八宝景天抑菌活性实验方案
1 材料与仪器
1.1 材料
八宝景天（茎、叶、花），采摘于吉林农业大学校园，去离子水洗净，阴干，经粉碎机粉碎(过40～60 目筛)，所得植物粉用密封袋于遮光处保存备用。
1.2 微生物
真菌：黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、黄瓜黑星病菌（Cladosporium cucumerinum）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum nigrum）由吉林省蔬菜花卉科学研究院提供。番茄叶霉病菌( Fulvia fulva )、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、甜瓜茎腐病菌(Fusarium gramimearum)、水稻立枯病菌（Rhizoctonia solani Kuhn）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、黄瓜菌核病菌(Sclerotinia sclerrotium) 均由吉林农业大学农学院植物病理研究室提供。
1.3 试剂与仪器
95%乙醇分析纯国药集团化学试剂有限公司
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琼脂粉生化试剂天津科密欧化学试剂有限公司
马铃薯
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1.4 培养基的制备
真菌都用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基)
马铃薯(去皮) 200g 葡萄糖20g琼脂20g水1000mL pH值自然
培养基具体制作方法是：将200g马铃薯去皮，去芽眼，切成小条放入铝锅中，加入1000mL水，煮沸20～30分钟左右至马铃薯软而不烂时，用6～8层纱布过滤，取滤汁于锅中，补水至1000mL，加入琼脂熔化，再加入糖搅拌均匀，趁热分装于试管或锥形瓶中。分装后121℃灭菌20min。
2 试验方法
2.1植物提取液的制备
准确称取100 g的样品，于250 ml锥形瓶中，加入200 ml 95%的乙醇，室温下，超声提取45 min，连续提取3次，过滤粗提物，离心（3500 r/min,20 min），过滤除杂，滤液用旋转蒸发仪浓缩至干，4 ℃冰箱中保存备用。
2.2八宝景天（茎、叶、花）提取物抑菌活性的测定
抑菌试验样品的准备：称取一定量的提取物，用20%（体积分数）乙醇将植物提取物配制成质量浓度为10 g/ml的供试药液做抑菌试验用。
菌的活化培养：供试真菌从4 ℃冰箱取出，接种于具有马铃薯葡萄糖琼脂培养基的培养皿中，于28℃下活化培养，待菌丝长满整个培养皿的80%时备用。
菌悬液的制备：取一定量已活化的供试菌于装有50mL的液体PDA培养基的锥形瓶中，制成菌悬液于28℃下培养48h，用无菌的移液管取1.0mL培养好的菌悬液于试管中，加入9.0mL的无菌水依次梯度稀释，每稀释一个试管，浓度降低10-1，用稀释培养基测数法测菌体个数，调至浓度为6.8×106CFU/mL（指每毫升样品中含有的细菌群落总数）。
八宝景天（茎、叶、花）提取物抑菌活性的测定采用菌丝生长速率法、稀释培养基测数法。
2.2.1菌丝生长速率法
又称抑菌圈法或琼脂平板法。生长速率是指将不同浓度的药液与融化的培养基混合，制成带毒培养基平面，在平面上接种病原菌，以病菌生长速度的快慢来
判断药剂毒力大小的方法，以一定的时间内菌落直径的大小来表示。
菌丝生长速率法试验步骤：1）制备带毒培养基平面准确的吸取一定量的上述植物提取物加入到已融化的培养基中，混合均匀倒入已灭菌的培养皿内，冷却后即成带毒的培养基平面2）接种病原菌用无菌打空器将已活化的菌制成直径为6mm的菌饼，用无菌镊子将菌饼接入平板中央，每培养皿放置1 个菌饼，置于25 ℃~28 ℃的电热恒温培养箱黑暗培养。3）结果采用十字交叉法测定菌落直径,按以下公式计算抑制率：
抑制率=[(CK菌落直径-0.6)-(处理菌落直径-0.6)]/(CK菌落直径-0.6)×100% 2.2.2稀释培养基测数法
根据微生物在高度稀释条件下，固体培养基上所形成的单个菌落是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的技术方法，即一个菌落代表一个单细胞。
稀释培养基测数法试验步骤如下：1）稀释培养基测数法(最大或然数计数法Most probable number，MPN)测定每毫升原培养液含活菌数，根据MPN所得结果将原培养液稀释成约100CFU/mL；2）吸取20μL菌悬液于含提取物的固体培养基的平板中，用涂菌棒涂布均匀静置15 min，将培养基平板倒置(防止皿盖冷凝水下滴)于28℃生化培养箱培养24 h；3）数菌落数，对照组菌落数记为C0，涂布提取物平板菌落数记为C，按下式计算抑制率：
萌发率=萌发率= 孢子萌发数/ 检查孢子总数=C/C0×100%
抑制率(%)=(对照萌发率- 处理萌发率)/ 对照萌发率=(C0-C)/C0×100%
以上每种试验方法重复三次。
一、抗菌实验 字体[大][中][小] (一) 体外抗菌实验 1. 实验前的准备工作 (1) 培养基的准备：肉汤琼脂培养基、真菌琼脂培养基等均可按药典规定的方法配制。 (2) 药液的准备：一般采用中草药水煎液，经滤过浓缩成1：10～1：1的浓度，试验前的药液需灭菌，以免污染影响结果。 (3) 试验菌株的选择及制备：一般使用典型的菌株，或从临床分离经鉴定后取得的菌株，如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、绿脓杆菌、链球菌、肺炎双球菌、白色念珠菌、酵母菌及真菌等。 细菌菌液的制备：将斜面菌种接种于普通肉汤培养基中，肺炎双球菌及溶血性链球菌须在上述培养基中加入5%～10%血清，或加入25%(V/V)或20%猪血水，37℃培养6～8小时或16～18小时。 真菌菌液的制备：将菌种接种于大试管中，并在22℃～25℃培养24小时或7天(视菌种及生长速度而定)，然后用灭菌生理盐水10mL洗脱制成混悬液。 菌液的浓度一般先采用培养液，如不显示抗菌作用，可再稀释成一定浓度。金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、痢疾杆菌可用1：1000浓度，肺炎双球菌、溶血性链球菌、白色念珠菌、酵母菌可用1：10或1：100浓度。 2. 实验方法 (1) 平碟法：取熔化后的培养基，每平碟(培养皿)倒入15mL，待凝固后，在培养基表面划线接种试验菌株，在划线的中间位置安放一个灭菌的不锈钢圈，在圈内滴入试验药液。也可采用打洞法，即在凝固的培养基上用已灭菌的打孔器打孔挖去琼脂块，将药液滴在洞内。用灭菌陶盖盖好，细菌在37℃、真菌在22℃～25℃培养18～20小时，观察细菌生长情况，如全线生长则认为该浓度的药液无抗菌作用，如细菌或真菌划线为药液所切断，则认为该浓度药液有抗菌作用。 (2) 平碟稀释法：先将中药药液2mL加入平碟内，再加入已溶化的培养基8mL，充分摇匀，待凝固后，划线接种菌株，同时用水2mL代替药液制作空白对照平碟，方法同样，接种后，将平碟倒置，在37℃(真菌在22℃～25℃) 培养18～20小时，观察结果。如对照碟长菌、药液碟不长菌，则认为有抗菌作用。 (3) 试管法：取试管12支，在每一试管中加入培养基5mL，于第1管中加被试药液5mL，混合均匀，吸出5mL加到第2管中，混合均匀，再吸5mL加到第3管中，依次操作，直到第10管，将第10管混合均匀后吸出5mL弃去，其药液稀释依次为1：2，1：4，1：8，……1：1024，再于前11管中各加入适当浓度的菌液0.1mL，第11管作为菌液对照，第12管不加菌液，加被试药液0.1mL，作为药液对照。将其全部在37℃(真菌22℃～25℃)培养16～24小时(真菌24～72小时)，观察各管菌株生长情况。如菌液对照管浑浊，表示菌株生长良好;药液对照管澄明，表示药液没有染菌。再将试验管与对照
八宝景天抑菌活性实验方案 1 材料与仪器 1.1 材料 八宝景天（茎、叶、花），采摘于吉林农业大学校园，去离子水洗净，阴干，经粉碎机粉碎(过40～60 目筛)，所得植物粉用密封袋于遮光处保存备用。 1.2 微生物 真菌：黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、黄瓜黑星病菌（Cladosporium cucumerinum）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum nigrum）由吉林省蔬菜花卉科学研究院提供。番茄叶霉病菌( Fulvia fulva )、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、甜瓜茎腐病菌(Fusarium gramimearum)、水稻立枯病菌（Rhizoctonia solani Kuhn）、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、黄瓜菌核病菌(Sclerotinia sclerrotium) 均由吉林农业大学农学院植物病理研究室提供。 1.3 试剂与仪器 95%乙醇分析纯国药集团化学试剂有限公司 葡萄糖分析纯国药集团化学试剂有限公司 琼脂粉生化试剂天津科密欧化学试剂有限公司 马铃薯 JFSD-100粉碎机上海淀久中药机械制造有限公司 JJ200型精密电子天平美国双杰兄弟有限公司常熟双杰测试仪器厂HH-S数显恒温水浴锅江苏省金坛市医疗仪器厂 RE-2000旋转蒸发器上海亚荣生化仪器厂 SHZ-III型循环水真空泵上海亚荣生化仪器厂 TDL-5A低速大容量离心机上海悦丰仪器仪表有限公司 生化培养箱SPX-250型上海跃进医疗器械厂 ZKF035电热真空干燥箱上海实验仪器厂有限公司 KQ5200B型超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司 不锈钢手提式灭菌器上海申安医疗器械厂 超净工作台上海生物科技有限公司
抗菌抗病毒常用实验研究方法 细菌、病毒性疾病是目前国内外流行的主要传染病,尤其是近两年来,由冠状病毒引起的SARS及由流感病毒引起的禽流感给动物及人类带来的严重危害,是人所共知的"由于各种疫苗的不断出现,虽然一些细菌、病毒病已得到了有效的控制,但是其治疗尚无有效的解决方法因此研制高效、低毒的新型中药抗菌、抗病毒制剂已成为巫待解决的问题。 1、常用的抗菌方法 1、1稀释法 1、1、1试管稀释法 培养基内抗生素的含量按几何级数稀释并接种适量的细菌，经孵育后，观察能引起抑菌作用最低抗生素浓度，称最低抑菌浓度(MIC)为该菌对药物的敏感度。稀释法所获得的结果比较准确，常被用作校正其他方法的标准。如以下黄贝贝等的青钱柳抗菌作用的实验研究和黄利权等的火绒草的抗菌活性研究的实验方法: 1、应用试管稀释法,测定青钱柳提取物对试验菌的抑菌效果,检验不同浓度下青钱柳提取物对细菌、霉菌的抗菌作用。结果:青钱柳提取物在体外对金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌等革兰氏阳性菌具有较强的抗菌作用;而对大肠埃希氏菌、铜绿假单孢菌等革兰氏阴性菌的抗菌作用不明显;对黄曲霉、烟曲霉等霉菌的抗菌作用不明显[1]。 2、采用试管稀释法,分别测定了火绒草水煎液、水提醇沉液、醇提物、醇提石油醚部分、醇提乙酸乙酯部分、醇提正丁醇部分、醇提水溶部分等7种提取物对大肠杆菌C83882、大肠杆菌C8390 3、大肠杆菌C8391 4、沙门氏菌C79-20、金黄色葡萄球菌Newbould S-30 5、金黄色葡萄球菌临床分离株等6株病原菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。试验结果表明,火绒草醇提物及其石油醚部分和乙酸乙酯部分对两种金黄色葡萄球菌具有较强的抑制作用,其MIC为0114 mg/ml生药浓度,MBC为0127 mg/ml生药浓度,而其它部分对金黄色葡萄球菌的抑制作用较弱。火绒草醇提正丁醇部分和水溶部分对3株大肠杆菌和1株沙门氏菌具有较强的抑制作用,其MIC为2170 mg/ml生药浓度,MBC为2170 mg/ml 生药浓度,显示了较强的抗菌活性[2]。 1、1、2肉汤稀释法 以水解酪蛋白(M-H)液体培养基将抗生素作不同浓度的稀释，然后种入待检细菌，定量测定抗菌药物抑制或杀死该菌的最低抑菌浓度(MIC)或最低杀菌浓度(MBC)。 如刘菁菁的研究蓝玉簪龙胆对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌( MRSA) 的体内外抗菌活性。蓝玉簪龙胆分别以乙醇、氯仿、正丁醇、蒸馏水提取，得到极性不同的4部分产物，利用肉汤稀释法测定其对 MRSA 和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌( MSSA) 的最低抑菌浓度( MIC) ; 体内实验部分: 采用腹腔注射 MRSA 法建立小鼠感染模型，分别给予蓝玉簪龙胆水提液高、中、低剂量，银黄胶囊治疗 15 d，并与模型对照组比较，观察存活率。结果：体外实验: 蓝玉簪龙胆各极性组分对 MRSA 和 MSSA 菌株均有不同程度的抑菌作用，其中正丁醇组分抑菌作用最强，其次为乙醇、水层组分; 体内试验: 除了蓝玉簪龙胆大剂量组，其余各治疗组存活率均高于模型对照组，而蓝玉簪龙胆中剂量组存活率最高。结论蓝玉簪龙胆对 MRSA 和 MSSA 均具有一定的抗菌作用，而且敏感性差异无显著性; 对MRSA 感染小鼠有一定治疗作用[3]。胡景玉等为了了解衡水地区大肠埃希菌的药
v1.0 可编辑可修改 1 实验七杀菌剂生物活性测定方法——抑菌圈法 一、实验目的 学习并掌握杀菌剂的离体活性测定方法——抑菌圈法。 二、实验原理 抑菌圈法即水平扩散法基本原理是在已接种供试菌的琼脂培养基上施以少量抗菌性物质或杀菌剂，使之接触培养基和病菌，经定温培养一定时间后，因药剂的渗透扩散作用，施药部位周围因杀死了病菌而抑制了其在培养基上的生长，从而产生了抑菌圈。在一定范围内，抑菌圈直径的平方或面积与药剂浓度的对数呈直线函数关系，从而可比较供试样品杀菌活性大小。其最大优点是精确度高，操作简单，能较快得出结果。但测定结果受药剂溶解性和扩散能力影响很大，具一定局限性。根据药剂施加在琼脂培养基表面方式不同，又分为管碟法（牛津杯法）、滤纸片法、孔碟法、滴下法等，其中以管碟法和滤纸片法应用最广。 三、实验材料 供试药剂：速克灵或扑海因。供试病原菌：番茄灰霉病菌。 实验器材：无菌水、无菌接种针、灭菌三角瓶、玻璃珠、灭菌双层纱布、75%酒精棉球、消毒摄子、移液管、试剂瓶、吸耳球、超净工作台、胶头滴管、尺子。 四、实验方法 采用管碟法。将供试药剂加于放置在琼脂培养基表面的用不锈钢制成的小圆筒（又称为牛津杯，一般为外径8 mm，内径6 mm，高10 mm）内，定温培养一定时间后测量抑菌圈大小。 1．配制药液：用灭菌蒸馏水将供试药剂配成一系列梯度浓度，一般5-7个浓度。灭菌蒸馏水为对照。2．制备一定“浓度”的供试菌悬浮液：如真菌，则宜用孢子悬浮液。在培养好的菌种上倒入10 mL灭菌水，用接种针轻轻刮动平面孢子悬浮，倾于灭菌三角瓶内（事先装数粒玻璃珠）摇动5 min，将孢子悬浮液用灭菌双层纱布过滤入另一灭菌三角瓶内。用低倍（15×20倍）显微镜检查，调节孢子浓度，每视野80-100个孢子为宜；以上操作应在无菌条件下进行，动作要迅速准确。 3．浇制双层培养基：将装在试管内已灭菌的清水琼脂培养基10 mL溶化后，趁热倒入9 cm直径培养皿中，水平冷凝。将适合供试菌生长发育的100 mL培养基熔化后冷至45-50℃左右后，迅速吸取10 mL菌液加入培养基中，充分混匀后，立即吸取5 mL带菌培养基加在已凝固的清水琼脂培养基上，并使之均匀地铺在底层上。 4．注药用消毒镊子夹取不锈钢小管（即牛津杯，外径8.0mm、内径6.0mm、高10mm），每皿内按合适的间隔放置6个不锈钢小管，其中1个小管为对照，其余5管为5种不同浓度的药液（药液加至在管口形成凸面），在适合的温度下培养。 6．结果检查培养一定时间后，取出用十字交叉法测量抑菌圈直径，并以抑菌圈的有无及抑菌圈大小评价杀菌活性。若抑菌圈直径呈椭圆形，长短之差超过一个单位，最好舍去不要。
实验五药物的体外抗菌试验 药物的抗菌试验是为了检查药物的抗菌能力。该项试验方法已广泛应用于新药研究和指导临床用药。如抗菌药物的筛选，提取过程的生物追踪、抗菌谱的测定、耐药谱的测定、药敏试验、药物血浓度测定等各个方面。 药物的体外抗菌试验在实验室进行，优点是方法简便、需时短、用药量少，不需要活的动物、实验条件容易控制。因此，药物的体外抗菌试验已广泛应用各种测定了。 药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法，其中最常用的方法用系列稀释法和琼脂扩散法。 （一）稀释法（结果示教） 稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种。这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用μg∕ml或U/ml表示。 （二）琼脂扩散法 它是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低，在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈，抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法。 滤纸片法（K-B纸片法）－学生操作 滤纸片法是最常用的方法，适用于新药的初筛试验（初步药物是否有抗菌作用）及临床的药敏试验（细菌药物第三性试验、以便选择用药）。滤纸片分湿、干两种，可以在试验时用无菌纸片沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也以预先做成一定浓度的干燥纸片。一般来说预先做成的干燥纸片实用一些而且准确一些。 至于干燥纸片的制备方法：选用吸水力强而且质地均匀的滤纸，用打洞机制成6mm直径的圆纸片，120℃干燥灭菌2小时。然后把配制好的各种适宜浓度的抗生素溶液，每100张纸片加入0.5ml药液，使它均匀浸润，放在无菌平皿中，
利用吸附法测定壳聚糖无纺布抑菌性能试验方案 一、实验原理：本实验参考了国标GB/T20944方法，根据我们的材料特性进行了微调。即：选取革兰氏阴性菌（大肠杆菌（25922））和革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌（25923））两类代表性指示微生物。将测试材料浸泡在活化好的菌悬液（浓度控制为107CFU/ml）中，设置不同处理时间，稀释涂布，平板单菌落计数，计算无纺布材料的抑菌性能。 二、实验方法： 2.1试验菌种的活化 1）冻干粉接种至大豆蛋白肉汤(TSB)培养基，37℃培养24h。一部分用于抑菌试验，另一部分用于划线接种至斜面或平皿冷藏保藏（可保藏1个月）。 2）培养液稀释。活化好的菌悬液用稀释液稀释20倍，取1ml培养液添加到19ml稀释液（应提前灭菌）中。 3）式样预处理。大小合适的试样饱和吸水，灭菌处理。（周教授负责） 4）菌悬液洗涤。将稀释好的菌悬液转移到试样中，分别震荡15min 和30min，为防止微生物传代，影响试验结果，立即放入冰箱冷藏。 5）洗涤液梯度稀释。处理后的洗涤液立即梯度稀释到10-1, 10-2,10-3,10-4和10-5。具体方法：取1ml洗涤原液加入9ml稀释液此时为10-1梯度；取1ml稀释后的10-1菌液加入到9ml稀释液，此时为
10-2梯度；······。 6）涂布。分别取10-3,10-4和10-5的稀释液200ul涂布到平板（计数培养基，简称EA），每个处理做2个平行，37℃，培养24-48h，计数。 7）抑菌效果评价。参照GB/T20944。 三、试验简易流程 注：如果活化后的菌液浓度较高，可取10-4、10-5和10-6梯度稀释液涂布。
微量肉汤稀释法（borth microdilution method） 实验方法： 1.用无菌蒸馏水在聚丙烯离心管中将抗菌肽和抗生素溶解制成1280 g/L的储 备液，然后用等量无菌的0.02%乙酸（含0.4% BSA）稀释，在用0.01%乙酸（含0.2% BSA）溶液对等量稀释后的溶液在进行一系列的双倍稀释，得到质量浓度为640，320，160……1.25 mg/L的共10个梯度的系列稀释液， 4 ?C下保存备用。 2.将待测细菌在灭菌MH肉汤琼脂平板上过夜培养，挑取菌落接种于灭菌试管 中的MH肉汤，37 ?C，180 r/min过夜培养。将培养后的菌液稀释至2*10^5-7*10^5 CFU/mL，向无菌的96孔平板中的1-11孔各加入100 μL的菌液，12孔不加入菌液而加入100 μLMH肉汤，然后从1～10孔逐一加入相应的待测抗菌肽，11孔作为扫描对照组不加肽。37 ?C，90 r/min培养18-24 h，这样待测抗菌肽的终质量浓度分别为64，32，16，……0.125 mg/L。（不知道待测抗菌肽添加量是多少，最终抗菌肽的终浓度怎么缩小了10倍） 3.最小抑菌浓度MIC（mininmal inhibitory concentration）就是能阻止50%以 上细菌生长的最小肽浓度。用酶标仪在490 nm下对平板进行扫描，肽的MIC 的确定按照比对照孔（11孔）的浑浊程度低50%以上的最小质量浓度计算。 4.最小杀菌浓度MBC（minimal bactericidal concentration）就是能抑制任何残 余菌落生长的肽的最低浓度。从没有细菌生长的平板孔中的内容物中取10 μL涂布到MH琼脂平板上，37 ?C培养18 h，以此来确定肽的MBC。 参考文献： 【1】汪以真，抗菌肽与抗生素的体外抗菌效果比较[J].中国兽医学报，2004，24（3）：270-273. 抗菌肽的体外抑菌实验（平板法） 1.稀释：将一定效价的抗菌肽做6个浓度的稀释，将抗生素按正常使用剂量同 样做6个浓度的稀释 2.指示菌：指示菌用液体LB培养基培养24 h后稀释至10^6 CFU/mL
题目：中草药提取有效成分及抑菌试验的实验方案 顾建凯，李威，宗凯，唐勇，吴杰 （生物技术0901） 一、问题的提出 西药抗生素的抗菌作用不容置疑，但其毒副作用、所引起的过敏反应、二重感染及细菌的耐药性等使其应用受到一定限制;单味中药抗菌谱一般较窄，其效用难以适应复杂而多变的病情;中药复方制剂因含多种有效成分，具有多方位的综合效用，抗菌谱广，且高效、低毒、不易产生耐药性等特点与优势，日渐受到学者们的重视。我小组想通过单味中药与中药复方制剂抑菌效果的对比，来验证中药复方的效果。 二、实验假设与理论依据 中医复方的抗菌作用所以优于单味药，主要在于通过配伍发挥了药物间的相辅相成作用，从而明显增强复方的抗菌效能。 三、实验目标 1.了解中药的抑菌作用 2.学习中药有效成分的提取方法 3.验证中药复方制剂的抑菌效果优于单味中药; 四、实验对象、方法及手段 1.实验对象 实验室中老师所准备的各种微生物 2.实验方法 目前中药包括复方制剂杭菌作用的测定方法大部分是沿用抗菌素的研究方法，主要分为体外抗菌作用和体内抗菌作用两个方面。体外抗菌作用的测定方法又分为三类:一是连续稀释法，包括肉汤连续稀释法即试管两倍稀释法，肉汤琼脂斜面连续稀释法，肉汤琼脂平板连续稀释法;二是扩散法，包括纸片法，小杯法、打孔法等;三是熏蒸法，因其只限于挥发性物质抗菌作用研究，所以在复方制剂抗菌研究中很少使用。体内抗菌作用的测定多用动物实验性感染治疗模型，该模型均系注射大量细菌引起暴发型感染如小鼠致死性感染，家兔腹膜炎等。 五、实验内容（实验步骤） 1.中草药提取液的制备。将各中草药烘干、粉碎，用35%的酒精于50℃萃取48h，将提 取液离心后，减压浓缩．用35%酒精定容，使最终质量浓度为1g/ml。置于0-4℃冰箱中，备用； 2.培养基制备。○1按改良液体 马丁培养基常规制备方法 配制，用于测定中药M IC 值的培养基加入微量酚红(0 001%)。○2牛肉膏蛋白胨琼
v1.0可编辑可修改实验七杀菌剂生物活性测定方法——抑菌圈法 一、实验目的 学习并掌握杀菌剂的离体活性测定方法——抑菌圈法。 二、实验原理 抑菌圈法即水平扩散法基本原理是在已接种供试菌的琼脂培养基上施以少量抗菌性物质或杀菌剂，使之接触培养基和病菌，经定温培养一定时间后，因药剂的渗透扩散作用，施药部位周围因杀死了病菌而抑 制了其在培养基上的生长，从而产生了抑菌圈。在一定范围内，抑菌圈直径的平方或面积与药剂浓度的对 数呈直线函数关系，从而可比较供试样品杀菌活性大小。其最大优点是精确度高，操作简单，能较快得出 结果。但测定结果受药剂溶解性和扩散能力影响很大，具一定局限性。根据药剂施加在琼脂培养基表面方 式不同，又分为管碟法（牛津杯法）、滤纸片法、孔碟法、滴下法等，其中以管碟法和滤纸片法应用最广。 三、实验材料 供试药剂：速克灵或扑海因。供试病原菌：番茄灰霉病菌。 实验器材：无菌水、无菌接种针、灭菌三角瓶、玻璃珠、灭菌双层纱布、75%酒精棉球、消毒摄子、移液管、试剂瓶、吸耳球、超净工作台、胶头滴管、尺子。 四、实验方法 采用管碟法。将供试药剂加于放置在琼脂培养基表面的用不锈钢制成的小圆筒（又称为牛津杯，一般 为外径 8 mm，内径 6 mm，高 10 mm）内，定温培养一定时间后测量抑菌圈大小。 1．配制药液：用灭菌蒸馏水将供试药剂配成一系列梯度浓度，一般5-7 个浓度。灭菌蒸馏水为对照。 2．制备一定“浓度”的供试菌悬浮液：如真菌，则宜用孢子悬浮液。在培养好的菌种上倒入10 mL 灭菌水，用接种针轻轻刮动平面孢子悬浮，倾于灭菌三角瓶内（事先装数粒玻璃珠）摇动 5 min ，将孢子悬浮液用灭菌双层纱布过滤入另一灭菌三角瓶内。用低倍（15× 20 倍）显微镜检查，调节孢子浓度，每视野 80-100 个孢子为宜；以上操作应在无菌条件下进行，动作要迅速准确。 3．浇制双层培养基：将装在试管内已灭菌的清水琼脂培养基10 mL溶化后，趁热倒入9 cm直径培养皿中， 水平冷凝。将适合供试菌生长发育的100 mL培养基熔化后冷至45-50 ℃左右后，迅速吸取10 mL菌液加入培养基中，充分混匀后，立即吸取 5 mL 带菌培养基加在已凝固的清水琼脂培养基上，并使之均匀地铺在 底层上。 4．注药用消毒镊子夹取不锈钢小管（即牛津杯，外径8.0mm、内径 6.0mm、高 10mm），每皿内按合适的间隔放置 6 个不锈钢小管，其中 1 个小管为对照，其余 5 管为 5 种不同浓度的药液（药液加至在管口形成 凸面），在适合的温度下培养。 6．结果检查培养一定时间后，取出用十字交叉法测量抑菌圈直径，并以抑菌圈的有无及抑菌圈大小评价 杀菌活性。若抑菌圈直径呈椭圆形，长短之差超过一个单位，最好舍去不要。 1
评价药物的抗幽门螺旋杆菌活性等指标 ⑴检测药物对幽门螺旋杆菌标准菌株的最小抑菌浓度。 ⑵检测药物对幽门螺旋杆菌标准菌株的最小杀菌浓度。 ⑶检测药物对临床各种幽门螺旋杆菌耐药菌株的最小抑菌浓度。 ⑷评价药物对临床一线治疗幽门螺旋杆菌药物甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素 等是否具有协同作用。 ⑸评价幽门螺旋杆菌标准菌株对药物是否耐药及耐药频率是多少？该药物与 临床治疗幽门螺旋杆菌一线药物是否存在交叉耐药。 ⑹评估药物的毒性。 ⑺看是否可以构建幽门螺旋杆菌的持留菌模型，以检测药物对处于持留状态 的幽门螺旋杆菌是否具有杀灭作用。 ⑻评价在酸性条件下，药物对幽门螺旋杆菌是否也具有抑制作用。 实验方法 药物对幽门螺旋杆菌标准菌株及临床各种耐药菌株最小抑菌浓度（Minimum 甲硝唑ibitory concentration, MIC）的测定药物对幽门螺旋杆菌最小抑菌浓度MIC是评价药物活性一个非常重要的指标。具体方法如下： 1培养细菌到达对数期，此时OD600应该在0.6-0.8之间。 2取菌液2ml至2个1.5ml的EP管内。 38,000rpm离心10min，去除上清，用新鲜配制的培养基洗涤一次。 4调节菌浓度至OD600=0.1，此浓度与0.5McFarland相当，约1×107 cfu/mL（所用培养基为1×）。另一个EP里调节菌浓度至OD600=0.2，相当于2×107 cfu/mL （所用培养基为2×） 5用相应浓度培养基稀释菌液100倍至浓度为1×105 cfu/mL和2×105 cfu/mL。6溶解药物。 7取灭菌96孔圆底微孔板，在板四周每孔加200μl灭菌去离子水，目的是减少检测孔内的培养基蒸发。 8在第二列孔B至G内，加100μl已经调节为2×105 cfu/mL浓度的待检测菌液（所用培养基为2×）。其余孔内B3至G11加入100μl已经调节为1×105 cfu/mL浓度的待检测菌液菌液（所用培养基为1×）。 9在第二列孔内分别加入100μl药物药物。充分混匀后，取100μl菌液加入到下一个孔内，依次类推。加到G10时取出100μl弃掉。G11不加药物做为对照。
中草药对大肠杆菌体外抑菌试验＊ 路振香时维静杨用光 （安徽技术师范学院，安徽凤阳，233100） 选用27种不同的中草药制剂（煎剂、挥发油、蒸馏液，以平板稀释法和纸片法对一株肉鸡源的大肠杆菌进行体外抑菌试验。结果表明，有14种中药对此株大肠杆菌有不同程度的抑制作用。试验还表明中药制剂的配方工艺不同，其抑菌的效果亦有不同。 关键词：中药；大肠杆菌; 抑菌作用 中兽医学有着悠久的历史和丰富的应用经验，在抗生素使用以前，对保障家畜健康起着重要作用。随着科学技术的不断发展，西药以其方便快捷的优势逐渐在临床应用中占据主导地位，但由于西药抗生素类的广泛使用，使得病原菌的抗药性日趋增强[1]，中草药作为替代抗生素解决抗药性和药残的重要方案，越来越受到重视[2-3]，尤其是近年来肉食品中的抗生素残留问题已经被提到了一定的高度，而大肠杆菌又属于多血清型和变异型强的细菌，极易产生抗药性，笔者用不同种类和浓度的中药制剂分别用平板稀释法和纸片法对大肠杆菌进行体外抑菌试验，以期筛选出具有临床应用价值的中药制剂，为畜牧业生产服务。 1材料方法 1.1材料 1.1.1试验菌株 肉鸡源大肠杆菌（安徽技术师范学院动科系预防兽医教研室提供）。 1.1.2 培养基 普通营养琼脂、麦康凯琼脂。按常规方法配制。 1.1.3 单味中药 银花、防风、板兰根、白芷、连翘、杏仁、射干、辛夷、贯众、羌活、荆芥、藿香，每ml相当于1g生药量。中草药的煎制与蒸馏由安徽技术师范学院中药实验室完成。 1.1.4 复方中药 银射煎液、麻杏射防煎液、羌藿连防煎液、辛芷荆煎液、辛芷荆蒸馏液、银射蒸馏液、羌藿连防蒸馏液、麻杏射防蒸馏液，每ml相当于1g生药量。 1.2 方法 1.2.1大肠杆菌对中药（单味、复方）敏感性的体外试验——平板稀释法[4]。 1.2.1.1取1ml原药液为第一支试管；在第二只试管中分别加入0.5ml原药液和0.5ml生理盐水以倍比稀释法稀释至第四支试管；第五支试管为无药对照，每支试管中均含有1ml不同浓度的药液。先把药液倒入无菌的平皿中，然后倒入60℃左右的无菌的普通营养琼脂或麦康凯琼脂，并迅速混合均匀，制成平板。然后以无菌的涂布棒蘸取细菌均匀涂布于平板表面，置37℃培养箱内培养24h后观察结果。 1.2.1.2 在第一支试管加入8ml原药液，第二支试管加入4ml原药液，第三支试管加入2ml 原药液，第四支试管加入1ml原药液，第五支试管为无药对照，在第二支试管至第五支试管中分别加入4ml、6ml、7ml及8ml生理盐水；按照1.2.1.1的方法制成平板，涂布细菌后 ＊项目基金：安徽技术师范学院稳定人才基金资助（批准号：YRC200316）
一、实验材料的制备 （一）病虫害的制备 1、病虫害的采集 本实验所用材料分病原菌及害虫两类。 其中病原菌分别从宣木瓜和丹皮两种地道药材植物上采集。宣木瓜的病原菌本实验室已有，并且提取了单一菌种。丹皮方面需要我们查阅资料以及请教师姐，把握最佳采集时间和采集类型，然后我们进行实地考察以及集采。采集丹皮根部，连同根部泥土带回。 害虫方面，我们将到野外筛选采集。 2、病原菌的纯种分离 2.1培养基的制备 根据实验需要制备培养病原菌所需培养基，主要为牛肉膏蛋白胨培养基（用来培养细菌）、PDA培养基（用来培养真菌）。 2.2病原菌稀释平板计数 2.2.1. 制备病原菌悬液 将带有土壤的丹皮烂根放入锥形瓶中，加入9ml无菌水中，振荡20min，让菌充分分散，静置5 min. 2.2.2编号 取无菌平皿 9套，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6各3套。另取6支盛有9ml无菌水的试管，排列于试管架上，依次标明10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。 2.2.3稀释 用1ml无菌吸管精确地吸取1ml病原菌悬液放入10-1的试管中，注意吸管尖端不要碰到液面，以免吹出时，管内液体外溢。然后仍用此吸管将管内悬液来回吸吹三次，吸时伸入管底，吹时离开水面，使其混合均匀。另取一支吸管自10-1试管吸1ml放入10-2试管中，吸吹三次，……其余依次类推。
2.2.4取样 用3支1ml无菌吸管分别精确地吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液0．2ml，对号放入编好号的无菌培养皿中。 2.2.5倒平板 于上述盛有不同稀释度菌液的培养皿中，倒入溶化后冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基约10—15ml，置水平位置，迅速旋动混匀，待凝固后，倒置于37℃温室中培养。 0．2ml菌液对号接种于不同稀释度编号的培养皿中的培养基上，再用无菌玻璃刮棒将菌液在平板上涂布均匀，平放于实验台上20—30分钟，使菌液渗透入培养基内，然后再倒置于37℃的温室中培养。 2.3划线法分离 2.3.1、倒平板将加热融化的牛肉膏蛋白胨培养基和马铃薯蔗糖培养基分别倒平板，并标明培养基的名称。 2.3.2、划线
细菌药敏试验实验报告解读 “医院有的药物不做药敏实验，医院没有的药物做什么药敏实验？”在临床上经常能听到临床医生们抱怨。“药敏报告显示敏感的药物，而临床治疗无效？”有时也让大夫们感到不解。这些问题使得临床医师不知道如何选择抗菌药物，那么如何正确解读药敏报告，合理选择抗菌药物报告呢。 我们先来了解几个概念： 最低抑菌浓度（MIC）：测量抗菌药物的抗菌活性大小的一个指标，指在体外培养细菌18至24小时后能抑制培养基内病原菌生长的最低药物浓度。 最小杀菌浓度（MBC）：抗菌药物能能使受试菌最初的活菌总数减少99.9%以上所需要的最低抗菌药物浓度。 折点：是最低抑菌浓度或者抑菌圈直径，用于区分离株为敏感、剂量依赖性敏感、中介、非敏感还是耐药 敏感（S）：通过折点来定义，指当对感染部位采用推荐剂量时，具有MIC值等于或低于敏感折点（或抑菌圈等于或高于敏感折点）的菌株通常可被抗菌药物所达到的浓度水平所抑制，产生可能的临床疗效。 中介（I）：通过折点来定义，包括这些MlC或者抑菌圈直径在中介范围内的菌株，其抗菌药物MIC接近于血液和组织中通常可达到的水平，而抗菌药物治疗的疗效可能低于敏感株。耐药（R）：通过折点来定义，指按常规用药方案，在药物通常可达到的浓度水平时，菌株不能被抑制，表明MIC值或抑菌圈直径可能在一个产生了某种特殊的耐药机制(如β-内酰胺酶）的范围内，而且治疗研究显示该药的临床疗效不可靠。 多重耐药（MDR）：是指有多重耐药性的病原菌。其定义为一种微生物对三类（比如氨基糖苷类、大环内酯类、β－内酰胺类、喹诺酮类等）或三类以上抗菌药物同时耐药，而不是同一类的三种。 泛耐药(XDR)：广泛耐药细菌指细菌对常用抗菌药物几乎全部耐药，革兰氏阴性杆菌仅对黏菌素和替加环素敏感，革兰氏阳性球菌仅对糖肽类和利奈唑胺敏感。 全耐药（PDR）：泛耐药细菌指对所有分类的抗菌药物全部耐药，革兰氏阴性杆菌对包括黏菌素和替加环素在内的全部抗菌药物耐药，革兰氏阳性球菌对包括糖肽类和利奈唑胺在内的全部抗菌药物耐药。 药敏试验目的 使用体外试验的方法检测细菌的耐药性，预测抗菌药物临床治疗效果并为临床医生针对某一特定感染问题选用药物提供依据。 判断标准
抑菌活性实验方案 薄层层析(TLC)是一种广泛应用于氨基酸、多肽、核苷酸、脂肪类、糖脂和生物碱等多种物质的分离和鉴定的层析方法。 (1) 初始发酵培养基的筛选 在250 mL三角瓶装100 mL基础培养，将种子培养基以6%接种量接入各种基础培养基中，细菌37℃160r/min培养1d，放线菌28℃、170 r/min培养5d，测定不同培养基下发酵液对供试病原菌的抑制率，确定最佳基础培养基。 (2) 发酵时间的确定 将活化的种子培养基以6%接种量接入筛选出的基础培养基中，细菌37℃160r/min培养1d，放线菌28℃、170 r/min培养不同时间段，测定每个时间段发酵液上清液对供试病原菌的抑制率，确定最佳发酵时间。 (3) 发酵初始pH值的初步确定 将优化后碳氮源的基础培养基的pH分别调成3、5、7、9、11，然后再按6 %接种种子培养基，28 ℃、170 r/min培养一定时间后，测定不同pH培养基发酵液无菌滤液对供试病原菌的抑制率，确定初始pH范围。 (4) 发酵温度的初步确定 以优化后碳氮源的基础培养基为发酵培养基，按 6 %接种种子培养基，分别在20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃，170 r/min培养一定时间后，测定不同温度下发酵所得发酵液对供试病原菌的抑制率，确定发酵温度范围。 (5) 发酵接种量的初步确定 以优化后碳氮源的基础培养基为发酵培养基，分别按2 %、4 %、6 %、8 %、10 % 接种种子培养基，在28 ℃、170 r/min培养一定时间后，测定不同接种量对发酵液抑菌活性的影响，确定发酵接种量范围。 (6) 发酵转速的初步确定 以优化后碳氮源的基础培养基为发酵培养基，按6 %接种种子培养基，28 ℃、以100r/min、130 r/min、160 r/min、190 r/min、210 r/min培养一定时间后，测定不同发酵转速对发酵液抑菌活性的影响。 (7) 发酵装液量的初步确定 以优化后碳氮源的基础培养基为发酵培养基，在250 mL锥形瓶中装入50 mL、75mL、100 mL、125 mL、150 mL，按6 %接种种子培养基，28 ℃、170 r/min 培养一定时间后，测定不同发酵装液量对发酵液抑菌活性的影响。 (8) 碳、氮源的筛选 碳源优化：分别以葡萄糖、果糖、蔗糖、可溶性淀粉、小米、玉米粉、麦芽糖、燕麦粉和麸皮替换筛选出基础培养基中的碳源，并以缺少碳源的基础培养基
抑菌试验方法总结 用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。 1、定性测定 （1）纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法：WHO推荐的全球统一的标准方法。 原理：含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。 质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。 影响因素：培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。 操作方法： 按每1000 ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38 g配备M—H琼脂，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。 将孵育16—24 h的菌种分别接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108 CFU／m1)。 用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M—H琼脂表面，均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。 平板在室温下干燥3—5 min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面．置35℃孵育16 18 h。记录抑菌圈的直径，实验。重复10次。 主要用于比较不同抗菌物质，或者通过不同方法提取的同一种物质的效果。 （2）打孔法药敏实验： 待M—H平板干后，用无菌棉签蘸取菌液(相当于1.0×108CFU／m1)，在培养基平板上密集划线接种。盖好平皿。放置5 min，待平板表面水分吸收后，用直径6 mm无菌金属打孔器在平皿内打孔。除去洞内琼脂，用微量移液器吸取50μl第二次浓缩液加入洞内，37℃培养16~18 h，记录抑菌圈的直径。实验重复10次。 主要用作重复试验 2、定量测定的稀释法(dilution test)，主要测定细菌对某药的最低抑菌浓度，包括肉汤稀释法和琼脂稀释法。 （1）肉汤稀释法 培养基使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。 稀释抗菌药物的制备及菌液接种取无菌试管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1280μg/ml）0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml。 将接种好的稀释管塞好塞子，置35℃普通空气孵箱中孵育16~20h
几种测定抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）方法 1.1.常量肉汤稀释法 1.1.1.抗菌药物贮存液制备抗菌药物贮存液浓度不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。抗菌药物直接购自厂商或相关机构。所需抗菌药物溶液量或粉剂量可公式进行计算。例如：需配制100 ml浓度为1280μg/ml的抗生素贮存液，所用抗生素为粉剂，其药物的有效力为750μg/mg。用分析天平精确称取抗生素粉剂的量为18 2.6 mg。根据公式计算所需稀释剂用量为：（182.6 mg×750μg/ml）/1280μg/ml=107.0ml，然后将182.6 mg抗生素粉剂溶解于107.0ml稀释剂中。制备抗菌药物贮存液所用的溶剂和稀释剂见表5。配制好的抗菌药物贮存液应贮存于-60℃以下环境，保存期不超过6个月。 1.1. 2.药敏试验用抗菌药物浓度范围根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。 1.1.3. 培养基 NCCLS推荐使用Mueller-Hinton（MH）肉汤，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的MH肉汤。嗜血杆菌属菌使用HTM肉汤，肺炎链球菌和其它链球菌使用含2%~5%溶解马血的MH肉汤。 1.1.4.接种物的制备有2种方法配制接种物，一是细菌生长方法，用接种环挑取形态相似待检菌落3-5个，接种于4-5ml的水解酪蛋白（MH）肉汤中，35℃孵育2-6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或MH肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1~2×108CFU/ml。二是直接菌落悬液配制法，对某些苛养菌，如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌和链球菌及甲氧西林耐药的葡萄球菌等菌株，推荐直接取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行1∶100稀释后备用。注意应在15分钟内接种完配制好的接种物，并取一份接种物在非选择性琼脂平板上传代培养，以检查接种物纯度。 1.1.5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种取无菌试管（13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第1管加入抗菌药物原液（如1280μg/ml） 0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓度约为5×105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、0.125μg/ml。 1.1.6.孵育将接种好的稀释管塞好塞子，置35℃普通空气孵箱中孵育16~20h；嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育20~24h；对可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌应持续孵育满24h。 1.1.7.结果判断与解释在读取和报告所测试菌株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法终点判断，与阳性生长对照管比较抑制80%细菌生长管药物浓度为受试菌MIC。 根据NCCLS推荐的分界点值标准，判断耐药（resistant, R）、敏感(susceptible, S)或中介（intermediate, I）。S表示被测菌株所引起的感染可以用该抗菌药物的常用剂量治疗有效，禁忌症除外。R指该菌不能被抗菌药物的常用剂量在组织液内或血液中所达到的浓度所抑制，或属于具有特定耐药机理（如β-内酰胺酶），所以临床治疗效果不佳。I是指MIC接近药物的血液或组织液浓度，疗效低于敏感菌。还表示被测菌株可以通过提高剂量（如β-内酰胺类药物）被抑制，或在药物生理性浓集的部位（如尿液）被抑制。另外，中介还作为“缓冲域”，
柠檬果皮精油的抑菌实验 食品保鲜主要手段多为冷藏结合化学杀菌剂。但是化学杀菌剂对人类健康和 环境的危害同样也成为全世界关心的重要问题。因此，开发天然的防腐保鲜剂已经成为 当前食品行业保鲜研究领域的一个热点。从某些植物中提取的精油具有良好的抑菌能力 和较高的食用安全性，是开发天然防腐保鲜剂的重要原材料。 精油除了具有良好的抑菌能力外，在气态时还具有较强的生物活性，可以作为使用 方便的熏蒸剂用于农产品的贮藏保鲜过程之中。一些研究表明，植物精油可以通过控制 细菌生长腐败而延长食品的存储货架期。 通过对柠檬果皮抑菌性的探讨，确定出离心法与蒸馏法所得柠檬精油的抑菌性能 力，进一步比较离心法柠檬精油与蒸馏法所得柠檬精油的区别，为后续将柠檬精油作为 抑菌剂而使用提供一定的理论依据。 1材料与方法 1.1材料与试剂 柠檬精油蒸馏水牛肉膏蛋白胨NaCl 琼脂 试验菌种 金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌 1.2仪器与设备 电子天平酸度计电热恒温隔水式培养箱立式压力蒸汽压灭菌器家用冷藏冷冻箱显微镜血球计算板磁力加热搅拌器电炉其他：具塞三角瓶、试管、大小烧杯、量筒、培养平皿、涂布棒、接种环、移液管、 酒精灯、游标卡尺等。 1.3实验方法 菌悬液的制备 细菌选用牛肉膏蛋白胨作为培养基，将供试菌种分别接种于装有对应培养基的试管 之内，进行扩大培养。将细菌置于37℃恒温培养箱中培养24h，然后取活化好的菌种斜面，用无菌生理盐水配制成（1~10）×10个/ml 的菌悬液，备用。 1.4抑菌效力的测定 采用滤纸片扩散法测定细菌的抑菌效力。分别取0.1 ml 的菌悬液再分别倒入培养皿 中。用无菌三角玻璃棒将菌悬液在平板表面涂抹均匀，直至涂布棒与培养基之间有粘稠感。将直径约6mm 的无菌滤纸片先在柠檬精油中充分浸润，然后取出置于平板中，并 用无滤纸片的含菌培养皿作为对照，最后将上述平板置于恒温培养箱中，37℃培养24h。用游标卡尺测定其抑菌圈直径，取其平均值。 最低抑菌浓度（MIC）的测定 根据抑菌圈测定的结果，采用试管法 测定各样品的最低抑菌浓度MIC，以丙酮作 为溶剂，用无菌试管配制一系列梯度浓度的柠檬精油溶液，将各梯度浓度的精油溶液加
体外抑菌实验方案 体外实验室是筛选抗菌药物或测试新药抗菌性能的重要环节。药物对细菌代谢的影响，可以使细胞呼吸量减低，或酶系统受到抑制等，因而出现细菌停止生长或部分抑制，借以判断药物对细菌有无抗菌作用或抗菌范围。体外实验是细菌与药物直接接触，没有机体诸因素参与，故体外和体内实验的结果不一定完全一致，需两方面综合分析进行评价。 一、体外实验的准备 （一）实验菌株的选择 一般使用实验室保存的典型菌株和临床分离菌株。 （二）培养基的制备 选择适合细菌生长繁殖的营养物质的培养基 （三）实验器皿的准备 抗菌实验的步骤需用无菌操作，应用的试管、平皿、吸管等与细菌接触的器皿，均需经过高压灭菌后应用。 （四）药物的准备 实验时称取一定量的药物，铵盐基折算成效价/mg，配成溶液或制成均匀的混悬液，pH调至中性。 （五）菌液制备 抗菌药物实验是针对细菌的作用，实验菌株不能含其他杂菌。 （六）细菌计数 将菌稀释至OD值为0.002（实验时1ml菌液加1ml药液OD值降为0.001）二、体外抗菌实验（试管稀释法） （一）1ml药液采用8个梯度：500、100、50、25、10、5、2.5、1.25（ug）。 配置方法： 每个药液浓度为1ml，8个梯度总共694ug，取整700ug。 （1）称取700ug待测物，溶解在1.4ml溶剂中得到500ug/ml的药液。 （2）从500mg/ml的药液中取0.4ml，加入1.6ml溶剂得到100ug/ml的药液。（3）从100mg/ml的药液中取1ml，加入1ml溶剂得到50ug/ml的药液。
（4）从50mg/ml的药液中取0.5ml，加入0.5ml溶剂得到25ug/ml的药液。（5）从50mg/ml的药液中取0.5ml，加入2ml溶剂得到10ug/ml的药液。 （6）从10mg/ml的药液中取1ml，加入1ml溶剂得到5ug/ml的药液。 （7）从5mg/ml的药液中取1ml，加入1ml溶剂得到2.5ug/ml的药液。 （8）从2.5mg/ml的药液中取1ml，加入1ml溶剂得到1.25ug/ml的药液。 （图示如下图） （二）1ml菌液采用OD值0.002的菌液 配置方法：菌悬液在600nm波长下测定其OD值，根据具体的OD值按10倍稀释使菌悬液的OD值接近0.002，在接近0.002后缩小稀释倍数使菌悬液OD 值为0.002。 （三）菌药混合培养 取稀释药液各1ml分装于小试管内（从稀到浓可不换吸管），做好标记，然后取经培养16-18h细菌培养液，每管1ml，每小试管总量为2ml，置37℃培养箱内培养16-18h，检查结果。 （四）结果分析 如加入细菌的药液管仍未澄清，即表明无细菌生长，则该管药物有抗菌作用；如为浑浊，即表明细菌已生长，该管药物无抗菌作用。以完全无细菌生长的最低药物浓度作为细菌对药物的敏感度，即为该药物最小抑菌浓度。