生物质谱在蛋白质组学研究中应用
张养军钱小红
军事医学科学院放射与辐射医学研究所
北京蛋白质组研究中心
主要内容：
一、蛋白质组学发展简介
二、蛋白质组研究意义
三、蛋白质组学研究的内容
四、蛋白质组研究中的复杂性
五、蛋白质组学研究的主要研究策略
六、生物质谱在蛋白质组学研究中的应用
七、蛋白质组学研究中的主要技术挑战
一、蛋白质组学发展简介
蛋白质组（proteome）：
一种细胞、组织或生物体完整基因组所对应的全套蛋白质。
蛋白质组学（proteomics)：
研究细胞、组织或生物体中蛋白质组成、定位、变化及其相互作用规律的科学。简要历史回顾：
1994年，澳大利亚的科学家首次提出蛋白质组概念；
1995年，蛋白质组一词首次见诸报端；
2001年4月，在美国成立了国际人类蛋白质组研究组织(Human
Proteome Organization, HUPO)，随后欧洲、亚太
地区都成立了区域性蛋白质组研究组织，试图通过
合作的方式，融合各方面的力量，完成人类蛋白质
组计划(Human Proteome Project)；另外，除了相关
期刊外，创刊了蛋白质组学专门杂志，如
《Proteomics》、《Molecular & cellular
proteomics》和《Journal of proteome research》；
2002年～现在，已经举行了七届HUPO国际会议和四届中国蛋
白质组学术大会。
二、蛋白质组研究的意义
1、一些物种如小鼠、大鼠等基因组测序工作的完
成，特别是人类基因组计划草图完成（2001
年），为蛋白质组计划的实施奠定了基础。蛋白
质组的研究不仅是基因组研究的深入和延续，更
重要的是要回答在基因组和转录组水平上无法回
答的生物学问题，比如它们之间的连锁关系以及
功能网络等。
2、作为生命功能的执行体——蛋白质组的研究是
为了从更高层次上深入解读生命的本质和生命
活动的规律。
3、为人类疾病的病理研究、早期诊断、治疗以及
药物开发提供依据。
三、蛋白质组学研究的内容
1、蛋白质组表达谱
（proteome expression profiling）
针对已有基因组或转录组数据库的生物体、组织或细胞，建立相应蛋白质组或亚蛋白质组数据库。如：Human plasma proteome project；Human liver proteome project。
2、蛋白质组修饰谱
(proteome modification profiling)
建立生命功能执行和调控网络相关的蛋白质
翻译后修饰数据库。
3、基本生物学问题
研究与生命活动过程中密切相关的问题。
比如：Post-translational modification；
Protein-protein interaction；
Genome-Transcriptome-Proteome。
4、临床应用问题
以重要的生命过程或人类一些重大疾病为对
象，进行重要的生理和病理体系或过程的研究，
即进行比较蛋白质组学研究。
比如：Disease marker-diagnosis
Mechanism of the disease
Drug target-therapy
5、蛋白质组学中的新技术和新方法
建立蛋白质组学支撑技术平台以及生物信息
学研究工具。
四、蛋白质组研究中的复杂性
一种细胞、组织或生物体有多少蛋白质?
人类基因组含有3～4万个基因，仅是果蝇
或线虫的两倍左右。
人体：1个受精卵1012细胞，103细胞类型。
其“蛋白质组”随“时”、“空”处于变化之中，而“基因组”则处于永恒于之中。生命体的统一性源于基因组
生命体的复杂性基于蛋白质组
五、主要研究策略
1、研究基础
（1）生物学的发展，特别是基因组测序的
完成为我们提供了蛋白质组数据库；
（2）生物质谱和分离科学的进步为我们提
供了分离和鉴定的必须手段；
（3）计算机技术的提高，特别是生物信息
学的发展为我们处理海量数据提供了
有力的支持。
2、蛋白质组学研究方法分类
（1）蛋白质定性分析
依据分析对象是整体蛋白质混合物或酶切后的多肽混合物，蛋白质组的定性分析方法分为自下向上法（bottom up,针对多肽混合物）和自上向下法(top down，针对整体蛋白质混合物)。
依据蛋白质数据库中是否存在所鉴定的蛋白质，蛋白质组的定性分析方法进一步分为：对蛋白质数据库中含有待鉴定的蛋白质，包括:肽质量指纹谱法（PMF，适合于简单蛋白质混合物);肽序列标签法（PST，适合于复杂蛋白质混合物）
对蛋白质数据库中不存在待鉴定的蛋白质，采用从头测序法（de novo）
（2）蛋白质组相对定量分析方法
①直接进行比较，包括SDS-PAGE、2DE、HPLC；
②标记方法，包括同位素标记亲和标签
（ICA T）、元素标记亲和标签（ECA T）、
同位素氨基酸细胞培养标记(SILAC)和
DYGE技术；
③直接同位素标记法，如酶促18O标记。
3 蛋白质组研究方法进展
(1)复杂蛋白质组体系
目前对于组织、细胞和血浆等复杂蛋白质组的分析，均采用多维分离技术与质谱联用的方法。
（2）简单的蛋白质组体系
对于特定的、简单的蛋白质组分析，既可采用多维分离技术与质谱联用的方法，也可以采用较少步骤的分离和质谱联用技术。其技术路线如图3所示。
六、生物质谱在蛋白质组学研究中的应用
1、表达谱构建
2、修饰谱构建
3、蛋白质组定量
1、表达谱构建
(1) 2DE-MALDI-TOF/TOF MS技术平台
2DE-MALDI-TOF/TOF MS技术路线具有分离效率高、直观和相对定量的特点，被广泛应用于蛋白质组学的研究。目前该技术在我们实验室已经成功地应用于胎肝蛋白质组、血浆蛋白质组和成人肝脏蛋白质组等组织和细胞系蛋白质组的研究。
2DE-MALDI-TOF/TOF MS技术平台
技术路线特点：成功率(考染): 大于90%
蛋白质组双向电泳zoom胶技术与MALDI-TOF/TOF MS联用
为了获得更高的分离度，展示更多的蛋白质点，采用ZOOM胶技术是一个重要的选择，并通过MALDI-TOF/TOF MS的联用，可鉴定更多的蛋白质点。
胎肝全蛋白2-DE 表达谱
共鉴定：601，唯一蛋白质: 330
（2）多维分离-质谱分析技术平台构建
作为2DE-MS技术平台的重要补充，多维分离技术路线已经受到人们的高度重视。
多维液相色谱既可用于整体蛋白质预分离，也可用于多肽混合物的预分离。与小分子相
比，由于蛋白质或多肽的理化性质（分子量、等电点和疏水性等）的显著差异，使其在色谱柱中的传质速率和容量因子相差较大，所以在对其进行分离时，一般采用梯度洗脱，且色谱峰较宽。
整体蛋白质分离方法选择依据：
（1）依据分子形状和大小，如超滤、体积排阻等；
（2）依据分子密度性质，如蔗糖梯度密度离心技术；
（3）依据分子等电点不同，如离子交换、色谱聚焦、
等电聚焦；
（4）依据分子疏水性不同，如反相色谱、疏水色谱；
（5）依据亲和性不同，如亲和色谱；
（6）依据与金属离子螯合性质的不同，如IMAC方法
对磷酸化肽段提取；
（7）依据特殊化学反应基团，如巯基填料选择性富集
含巯基的肽段。
液相色谱-质谱联用方法用于严重急性呼吸系统综
合征冠状病毒结构蛋白质的研究
到2003年5月初，全世界完成全基因组测序并提交到Genebank的病毒株已达到11株，其中包括由军事医学科学院微生物流行病研究所和中国科学院基因组研究所提交的BJ01病毒株的全基因组序列。
SARS-CoV （BJ01）基因组
基因组预测的SARS-CoV(BJ01) 蛋白质的理化性质
研究意义
SARS冠状病毒基因组序列的测定为SARS病原学及后续研究奠定了基础，但基因组全序列的解析并不等于揭示了基因组所编码的全部蛋白质。依靠生物信息学的系统分析，可以较为全面地预测病毒基因组所编码的全部蛋白质，但是难以洞悉蛋白质合成后所发生的大量的裂解、修饰与定位、转运。
研究目的
采用蛋白质组学的策略，通过系统研究SARS冠状病BJ01 株的天然结构蛋白质，全面验证基因组与生物信息学推测的SARS冠状病毒的蛋白质组及其裂解、修饰的蛋白质表达谱，为全面揭示SARS的发病机理、提供SARS早期诊断及药物筛选的靶标、研制有效的治疗药物提供基础。
N 蛋白质肽序列检索结果
S 蛋白质肽序列检索结果
M 蛋白质肽序列检索结果
N 蛋白质肽序列检索结果
N蛋白质分子量
Theoretical:45935Da Measured: 45929Da Difference: 0.13/1000
MALDI-MS 测定N蛋白质分子量
1 N蛋白降解片段
2 完整N蛋白
SARS-CoV 攻击V ero E6细胞裂解液蛋白质HPLC
小结
1、利用蛋白质组学策略，从SARS CoV感染的V ero E6细胞提取
液中成功鉴定出S、N及M三个结构蛋白质，其中M蛋白首次
在蛋白质水平鉴定出来；
2、精确测定N 蛋白的相对分子质量，证明其氨基末端的第一
个氨基酸-丝氨酸发生乙酰化修饰，提示不存在理论预测的
磷酸化修饰；
3、通过比较表明两种方法在蛋白质组学研究中各具优缺点，
可根据不同目的选择使用。
胎肝线粒体蛋白质制备
胎肝组织充分清洗后进行匀浆，然后对匀浆液(2%蔗糖，蛋白质酶抑制剂，2～3g/10ml)进行蔗糖密度梯度离心（120000g, 90min）提取线粒体，最后用裂解液（8M urea, 65mM DTT, 40mM Tris）提取全蛋白质，25000g离心并过滤后，进一步进行整体蛋白质分离。
用
ProteomLab PF 2D色谱仪对胎肝线粒体提取液进行二维色谱分离示意图
对胎肝线粒体全蛋白提取液的一维色谱分离
一维色谱分离M2B3馏分的反相色谱分离图
色谱条件：反相柱为4.6mm I.d. 35mm, C18, 1.5μm; 流速为0.5ml/min; 检测波长214nm；溶剂梯度：0～100％B, 60min，100％B保持8min，1.0min回到100％A平衡色谱系统；每管收集2min。
整体蛋白混合物二维色谱分离实验结果：一维色谱聚焦:40个馏分（0.3pH 或5min）二维反相色谱:20个馏分（1.0min）
总计:800个馏分。
M2C8_21反相色谱馏分酶切液进行Micro LC-ESI-Ion Trap MS
扫描中保留时间为12.90min时的一级质谱图
SEQUEST 处理的结果
判据：电荷为+1时，Xcorr值2.0；电荷为+2时，Xcorr值2.2；电荷为+3时，Xcorr值3.5；△Cn≥0.1；而且至少2肽段或3个连续的y或b序列
Nano LC-ESI-Q/TOF MS
M2B3_1 8反相色谱馏分酶切液的Nano LC-ESI-Q/TOF MS
一级质谱总离子流色谱图
M2B3_18反相色谱馏分酶切液的Nano LC-ESI-Q/TOF MS二级质谱四通道总离子流色谱图
M2B 3_18反相色谱馏分酶切液中m/z为795肽段的Nano LC-ESI-Q/TOF MS二级质谱的质谱图MASCOT 对数据进行检索
蛋白质组学研究方法选择及比较 目前研究蛋白组学的主要方法有蛋白质芯片及质谱法，本文将从多方面对两种研究方法进行了解与比较； 蛋白质芯片（Protein Array） 将大量不同的蛋白质有序地排列、固定于固相载体表面，形成微阵列。利用蛋白质分子间特异性结合的原理，实现对生物蛋白质分子精准、快速、高通量的检测。 主要类型： ●夹心法芯片(Sandwich-based Array) ●标记法芯片(Label-based Array) ●定量芯片(Quantitative Array) ●半定量芯片(Semi-Quantitative Array) 质谱（Mass Spectrometry） 用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测，测出离子准确质量并确定离子的化合物组成，即通过对样品离子质荷比的分析而实现对样品进行定性和定量的一种方法。 主要类型：
●二维电泳+质谱(2D/Mass Spectrometry, MS) ●表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(Surface-enhanced laser desorption/ionization- time of flight, SELDI) ●同位素标记相对和绝对定量(Isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ) Protein Array or Mass Spectrometry？ 如何选择合适的研究方法？以下将从六个方面进行比较与推荐： 1.筛查蛋白组学表达差异 建议选择：RayBiotech（1000个因子的芯片）+质谱 a)不同的方法学有不同的特点：对于质谱，可以筛查到未知的蛋白，但是对于分子量大、 低丰度的蛋白质，质谱的灵敏度和准确性有一定的限制。 b)不同的方法能筛查到的目标不同：根据Proteome Analysis of Human Aqueous Humor 一文中报道，质谱筛查到的差异蛋白集中在小分子与代谢物。而用RayBiotech芯片筛查到的结果，多是集中在细胞因子、趋化、血管、生长等等。 c)质谱筛查到355个蛋白，而RayBiotech抗体芯片也筛查到328个蛋白，且用定量芯片 验证25个蛋白有差异，这些蛋白是质谱找不到的。目前RayBiotech夹心法抗体芯片已经可以检测到1000个蛋白，采用双抗夹心法，尤其是对于低丰度蛋白，有很好的灵敏度和特异性，很多的低丰度蛋白是抗体芯片可以检测出来，而质谱检测不到的，且样品不经过变性和前处理，保持天然状态的样品直接检测，对于蛋白的检测准确度高。 d)质谱的重复性一直是质谱工作者纠结的问题，不同操作者的结果，不同样品处理条件， 峰值的偏移等影响因素都会产生大的影响；RayBiotech的夹心法芯片重复性高。
生物信息学分析FAQ CHAPTER ONE ABOUT GENE ONTOLOGY ANNOTATION (3) 什么是GO？ (3) GO和KEGG注释之前，为什么要先进行序列比对（BLAST）？ (3) GO注释的意义？ (3) GO和GOslim的区别 (4) 为什么有些蛋白没有GO注释信息？ (4) 为什么GO Level 2的统计饼图里蛋白数目和差异蛋白总数不一致？ (4) 什么是差异蛋白的功能富集分析&WHY？ (4) GO注释结果文件解析 (5) Sheet TopBlastHits (5) Sheet protein2GO/protein2GOslim (5) Sheet BP/MF/CC (6) Sheet Level2_BP/Level2_MF/Level2_CC (6) CHAPTER TWO ABOUT KEGG PATHWAY ANNOTATION (7) WHY KEGG pathway annotation? (7) KEGG通路注释的方法&流程？ (7) KEGG通路注释的意义？ (7) 为什么有些蛋白没有KEGG通路注释信息？ (8) 什么是差异蛋白的通路富集分析&WHY？ (8) KEGG注释结果文件解析 (8) Sheet query2map (8) Sheet map2query (9) Sheet TopMapStat (9) CHAPTER THREE ABOUT FEATURE SELECTION & CLUSTERING (10) WHY Feature Selection? (10)
聚类分析（Clustering） (10) 聚类结果文件解析 (10) CHAPTER FOUR ABOUT PROTEIN-PROTEIN INTERACTION NETWORK (12) 蛋白质相互作用网络分析的意义 (12) 蛋白质相互作用 VS生物学通路？ (12) 蛋白质相互作用网络分析结果文件解析 (12)
生物质谱技术在蛋白质组学中的应用（北京大学药学院 杨春晖 学号：10389071） 一、 前言[1，2] 基因工程已令人难以置信的扩展了我们关于有机体DNA序列的认识。但是仍有许多新识别的基因的功能还不知道，也不知道基因产物是如何相互作用从而产生活的有机体的。功能基因组试图通过大规模实验方法来回答这些问题。但由于仅从DNA序列尚不能回答某基因的表达时间、表达量、蛋白质翻译后加工和修饰的情况、以及它们的亚细胞分布等等，因此在整体水平上研究蛋白质表达及其功能变得日益显得重要。这些在基因组中不能解决的问题可望在蛋白质组研究中找到答案。蛋白质组研究的数据与基因组数据的整合，将会在后基因组研究中发挥重要作用。 目前蛋白质组研究采用的主要技术是双向凝胶电泳和质谱方法。双向凝胶电泳的基本原理是蛋白质首先根据其等电点，第一向在pH梯度胶内等电聚焦，然后转90度按他们的分子量大小进行第二向的SDS-PAGE分离。质谱在90年代得到了长足的发展，生物质谱当上了主角，蛋白质组学又为生物质谱提供了一个大舞台。他们中首选的是MALDI-TOF，其分析容量大，单电荷为主的测定分子量高达30万，干扰因素少，适合蛋白质组的大规模分析。其次ESI为主的LC-MS 联机适于精细的研究。本文将简介几种常用的生物质谱技术，并着重介绍生物质谱技术在蛋白质组学各领域的应用。 二、 生物质谱技术[3，4] 1．电喷雾质谱技术（ESI）[5] 电喷雾质谱技术( Electrospray Ionization Mass Spectrometry , ESI - MS) 是在毛细管的出口处施加一高电压,所产生的高电场使从毛细管流出的液体雾化成细小的带电液滴,随着溶剂蒸发,液滴表面的电荷强度逐渐增大,最后液滴崩解为大量带一个或多个电荷的离子,致使分析物以单电荷或多电荷离子的形式进入气相。电喷雾离子化的特点是产生高电荷离子而不是碎片离子, 使质量电荷比(m/ z)降低到多数质量分析仪器都可以检测的范围,因而大大扩展了分子量的分析范围,离子的真实分子质量也可以根据质荷比及电荷数算出。 2．基质辅助激光解吸附质谱技术（MOLDI）[5-7] 基质辅助激光解析电离（MOLDI）是由德国科学家Karas和Hillenkamp发现的。将微量蛋白质与过量的小分子基体的混合液体点到样品靶上，经加热或风吹烘干形成共结晶，放入离子源内。当激光照射到靶点上时，基体吸收了激光的能力跃迁到激发态，导致蛋白质电离和汽化，电离的结果通常是基体的质子转移到蛋白质上。然后由高电压将电离的蛋白质从离子源转送到质量分析器内，再经离子检测器和数据处理得到质谱图。TOF质量分析器被认为是与MALDI的最佳搭配，因为二者都是脉冲工作方式，在质量分析过程中离子损失很少，可以获得很高的灵敏度。TOF质量分析器结果简单，容易换算，蛋白质离子在飞行管内的飞行速度仅与他的(m/z)-1/2成正比，因此容易通过计算蛋白质离子在飞行管内的飞
生命科学被誉为２１世纪的最前沿科学之一，随着人类第一张基因序列草图的完成和发展，生命科学的研究也将进入一个崭新的后基因组学，即蛋白质组学时代。正如基因草图的提前绘制得益于大规模全自动毛细管测序技术一样，后基因组研究也将会借助于现代生物质谱技术等得到迅猛发展。本文拟简述生物质谱技术及其在生命科学领域研究中的应用。 １．质谱技术 质谱（ＭａｓｓＳＰｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（或质量）的大小顺序排列的图谱。质谱仪是一类能使物质粒子高化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离，并检测强度后进行物质分析的仪器。质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组成。 质谱分析的基本原理 用于分析的样品分子（或原子）在离子源中离化成具有不同质量的单电行分子离子和碎片离子，这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能并形成一束离子，进入由电场和磁场组成的分析器，离子束中速度较慢的离子通过电场后偏转大，速度快的偏转小；在磁场中离子发生角速度矢量相反的偏转，即速度慢的离子依然偏转大，速度快的偏转小；当两个场的偏转作用彼此补偿时，它们的轨道便相交于一点。与此同时，在磁场中还能发生质量的分离，这样就使具有同一质荷比而速度不同的离子聚焦在同一点上，不同质荷比的离子聚焦在不同的点上，其焦面接近于平面，在此处用检测系统进行检测即可得到不同质荷比的谱线，即质谱。通过质谱分析，我们可以获得分析样品的分子量、分子式、分子中同位素构成和分子结构等多方面的信息。 质谱技术的发展 质谱的开发历史要追溯到２０世纪初Ｊ．Ｊ．Ｔｈｏｍｓｏｎ创制的抛物线质谱装置，１９１９年Ａｓｔｏｎ制成了第一台速度聚焦型质谱仪，成为了质谱发展史上的里程碑。
第35卷 第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) Journa l o fN anji n g Forestry Un i v ersity (Natural Sc ience Ed ition) V o.l 35,N o .1Jan .,2011 htt p ://www.n l dxb .com [do :i 10.3969/.j issn .1000-2006.2011.01.024] 收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10KJ B220002) 作者简介:甄艳(1976)),副教授,博士。*施季森(通信作者),教授。E-m ai:l js h @i n jfu .edu .cn 。 引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄 艳,施季森 * (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏 南京 210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 Application of m ass spectro m etry i n proteo m ics studies Z HEN Yan ,SH I Jisen * (K ey Labo ra t o ry o f F orest G eneti cs and B i o techno l ogy M i n istry o f Educati on , N an ji ng Forestry U n i versity ,N an ji ng 210037,Chi na) Abstrac t :W ith the rap i d develop m ent o f pro teo m i cs ,m ass spec trom etry i s m aturi ng to be a po w erfu l too l and core tech -nology fo r proteo m ics st udies dur i ng the recen t years .The super i or ity o fm ass spectrom etry lies i n providi ng the through -pu t and the m olecu lar infor m ati on ,w hich no other techno logy can be m a tched i n proteom ics .In th i s rev ie w,w e m ade a g lance on the outli ne o fm ass spectrome try -based proteo m ics .A nd then w e addressed on t he advances o f data ana l y si s o f m ass spec trom etry -based proteom ics ,quantitati ve m ass spectro m etry -based pro teom i cs ,post -translati onal m odificati ons based m ass spectrom etry ,targeted proteo m ics and functiona l proteo m ics based -mass spectrome try .K ey word s :m ass spectrome try;proteo m ics ; quantitative pro teom i cs ; post -trans l ation m odifica ti on ; targ eted pro - teo m i cs ;f uncti ona l proteom ics 蛋白质组学(Pr o teo m ics)是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。 目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(electro spray ion izati o n,ESI )和基质辅助激光解析离子化(m a -tri x assisted laser desorpti o n i o nization ,MALD I)的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(ion trap ,I T),飞行时间(ti m e of fli g h,t TOF),串联飞行时间(TOF -TOF),四级杆/飞行时间(quadr upo le /TOF hybrids),离子阱/轨道阱(I T /orbitrap hybri d )和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /Four i e r transfor m ioncyclotron resonance m ass spectro m eters hybr i d s ,I T /FT M S),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化
蛋白质质谱分析研究进展作者：汪福源蛋白质质谱分析研究进展摘要：随着科学的不断发展，运用质谱法进行蛋白质的分析日益增多，本文简要综述了肽和蛋白质等生物大分子质谱分析的特点、方法及蛋白质质谱分析的原理、方式和应用，并对其发展前景作出展望。关键词：蛋白质，质谱分析，应用前言：蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子，存在于所有生物细胞，约占细胞干质量的50%以上，作为生命的物质基础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用，因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究，一直是化学家及生物学家极为关注的问题，其研究的内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速。自约翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一[1]。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱法已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要地位[2]。1．质谱分析的特点质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点：很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息，能最有效地与色谱联用，适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定，同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。2．质谱分析的方法近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种：1)电喷雾电离质谱；2)基质辅助激光解吸电离质谱；3)快原子轰击质谱；4)离子喷雾电离质谱；5)大气压电离质谱。在这些软电离技术中，以前面三种近年来研究得最多，应用得也最广泛[3]。3．蛋白质的质谱分析蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级，三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。3.1蛋白质的质谱分析原理以往质谱(MS)仅用于小分子挥发物质的分析，由于新的离子化技术的出现，如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化，各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是：通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子，然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来，经过离子检测器收集分离的离子，确定离子的M/Z值，分析鉴定未知蛋白质。3.2蛋白质和肽的序列分析现代研究结果发现越来越多的小肽同蛋白质一样具有生物功能，建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等，这些方法都存在一些缺陷。例如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的N末端氨基酸苯异硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法，又称PTH法)，测序速度较慢(50个氨基酸残基/天)；样品用量较大(nmol级或几十pmol级)；对样品纯度要求很高；对于修饰氨基酸残基往往会错误识别，而对N末端保护的肽链则无法测序[4]。C末端化学降解测序法则由于无法找到PITC这样理想的化学探针，其发展仍面临着很大的困难。在这种背景下，质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛注意。在质谱测序中，灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低，所以肽的序列分析比蛋白容易许多，许多研究也都是以肽作为分析对象进行的。近年来随着电喷雾电离质谱(electrospray ionisation，ESI)及基质辅助激光解吸质谱(matrix assisted laser desorption/ionization，MALDI)等质谱软电离技术的发展与完善，极性肽分子的分析成为可能，检测限下降到fmol级别，可测定分子量范围则高达100000Da，目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI
基于质谱分析的蛋白质组学 在21世纪，生命科学的研究进入了后基因组时代，蛋白质组学作为其中的一个重要分支于20世纪90年代中期应运而生。由于蛋白质的复杂性，传统的蛋白质鉴定方法如末端测序等已无法满足蛋白质组学研究中的一系列需要。因此，质谱技术作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟，并作为样品制备和数据分析的信息学工具被广泛地应用。质谱技术具有灵敏度、准确度、自动化程度高的优点，能准确测量肽和蛋白质的相对分子质量，氨基酸序列及翻译后修饰、蛋白质间相互作用的检测[1]，因此质谱分析无可争议地成为蛋白质组学研究的必然选择。 1. 蛋白质组学 蛋白质组学（proteomics ）是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用，是功能基因组学时代一门新的科学。包括鉴定蛋白质的表达、修饰形式、结构、功能和相互作用等。根据研究目的，蛋白质组学可以分为表达蛋白质组学、结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。表达蛋白质组学用于细胞内蛋白样品表达的定量研究。以绘制出蛋白复合物的结构或存在于一个特殊的细胞器中的蛋白为研究目的的蛋白质组学称为结构蛋白质组学，用于建立细胞内信号转导的网络图谱并解释某些特定蛋白的表达对细胞的作用[2]。功能蛋白质组学以细胞内蛋白质的功能及蛋白质之间的相互作用为研究目的，通过对选定的蛋白质组进行研究和分析，能够提供有关蛋白质的磷酸化、糖基化等重要信息。 蛋白质组学研究的核心就是能够系地的鉴定一个细胞或组织中表达的每一个蛋白质及蛋白质的性能。蛋白质组学的主要相关技术有双向凝胶电泳、双向荧光差异凝胶电泳、质谱分析等[2]。由于蛋白质的高度复杂性和大量低丰度蛋白质的存在，对分析技术提出了巨大挑战，生物质谱技术则是适应这一挑战的必然选择。 2. 生物质谱技术
第35卷 第1期2011年1月 南京林业大学学报(自然科学版) J o u r n a l o f N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y (N a t u r a l S c i e n c e E d i t i o n ) V o l .35,N o .1 J a n .,2011 h t t p ://w w w .n l d x b .c o m [d o i :10.3969/j .i s s n .1000-2006.2011.01.024] 收稿日期:2009-12-31 修回日期:2010-10-26 基金项目:国家自然科学基金项目(31000287);江苏省高校自然科学基础研究项目(10K J B 220002) 作者简介:甄艳(1976—),副教授,博士。＊施季森(通信作者),教授。E -m a i l :j s h i @n j f u .e d u .c n 。 引文格式:甄艳,施季森.质谱技术在蛋白质组学研究中的应用[J ].南京林业大学学报:自然科学版,2011,35(1):103-108. 质谱技术在蛋白质组学研究中的应用 甄 艳,施季森 ＊ (南京林业大学,林木遗传与生物技术省部共建教育部重点实验室,江苏 南京 210037) 摘要:随着蛋白质组学研究的迅速发展,质谱技术已成为应用于蛋白质组学研究中的强有力工具和核心技术。质谱技术的先进性在于为蛋白质组学研究提供的通量和分子信息。笔者重点概述了基于质谱路线的蛋白质组学研究,介绍了基于质谱的定量蛋白质组学﹑翻译后修饰蛋白质组学、定向蛋白质组学、功能蛋白质组学以及基于串联质谱技术的蛋白质组学数据解析的研究 进展。 关键词:质谱;蛋白质组学;定量蛋白质组学;翻译后修饰;定向蛋白质组学;功能蛋白质组学中图分类号:Q 81 文献标志码:A 文章编号:1000-2006(2011)01-0103-06 A p p l i c a t i o n o f m a s s s p e c t r o m e t r y i n p r o t e o m i c s s t u d i e s Z H E NY a n ,S H I J i s e n ＊ (K e y L a b o r a t o r y o f F o r e s t G e n e t i c s a n d B i o t e c h n o l o g y M i n i s t r y o f E d u c a t i o n , N a n j i n g F o r e s t r y U n i v e r s i t y ,N a n j i n g 210037,C h i n a ) A b s t r a c t :W i t ht h e r a p i d d e v e l o p m e n t o f p r o t e o m i c s ,m a s s s p e c t r o m e t r y i s m a t u r i n g t o b e a p o w e r f u l t o o l a n dc o r e t e c h -n o l o g y f o r p r o t e o m i c s s t u d i e s d u r i n g t h e r e c e n t y e a r s .T h e s u p e r i o r i t y o f m a s s s p e c t r o m e t r y l i e s i n p r o v i d i n g t h e t h r o u g h -p u t a n d t h e m o l e c u l a r i n f o r m a t i o n ,w h i c hn o o t h e r t e c h n o l o g y c a n b e m a t c h e di np r o t e o m i c s .I nt h i s r e v i e w ,w e m a d e a g l a n c e o n t h e o u t l i n e o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e d p r o t e o m i c s .A n dt h e nw e a d d r e s s e d o n t h e a d v a n c e s o f d a t a a n a l y s i s o f m a s s s p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,q u a n t i t a t i v em a s ss p e c t r o m e t r y -b a s e dp r o t e o m i c s ,p o s t -t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s b a s e d m a s s s p e c t r o m e t r y ,t a r g e t e d p r o t e o m i c s a n df u n c t i o n a l p r o t e o m i c s b a s e d -m a s s s p e c t r o m e t r y . K e yw o r d s :m a s ss p e c t r o m e t r y ;p r o t e o m i c s ;q u a n t i t a t i v ep r o t e o m i c s ;p o s t -t r a n s l a t i o n m o d i f i c a t i o n ;t a r g e t e d p r o -t e o m i c s ;f u n c t i o n a l p r o t e o m i c s 蛋白质组学(P r o t e o m i c s )是从整体水平上研究细胞内蛋白质的组成、活动规律及蛋白质与蛋白质的相互作用,是功能基因组学时代一门新的学科。目前蛋白质组学的研究主要有两条路线:一是基于双向电泳的蛋白质组学;二是基于质谱的蛋白质组学,其中基于双向电泳的蛋白质组学研究路线最终也离不开质谱技术的应用。自20世纪80年代末,两种质谱软电离方式即电喷雾电离(e l e c t r o s p r a y i o n i z a t i o n ,E S I )和基质辅助激光解析离子化(m a -t r i x a s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n ,M A L D I )的发明和发展解决了极性大、热不稳定蛋白质和多肽分 析的离子化和分子质量大的测定问题[1] ,蛋白质组学研究中常用的质谱分析仪包括离子阱(i o n t r a p ,I T ),飞行时间(t i m e o f f l i g h t ,T O F ),串联飞行时间(T O F -T O F ),四级杆/飞行时间(q u a d r u p o l e /T O F h y b r i d s ),离子阱/轨道阱(I T /o r b i t r a ph y b r i d ) 和离子阱/傅里叶变换串联质谱分析仪(I T /F o u r i e r t r a n s f o r m i o n c y c l o t r o nr e s o n a n c em a s s s p e c t r o m e t e r s h y b r i d s ,I T /F T M S ),这些质谱仪具有不同的灵敏度、分辨率、质量精确度和产生不同质量的M S /M S 谱[2] 。质谱作为蛋白质组学研究的一项强有力的工具日趋成熟,并作为样品制备及数据分析的信息学工具被广泛地应用。因此,有学者指出质谱技术 已在蛋白质组学研究中处于核心地位[3] 。目前在通量及所包含的分子信息内容上,基于质谱的蛋白质组学技术在细胞生物学研究中可以鉴定和量化
世界著名的质谱方面网站清单 质谱技术在蛋白鉴定等实验中具有不可忽视的作用，但是，目前的应用还不是特别广泛。那么，有问题了怎么解决呢?本文收集整理了相关的网站，包括世界著名的质谱学会、质谱研究组、质谱软件等。 美国质谱学会(ASMS, American Association for Mass Spectrometry) https://www.doczj.com/doc/9e884114.html,/ 南非质谱协会(SAAMS) http://www.saams.up.ac.za/ 欧洲质谱学会(ESMS) https://www.doczj.com/doc/9e884114.html,/esms/ 岛津公司：Koichi Tanaka (2002年诺贝尔化学奖获得者) https://www.doczj.com/doc/9e884114.html,/about/nobel/ ***高纯度化学研究所 http://www1m.mesh.ne.jp/kojundo/e/index.htm ***质谱学会(MSSJ) http://www.mssj.jp/ 瑞典质谱学会(SMSS) http://www.smss.uu.se/ 瑞士质谱组(SGMS) http://www.sgms.ch/ 生物技术中的质谱仪器相关资源 https://www.doczj.com/doc/9e884114.html,/ 以色列巴依兰大学：化学系 http://www.biu.ac.il/ESC/ch/ 印度质谱学会(ISMAS) https://www.doczj.com/doc/9e884114.html,/ 英国表面分析论坛 https://www.doczj.com/doc/9e884114.html, 英国伦敦大学比克贝克学院生物与化学学院：分析科学研究小组 https://www.doczj.com/doc/9e884114.html,/~chm_tgc/ 英国曼彻斯特理工大学化学系：J. Philip Day的研究小组 https://www.doczj.com/doc/9e884114.html,/people/academic/jpd.html 英国质谱学会(BMSS) https://www.doczj.com/doc/9e884114.html,/index.html 质谱:Mass Spectrometry Database,American Academy of Forensic Sciences (免费) http://www.ualberta.ca/~gjones/mslib.htm
【摘要】基因组相对较稳定，而且各种细胞或生物体的基因组结构有许多基本相似的特征；蛋白质组是动态的，随内外界刺激而变化。对蛋白质组的研究可以使我们更容易接近对生命过程的认识。蛋白质组学是在细胞的整体蛋白质水平上进行研究、从蛋白质整体活动的角度来认识生命活动规律的一门新学科，简要介绍功能基因组学和蛋白质组学的科学背景、概念及其应用。 【关键词】基因组；功能基因组学；蛋白质组学； 一、基因组及基因组学的概念 基因组(genome)一词系由德国汉堡大学H．威克勒教授于1920年首创，用以表示真核生物从其亲代所继承的单套染色体，或称染色体组。更准确地说，基因组是指生物的整套染色体所含有的全部DNA序列。由于在真核细胞的线粒体和植物的叶绿体中也发现存在遗传物质，因此又将线粒体或叶绿体所携带的遗传物质称为线粒体基因组或叶绿体基因组。原核生物基因组则包括细胞内的染色体和质粒DNA。此外非独立生命形态的病毒颗粒也携带遗传物质，称为病毒基因组。所有生命都具有指令其生长与发育，维持其结构与功能所必需的遗传信息，本书中将生物所具有的携带遗传信息的遗传物质总和称为基因组。[1] 基因组学(genomic)一词系由T．罗德里克(T．Roderick)于1986年首创，用于概括涉及基因组作图、测序和整个基因组功能分析的遗传学学科分支，并已用来命名一个学术刊物Genomics。基因组学是伴随人类基因组计划的实施而形成的一个全新的生命科学领域。[1] 基因组学与传统遗传学其他学科的差别在于，基因组学是在全基因组范围研究基因的结构、组成、功能及其进化，因而涉及大范围高通量收集和分析有关基因组DNA的序列组成，染色体分子水平的结构特征，全基因组的基因数目、功能和分类，基因组水平的基因表达与调控以及不同物种之间基因组的进化关系。基因组学的研究方法、技术和路线有许多不同于传统遗传学的特点，各相关领域的研究仍处于迅速发展和不断完善的过程中。 基因组学的主要工具和方法包括：生物信息学，遗传分析，基因表达测量和基因功能鉴定。 二、功能基因组学的概念及应用
蛋白质组学及其主要技术 朱红1 周海涛2 (综述) 何春涤1, (审校) (1.中国医科大学附属第一医院皮肤科,辽宁沈阳110001； 2.北京大学深圳医院核医学 科，广东深圳518036) 【摘要】蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象的新兴学科，近年来发展迅速，已成为后基因组时代的研究热点。目前，蛋白质组学研究技术主要包括：样品的制备和蛋白质的分离、蛋白质检测与图像分析、蛋白质鉴定及信息查询。本文就蛋白质组学概念及主要技术进行综述。 【关键词】蛋白质组，蛋白质组学 1蛋白质组学的概念 随着人类基因组测序计划的完成，人们对生命科学的研究重点由结构基因组转向功能基因组，1994年Wilkins和Williams首先提出蛋白质组一词[1]，蛋白质组是指一种细胞、组织或有机体所表达的全部蛋白质。从基因到蛋白质存在转录水平、翻译水平及翻译后水平的调控，组织中mRNA丰度与蛋白质丰度不完全符合[2]。蛋白质复杂的翻译后修饰、蛋白质的亚细胞定位或迁移、蛋白质-蛋白质相互作用等也无法从DNA／mRNA水平来判断。因此，只有将功能基因组学与蛋白质组学相结合，才能精确阐明生命的生理及病理机制。 蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，对组织、细胞的整体蛋白进行检测，包括蛋白质表达水平、氨基酸序列、翻译后加工和蛋白质的相互作用,在蛋白质水平上了解细胞各项功能、各种生理、生化过程及疾病的病理过程等[3,4]。蛋白质组学有两种研究策略。一种是高通量研究技术，把生物体内所有的蛋白质作为对象进行研究，并建立蛋白质数据库，从大规模、系统性的角度来看待蛋白质组学，更符合蛋白质组学的本质。但是，由于剪切变异和翻译后修饰，蛋白质数量极其庞大，且表达随空间和时间不断变化，所以分析生物体内所有的蛋白质是一个耗时费力，难以实现的理想目标。另一种策略是研究不同状态或不同时期细胞或组织蛋白质组成的变化，主要目标是研究有差异蛋白质及其功能，如正常组织与肿瘤组织间的差异蛋白质，寻找肿瘤等疾病标记物并为其诊断治疗提供依据。 2蛋白质组学的常用技术 2.1样品的制备和蛋白质的分离技术 2.1.1样品的制备样品制备包括细胞裂解与蛋白质溶解，以及去除核酸等非蛋白质成分。 激光捕获显微切割(Laser-captured microdissection, LCM)[5]技术可大量获得足够用于蛋白质组学研究的单一细胞成分，避免其他蛋白成分对电泳结果的干扰。尤其是肿瘤的蛋白质组学研究常用LCM技术来获取单一的肿瘤细胞。 2.1.2蛋白质的分离技术 ①双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis, 2-DE)：双向电泳方法于 l975年由O'Farrell[6]首先提出，根据蛋白质等电点和分子量的差异，连续进行成垂直方向的两次电泳将其分离。 第一向为等电聚焦(Isoelectric focusing,IEF)电泳，其基本原理是利用蛋白质分子的等电点不同进行蛋白质的分离。较早出现的IEF是载体两性电解质pH梯度，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度；20世纪80年代初建立起来的固相pH梯度(Immobilized pH gradients，IPG)IEF，是利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合，形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度。IPG胶实验的重复
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质谱技术在蛋白质组学中的应用发展 作者：吴晓歌， 鲁新宇， WU Xiao-ge， LU Xin-yu 作者单位：南京工业大学应用化学系,江苏南京,210009 刊名： 医学研究生学报 英文刊名：JOURNAL OF MEDICAL POSTGRADUATES 年，卷(期)：2007,20(10) 被引用次数：5次 参考文献(20条) 1.Diane G Mass spectrometry:gaining mass appeal in proteomics[外文期刊] 2005(06) 2.Taranenko NI;Potter NT;Allman SL Gender identification by atrix-Assisted laser desorption /ionization time-of-flight mass spectrometry[外文期刊] 1999(10) 3.Schurenberg M;Dreisewerd K;Hillenkamp F Laser desorption/ionization mass spectrometry of peptides and proteins with particle suspension matrixes[外文期刊] 1999(01) 4.钱小红;盛龙生生物质谱技术与方法 2003 5.Judith H Product review:Proteomics systems emerge 2001(13) 6.Joerg R;Urs L;Jan M Challenges in mass spectrometrybased proteomics 2004(12) 7.蒋娟娟基质辅助激光解吸离子化中的基质和基质添加剂[期刊论文]-药学进展 2004(08) 8.Krause E;Wenschuh H;Jungblut PR The Dominance of Arginine-containing peptides in MALDI-Derived tryptic mass Fingerprint of proteins[外文期刊] 1999(19) 9.Mpamhanga CP;Chen B;Mclay I Knowledge-based interaction fingerprint scoring:a simple method for improving the effectiveness of fast scoring functions[外文期刊] 2006(02) 10.Yang CY;Wang R;Wang S M-score:a knowledge-based interaction fingerprint scoring:a simple method for improving the effectiveness of fast scoring functions[外文期刊] 2006(20) 11.Wen K;Chungang G;Hongjie Z Use of high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry to distinguish panax ginseng C.A.Meyer (Asian Ginseng) and Panax quinquefolius L[外文期刊] 2000(21) 12.Josip B;Maria C;Rodriguez G Analysis of murine natural killer cell microsomal proteins using two-dimensional liquid chromatography coupled to tandem electrospray ionization mass spectrometry[外文期刊] 2004(04) 13.张养军;蔡耘;王京兰蛋白质组学研究中的色谱分离技术[期刊论文]-色谱 2003(01) 14.曹晓梅;陈冰;冷伟卫高效液相色谱法同时测定血浆中异烟肼和乙酰烟肼[期刊论文]-医学研究生学报 2005(05) 15.Demirev PA;Ramirez J;Fenselau C Tandem mass spectrometry of intact proteins for characterization of biomarkers from bacillus cereus T spores[外文期刊] 2001(23) 16.Ciminiello P;Dell AC;Fattorusso E The Genoa 2005outbreak.Determination of putative palytoxin in Mediterranean ostreopsis ovata by a new liquid chromatography tandem mass spectrometry method[外文期刊] 2006(17) 17.Ji C;Li L Quantitative proteome analysis using differential stable isotopic labeling and microbore LC-MALDI MS and MS-MS[外文期刊] 2005(03) 18.周济宏;李幼生;曹亚澄稳定性核素测定大鼠小肠蛋白质合成[期刊论文]-医学研究生学报 2006(10) 19.Heng J;Ann ME Quantitative analysis of the yeast proteome by incorporation of isotopically