《分子生物学》实验报告
实验一植物基因组DNA的提取及其定性、定量分析
【实验目的】
通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。
【实验原理】
CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下(大于0.7 M NaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA。
琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中，并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快，其次为线状DNA(L DNA)，最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。
核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。1 OD260相当于dsDNA 50 μg/mL，ssDNA 33 μg/mL和ssRNA 40 μg/mL。可以此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260 nm和280 nm
的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。
【仪器、材料与试剂】
一、仪器及耗材
离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000 μL 量程各一支)、100 mL或250 mL锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、
1.5 mL EP管、PE手套和乳胶手套。
二、药品
三羟甲基氨基甲烷(Tris)、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、β-巯基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化钠(NaCl)、盐酸、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、核酸染料。
三、试剂
1. 2×CTAB buffer【1】
2.70%乙醇【2】
3.RNaseA (天根)【3】
4.0.5×TBE缓冲液(工作浓度)【4】
5.6×loading buffer【5】
6. 核酸染料(赛百盛)
7. DNA marker DL 2000(Takara)
8. 酚/氯仿(1:1, V/V) 【6】
【实验步骤】
1. 取约100 mg新鲜的拟南芥嫩叶放入1.5 mL EP管，在液氮冷冻条件下研磨成粉末状。
2. 加入0.6 mL 2×CTAB提取液（用前加入0.2﹪的巯基乙醇），混匀，65℃水浴30 min，
每10 min颠倒混匀一次。
3. 取出离心管，冷却后加入0.6 mL酚氯仿混合液，混匀。
4. 11,500 rpm室温离心8 min(若没离好可重复一次)。
5. 将上清液(约400 μL)转移到另一新的1.5 mL离心管中。
6. 加入与上清等体积的氯仿，混匀，11,500 rpm 离心8 min，取上清(约350μL)。
7. 加入600 μL无水乙醇，上下颠倒混匀，-80℃放置30 min。
8. 4℃，15,800 rpm离心20 min，弃上清。
9. 1 mL 70％乙醇(预冷)洗涤沉淀2次，上下颠倒几次，不能vortex，7,000 g离心3 min，弃上清，风干。
10. 加入30 μL无菌水(含20 μg/mL RNase A)，37℃溶解DNA 30 min。
11. 取5 μL DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测：
(1) 制备琼脂糖凝胶
称取0.3 g 琼脂糖，放入三角瓶中，加入30 mL 0.5× TBE缓冲液，置微波炉中加热至完全熔化，取出摇匀，则为1％琼脂糖凝胶液。
(2) 胶板的制备
①取有机玻璃内槽，洗净，晾干，用橡皮膏或胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（一定封严，不能留缝隙），形成一个模具。
②将有机玻璃内槽放置于一水平位置，并在固定位置放好样品梳子。
③待琼脂糖凝胶液冷却到60℃左右时，加入核酸染料1.5 μL，摇匀，缓缓倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面（注意不要形成气泡）。
④室温下静置直至凝胶完全凝固（室温下30-45 min），垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。
⑤加入0.5× TBE电泳缓冲液至电泳槽中，使缓冲液没过胶面约1 mm。
(3) 加样
在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1×。用10 μL微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，将DNA marker分别加至样品孔的左侧和右侧孔内。每加完一个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面（注意：加样前要先记下加样的顺序）。
(4) 电泳
①接通电泳槽与电泳仪的电源，DNA片段从负极（黑色插头）向正极（红色插头）移动）。DNA的迁移速度与电压成正比，但电压升高使琼脂糖凝胶的有效分离范围降低，因此，最高电压不超过5V/cm。
②当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳。
③紫外灯下观察琼脂糖凝胶中的带（戴手套操作），采用凝胶成像系统拍照保存。
12.紫外分光光度法测定DNA浓度及纯度：
(1) 用0.1×TE对待测DNA样品按1:20或合适的倍数稀释。
(2) 开机，仪器会自动对光路及分析软件进行检测，待显示屏上出现“instrument Ready”
时，进入核酸测定窗口。
(3) 调零。先用0.1×TE缓冲液注入样品杯，放入样品槽，关闭盖板。点击“set ref”键，仪
器自动校正零点。将样品槽内的样品杯取出，换上待测样品。
(4) 吸70 μL已稀释的DNA样品转入石英样品杯，放入样品槽，关闭盖板。如果样品很
少，可以用5-7 μL的石英样品杯。点击“enter” 键，仪器即进入分析状态。窗口同时显示260
nm和280 nm处的光密度（OD值）及A260/A280 nm和A280/A260 nm的比率以及DNA样
品的浓度等。
(5) 打开盖板，取出石英样品杯，吸出样液，用超纯水清洁石英样品杯，风干后，再加
入下一个待测样品。
(6) DNA纯度：以A260/ A280比值来反映。当A260 /A280比值<1.8时，说明样品存在蛋
白质或酚等杂质，可采用平衡酚/氯仿/异戊醇再抽提除去蛋白质或用氯仿或乙醚抽提去除残
留酚，再用无水乙醇沉淀，TE溶解后再测定。当A260/A280比值>2.0，说明样品存在RNA
污染，可以用RNA酶处理样品去除RNA。
实验结果与分析
1. 1%的琼脂糖凝胶电泳检测拟南芥基因组DNA
1%的琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA 5μl样品，电泳结果如图所示
C组电泳结
果如图所
示
有DNA 条带出现，表明已经成功提取到了拟南芥的基因组
DNA 。
2.DNA 样品的OD 检测 检测OD 值 C1：浓度:1061.7 ng/
OD260/OD280：1.87
表明：C1接种DNA 质量良好。（如下图所示）
C2：浓度:1017.6ng/
OD260/OD280：1.86
表明:C2接种DNA质量良好。（如下图所示）
C3：浓度:711.0ng/
OD260/OD280：1.86
表明:C3接种DNA质量良好。（如下图所示）
注意事项：1、磨样时要反复插入液氮中冷冻，但要避免液氮进入管中；
2、取酚氯仿混合液时要吸取下层；
3、加入酚氯仿和氯仿时要充分混匀；
4、氯仿抽提后取上清时不要吸到蛋白层；
5、晾干沉淀时，要尽可能的吸除酒精。
实验二PCR扩增目的片段
【实验目的】
通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。
【实验原理】
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将待扩增的DNA片段与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。
典型的PCR 反应体系由如下组分组成：DNA 模板、反应缓冲液、dNTP、两个合成的
DNA引物、耐热DNA聚合酶。PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。整个扩增过程分三步：①变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段；②退火，快速降低温度至50-60℃后，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火阶段；③延伸，溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4 种脱氧核苷三磷酸（dNTP)，按5′→3′方向复制出互补DNA ，即引物的延伸阶段。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA 量就增加一倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。经过25-30个循环后，DNA可扩增106-109倍。PCR扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。
【仪器、材料与试剂】
一、仪器及耗材
PCR热循环仪、台式离心机、电泳仪、凝胶成像系统、移液器（0.1-2.5 μL）、200 μL PCR管、吸头、离心管、手套、制冰机、微量移液器（10、100、1000 μL量程各一支）、100 mL或250 mL锥形瓶、量筒、点样板或parafilm、吸头、PE手套和乳胶手套。
二、试剂
1. 10 ×缓冲液
2. DNA 模板 1 ng/μL（以实验一提取的拟南芥基因组DNA为模板）
3. dNTP Mix (Takara)
4．引物
P3：5′-CGG GTA CCG GTG AAT TAA GAG GAG AGA GGA GG-3′
P5：5′-ACT CTA GAT GAG TAA AAC AGA GGA GGG TCT CAC-3′
引物溶液浓度：2 μM
5. rTaq 酶 5 U/μL
6. 低熔点琼脂糖
7. 去离子水或TE（pH7.6）【7】
【实验步骤】
1．在200 μL PCR 管内配制20 μL 反应体系：
反应物体积/μL
ddH2O 11.3
10×PCR 缓冲液 2.0
dNTP 1.6（终浓度20—200 μM）
引物1 2.0（引物终浓度0.2 μM）
引物2 2.0（引物终浓度0.2 μM）
模板DNA 1.0
rTag 酶0.1
Total 20
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2. 将上述试剂依次加入PCR薄壁管。加样后用手轻弹混匀，6,000 rpm离心15 sec使反应成分集于管底。
3. PCR反应热循环程序设置：
①94 ℃预变性3 min;
②94 ℃变性30 sec;
③64 ℃退火30 sec; 30 cycles
④72 ℃延伸 1 min;
⑤72 ℃延伸10min;
⑥16℃pause
反应结束后短暂离心，置4℃保存备用。
4. 配制1％的琼脂糖凝胶。
5. 取5 μL PCR产物，加1 μL的6× loading buffer(上样缓冲液)，轻弹混匀后进行电泳检测。
6. 如果PCR产物非常特异，可以直接用于与载体的重组连接。
【实验结果】
本实验扩增片段长652 bp。
注意事项：1、加样时要精确用移液器。
2、检查PCR仪是否热盖。
3、每种试剂弹化后要离心；
做MIX时，最后加酶，分装之前要混匀；
分装后需离心混匀。
实验二的PCR扩增
实验结果与分析
用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，电泳结果如图所示，有DNA条带，约600 bp；或者无DNA条带。
植物基因组DNA提取试剂盒 1 取植物新鲜组织约100 mg或干重组织约30 mg，加入液氮充分研磨。 2 将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700 μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20 min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。 3 加入700 μL氯仿，充分混匀，12,000 rpm（~13,400×g）离心5 min。 注：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚：氯仿/1:1进行等体积抽提。 4 小心的将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中，加入700 μL缓冲液GP2，充分混匀。 5 将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，弃掉废液。（吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心。） 6 向吸附柱CB3中加入500 μL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 7 向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 8 重复操作步骤7。 9 将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中的乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。 10 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min，12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，将溶液收集到离心管中。 注意：洗脱缓冲液体积不应少于50 μL，体积过小影响回收率。洗脱液的PH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置 2 min，12,000 rpm （~13,400×g）离心2 min。
４期吴永升等：植物数量性状全基因组选择研究进展１５１１ 全基因组选择的概念和原理 全基因组选择（Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ＧＷＳ），又称基因组选择（Ｇｅｎｏｍｉｃｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ＧＳ），由Ｍｅｕ—ｗｉｓｓｅｎ于２００１年首先提出∞Ｊ。主要是通过全基因组中大量的分子标记和参照群体（ｔｒａｉｎｉｎｇｐｏｐｕｌａ—ｔｉｏｎ）的表型数据建立ＢＬＵＰ模型估计出每一标记的育种值，然后仅利用同样的分子标记估计出后代个体育种值并进行选择［７】。 全基因组选择理论主要利用连锁不平衡信息，即假设标记与其相邻的ＱＴＬ处于连锁不平衡状态，因而由相同标记估计的不同群体的染色体片段效应是相同的，这就要求标记密度足够高以使所有的ＱＴＬ与标记处于连锁不平衡（ＬＤ）状态哺Ｊ。而目前随着拟南芥、水稻、玉米等植物基因组序列图谱及ＳＮＰ图谱的完成或即将完成，提供了大量的ＳＮＰ标记用于基因组研究。而随着ＳＮＰ芯片等大规模高通量ＳＮＰ检测技术的发展和成本的降低，使得全基因组选择应用成为可能。 ２全基因组选择的基本方法及案例说明 ２．１全基因组选择的基本方法 全基因组选择在实施过程中应该包括以下几个基本步骤：在需要实行选择的参照群体中获取参照群体的基因型数据和表现型数据；然后，通过ＢＬＵＰ程序估计出每个标记位点的标记效应值，从而获得育种值；最后，在接下来每一轮的选择中，不再需要表型数据，根据每一轮次群体基因型信息估计育种值，直接选择群体的优良单株【９ｊ。 全基因组选择的核心过程就是用从参照群体中每一个体的表现型数据和基因型数据建立的数学模型来估算接下来的育种群体中仅有基因型数据的个体的ＧＥＢＶ值。由既有表现型数据又有基因型数据的每一个体组成的群体被成为参照群体。参照群体用来估计数学模型的参数，这个参数接着用来计算仅有基因型数据的育种个体ＧＥＢＶ值，然后根据计算的ＧＥＢＶ值对育种群体进行选择并提升到下一轮次的选择中。因此，通过模型来预测个体的育种值，可以不进行表型鉴定就直接对育种群体的个体进行选择（Ｍｅｕｖｉｓｓｅｎ，２００１）。为了使估算的ＧＥＢＶ值尽可能地准确，参照群体必须具有代表性，尽可能地代表接下来在育种过程中用全基因组选择方法来进行选择的分离群体。 ２．２全基因组选择方法案例 如图ｌ所示，在这个例子中，笔者的目标是把外来种质中的优良性状基因（包括产量、矮杆、抗逆等）导入本地优良的自交系，从而实现种质的改良 图１在玉米中利用全基因组选择方法导入外源种质 Ｆｉｇ．１Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅｓｅｌｅｃｔｉｏｎｔｏ ｉｎｔｒｏｇｒ％ｅｘｏｔｉｃｔｒａｉｔｓｉｎｔｏａｄａｐｔｅｄｍａｉｚｅ
1 快速微量提取法A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。 B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE 溶液中，置4oC保存备用。 2 蛋白酶/SDS法制备先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE （50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h~5h，接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。 3 1) 细菌培养：细菌接种于5ml 液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。2) 细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP 管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O 也行)。3) 菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）4) 抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）5) 沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1 2000rpm离心10min。6)洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。7) 抽（凉）干后，溶于50μl ddH2O中，取2-5μl电泳。作PCR模板用。
水稻、玉米、大豆、甘蓝、白菜、高粱、黄瓜、西瓜、马铃薯、番茄、拟南芥、杨树、麻风树、苹果、桃、葡萄、花生 拟南芥籼稻粳稻葡萄番木瓜高粱黄瓜玉米栽培大豆苹果蓖麻野草莓马铃薯白菜野生番茄番茄梨甜瓜香蕉亚麻大麦普通小麦西瓜甜橙陆地棉梅毛竹桃芝麻杨树麻风树卷柏狗尾草属花生甘蓝 物种基因组大小和开放阅读框文献 Sesamum indicum L. Sesame 芝麻（2n = 26）293.7 Mb, 10,656 orfs 1 Oryza brachyantha短药野生稻261 Mb, 32,038 orfs 2 Chondrus crispus Red seaweed爱尔兰海藻105 Mb, 9,606 orfs 3 Pyropia yezoensis susabi-nori海苔43 Mb, 10,327 orfs 4 Prunus persica Peach 桃226.6 of 265 Mb 27,852 orfs 5 Aegilops tauschii 山羊草（DD）4.23 Gb (97% of the 4.36), 43,150 orfs 6 Triticum urartu 乌拉尔图小麦（AA）4.66 Gb (94.3 % of 4.94 Gb, 34,879 orfs 7 moso bamboo (Phyllostachys heterocycla) 毛竹2.05 Gb (95%) 31,987 orfs 8 Cicer arietinum Chickpea鹰嘴豆~738-Mb，28,269 orfs 9 520 Mb (70% of 740 Mb), 27,571 orfs 10 Prunus mume 梅280 Mb, 31,390 orfs 11 Gossypium hirsutum L.陆地棉2.425 Gb 12 Gossypium hirsutum L. 雷蒙德氏棉761.8?Mb 13 Citrus sinensis甜橙87.3% of ~367 Mb, 29,445 orfs 14 甜橙367 Mb 15 Citrullus lanatus watermelon 西瓜353.5 of ~425 Mb (83.2%) 23,440 orfs 16 Betula nana dwarf birch，矮桦450 Mb 17
植物基因组DNA的提取及其定性定量分析 【实验目的】 通过本实验学习利用CTAB法从植物组织中提取DNA并通过琼脂糖凝胶电泳及紫外分光光度法对DNA进行定性定量分析。 【实验原理】 CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)是一种阳离子型去污剂，可溶解细胞膜，在高离子强度下(大于0.7 M NaCl)，与蛋白和中性多糖形成复合物沉淀出来。利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。然后加入CTAB缓冲液将DNA溶解出来，再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，最后经乙醇沉淀得到DNA。 琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样品加入到一块包含电解质的多孔支持介质(琼脂糖凝胶)的样品孔中，并置于静电场上。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此，在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，分子量小的DNA分子比分子量大的DNA分子迁移速率快，迁移距离远，由此得到分离。凝胶电泳也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子，超螺旋质粒DNA(cccDNA)泳动最快，其次为线状DNA(L DNA)，最慢的为开环质粒DNA(ocDNA)。 核酸分子(DNA或RNA)由于含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在260 nm波长处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸的浓度成正比，这个物理特性为测定核酸溶液浓度提供了基础。 1 OD260相当于dsDNA 50 μg/ml，ssDNA 33 μg/ml和ssRNA 40 μg/ml。可以此来计算核酸样品的浓度。紫外分光光度法不但能确定核酸的浓度，还可通过测定260 nm和280 nm 的紫外线吸收值的比值(A260/A280)估计核酸的纯度，若DNA的A260/A280比值高于2.0，则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。 【仪器、材料与试剂】 一、仪器及耗材离心机、恒温水浴器、台式离心机、电子天平、水平电泳槽、电泳仪、凝胶成像分析系统、高压灭菌锅、紫外线透射仪、微波炉、紫外分光光度仪、微量移液器(10、100、1000 μl量程各一支)、100 ml或250 ml锥形瓶、量筒、液氮、研磨棒、点样板或parafilm、吸头、1.5 ml EP管、PE手套和乳胶手套。 二、药品 三羟甲基氨基甲烷(Tris)、CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、β-巯基乙醇、氯仿、苯酚、乙醇、氯化钠(NaCl)、盐酸、液氮、硼酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、核酸染料。 三、试剂 1. 2×CTAB buffer 70%乙醇 RNaseA 0.5×TBE缓冲液(工作浓度) 凝胶加样缓冲液(6×) 6. 核酸染料 7. DNA marker 8. 酚/氯仿(1:1, V/V)
千年基因将应邀参加第十六届全国植物基因组学大会 第十六届全国植物基因组学大会将于2015年8月19日-22日在陕西杨凌召开，千年基因应邀参加此次会议，并将在会场学术交流区设立展台。届时千年基因的技术团队会向大家展示我们最全面的测序平台、一站式的基因组学解决方案以及近年来在植物基因组学领域取得的科研成果，欢迎广大科研人员莅临指导交流！ 在测序平台方面，千年基因目前拥有国内最全面的测序平台，能够为科研人员提供一站式解决方案。以PacBio RS II三代平台为例，千年基因自去年提供PacBio RS II测序以来，通过项目经验的积累及严格的质量控制，目前各项数据指标已达国内最高水平。数据产出已稳步升级至1.4Gb/ SMRT cell，读长最长可达42 Kb，reads N50高达18Kb，远超PacBio官方提供的数据标准！在植物基因组de novo测序的研究中，千年基因提供的超长读长测序可更好地跨越基因组高重复序列、转座子区域以及大的拷贝数变异区域和结构变异区，从而实现对高杂合及高重复基因组的完美组装。在植物转录组测序的研究中，千年基因提供的超长读长测序无需拼接即可获得全长转录组序列信息，同时可获得全面的可变剪切、融合基因以及Isoform信息。另外，千年基因提供的HiSeq 4000及HiSeq 2000/2500测序可解决研究人员在植物基因组重测序、转录组测序、小RNA测序等方面的科研需求。 在项目经验方面，千年基因与来自全球的科研人员合作开展了大量植物基因组项目，相关成果已发表于Nature、Nature Genetics、Science等杂志。例如，油棕榈基因组项目在Nature 杂志同时发表两篇文章，辣椒基因组项目的成果发表于Nature Genetics，玉米基因组项目的成果发表于Science。在国外合作方面，千年基因与美国爱荷华州立大学Patrick Schnable教授领导的国际玉米基因组团队合作开展的上万份玉米样本重测序项目也正在进行中；千年基因与国际半干旱热带作物研究所建立长期战略合作关系，正在开展上千份木豆、鹰嘴豆及高粱样本的群体遗传学研究；同时千年基因与华盛顿大学的Evan Eugene Eichler院士及佐治亚大学的Jeffrey Lynn Bennetzen院士也有大量基因组项目合作。在国内合作方面，千年基因与广东省农科院、山东省农科院共同启动的花生基因组项目已全部完成de novo测序及数据挖掘，同时与中国科学院、北京大学、中国农业大学、中国科学技术大学、上海交通大学、
植物基因组DNA提取 一、实验目的 1、掌握植物基因组总DNA的抽提方法和基本原理。 2、学习根据不同的植物和实验要求设计和改良植物总DNA抽提方法。 二、实验原理 通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。 十六烷基三甲基溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide，简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。 三、实验仪器及试剂 实验仪器：高速离心机；烘箱；冰箱；水浴锅；高压灭菌锅；Nanodrop。 实验试剂：玻璃珠，十二烷基磺酸钠(SDS)；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；乙二胺四乙酸（EDTA）；氯化钠；苯酚；氯仿；无水乙醇等。 四、实验步骤 1.SDS提取缓冲液在65℃水浴中预热。 2.将叶片置于1.5ml离心管中，液氮速冻，组织研磨器打样。 3.加入700 l的SDS提取缓冲液，涡旋摇匀。 4.置于65℃的水浴中，每隔10 min轻轻摇动，30 min后取出。
5.加入200 μl KAc溶液，摇匀，放入-20℃冰箱30 min。 6.10000 rpm离心5 min，上清移至新离心管中，12000 rpm离心5 min。 7.上清移至新离心管中，加入700 μl异丙醇，-20℃冰箱30 min。 8.10000 rpm离心5 min，弃上清，加入500 μl 70%乙醇漂洗。 9.弃液体，晾干。 10. DNA纯度与浓度测定（使用nanodrop）。 （1）DNA纯度：DNA的OD260/OD280一般为1.8左右。 OD260/OD280 ≈ 1.8：说明较纯； OD260/OD280 > 1.8：说明可能有RNA污染； OD260/OD280 < 1.8：说明可能有蛋白质污染。 五、注意事项 1. 叶片磨得越细越好。 2. 注意移液器的正确使用。 3. 由于植物细胞中含有大量的DNA酶，因此，除在抽提液中加入EDTA抑制酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使DNA降解。 六、结果与分析 1.植物DNA提取所用试剂的作用？ 2.植物DNA提取的关键步骤有哪些？ 3.植物DNA提取后的用途有哪些？ 4.从化学结构、化学性质、存在场所以及功能等方面比较DNA和RNA的异同。
全基因组从头测序(de novo测序) https://www.doczj.com/doc/9f15789735.html,/view/351686f19e3143323968936a.html 从头测序即de novo 测序，不需要任何参考序列资料即可对某个物种进行测序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。利用全基因组从头测序技术，可以获得动物、植物、细菌、真菌的全基因组序列，从而推进该物种的研究。一个物种基因组序列图谱的完成，意味着这个物种学科和产业的新开端！这也将带动这个物种下游一系列研究的开展。全基因组序列图谱完成后，可以构建该物种的基因组数据库，为该物种的后基因组学研究搭建一个高效的平台；为后续的基因挖掘、功能验证提供DNA序列信息。华大科技利用新一代高通量测序技术，可以高效、低成本地完成所有物种的基因组序列图谱。包括研究内容、案例、技术流程、技术参数等，摘自深圳华大科技网站 https://www.doczj.com/doc/9f15789735.html,/service-solutions/ngs/genomics/de-novo-sequencing/ 技术优势: 高通量测序：效率高，成本低；高深度测序：准确率高；全球领先的基因组组装软件：采用华大基因研究院自主研发的SOAPdenovo软件；经验丰富：华大科技已经成功完成上百个物种的全基因组从头测序。 研究内容: 基因组组装■K-mer分析以及基因组大小估计；■基因组杂合模拟（出现杂合时使用）； ■初步组装；■GC-Depth分布分析；■测序深 度分析。基因组注释■Repeat注释； ■基因预测；■基因功能注释；■ ncRNA 注释。动植物进化分析■基因家族鉴定（动物TreeFam；植物OrthoMCL）；■物种系统发育树构建； ■物种分歧时间估算（需要标定时间信息）；■基因组共线性分析； ■全基因组复制分析（动物WGAC；植物WGD）。微生物高级分析 ■基因组圈图；■共线性分析；■基因家族分析； ■CRISPR预测；■基因岛预测（毒力岛）； ■前噬菌体预测；■分泌蛋白预测。 熊猫基因组图谱Nature. 2010.463:311-317. 案例描述 大熊猫有21对染色体，基因组大小2.4 Gb，重复序列含量36%，基因2万多个。熊猫基因组图谱是世界上第一个完全采用新一代测序技术完成的基因组图谱，样品取自北京奥运会吉祥物大熊猫“晶晶”。部分研究成果测序分析结果表明，大熊猫不喜欢吃肉主要是因为T1R1基因失活，无法感觉到肉的鲜味。大熊猫基因组仍然具备很高的杂合率，从而推断具有较高的遗传多态性，不会濒于灭绝。研究人员全面掌握了大熊猫的基因资源，对其在分子水平上的保护具有重要意义。 黄瓜基因组图谱黄三文, 李瑞强, 王俊等. Nature Genetics. 2009. 案例描述国际黄瓜基因组计划是由中国农业科学院蔬菜花卉研究所于2007年初发起并组织，并由深圳华大基因研究院承担基因组测序和组装等技术工作。部分研究成果黄瓜基因组是世界上第一个蔬菜作物的基因组图谱。该项目首次将传
程论文（作业）封面（2011 至2012 学年度第 2 学期）课程名称：_ ___ 课程编号：___________ 学生姓名：__ ________ 学号：_______ 年级：__ ___________ 任课教师: _ ____________ 提交日期：年月日成绩：__________________ 教师签字：__________________ 开课---结课：第周---第周评阅日期：年月日
植物的功能基因组学研究进展 摘要:基因组研究计划包括以全基因组测序为目标的结构基因组学和以基因功能鉴定为 目标的功能基因组学两方面的内容。目前基因功能鉴定的方法主要有:基因表达的系统分析(SAGE) 、cDNA 微阵列、DNA(基因) 芯片、蛋白组技术以及基于转座子标签和T-DNA 标签的反求遗传学技术等。本文对上述各种技术的优缺点以及它们在植物基因功能鉴定中的应用进行了综述。 关键词:功能基因组学; 基因表达的系统分析;cDNA 微阵列;DNA 芯片;蛋白组 以拟南芥和水稻为代表的植物基因组研究已取得了迅速的进展,到目前为止,占拟南芥基因组(100Mb) 近三分之一的DNA 序列已被测定并在GenBank 数据库中登记注册,预期到2001 年通过全球合作将完成拟南芥全基因组的序列测定工作。随着植物基因组计划的实施和进展,GenBank 中累积了大量的未知功能的DNA 序列,如何鉴定出这些基因的功能将成为基因组研究的重点课题, 因此, 基因组研究应该包括两方面的内容: 以全基因组测序为目标的结构基因组学(structural genomics) 和以基因功能鉴定为目标的功能基因组研究, 后者往往又被称为后基因组研究。功能基因组研究的内容是利用结构基因组所提供的信息, 发展和应用新的实验手段系统地分析基因的功能〔1 〕。目前人类和酵母的功能基因组研究已经全面展开, 尤其是对已完成全基因组测序的酵母来说, 其功能基因组研究任务更加紧迫。植物的基因组研究虽然起步较晚, 但由于吸取了人类基因组研究中积累的一些经验, 所以进展也相当迅速, 对植物功能基因组学的研究目前也已经受到重视, 在1998 年12月出版的最新一期Plant Cell (10 :1771) 和Plant Physiol . (118 :713) 上均编发了关于植物功能基因组学研究的编者按, 并由Bouchez 和Hofte (1998) 〔2 〕综述了植物尤其是拟南芥功能基因组学研究的现状, 本文在此基础上综述了目前植物功能基因组学研究中使用的主要技术手段以及最新的研究进展。 1 基因功能的含义 基因的功能主要包括: 生物化学功能, 如作为蛋白质激酶对特异的蛋白质进行磷酸化修饰; 细胞学功能, 如参与细胞间和细胞内的信号传递途径; 发育上的功能, 如参与形态建成等。目前,获得一段DNA 序列的功能信息的最简单的方法是将该DNA 序列与GenBank 中公布的基因序列进行同源性比较,如利用BLASTn 和BLASTx 两种软件分别进行核苷酸和氨基酸序列同源性比较等。同源性比较的结果大体可以分为如下类型: 与生化和生理功能均已知的基因具同源性; 与生化功能已知的基因具同源性, 但该基因的生理功能未知;与其它物种中生化和生理功能均未知的基因具同源性; 虽与生化和生理功能均已知的基因具同源性, 但对该基因功能的了解尚不深入, 仍停留在表观现象上。上述同源性检索分析方法仅仅为该DNA 片段的功能提供了间接的证据,对基因功能的直接证据还需要实验上的数据。Bouchez 和Hofte (1998)〔2 〕将所需要的实验证据归纳如下: (1) 通过研究基因的时空表达模式确定其在细胞学或发育上的功能, 如在不同细胞类型、不同发育阶段、不同环境条件下以及病原菌侵染过程中mRNA 和/ 或蛋白质的表达的差异等。(2) 研究基因在亚细胞内的定位和蛋白质的翻译后调控等。(3) 利用基因敲除(knock - out) 技术进行功能丧分析或通过基因的过量表达(转基因) 进行功能获(gain2of2function) 分析,进而研究目的基因与表型性状间的关系。(4) 通过比较研究自发或诱发突变体与其野生型植株在特定环境条件下基因表达的差异来获取基因功能的可能信息。 2 植物的表达序列标记(EST) 与基因组大规模测序 通过从cDNA 文库中随机挑取的克隆进行测序所获得的部分cDNA 的5′或3′端序列称为表达序列标记( EST) ,一般长300～500bp 左右, 利用EST作为标记所构建的分子遗传图
植物基因组D N A提取试剂盒(北京天根)
植物基因组DNA提取试剂盒 1 取植物新鲜组织约100 mg或干重组织约30 mg，加入液氮充分研磨。 2 将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700 μL 65℃预热缓冲液GP1的离心管中（实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1%），迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20 min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。 3 加入700 μL氯仿，充分混匀，12,000 rpm（~13,400×g）离心5 min。 注：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚：氯仿/1:1进行等体积抽提。 4 小心的将上一步所得水层上相转入一个新的离心管中，加入700 μL缓冲液GP2，充分混匀。 5 将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，弃掉废液。（吸附柱容积为700μL左右，可分次加入离心。） 6 向吸附柱CB3中加入500 μL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 7 向吸附柱CB3中加入600 μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000 rpm（~13,400×g）离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。 8 重复操作步骤7。 9 将吸附柱CB3放回收集管中，12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂
洗液。 注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中的乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。 10 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200 μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5 min，12,000 rpm（~13,400×g）离心2 min，将溶液收集到离心管中。 注意：洗脱缓冲液体积不应少于50 μL，体积过小影响回收率。洗脱液的PH值对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2 min，12,000 rpm （~13,400×g）离心2 min。
基因组DNA提取步骤 1.从无水乙醇中取出少许组织（约50mg）加入干净灭菌的EP管中， 剪碎； 2.加入400ul 1％的SDS，8ul（20mg/ml）的蛋白酶K，充分浸润， 入55℃摇床（100转/分），期间振荡助溶至澄清（5-6h）； 3.取出消化液，加入6mol/L的NaCl300ul，氯仿200ul，轻柔正反 颠倒，使其充分乳化，4℃13000转/分离心30min； 4.取出上清（约400ul），加入等体积氯仿抽提一次，轻柔颠倒后， 4℃13000转/分离心10min； 5.上清加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃10分钟, 除去RNA(RNA对DNA的操作、分析一 般无影响，可省略该步骤）。 6.取上清加入等体积异丙醇，轻柔混匀后-20℃沉淀10min； 7.4℃13000转/分离心15min，弃上清； 8.用75％乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心2min），弃上 清； 9.冰冻无水乙醇洗涤1-2次（1000ul，11000转/分离心4min）弃上 清，自然晾干或烘干，DDW溶解，30-50ul。 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，
基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。 本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。 从植物组织提取基因组DNA 一、材料 水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。 二、设备 移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和 1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。 三、试剂 1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。 3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇 4、RnaseA母液：配方见第一章。 5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。 四、操作步骤： （一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA提取 1. 在50ml离心管中加入20ml提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。 2. 水稻幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60分钟(时间长,DNA产量高), 不时摇动。 3. 加入20ml氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10分钟, 使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。 4. 室温下5000rpm离心5分钟。 5. 仔细移取上清液至另一50ml离心管,加入1倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA沉淀。 6. 在1.5ml eppendorf中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA絮团,在干净吸水纸上吸干,转
第9卷 第1期2007年3月 衡水学院学报 J o u r n a l o f H e n g s h u i U n i v e r s i t y V o l.9,N o.1 Ma r.2007植物功能基因组学及其研究技术 崔兴国 (衡水学院 生命科学系,河北 衡水053000) 摘 要:植物基因组的研究已经由以全基因组测序为目标的结构基因组学转向以基因功能鉴定为目标的功能基因组学研究.植物功能基因组学研究是利用结构基因组学积累的数据,从中得到有价值的信息,阐述D N A序列的功能,从而对所有基因如何行使其职能并控制各种生命现象的问题作出回答.近年来植物功能基因组学的研究技术主要包括表达序列标签、基因表达的系列分析、D N A微阵列和反向遗传学等.对植物功能基因组学的研究将有利于我们对基因功能的理解和对植物形状的定性改造和利用. 关键词:植物;功能基因组学;研究技术 中图分类号:Q3-3 文献标识码:A 文章编号:1673-2065(2007)01-0023-04 基因是细胞的遗传物质,决定细胞的生物学形状,细胞的生物学功能最终是由大量的基因表达完成的.随着人类基因组“工作框架图”的完成,生命科学研究的重点已经从结构基因组学转移到了功能基因组学的研究,特别是模式植物拟南芥(A r a b i d o p-s i s t h a l i a n a)和水稻(O r y z a s a t i v a)基因组测序的完成,公共数据库中已经积累了大量基因序列信息,获得了许多与植物发育相关的功能基因,在此基础上应用实验分析方法并结合统计和计算机分析来研究基因的表达、调控与功能,并相应诞生和发展了一批新的研究技术,为功能基因组学的研究提供了必要而有效的技术支撑.功能基因组学研究的最终目标是解析所有基因的功能,即从基因水平上大规模批量鉴定基因的功能,进而全面研究控制植物生长发育及响应环境变化的遗传机制,在基因组序列与细胞学行为之间起到桥梁作用,共同承担起从整体水平上解析生命现象的重任. 1 植物功能基因组学研究 植物的生长和发育是一个有机体或有机体的一部分形态建成和功能按一定次序而进行的一系列生化代谢反应的总合,反应在分子水平上,它要求相应的遗传代谢途径必须按照特定的时空次序严格进行以保证正常发育.植物功能基因组研究就是要利用植物全基因组序列的信息,通过发展和应用系统基因组水平的实验方法来研究和鉴别基因组序列的作用;研究基因组的结构、组织与植物功能在细胞、有机体和进化上的关系以及基因与基因间的调控关系;从表达时间、表达部位和表达水平3个方面对目的基因在植物中的精细调控进行系统研究.当前植物功能基因组学研究主要集中于一年生的拟南芥与水稻两个物种上,这主要是由于它们的遗传背景清楚,基因组较小,基因结构简单而且易于进行分子生物学操作.拟南芥研究组“2010计划”的宏伟目标是充分利用拟南芥基因组计划获得的序列信息并结合功能基因组研究技术来获知其25000个基因的全部功能,例如开花的诱导过程是植物生活周期中最奇妙的过程,目前从拟南芥中鉴定了提早开花和延迟开花的多种突变体,显示植物开花受多个遗传基因的控制,如延迟开花的两个突变体是由等位基因 C O(C O N S T A N S)和L D(C O L D L U M I N I D E P E N- D E N S)突变引起,这两个基因均已被克隆,并使其在转基因植物的叶片中进行表达,将C O基因转移到拟南芥中,高效表达C O蛋白的转基因植株即使处于短日照条件下也会开花,这说明C O基因具有激活开花基因的作用.对模式植物功能基因组的研究将有助于整个植物基因组学的研究. 目前的功能基因组研究主要包括以下几个方面:(1)c D N A全长克隆与测序;(2)获得D N A芯片 ①收稿日期:2006-10-12 作者简介:崔兴国(1963-),女,河北冀州市人,衡水学院生命科学系副教授.
1.2实验方法 1.2.1 茶花基因组DNA的提取 采用CTAB法[8]提取DNA，所有试剂（有机溶剂除外）和器皿都经高压灭菌，主要步骤如下： （1）取两片幼嫩新鲜叶片，置于预冷的研钵中，倒入适量液氮，迅速研磨成粉末状，随后加入3ml预热的2%CTAB抽提缓冲液和50ul抗氧化剂2-巯基乙醇，继续研磨成略有流动性的糊状或粥状，转入1.5ml的离心管中，于65℃水浴锅中保温约60min. (2)待混合物冷却至室温后加入等600ul的CI（氯仿：异戊醇=24：1）溶液混匀，轻轻颠倒离心管几次使管内混合物成乳浊液，常温下10000rpm离心10min,取上清液转入另一干净的离心管中。 （3）重复步骤（2）一次。 （4）取步骤（3）上清液加入2.5倍体积无水乙醇，仔细混匀，-20冰箱30min以上，沉淀DNA 4℃，12000rpm离心10min. (5)弃去上层有机溶剂，加500ul75%乙醇洗涤沉淀，4℃下8000rpm离心5min,弃去上清，洗涤沉淀3次。 （6）倒置或者37度培养箱烘干. (7)加50ulTE缓冲液溶解DNA，于-20℃冷藏备用。 1.2.2 DNA含量和质量的测定 （1）紫外分光光度法：取4ml提取的DNA，将之稀释200倍，测定提取的DNA在260nm 和280nm处的吸光度值，得出OD260/280的值以及DNA和蛋白质浓度。如蛋白质浓度过高，需纯化。 （2）琼脂糖凝胶电泳：配制1.0%琼脂糖凝胶，在0.5×TBE缓冲液中，电压5V/cm电泳约60min，溴化乙锭染色20min,在凝胶成像系统上观察并拍照。 1.2.3 PCR扩增 (1)PCR反应在Biometro PCR仪上进行，反应体系为25ul:ddH2O 14ul,10×Buffer 2.5ul,MgCl(25mM) 2.5ul,dNTPs(2.5mM) 2.0ul,primer(2.0uM) 1.0ul,DNA 2.7ul(约
四川大学实验报告 题目：的提取与检测植物基因组DNA一、实验目的 1.了解真核生物基因组DNA提取的一般原理； 2.掌握基因组DNA提取的方法和步骤。 二、实验原理 1.在液氮中对植物组织进行研磨，破碎细胞； 2.SDS等离子型表面活性剂能溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使核蛋白解聚，从而使DNA游离出来； 3.苯酚和氯仿等有机溶剂能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质； 4.上清液中加入异丙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE缓冲液中，即得植物基因组DNA溶； 5.DNA的琼脂糖凝胶电泳鉴定：带电荷的物质，在电场中的趋向运动称为电泳。DNA的琼脂糖凝胶电泳可以分离长度为200bp至近50kb的DNA分子。DNA的迁移率（U）的对数与凝胶浓度（T）之间存在反平行线性关系。因此，要有效地分离不同大小的DNA片段，选用适当的琼脂糖凝胶浓度是非常重要的。 三、实验材料 1.设备 移液器，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，1.5ml离心管 2.材料 植物幼嫩叶片 3.试剂 （1）细胞提取液：100mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 5mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.25% SDS，1%β-巯基乙醇（去除酚类） （2）氯仿:异戊醇（24:1） （3）其它试剂：液氮、无水乙醇、 TE缓冲液、异丙醇、洗涤缓冲液 四、方法和步骤 0C水浴（金属浴）中加热备用；μ500L细胞提取液于651、取2、研钵用液氮预冷，新鲜植物叶片（自来水清洗，蒸馏水冲洗干），去除叶脉，剪成细条状，置于研钵中研磨成粉末状（越细越好）； 0C预热的细胞提取液中，迅速摇匀，65500、取0.1g粉末（大约两勺半）转移至
动物基因组DNA的提取 [实验原理] 在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动构基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100-150 kb，适用于L嘴菌体构建基因组文库和Southern分析。 通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤，以及相对分子质量较大的DNA 的琼脂糖凝胶电泳技术。 [仪器、材料与试剂] (一)仪器 1.台式离心机 2.玻璃匀浆器 3．高压灭菌锅 4．恒温水浴 (二)材料 1．1.5mL微量离心管 2．微量取样器和吸头 3．无菌过滤器(一次性) 4．10 mL注射器 5．鼠肝 6．三羟甲基氨基甲烷(Tris) 7.十二烷基硫酸钠(SDS) 8．乙二胺四乙酸(EDTA)
9．蛋白酶K 10．RNA酶 11．DNA相对分子质量标准物，DNA／EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物 (三)试剂 1、1.5 mol／L NaCl 2、0.5 mol／L Tris·HCI pH8.0 3．0.5 mol／L EDTA pH8.0 4．3 mol／L NaAc pH5.2 以上均高压灭菌。 5．蛋白酶K 10mg／mL配好后用一次性过滤器过滤，-20 保存(教师配制) 6.组织匀浆液100mmol／LNaCI，10mmol／LTris·HCl(pH 8.0)，0.25mmol／LEDTA(pH8.0) 7．酶解液200mmol／LNaCI，20mmol／L Tris·HCI(pH 8．O)，50mmol／LEDTA(PH 8.0)，200~g／mL蛋白酶K，1％SDS 8．无DNA酵的RNA酶：将胰RNA酶溶解于10mmol／L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol ／L NaCl溶液中，浓度l0mg／mL，于100℃水浴处理15min，以降解DNA酶，缓慢冷却到室温，-20℃保存 9．TE缓冲液：10mmol／LTris·HCl(pH8.0)，25 mmol／LEDTA(pH8.0) 10．平衡酚(pH8.0)：氧仿：异戊醇=25：24：1<体积比) 11．氧仿：异戊醇=24：l(体积比) 12．5xTBE 5．4gTris，2．75g硼酸2mL 0.5mol／L EDTA(pH8.0)，加水到100mL；13．6x上样缓冲液o．25％溴酚蓝，40％(W／V)蔗糖水溶液