(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910214737.6 (22)申请日 2019.03.20 (71)申请人 复旦大学附属华山医院 地址 200040 上海市静安区乌鲁木齐中路 12号 (72)发明人 宫晔 邓水香 朱宏达 冯圣捷 田觅 金朋 (74)专利代理机构 上海申新律师事务所 31272 代理人 俞涤炯 (51)Int.Cl. A61D 1/00(2006.01) A61D 7/00(2006.01) (54)发明名称 一种大鼠重症脑出血合并脓毒症复合模型 的建立方法及其应用 (57)摘要 本发明涉及一种大鼠重症脑出血合并脓毒 症复合模型的建立方法,其包括:大鼠注射麻醉 后,断尾取血匀速注入右侧尾状核,获得脑出血 大鼠模型;脑出血大鼠模型制备成功后,采用盲 肠结扎穿孔法获得重症脑出血合并脓毒症复合 模型。本发明还涉及上述复合模型在制备预防/ 治疗重症脑出血合并脓毒症的药物中的应用。本 发明成功构建了重症脑出血合并脓毒症复合模 型,更好的模拟临床重症脑出血并发感染以及脓 毒症的临床表现,为进一步探索重症脑出血合并 感染和脓毒症的发病机制和干预措施提供理论 基础;并将其具体应用于治疗重症脑出血+脓毒 症的药物的筛选,对防治重症脑出血合并感染和 脓毒症的发生及后期的康复治疗及预后具有重 要的意义。权利要求书1页 说明书5页 附图2页CN 109938870 A 2019.06.28 C N 109938870 A
权 利 要 求 书1/1页CN 109938870 A 1.一种大鼠重症脑出血合并脓毒症复合模型的建立方法,其特征在于,包括如下步骤: 步骤一、脑出血大鼠模型的制备; 大鼠注射麻醉后,断尾取血匀速注入右侧尾状核,留置预定时间,缓慢拔针,防止反流,获得脑出血大鼠模型; 步骤二、重症脑出血合并脓毒症模型的制备; 步骤一的脑出血大鼠模型制备成功后,大鼠注射麻醉后仰卧固定,腹部手术区域皮肤杀菌后铺无菌孔巾,沿正中线剪开皮肤、肌肉、腹膜后牵出盲肠,以无菌丝线测量盲肠全长后取该段丝线对折处所对应的盲肠部位以无菌丝线结扎,扎紧前将盲肠内容物向降部挤压,扎紧后用无菌不锈钢针沿结扎远端肠管外侧缘穿刺两孔并将穿刺针来回抽动后退出穿刺针;轻轻挤压结扎盲肠降部,挤出少量粪质后将肠管还纳腹腔,确认腹腔内无活动性出血后以无菌丝线逐层缝合腹壁,获得重症脑出血合并脓毒症复合模型。 2.根据权利要求1所述的建立方法,其特征在于,所述步骤一中,大鼠采用10%水合氯醛320~380mg/kg腹腔注射麻醉,其断尾取血量为50~180ul,其血液注入方法为:2次注入法,先注入一半,留置8~12min后,再注射另一半血量;注入完成后,留置12~18min后拔针。 3.根据权利要求1所述的建立方法,其特征在于,所述步骤一中,所述右侧尾状核的注入位置为:前囟中线旁开2.8~3.2mm,冠状缝前0.8~1.2mm,深度5~7mm。 4.根据权利要求1所述的建立方法,其特征在于,所述步骤一中,在拔针后,采用骨蜡封闭颅骨创口,缝合头皮,局部皮肤用复合碘消毒液消毒,防止局部感染。 5.根据权利要求1所述的建立方法,其特征在于,在脑出血模型制备成功20~28h后制备重症脑出血合并脓毒症复合模型。 6.根据权利要求1所述的建立方法,其特征在于,所述步骤二中,大鼠采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉;皮肤杀菌采用安尔碘涂搽;无菌不锈钢针的尺寸为外径2~4mm,其来回抽动的次数为2~5次。 7.根据权利要求1所述的建立方法,其特征在于,所述步骤二中,腹壁缝合完毕后,即刻注射生理盐水15~25毫升/千克体重于大鼠后腿根部皮下。 8.根据权利要求1~7中任一项制备的大鼠重症脑出血合并脓毒症复合模型在制备预防和治疗重症脑出血合并脓毒症的药物中的应用。 2
痛风动物模型的研究现状及评价 (作者:___________单位: ___________邮编: ___________) 【摘要】通过对痛风性关节炎和痛风性肾病的动物模型相关文献的系统回顾,对模型制作的现状,常用模型的特点及应用进行了总结和评价。目前常见的痛风动物模型在稳定性,持久性,制作程序的标准化等方面需要继续努力改进,复制出更接近于人类嘌呤代谢障碍和(或)尿酸排泄障碍所形成的持久稳定的高尿酸血症模型是基础和关键。应用现有模型进行相关的实验研究需注意根据模型特点和研究目的合理选择,加强多种模型的联合应用,并注意实验结果的合理评价。 【关键词】痛风;动物模型;痛风性关节炎;痛风性肾病 痛风(gout)是由于嘌呤代谢紊乱和(或)尿酸排泄障碍所导致的一种异质性疾病,其临床特点是高尿酸血症、痛风性急性关节炎反复发作、痛风石沉积、特征性慢性关节炎和关节畸形,常累及肾引起慢性间质性肾炎和肾尿酸结石形成。随着人们生活方式的改变,痛风患病率有明显上升趋势,20年间,痛风在我国发病率已上升至7.6/10万,南方和沿海经济发达地区发病率尤高[1,2],因此越来越受到医学界的重视。几十年来国内外学者不断努力,已探索性地建立了一些疾
病动物模型,可供研究参考。高尿酸血症是引起痛风重要的前提和生化基础,但是痛风的患病率远低于高尿酸血症[3],故本文主要讨论痛风性关节炎和痛风性肾病的动物模型制作。 1 痛风性关节炎的动物模型 1.1 鼠兔等哺乳动物痛风性关节炎模型由于鼠兔等哺乳动物体内嘌呤代谢途径与人类不同,难以从嘌呤代谢紊乱方面来复制痛风性关节炎的模型,因此人们将尿酸钠盐(MSU)直接注射局部关节以获得类似临床痛风性关节炎的动物模型。 早在19世纪80年代,Coderre等[4]就采用MSU 0.2 ml 注射大鼠踝关节的方法,造出急性痛风性关节炎的动物模型。陈文照等[5]在研究痛风宁疗效时,采用MSU溶液0.2 ml注入大鼠右侧踝关节腔,模型动物受试关节周围软组织明显充血水肿,受试关节滑膜细胞内线粒体、内质网等细胞器明显肿胀,确认造模成功。金红兰等[6]将5%尿酸盐溶液50 μl,注入痛风模型组大鼠右后肢内踝的胫跗关节腔内,每个动物仅注射1次,24 h后,模型大鼠内踝的胫跗关节均出现不同程度的关节肿胀、行走迟缓、足爪卷曲、肢体不愿着力负重,个别动物后肢过度俯屈甚至跛行。踝关节及其周围组织的钾离子浓度明显高于正常,局部解剖发现尿酸盐结晶沉着于踝关节腔内,光镜下可见明显的关节炎病理改变。王斌等[7]将大鼠双侧后腿膝关节周围剃毛,消毒皮肤,轻度弯曲膝关节,经关节正中进针,用TB注射器6号针头将2%尿酸钠晶体溶液0.2 ml通过髌上韧带注
代谢综合征大鼠模型的建立 【关键词】代谢综合征 代谢综合征(metabolic syndrome,MS)是一种涉及多种代谢异常、与心血管病紧密联系的疾病状态,其中以肥胖(超重)、血压、血糖和血脂异常四项为突出,MS患者DM风险增高5倍,CVD风险增高3倍,心血管死亡率增高2倍,总死亡率风险增高1.5倍[1]。因此,研究代谢综合征的防治对于降低上述疾病的死亡率非常重要,而实验动物模型的建立是该研究工作的重要前提。 1 实验材料 1.1 实验动物选用离乳健康性Sprague-Dawley(SD)大鼠100只,雌雄各半,体重49~70g,普通清洁级,购自山东中医药大学实验动物中心,动物生产许可证号:SCXK(鲁)20050015。 1.2 动物饲料基础饲料为山东中医药大学实验动物中心提供普通清洁级动物饲料,高脂高热量饲料参照文献[2,3]改进,配方为:普通饲料56%,猪油10%,白糖10%,奶粉10%,蛋黄12%,豆粉2%。白糖为山东省东方糖业有限公司生产的天园牌优级绵白糖,批号为GB1445,奶粉为内蒙古伊利实业集团股份有限公司生产的全脂甜奶粉,批号为81211F3,猪油、蛋黄、豆粉均由市场购买。两种饲料组成及营养成分见表1。 1.3 主要试剂与仪器 Olypus Au2700全自动生化分析仪(日本东芝公司生产),奥林巴斯诊断产品有限公司提供的血糖、甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇试剂盒,批号:
OSR6121。电子天平YP600型(上海精科天平仪器厂),电子动物称(北京六一仪器厂),高速台式离心机TDL-5型(上海安亭科学仪器厂)。 2 实验方法 2.1 分组喂养离乳SD大鼠100只,随机分为2组:对照组20只(雌雄各半)给基础饲料,高脂组80只(雌雄各半)给高脂高热量饲料喂养。大鼠实验期间均自由摄食和饮水,饲料和水每日更换一次,饲养环境清洁,自然光照,温度20~25℃,湿度50%~70%,通风良好,共喂养8周。表1 两种饲料组成及营养成分表(略) 2.2 代谢综合征大鼠的筛选标准饲养8周后,称体重,量身长,计算Lee’s指数,公式为 3 体重(g)×103/体长(cm)。以高脂组体重超过对照组平均体重加1.96倍标准差为模型大鼠。 2.3 血糖和血脂检测对照组和筛选后符合标准的MS模型大鼠禁食禁水12h,尾静脉取血,分离血清,全自动分析仪上检测血糖、血脂,包括血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLc)和低密度脂蛋白胆固醇(LDLc)。用Dobiasova 等[4]的方法计算血浆致动脉硬化指数(atherogenic index of plasma,AIP):AIP=log[TG/HDLc]。 2.4 统计学处理各组数据用均数±标准差(x±s)表示,分别对雄性模型组和雄性对照组,雌性模型组和雌性对照组进行独立样本的t检验(Independent-Samples t test),用SPSS14.0软件进行统计分析,以P<0.05作为差异有显著性检验水准。 3 实验结果 3.1 实验动物的体重、身长、Lee’s指数比较用两种不同的饲
罗库溴铵项目简介 一、产品简介: 中文名:罗库溴铵 英文名:Rocuronium Bromide 中文化学名:1-[17β-乙酰氧基-3α-羟基-2β-(4-吗啉基)-5α-雄甾烷-16β-基]-1-(2-丙烯基)吡咯烷溴化物 英文化学名:1-[17β-Aloxycety-3α-hydroxy-2β-(morpholin-4-yl)-5α-androstan-16β-yl]-1-(prop-2-enyl)pyrrolidinium bromide 化学结构式: CAS :119302-91-9 分子式:C32H53BrN2O4 分子量:609.70 理化性质:本品为类白色至微黄白色粉末;有吸湿性,无臭,味苦。本品在乙醇中极易溶解,在水中易溶,在乙醚中几乎不溶。 质量标准:申报生产用药品质量标准或企业标准。 作用与用途:非去极性神经肌肉松弛剂。 储存要求:2-8℃密封避光储存。 包装材料要求:内包装采用塑料袋包装封口,外包装采用铝箔包装封口。
二、申报情况: 4家在审(重庆青阳药业、浙江仙琚制药、北京健力药业、海南长安国际制药) 原料药现在均未投产。 三、制剂价格状况: 【市场价格】目前上市只有小针5ml:50mg/支,95.07元/支 四、工艺情况简介: 该工艺以表雄酮为起始原料,经过上磺,脱磺,烯醇酯化,环氧,还原,缩合,酯化,水解,成盐9步反应制得,其中第四步得环氧产物往后面继续经过四步反应还可以生产得到另外一个产品维库溴铵。 工艺附表包括:原材料质量标准、工艺流程图、反应操作规程、设备一览表、每公斤罗库原料消耗表。 五、药理作用: 罗库溴铵是一起效、中时效的非去极化肌松药,具有该类药物所有的药理作用特性(箭毒样作用)。通过与运动终板处N型乙酰胆碱受体竞争性结合产生作用。其作用可被乙酰胆碱酯酶抑制剂如新斯的明、依酚氯铵和吡啶斯的明所拮抗。静脉麻醉时ED90值(刺激尺神经使拇指肌颤搐反应抑制90%时所需的剂量)约为0.3 mg/kg。静注罗库溴铵0.6 mg/kg (静脉麻醉时2倍ED90量)60秒内,几乎所有病人均可获得合适的气管插管条件,其中80%的气管插管条件为优。在2分钟内产生的全身肌松适合各类手术。该剂量的临床作用时间(注药结束至25%肌颤搐自然恢复的时间)为30-40分钟。总作用时间(90%肌颤搐自然恢复的时间)为50分钟。单次静注罗库溴铵0.6 mg/kg后,肌颤搐从25%自然恢复至75%的平均时间(恢复指数)为14分钟。用较小剂量罗库溴铵0.3-0.45 mg/kg(1-1.5倍ED90量)时,其起效减慢,时效缩短。给罗库溴铵0.45 mg/kg的剂量90秒后,才达到适当气管插管条件。剂量超过3倍ED90时,气管插管条件未见进一步改善,而其时效却延长。剂量超过4倍ED90量未进行研究。罗库溴铵0.15 mg/kg维持剂量的时效,在安氟醚和异氟醚麻醉老年病人,及有肝脏和/或肾脏疾病病人(约20分钟)中,比较静脉麻醉下无排泄器官功能损伤病人(约13分钟)有一定延长。在重复追加推荐剂量的维持量未见蓄积作用(即时效逐渐增加)。心脏手术病人中,当给本品0.6—0.9 mg/kg达大阻滞时,其常见心血
痛风动物模型的研究现状及评价 (作者: _________ 单位:___________ 邮编: ___________ ) 【摘要】通过对痛风性关节炎和痛风性肾病的动物模型相关文献的系统回顾,对模型制作的现状,常用模型的特点及应用进行了总结和评价。目前常见的痛风动物模型在稳定性,持久性,制作程序的标准化等方面需要继续努力改进,复制出更接近于人类嘌呤代谢障碍和(或)尿酸排泄障碍所形成的持久稳定的高尿酸血症模型是基础和关键。应用现有模型进行相关的实验研究需注意根据模型特点和研究目的合理选择,加强多种模型的联合应用,并注意实验结果的合理评价。 【关键词】痛风;动物模型;痛风性关节炎;痛风性肾病痛风(gout)是由于嘌呤代谢紊乱和(或)尿酸排泄障碍所导致的一种异质性疾病,其临床特点是高尿酸血症、痛风性急性关节炎反复发作、痛风石沉积、特征性慢性关节炎和关节畸形,常累及肾引起慢性间质性肾炎和肾尿酸结石形成。随着人们生活方式的改变,痛风患病率有明显上升趋势,20年间,痛风在我国发病率已上升至 7.6/10 万, 南方和沿海经济发达地区发病率尤高]1,2],因此越来越受到医学界的重视。几十年来国内外学者不断努力,已探索性地建立了一些疾病动物模型,可供研究参考。高尿酸血症是引起痛风重要的前提和生化基础,但是痛风的患病率远低于高尿酸血症]3],故本文主要讨论痛风性关节炎和痛风性肾病的动
物模型制作。 1痛风性关节炎的动物模型 1.1鼠兔等哺乳动物痛风性关节炎模型由于鼠兔等哺乳动物体内嘌呤代谢途径与人类不同,难以从嘌呤代谢紊乱方面来复制痛风性关节炎的模型,因此人们将尿酸钠盐(MSU直接注射局部关节以获得类似临床痛风性关节炎的动物模型。 早在19世纪80年代,Coderre等[4]就采用MSU 0.2 ml 注射大鼠踝关节的方法,造出急性痛风性关节炎的动物模型。陈文照等[5]在研究痛风宁疗效时,采用MSU溶液0.2 ml注入大鼠右侧踝关节腔,模型动物受试关节周围软组织明显充血水肿,受试关节滑膜细胞内线粒体、内质网等细胞器明显肿胀,确认造模成功。金红兰等 [6]将5%尿酸盐溶液50 l,注入痛风模型组大鼠右后肢内踝的胫跗关节腔内,每个动物仅注射1次,24 h后,模型大鼠内踝的胫跗关节均出现不同程度的关节肿胀、行走迟缓、足爪卷曲、肢体不愿着力负重,个别动物后肢过度俯屈甚至跛行。踝关节及其周围组织的钾离子浓度明显高于正常,局部解剖发现尿酸盐结晶沉着于踝关节腔内,光镜下可见明显的关节炎病理改变。王斌等[7]将大鼠双侧后 腿膝关节周围剃毛,消毒皮肤,轻度弯曲膝关节,经关节正中进针,用TB注射器6号针头将2%尿酸钠晶体溶液0.2 ml通过髌上韧带注入大鼠膝关节腔,制成痛风性关节炎模型。最近,姚丽等]8]对大鼠急性痛风性关节炎动物模型进行
脓毒症大鼠肝组织基因表达变化的研究 摘要】目的应用基因芯片技术初步分析脓毒症大鼠肝脏组织细胞基因表达谱的 变化。方法健康Wistar 大鼠40 只,随机分为模型组和假手术组,每组各20 只。通过盲肠结扎穿孔术(CLP)制备大鼠脓毒症模型,应用含有22523 个大鼠基因cDNA 克隆的表达谱基因芯片进行检测,筛选差异表达基因,用计算机软件分析 脓毒症大鼠肝脏组织术后24 小时的基因表达变化。结果与假手术组比较,共筛 选出差异表达基因共285 条,占基因芯片总点数的1.26%,其中已知基因180 条,93 条基因表达上调,87 条基因表达下调。涉及到一系列与细胞生长调节相关基因,物质能量代谢相关基因,信号转导、炎症、应激反应相关基因,转录调控及 蛋白质翻译、修饰、加工、降解相关基因等相关的基因异常表达。结论脓毒症导 致的多脏器功能不全(MODS)是多种基因作用的结果,采用基因芯片技术全面 揭示脓毒症肝脏基因表达的模式,有利于发现新的研究目标和治疗途径。 【关键词】脓毒症肝基因表达基因芯片 【中图分类号】R394 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752(2012)08-0053-03 脓毒症(Sepsis) 及其所导致的多脏器功能不全(MODS),在临床上发病率高,病死率高,临床救治棘手,源于其发病机制非常复杂。目前多数认为是过度的炎 症反应与代偿性抗炎反应失衡,出现免疫系统功能紊乱的病理生理过程,并与机 体多系统、多器官病理生理改变密切相关,涉及感染、炎症、免疫、凝血及组织 损害等一系列基本问题[1]。国内外已有学者运用基因芯片技术对经C L P 或腹腔 注射脂多糖制备小鼠脓毒症模型的多个脏器组织的基因差异表达分别进行研究, 其结果初步显示了这些组织中部分基因表达的特异性改变,但并未对脓毒症机制 和治疗的研究提出新的看法。本实验再次运用基因芯片技术研究分析脓毒症时肝 脏相对应的基因表达谱变化,旨在进一步探讨脓毒症的研究治疗新途径。 1 材料和方法 1.1 实验动物及模型制备 雄性健康Wi s t a r 大鼠40 只,体重180 - 220g,购自上海斯莱克实验动物 有限公司。实验前在清洁级环境下饲养2 周,常规饲料喂食、正常饮水。按随机 数字表法分组:假手术组(n = 20 只)、模型组(n = 20 只)。模型组:采用 盲肠结扎穿孔术(CLP)方法建立大鼠肠源性脓毒症模型。实验前大鼠禁食过夜,自由饮水,称体重后以氯胺酮(100mg/ kg)腹腔麻醉固定,消毒铺巾,沿中下腹正中线切开2cm 开腹提出盲肠,7 号丝线距盲肠根部1c m 处血管弓内结扎盲肠;用9 号无菌针头刺穿盲肠3次,使肠内容物流出,避免伤及肠系膜血管,然后将 盲肠放回腹腔,缝合腹部切口。假手术组:不结扎和穿刺盲肠外,其余操作同CLP组。两组术毕皮下注射平衡液5ml/kg以补充术中丢失的体液并抗休克治疗, 术后正常饮食、自由饮水。 1.2 肝组织的留取和处理 两组大鼠(n=40只)24h断颈活杀迅速开腹摘取肝脏,置入液氮罐中骤冷保存,温度-70℃,备用。 1.3 基因芯片杂交及检测分析 用一步法总RNA提取试剂(Trizol)抽提液氮中肝组织总RNA。反转录并标记探针,与RatRef-12大鼠表达谱基因芯片(由联合基因技术有限公司制作,每个芯 片含有22523个大鼠基因cDNA克隆)杂交过夜,洗片、晾干后扫描,采用Scan
主堡塞坠处整盘查!!!!生!旦筮!!鲞筮!翅£丛!』垦婴!!蜡:!!P!!里!笪!Q!!:!巫:!!,№:! 腹腔持续引流置管模型在脓毒症中的应用及研究进展缪鹏郁正亚 脓毒症是一种由感染引起的临床综合征,它通常导致全身一系列炎症反应,可发展为多脏器功能衰竭(MODS),是危重症患者死亡的主要原因之一。脓毒症后期主要表现为全身器官衰竭(尤其在严重脓毒症期),并最终导致难以逆转的循环衰竭(感染性休克)¨j。近年来,严重脓毒症的发病率逐渐上升,其治疗费用也不断攀升,但死亡率仍然高居不下心】。 为了更好地研究脓毒症的发病机制与治疗措施,现已设计出多种与脓毒症发病类似的动物模型,尽可能模仿临床患者体内所出现的病理变化,如腹腔内毒素(LPS)注射及盲肠结扎穿孔(CLP),但均无法复制腹腔内持续感染状态如肠瘘及持续性细菌感染等病理生理变化的研究旧o。腹腔持续引流置管(CASP)模型是一种新型脓毒症动物模型,1998年由Zantl等Ho创立,目的在于建立一种持续性腹腔感染导致的脓毒症性腹膜炎,同时具备严重的炎症反应和高浓度菌血症,可以较好模拟临床肠瘘患者的病理生理变化。 一、CASP模型的建立 CASP模型的步骤现多参考Zantl等”1的报道,其方法是通过将一固定管径的支架植入鼠的升结肠壁,使肠腔与腹腔相通,肠内容物通过支架持续进入腹腔内,引起化学性和细菌性刺激,导致脓毒症性腹膜炎,其后动物发展为多器官衰竭,最终死亡。这种病理变化过程与临床上患者肠瘘或肠穿孔的病理变化过程相仿,胃肠道内容物持续渗液至腹腔内而肠壁无明显的缺血坏死灶,细菌血症较为明显,符合急性弥漫性腹膜炎的病理生理变化。CASP模型的死亡率随支架管径的增大而增高,其早期死亡 DOI:10.3760/cma.i.issn.1001-9030.2012.09.09l 基金项目:国家自然科学基金资助项目(81141021) 作者单位:100730北京,首都医科大学附属北京同仁医院普通外科 通信作者:郁正亚,Email:zhengyayu@ya—boo.eom率高,这有别于CLP动物模型,后者偏向 模拟局限性腹腔脓肿的病理生理变化, 早期菌血症不明显,后期死亡率高,死亡 时间分布在28d内"J。此外,Barrera 等拍1报道可以通过盲肠置管的改良方法 制作脓毒症动物模型,并降低因置入肠 腔内支架导致肠梗阻的风险,但尚无其 他文献证实。 根据文献报道可将CASP模型建立 成功的标准归纳于以下几点:动物模型具 有早期高死亡率并伴有脓毒血症反应如 寒战、体温降低、眼角分泌物增多、活动性 降低等特点,且死亡时限往往在3d之内; 24h内多脏器器官细菌培养阳性,组织病 理可发现肺、肝、肾、置管区肠壁组织炎症 反应严重,可伴有坏死组织;动物模型血 浆促炎及抗炎细胞因子大幅度上升;动物 模型手术后24h内支架无移位一o。 二、细菌感染 CASP模型特点之一就是其细菌感 染严重,菌血症出现时间较早,可以重现 多菌群细菌感染的脓毒症性腹膜炎的发 生、发展过程。手术后6h在腹腔灌洗 液、肝脏、脾脏中即可培养出明显细菌菌 落,12h后在血及大部分器官如肺脏、肝 脏、腹腔灌洗液中细菌浓度即达到最高 值,而在脾脏及肾脏中12h后细菌浓度 仍持续增高。细菌培养的类型为鼠内源 性肠道杆菌,如鼠大肠杆菌、鼠变形杆菌 等‘4。?8I。 腹腔细菌感染严重程度与动物模型 预后密切相关,现今许多对于脓毒症动 物模型治疗机制的研究都将动物体内细 菌清除作为重要的参照之一【9‘1…,因此, 如何降低脓毒症动物模型体内的细菌载 量并提高动物的存活率是当今研究的重 要领域。 三、全身促炎/抗炎反应及细胞因子 变化 脓毒症分期包括全身炎症反应综合 征(SIRS)、脓毒症、严重脓毒症以及脓毒 症休克4期。脓毒症炎症状态存在两种 截然不同的免疫反应现象:SIRS特点是 是产生过多促炎性介质因子,机体处于 免疫过度激活期,大量炎性因子和生物 活性介质的释放引起全身感染中毒症状 ?1869? ?综述? 和多脏器损伤。如果此时炎症及感染状 况没有被机体及时清除,随后发生的代 偿性抗炎症反应综合症(CARS)使机体 逐渐转入免疫系统的广泛抑制期,主要 表现为:固有免疫及适应性免疫受到抑 制,淋巴细胞凋亡增加,抗炎性细胞因子 如白细胞介素(IL)一10增加以抑制肿瘤 坏死因子(TNF)表达等011-12]。而不同时 期机体内细胞因子的变化可以作为衡量 脓毒症发展阶段的一个重要判断标 准㈣。 CASP模型中,SIRS及CARS阶段均 在形成感染性腹膜炎后迅速发展,其特 点为可能在不同部位同时发生。手术置 管3h后即可检出血浆促炎因子包括 TNF、IL一1B、IL-6、IL-12、IL.18及血浆抗 炎因子IL一10、趋化因子单核细胞趋化蛋 白(MCP)一1伴随性升高,TNF、IL一10于 12h达高峰。在小鼠肺脏中可发现大量 TNF但少有IL一10表达,肝脏中IL一10表 达较高而TNF表达低水平。其中IL-6、 IL一10被认为是判断临床患者预后较为 准确的指标¨4。1“,IL-6是一种促炎细胞 因子,在急性时相反应蛋白如C一反应蛋 白与脂多糖结合蛋白产生中起到重要作 用。IL-6的增高往往早于急性时相反应 蛋白,增高幅度与脓毒症的严重程度、脓 毒性休克和不良预后相关。IL-6水平持 续增高可导致患者多脏器功能不全和死 亡率明显增加。IL—10为抑炎因子,可以 抑制单核巨噬细胞及树突状细胞产生过 量细胞因子如TNF,并抑制细胞毒性T 细胞反应。MCP一1/CCL2及其受体CCR2 是趋化因子家族重要成员,其主要功能 是趋化和激活单核巨噬细胞,通过化学 趋向性梯度趋化、激活炎性细胞进入炎 症区ll。”j。IL.12p40缺乏的CASP模型 较对照组具有更高的死亡率。干扰素一1 (IFN.^y)在CASP模型外周血中表达较 低,但IFN.¨R。一小鼠造模死亡率明显 升高,推测其虽然含量较低,但生物活性 高,在脓毒症腹膜炎中具有保护作用。 而TNFRp55“一小鼠造模后死亡率并没 有明显变化,提示TNF在小鼠弥漫性腹 膜炎模型中可能没有起到关键作用或由 其介导的其他相关保护件及榻伤件细晌 万方数据
无症状高尿酸血症动物模型的建立及初步研究目的:建立新型的无症状高尿酸血症小鼠模型。方法:选取雄性尿酸氧化 酶基因敲除杂合子C57BL/6J小鼠和野生型C57BL/6J小鼠各20只,两类小鼠均按随机数字表法分为对照组和模型组,每组各10只,模型组给予高酵母饲料饲养并予以氧嗪酸钾盐悬液(1次/d,250 mg/kg)腹腔注射。分别于造模前和造模后第1、2、3、4周时鼠尾静脉取血检测小鼠血清尿酸水平(UA),并于造模后第5周取小鼠肾脏行病理切片及HE染色。结果:造模1周后,两模型组小鼠血清尿酸水平均较对照组明显升高,且杂合子模型组尿酸水平明显高于野生型模型组,比较差异均有统计学意义(P<0.05),但肾脏病理切片HE染色显示,两种小鼠对照组和模型组均无明显病理变化。结论:以高酵母饲料饲养并予以氧嗪酸钾盐悬液腹腔注射处理的尿酸氧化酶基因敲除杂合小鼠所构建的高尿酸血症动物模型具有尿酸值高,模型稳定的特点,为较理想的小鼠高尿酸血症动物模型。 尿酸是人类嘌呤代谢的最终产物。在约1500万年前人类由于基因突变失去了尿酸氧化酶基因[1],因此人类的尿酸水平高于其他物种,这种改变有利于人类适应当时的生存环境,但尿酸水平仍控制在一定范围内。现在所谓的高尿酸血症(hyperuricemia)是指嘌呤代谢紊乱和/或尿酸排泄障碍导致的血尿酸水平增高[2]。随着人们生活水平的提高及饮食结构的变化,高尿酸血症的发病率日渐增高[3-4],由于雌性激素的作用尿酸水平在男性中比绝经前女性更高[5-6]。高尿酸血症动物模型,是研究高尿酸血症及筛选降尿酸药物的重要工具[7-9]。目前尚未见尿酸氧化酶基因敲除杂合小鼠制作高尿酸动物模型的报道,本实验对尿酸氧化酶基因敲除杂合小鼠进行高酵母饲养及氧嗪酸钾悬液腹腔注射处理,观察其血清尿酸等指标,目的在于获得尿酸值较高且稳定的理想高尿酸血症动物模型。1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 实验动物选择以C57BL/6J小鼠为背景的尿酸氧化酶基因敲除杂合子小鼠(基因型为Uox+/-)20只及野生型C57BL/6J小鼠(基因型为Uox+/+)20只,均为雄性,6~8周龄,体质量18~25 g,尿酸氧化酶基因敲除杂合小鼠构建于上海南方模式生物研究中心,由本院实验动物中心SPF级动物饲养房饲养。 1.1.2 仪器和试剂日本东芝TBA-40FR全自动生化分析仪;Nikon90i显微镜;高酵母饲料(北京科澳协力饲料有限公司);氧嗪酸钾盐(美国Aldrich公司)。 1.2 实验方法 1.2.1 动物分组及建模杂合小鼠及野生型小鼠适应性饲养7 d后,按随机数字表法分别分为对照组和模型组,每组10只。模型组小鼠予以高酵母饲料饲养及氧嗪酸钾悬液腹腔注射(1次/d,250 mg/kg),对照组小鼠饲以普通小鼠颗粒饲料,并给予同体积蒸馏水腹腔注射。
炎调方干预脓毒症大鼠模型的效果研究 发表时间:2019-09-23T16:25:49.893Z 来源:《医师在线》2019年5月9期作者:张燕婷1 朱佳琳1 李淑芳2 熊旭东2 [导读] 目的探讨炎调方对脓毒症大鼠的作用机制。张燕婷1 朱佳琳1 李淑芳2 熊旭东2通讯作者(1上海三林康德社区卫生服务中心,中医科;2上海中医药大学附属曙光医院,感染科;上海200000)摘要:目的探讨炎调方对脓毒症大鼠的作用机制。方法将SD雄性88只大鼠随机分为正常组、假手术组、模型组、炎调方组、对照组(炎调方减去大黄、芒硝),采用盲肠结扎穿孔术制备脓毒症大鼠模型。术后分别于12h、24h、36h致死大鼠,测定血清IL-1β水平及观察各组肺病理切片的变化。结果血清方面:假手术组与正常组相比,血清IL-1β水平无统计学意义(P>0.05);与正常组相比,12h模型组的血清IL-1β水平与24h的血清IL-1β水平比较升高 (P<0.05);造模后12h炎调方组血清IL-1β水平和模型组对比,有显著降低(P<0.01),差异在24h 无统计学意义(P>0.05);对照组(炎调方去掉大黄和芒硝)与模型组对比,12h和24 h均无统计学意义(P>0.05);炎调方组血清IL-1β水平和对照组对比在12 h水平显著降低(P<0.01),24 h但是未见明显差异(P>0.05);肺病理切片方面:正常对照组及假手术组肺组织未见明显病理 学损伤性变化。CLP术后12h,模型组的肺组织轻微充血,CLP手术后24h,与12h对比,模型组肺组织损害更甚,充血更明显,减方对照组肺组织病变情况较模型组无明显改变。炎调方组和模型组相比,病变范围略小。结论炎调方能明显下调脓毒症大鼠血清IL-1β水平,并且能减轻脓毒症大鼠肺组织损伤。 关键词:炎调方脓毒症肺病理切片脓毒症(sepsis)是指由感染导致的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),进一步发展可以成急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和脓毒症休克(septic shock),甚至可导致多脏器功能障碍综合征(MODS)[1]。严重的脓毒症患者和脓毒性休克目前仍然是作为ICU内患者死亡的主要原因,其病死率达28%~50%。脓毒症一直以来都作为危重病、急救医学领域临床和基础科研的难点和热点 [2]。本研究是通过经典的盲肠结扎穿孔(CLP)术制作脓毒症大鼠模型,以通腑活血法治疗脓毒症,通过检测大鼠部分炎症介质变化和肺组织的变化及观察大鼠的死亡情况,进一步探讨并丰富炎调方对脓毒症干预的效果研究,为诊疗脓毒症疾病的发展提供研究证据。 1 实验材料 1.1动物来源与分组 88只雄性SD大鼠,购自上海中医药大学的实验动物中心,购回后所有大鼠均作适应性饲养一周后随机分为正常组、假手术组、模型组、炎调方组、对照组(炎调方减去大黄和芒硝)。 1.2 药物炎调方组:玄参l5g,当归15g,生大黄10g(后下),芒硝10g(冲),桃仁10g,赤芍15g。对照组:玄参l5g,当归15g,桃仁10g,赤芍15g。中药均由上海曙光西院中药房提供。按常规的煎煮方法来煎煮,最后将芒硝充分溶解于药液中,将药液浓缩为含生药1.0 g /ml,放入4℃冰箱备用。对照组(炎调方减去大黄和芒硝)煎煮方法同前,药液被浓缩为含生药1.0g/mL,保存备用于4℃冰箱。 1.3 仪器 Multiskan MK3 酶标仪(赛默尔上海世飞仪器厂);501C超级恒温水域槽(上海精宏实验设备公司);台式离心机(microfuge lite)(Beckman 公司);OLYMPLUS BH2 显微镜(PHILIP);石蜡全自动切片机(德国CUT6062切片机);低温冰箱(-70℃)(Forma scientific公司)。 2 方法 2.1 脓毒症模型的制备 参照相关文献[3-5],采用盲肠结扎穿孔(cecal ligationand puncture,CLP) 法制造脓毒症大鼠模型,实验鼠术前禁食12小时,腹腔注射2﹪的戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉,安尔碘消毒皮肤,沿中下腹做大约1.5cm的切口,提出盲肠,用4号线把盲肠根部结扎,将18号针把盲肠穿通3次后将肠还纳于腹腔,并逐层缝合皮肤。术后注射生理盐水(30mg/kg)于皮下抗休克。待麻醉清醒后可自由活动、喝水、进食。假手术组仅仅切开腹腔并翻动肠道,不去结扎穿刺,剩下的操作同模型组。 2.2 分组按随机方法将实验大鼠分成5个组,正常组8只,麻醉并腹主动脉取血和肺部组织后处死;假手术组8只,麻醉后开腹翻动肠道,关闭腹腔,12h后麻醉并腹主动脉取血和肺部组织后处死;模型组24只,CLP术后12h、24h、36h分别麻醉然后腹主动脉取血和肺部组织后处死,每个组各8只;炎调方组,将炎调方于术前灌胃(9.9g/kg),每天一次,连续3天,灌胃3次后2h予以造模,CLP术后各时间点分别麻醉并腹主动脉取血和取肺部组织后处死,每个组各8只;对照组(炎调方减去大黄和芒硝)24只,该方造模前灌胃(9.9g/kg),每天一次,连续3天,灌胃三次后2h予以CLP造模,术后各时间点分别麻醉和腹主动脉取血致死,每组各8只。 2.3 标本采集与检测 腹腔注射2%戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉大鼠,安尔碘消毒皮肤后逐层开腹,予以腹主动脉抽血.取血后静置30min于室温下,离心(3000转/rain15min)后血清存于4℃冰箱,备测白细胞介素1β(IL-1β),然后快速打开大鼠左右胸腔,取出左右两边肺叶。切取左肺和右肺的病理组织,左肺固定于福尔马林10%液体,酒精极度脱水,石蜡包埋并切片,常规HE染色,在光镜下对比肺组织的变化。右肺迅速置于液氮中备用,然后转入-70℃冰箱冻存。 3 统计学方法统计软件用于SPSS 19.0,计量资料的数据以Mean±SD(x±S)来表示,采用单因素方差分析方法。(P<0.05是差异具有统计学意义) 4 实验结果 4.1 多组大鼠死亡情况观察实验中,实验鼠共死亡19只(其中模型组8只,炎调方组4只,减方炎调方组7只),进入后续实验共69只。正常组、假手术组大鼠活动无异常。模型组的手术之后都有脓毒症严重现象,如手术结束后清醒推迟,呼吸变快明显,腹部向下膨隆,精神不振,少动等现象,剖开腹腔发现脓血和浑浊性恶臭液体,肠管可见肿胀,肺部明显淤血,CLP+减方对照组大鼠与模型组相比未见明显变化。CLP+炎调方组大鼠精神明显好于CLP组,术后表现较轻。取材前,各组大鼠的死亡情况(只)(见表1)。正常组和假手术组全部存活,模型组12h,24h分别死亡2,5只(死亡率8.3%,3 5.7%),炎调方组12h,24h分别死亡1,2只(4.17%,13.3%),减方炎调方组12h, 24h分别死亡1,4只(4.17%,2 6.67%)。 4.2各组大鼠血清IL-1β的比较
重症脓毒血症治疗的理论基础 文章来源: 2006-7-24 11:35:13 重症脓毒血症治疗的理论基础 肾脏病与透析肾移植杂志 1999年第6期第8卷基础医学 作者:孙启全王金泉 单位:南京军区南京总医院解放军肾脏病研究所 (南京,210002) 关键词:脓毒血症;器官衰竭;治疗 脓毒血症是一种由感染引起的临床综合征,伴有下列征象:体温高于或低于正常,白细胞增多或减少、心动过速、呼吸急促或每分钟通气量异常升高,如临床上出现其中两项或两项以上症状,即可诊断脓毒血症[1];当伴发器官功能衰竭,即称为重症脓毒血症(severe sepsis)。美国每年有50万名脓毒血症患者,存活率仅55%~65%。近年来在大量临床及实验研究的基础上,人们对脓毒血症有了许多新的认识,针对脓毒血症的检测手段有了提高,抗感染治疗、支持治疗有了很大改善,使脓毒血症患者的死亡率有所下降。本文就近年对脓毒血症的发病机制及重症脓毒血症的治疗综述如下。 1 脓毒血症的发病机制 正常情况下当微生物入侵人体,机体免疫防御系统会作出迅速而恰当的反应;然而,当免疫防御能力缺陷、反应过高或过低,都可以通过内源性致炎物质导致脓毒血症的发生和发展。早期起关键作用的是细胞因子,在内毒素刺激下,单核细胞产生炎症因子如肿瘤坏死因子(TNF)和白介素-1(IL-1),这些炎症因子能促进中性粒细胞与内皮细胞粘附,激活凝血系统,释放大量的炎性介质,包括其它细胞因子、白三烯及蛋白酶等,同时也产生抗炎性介质如IL-6、IL-10等(附图)。IL-1和TNF二者有协同作用,具许多相同的生物学效应。对脓毒血症动物模型研究表明,抑制IL-1和TNF可以改善器官功能并能提高存活率[2]。IL-8能够趋化中性粒细胞,导致炎症迁延不愈。IL-6和IL-10可能起负性调控作用,抑制TNF的产生,增强急性时相反应物质和免疫球蛋白的作用,抑制T淋巴细胞和巨噬细胞的功能。但在众多的临床研究中,仅一项研究提示TNF 的浓度改变具生理学效应,可以影响免疫级联反应下游的细胞因子水平[3]。 花生四烯酸代谢产物与脓毒血症的发生及发展有关,动物及临床试验已经观察到,环氧化酶抑制剂(布洛芬)通过抑制上述物质的产生可以降低体温、减慢心率、减少每分钟通气量和纠正乳酸中毒,但并不能降低死亡率[4]。进一步证实血栓烷A2(收缩血管)、前列环素(扩张血管)
脓毒血症动物模型具体步骤及说明 原型物种人 来源盲肠结扎穿孔术(CLP)致脓毒症 模式动物品系SPF级SD大鼠,健康,雄性,体重为180g~200g 实验分组实验分六组:正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组,每组15只动物。 实验周期2d 建模方法1. 称量大鼠,腹腔注射水合氯醛(350mg/kg)麻醉,腹部正中剃毛后用碘酒及酒精擦拭手术区域。 2. 沿腹白线切开腹腔约2cm,找出盲肠,用5-0 缝线结扎约1/3盲肠,以21G针头贯通穿刺结扎的盲肠2次。轻轻挤压使少量肠内容物从穿刺孔溢出确保通畅;将处理好的盲肠回纳入腹腔,用5-0 缝线缝合内层,3-0缝线缝合外层,将大鼠置于加热垫维持肛温在37±0.5℃。 3. 待大鼠苏醒后自由饮水,正常饲养。 4. 2d后大鼠水合氯醛钠麻醉后,于腹主动脉取血5ml,室温静止2h,4℃离心机3000r/min离心10min,分离出上层血清,置-80℃冰箱保存备用。处死大鼠,取出心脏、肝脏、肾脏、肺、小肠,4%多聚甲醛固定,石蜡包埋切片(厚4um),HE染色,观察病理改变,其余组织置于-80℃冰箱备用。 应用疾病模型
1.一般情况观察脓毒症组术后苏醒延迟,醒后精神萎靡,身体蜷缩,基本不活动,进食进水减少,对外界反应迟钝,呼吸频率加快,被毛蓬松少光泽,大便稀软,不再扎堆取暖。12h出现死亡大鼠,随着时间的延长大部分大鼠出现皮温低,肌力减弱,眼周血性分泌物,停止进食进水,排泄稀水样便,色黄,腥臭味。进一步发展出现呼吸急促,对被动仰卧无反抗,排泄物呈黏液状,量多,最终死亡。剖腹可见恶臭味血性渗液,肠管水肿黏连,盲肠坏死变黑。 心脏:光镜下结果比较,对照组大鼠心肌肌纤维结构排列紧密、无水肿、充血及渗出。模型组心肌肌纤维结构排列疏松,带状空泡化,细胞核肿胀,间质水肿、充血。 肝脏:肝有大量空泡脂肪样变性,肝细胞肿胀并有炎性细胞浸润。 肺:模型组肺间隔增厚,部分肺泡组织结构被破坏,炎症细胞浸润。 肾:可见肾皮质及间质水肿伴大量炎性细胞浸润,肾小管上皮细胞均有肿胀。空泡变性,坏死脱落。肾小管囊腔扩张、管型形成。皮髓质境界欠清晰,肾小球收缩、毛细血管微血栓形成 小肠:模型组小肠粘膜水肿、白细胞浸润、出血和上皮细胞坏死脱落。 血浆中炎症因子增加是脓毒症的典型特征之一,IL-1β、TNF-α及IL-6 是主要的促炎症细胞因子,在脓毒症模型后显著升高。
罗库溴铵(征求意见稿) Luokuxiu’an Rocuronium Bromide O H 3C O Br - 基。 盐中。 C )有关物质 取本品,精密称定,加乙腈-水(9:1)溶解并稀释成每1ml 中约含5mg 的溶液,作为供试品溶液;精密量取1ml ,置100ml 量瓶中,用乙腈-水(9:1)稀释至刻度,摇匀,作为对照溶液。照含量测定项下的色谱条件,取对照溶液10μl 注入液相色谱仪,调节检测灵敏度,使主成分色谱峰的峰高约为满量程的10%。再精密量取供试品溶液与对照溶液各10μl ,分别注入液相色谱仪,记录色谱图至主成分峰保留时间的2.5倍。供试品溶液的色谱图中如有杂质峰(杂质Ⅰ之前的色谱峰不计),已知杂质按加校正因子(见下表)的主成分自身对照法计算,其他未知杂质按不加校正因子的主成分自身对照法计算,杂质Ⅰ不得过0.2%,杂质Ⅱ、Ⅲ均不得过0.1%,杂质Ⅳ、Ⅴ均不得过0.3%,其他单个杂质不得过0.2%,
各杂质校正后峰面积的和不得过1.5%。 2.0ml;检测波长为210nm。分别取罗库溴铵杂质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ对照品与罗库溴铵对照品适量,加乙腈-水(9:1)溶解(杂质Ⅳ溶解时可加稀盐酸1滴助溶)并稀释制成每1ml 中分别含罗库溴铵1mg与杂质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ各0.1mg的溶液,作为系统适用性溶液。取10μl注入液相色谱仪,各组分的出峰顺序依次为溴离子峰、杂质Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、罗库溴铵和杂质Ⅴ;理论板数按罗库溴铵峰计算不低于5000,罗库溴铵与杂质Ⅴ的分离度应大于 3.5。 测定法取本品适量,精密称定,加乙腈-水(9:1)溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液,精密量取10μl,注入液相色谱仪,记录色谱图,另取罗库溴铵对照品适量,
大鼠盲肠结扎穿孔术(CLP)致脓毒症模型脓毒症(sepsis)是指由感染引起的全身炎症反应综合征(Systemic inflammatoy response syndrome,SIRS),临床上证实有致病菌侵袭存在或有高度可疑的感染性病灶,临床中多以常见并发症出现在重度感染、大面积烧伤、严重创伤或大手术术后的危重患者当中。脓毒症一旦发生,进展迅速,短时间可由全身炎性反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS)、脓毒症进展为重度脓毒症(severe sepsis)(合并器官功能不全)、脓毒症休克(septic shock)(并发充分液体复苏亦无法纠正的低血压)及多器官功能障碍综合征(Multiple organ dysfunction syndrome,MODS),以上三者可贯序发生,亦可同时发生,严重危及患者生命,产生极高的致死风险。虽然目前已经有许多动物模型用来复制脓毒症,但盲肠结扎穿孔术(CLP)致脓毒症的啮齿动物模型仍然是目前应用最广泛的脓毒症动物模型。 1.实验动物 SPF级Wistar大鼠,健康,雄性,体重为180g~200g 2.实验分组 实验分六组:正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组,每组15只动物。 3.实验周期 2d 4.建模方法 1.称量大鼠,腹腔注射水合氯醛(350mg/kg)麻醉,腹部正中剃毛后用碘酒及酒精擦拭手术区域。 2.沿腹白线切开腹腔约2cm,找出盲肠,用5-0缝线结扎约1/3盲肠,以21G针头贯通穿刺结扎的盲肠2次。轻轻挤压使少量肠内容物从穿刺孔溢出确保通畅;将处理好的盲肠回纳入腹腔,用5-0缝线缝合内层,3-0缝线缝合外层,将大鼠置于加热垫维持肛温在37±0.5℃。 3.待大鼠苏醒后自由饮水,正常饲养。 4.2d后大鼠水合氯醛钠麻醉后,于腹主动脉取血5ml,室温静止2h,4℃离心机3000r/min离心10min,分离出上层血清,置-80℃冰箱保存备用。处死大