等。样品前处理往往占整个样品分析时间的70%
左右，如何减少分析时间，提高样品检测通量是食品分析的一个重大难题。LC-MS/MS
与有效的样品前处理技术在线联用不仅缩短了样品预处理时间，具有高效快速的特点,而且对于目标待测物也有相当高的灵敏度。
1.5 LC-MS/MS在食品分析中的应用
LC-MS/MS技术已经作为一个常规检验方法用于食品分析，以下就其在农药残留、兽药残留以及真菌毒素等有毒有害物质分析中的应用情况作一综述。
1.5.1 LC-MS/MS在食品中农药残留分析中的应用
农药的种类繁多，有除草剂、杀虫剂、杀真菌剂和促生长剂等。据统计，在全球
范围内有超过800种农药正在使用，很多这类物质在食品中的残留水平都有相关的
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法律法规（如最大残留量或法定允许量），必须得到控制。因此分析食品中的农药残留十分重要。
目前，最常用的农药残留检测方法是GC/MS，然而由于受到自身性质的限制，GC-MS对于高极性、低挥发性、热不稳定性的农药残留分析存在困难, 如有机磷类、氨基甲酸甲酯类等。LC-MS/MS可以有效的解决这一问题。T. Goto等[14]采用LC-MS/MS对葡萄酒，水果汁中7种氨基甲酸甲酯类农药进行了检测，样品用超纯水溶解后，直接进样分析，检测限在0.02–0.05μg/l之间。徐远金等[15]采用ODS-C18 SPE净化，建立了蔬菜中7种有机磷类的LC-MS/MS对检测方法，检出限为0.02–0.090μg/kg。
由于农药种类很多，对于这类目标物的分析，人们希望同时测定多种残留物以减少工作量。如G. F. Pang等[16]采用GC-MS和LC-MS/MS对动物组织中的437种农药进行分析，样品采用环己烷和乙酸乙酯提取(1:1,V/V), 通过凝胶渗透层析法（GPC）净化，对于其中368种农药，用环己烷和乙酸乙酯(1:1,V/V)洗脱凝胶层析柱，在20-40min分钟收集，采用GC-MS分析，另外的69种，利用乙腈和水(60:40,V/V)溶解GPC填料提取，采用LC-MS/MS分析。实验结果表明，417种农药，回收率在60%-120%的占95%，在40%-60%的占5%，检测限0.2-600μg/kg之间。F. Hernández 等[17 ]采用LC-MS/MS对52种不能用GC分离的农药同时定性定量分析。为了研究不同基质对分析的影响，选用了多种不同性质的食品样品，含水量高(番茄), 酸性强(柠檬)，含糖量高(葡萄干), 含脂量高(鳄梨)。样品采用甲醇和0.1%甲酸水溶液(10:90,V/V)提取，并结合OASIS HLB 柱SPE净化。回收率在70–110%之间，在10μg/kg水平，可以准确的定性和定量。
LC-MS/MS在食品中农药残留分析中的另外一个应用是对于无目标物和未知代谢产物的检测。由于MS/MS能够提供丰富的质谱信息，可以进行分子结构分析，分析特别是、QLIT、QqTOF和IT-TOF等混合型的串联质谱的应用。E. M. Thurman等[18]利用LC-QIT-MS2对柑桔中可能存在的杀真菌剂的代谢产物进行了研究，J. F. G. Reyes等[19]采用LC-QIT-MS n调查了食品中可能存在的未知含氯农药。LC-MS/MS在这方面的应用还只是刚刚起步，但具有广阔的发展前景。
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表1.3 LC-MS/MS检测食品中的农药残留
物质样品前处理离子源质量分析器检测限参考文献
有机磷类(6种) 饮用水
无需提取，直接
SPE净化
APCI 三极四极杆
0.01–0.03
μg/l
[20]
有机磷类(7种) 卷心菜,
葡萄
乙酸乙酯提取 APCI 三极四极杆
1-4
μg/kg
[21]
氨基甲酸甲酯类（9种）水果和
蔬菜
乙酸乙酯提取 ESI 三极四极杆 0.01μg/kg [22]
植物生长剂（2种）番茄，
梨子，
小麦粉
甲酸铵-甲酸缓
冲液提取，SPE
阳离子柱净化
ESI 离子肼 <5
μg/kg
[23]
氯烟碱类
（3种）蔬菜用乙腈提取
ESI
离子肼-时间
飞行质谱
10-40
μg/kg
[24]
吡虫啉蔬菜,茶
叶
用乙腈提取,
SPE 弗罗里硅
土和活性炭混合
柱净化
ESI 三极四极杆 10μg/kg [25]
杀虫剂(6种) 桔子乙酸乙酯提取 APCI
四极杆
-离子肼
1-300
μg/kg
[26]
杀真菌剂(6种) 香蕉,
桔子
丙酮提取 ESI
三极四极杆
5-25
μg/kg
[27]
环丙马秦和氰尿酰胺牛皮菜
磷酸盐缓冲液和
甲醇提取
ESI 三极四极杆 10μg/kg [28]
阿巴美丁和川楝素桔子乙酸乙酯提取 ESI 三极四极杆 <7
μg/kg [29]
呋喃威及其6种代谢物桔子乙酸乙酯提取 ESI 三极四极杆
1-10
μg/kg
[30]
31种不同类别的农药水果和
蔬菜
乙酸乙酯提取 ESI 三极四极杆 <1
μg/kg [31]
38种不同类别的杀虫剂水果和
蔬菜
乙酸乙酯提取 ESI 三极四极杆
0.2-3
μg/kg
[32]
74种不同类别的农药水果和
蔬菜
乙酸乙酯提取 ESI 三极四极杆
10-100
μg/kg
[33]
32种农药和25种代谢物水果和
蔬菜
乙酸乙酯提取 ESI 三极四极杆 <10μg/kg [34]
氨基甲酸甲酯类和有机磷类（144种）水果和
蔬菜
乙酸乙酯提取，
加入Na2SO4盐
析，基质分散固
相萃取净化
ESI 三极四极杆 <10μg/kg [35]
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1.5.2 LC-MS/MS在食品中兽药残留分析中的应用
随着集约化畜牧业的发展,兽药的使用范围也在扩大,如抗生素、磺胺药、激素等已广泛用于促进畜禽生长、减少发病率和提高饲料利用率。兽药的广泛应用使畜牧业在增产的同时,也带来了兽药残留的问题。
兽药残留检测的样品基质和被检测组分的结构更为复杂、检出限更低,这对样品的前处理提出了更高的要求。基于LC-MS/MS极强的分抵背景干扰能力和高灵敏度，常常可以简化样品前处理步骤，如对氯霉素和克伦特罗的检测。传统的检测方法是GC-MS，需要衍生，过程繁琐。 LC-MS/MS避免了衍生步骤，前处理相对更加简单。
G. Alfredsson等[36]采用APCI离子源，LC-MS/MS对动物组织中的氯霉素残留进行了分析，样品用乙酸乙酯提取，C18柱固相萃取净化。回收率大于80%，检测限为0.02μg/kg。并且通过与GC-MS相比较，具有更灵敏的检测限(GC-MS为2μg/kg)。余建新等[37]建立了动物组织中克伦特罗的LC-MS/MS检测方法，样品采用乙酸铵缓冲溶液(PH=5.2)溶解, 加入盐酸葡萄糖醛苷酶水解后，C18和SCX双柱SPE净化。平均回收率为94.6%，检测限为0.05μg/kg。
LC-MS也时常用于动物源性食品中兽药残留分析，但很难达到欧盟委员会2002/ 657/ EC 决议规定的4个确证点要求。林黎明等[38]在利用LC-MS检测动物组织中硝基呋喃代谢产物过程中，为了达到这一要求，采用2-硝基苯甲醛和2-氯苯甲醛进行双衍生化处理，产生两个分子离子峰，大大增加了确证信息。虽然达到了确证要求，并且检测限(0.5μg/kg)也满足了最低要求检测限量，但是操作繁琐，过程复杂。LC-MS/MS可以提供丰富的质谱信息，采用MRM检测模式，很容易达到要求。A. Leitner等[39]建立了动物组织中四种硝基呋喃代谢产物的LC-MS/MS的检测方法。样品在酸性条件下经过2-硝基苯甲醛衍生化， LiChrolut EN 柱SPE 净化。MS/MS对每一种待测物的衍生产物选择了一个母离子和两个子离子检测扫描，检测限为0.5-5μg/kg。
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表1.4 LC-MS/MS检测食品中的兽药残留
物质样品前处理离子源质量分析器检测限参考
文献
硝基呋喃类(4种代谢物) 盐腌制品正己烷提取，上
清液在酸性条件
下经过邻硝基苯
甲醛衍生化
三极四极杆
μg/kg
硝基呋喃类(4种代谢物) 蜂蜜，蜂
王浆
在酸性条件下经
过邻硝基苯甲醛
衍生化，乙酸乙
酯提取，蜂王浆
需先用三氯乙酸
沉淀蛋白
ESI 三极四极杆和
离子肼
0.03-0.5
μg/kg
[41，42]
氯霉素类（3种）虾乙酸乙酯/ 25%
氨水, 97 +3,V
/V )提取，正己
烷去脂后，SPE
C18净化
ESI 三极四极杆0.01-0.05
μg/kg
[53]
氯霉素牛奶乙酸乙酯和
10mmol/甲酸水
溶液液-液提取
ESI 三极四极杆0.05ng/mL [54]
氯霉素蜂王浆加入阴性蜂蜜
稀释液混匀，乙
酸乙酯和水提
取，SPE C18净
化ESI 三极四极杆0.1
μg/kg
[55]
孔雀石绿及其代谢物鱼类 McIlvaine
缓冲
液和乙腈提取，
二氯甲烷去水，
SPE 苯磺酸柱
净化
ESI 三极四极杆0.14-0.18
μg/kg
[67]
结晶紫及其代谢物水产品 McIlvaine
缓冲
液和乙腈提取，
SPE 酸性氧化
铝-苯磺酸双柱
净化
ESI 三极四极杆 0.5μg/kg [68]
大环内酯类（5种）动物组
织，牛
奶，蛋
氨基丁三醇缓冲
液（pH 10.5）提
取，加入钨酸钠
沉淀蛋白，，SPE
Oasis柱净化
ESI 三极四极杆0.01-37
μg/kg
[69]
氟喹诺酮类（11种）猪肾乙腈提取，SPE
SDB-RPS柱净
化
ESI 三极四极杆0.3-2.1
μg/kg
[70]
华中科技大学硕士学位论文表1.4 LC-MS/MS检测食品中的兽药残留(续)
氟喹诺酮类（7种）水产品乙腈提取，正己
烷去脂
ESI 三极四极杆0.5-2.9
μg/kg
[71]
喹诺酮类（8种）牛的肌
肉，牛奶，
水产品
二蒸水提取，
SPE C18净化
ESI 离子肼36-110
μg/kg
[72]
磺胺类（16种）蛋乙腈提取，SPE
C18净化
ESI 离子肼5-10
μg/kg
[73]
磺胺类（16种）家禽组织乙腈和0. 01
mol/L乙酸铵溶
液提取，加入正
己烷去除脂肪
ESI 三极四极杆 1.0-12
μg/kg
[74]
磺胺类（10种）动物饲料用甲醇和0.1
mol/ L盐酸提
取，SPE Oasis
HLB 柱净化
ESI 三极四极杆0.5-2.0
μg/kg
[75]
β-内酰胺类（6种）牛的肝
脏，肾脏，
肌肉
肌肉样品用2%
氯化钠溶液提
取，肝脏，肾脏
用5%钨酸盐溶
液和0.17M硫酸
提取，并加入
2%氯化钠沉淀
蛋白，所有样品
都用离子交换
柱SPE净化
ESI 三极四极杆2-10
μg/kg
[76]
抗球虫药类（5种）蛋乙腈提取ESI 三极四极杆0.75-6
μg/kg
[77]
硝基咪唑类（3种）蜂蜜，蜂
王浆，家
禽肌肉组
织
蜂蜜：乙腈提
取；蜂王浆：
0.25mol/LNaOH
和乙腈提取；肌
肉组织：加入
0.5mol/L磷酸盐
缓冲溶（pH
8.8），乙腈提取
ESI 三极四极杆0.1-1.0
μg/kg；
[78-80]
四环素类（4种）动物组
织，蜂蜜，
牛奶，蛋，
鱼肉
0.1MNa2EDA
McIlvaine buffer
(pH 4.0)提取
SPE C18净化
APCI 三极四极杆 1-4μ
g/kg
[81]
华中科技大学硕士学位论文表1.4 LC-MS/MS检测食品中的兽药残留(续)
氨基糖苷类（壮观霉素）牛的肝
脏，肾脏，
肌肉，肥
肉
0.025M柠檬酸
缓冲液，10%三
氯乙酸和二氯
甲烷提取，SPE
CBA柱净化
APCI 三极四极杆 10μg/kg [82]
氨基糖苷类（庆大霉素和新霉素）牛奶加入HCl沉淀蛋
白，提取上清
液，加入柠檬酸
调节PH至中
性，SPE CBA柱
净化
ESI和
APCI
离子肼30μg/kg [83]
氨基糖苷类（链霉素和二氢链霉素）牛奶，蜂
蜜
牛奶：加入水和
5-硫水杨酰基
二水合物，离
心，提取上清
液，加入0.1M
庚烷磺钠，滤膜
过滤
蜂蜜：50mM庚
烷磺酸和25mM
磷酸钠（PH
2.0），SPE C18
净化
ESI 三极四极杆0.25-2
μg/kg
[84]
林肯霉素动物组
织，牛奶乙腈提取，加入
水，正己烷去脂
ESI 三极四极杆0.2-0.5
μg/kg
[85]
甲氧苄氨嘧啶尿样，动
物组织
丙酮- 乙酸乙
酯(体积比20∶
80)提取，SPE
SCX净化
ESI 三极四极杆 0.1μg/kg [86]
1.5.3 LC-MS/MS在食品中真菌毒素残留分析中的应用
真菌毒素(Mycotoxin)是由真菌产生的具有毒性的二级代谢产物，广泛污染农作物、食品及饲料等植物性产品。现已查明自然界存在的真菌毒素在200种以上，按真菌毒素的重要性及危害依次排列为: 黄曲霉毒素(Aflatoxin, AF)、赭曲毒素A(Ochratoxin A,OA)、单端孢霉烯族毒素(Trichothecenes)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEA)。真菌毒素具有两种毒性，一是致DNA损伤，有者可致癌；二是细胞毒性，
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有破坏质膜和细胞膜的作用。真菌毒素对于农作物的污染基于ppb水平的，而且分散极不均匀，对其分析检测存在很大困难。
表1.5 LC-MS/MS检测食品中的真菌毒素
物质样品前处理离子源质量分析器检测限参考文献
玉米赤霉烯酮和单端孢霉烯族毒素类（10种）玉米乙腈和水
(75:25, v/v)提
取，SPE
Carbograph-4柱
净化
ESI三极四极杆≤6
μg/kg
[90]
玉米赤霉烯酮谷类乙腈和水提取，
SPE C18或免疫
亲和性柱净化
APCI 三极四极杆 0.5μg/kg [91]
玉米赤霉烯酮和及其代谢物（3种）啤酒 SPE
C18净化APCI 三极四极杆0.03–0.06
μg/L
[92]
赭曲霉素A 葡萄干
等缓冲液提取，
SPE硅胶柱净
化
ESI三极四极杆 0.5μg/kg [93]
赭曲霉素A 啤洒丙酮沉淀蛋白，
加入水，1%氨
水至pH 6-8，
SPE阴离子交
换柱净化
ESI 离子肼 0.4μg/kg [94]
黄曲霉毒素M1 奶酪两种提取方法：
1.二氯甲烷或
丙酮提取；2.水
和甲醇(90:10,
v/v)提取;基质
分散固相萃取
和SPE
Carbograph-4柱
净化
ESI三极四极杆<0.02
μg/kg
[95]
黄曲霉毒素M1 牛奶丙酮提取，SPE
Carbograph-4柱
净化
ESI和
APPI
三极四极杆0.006
μg/kg
[96]
Leitner等[87]采用RP-18柱固相萃取净化，利用LC-ESI-MS/MS对葡萄酒中赫曲毒素A进行了检测分析，并且与免疫亲和性提取结合液相色谱-荧光检测(HPLC-FL)