江西中医学院
2011 届毕业论文
论文题目：沙清润咳颗粒提取工艺研究
课题来源：自选课题
论文性质：应用基础研究
学生姓名：汪源
学生学号：2007110052
所在班级：药学院07药学（1）班
导师姓名：关志宇
导师职称：讲师
导师电话：189********
导师签名：
实习单位：江西中医学院药学院
单位地址：南昌市湾里区云湾路18号
完成时间：2011年5月
目录
一、论文
1、标题和作者 (2)
2、中文摘要及关键词 (2)
3、英文摘要及关键词 (2)
4、前言 (2)
5、正文 (3)
6、讨论 (8)
7、参考文献 (9)
8、文献综述 (10)
9、致谢及声明 (18)
二、导师评阅意见表
三、实习总结
沙清润咳颗粒提取工艺研究
汪源（江西中医学院）关志宇（江西中医学院药学院）
目的：考察沙清润咳颗粒中黄芩等药的最佳水提工艺。方法：采用正交试验法，以加水量、提取时间、提取次数为考察因素，以水提液中黄芩苷提取量为考察指标进行工艺筛选。结果：黄芩等药物的最佳醇提工艺为10倍量水提取3次，每次90分钟。结论：该工艺简单合理。
关键词：沙清润咳颗粒；正交试验；黄芩苷
英文标的补上
英文作者补上
Abstract: Objective To Optimize the water extraction extraction technology of Radix Scutellaria andthe other Traditional Chinese medicine in Shaqing Runke Granule. Methods In this research , Anorthogonal test was carried out to investigate the amount of water, extraction time and extractiontimes,in order to optimized the extract conditions, the study used the dry extract weight and the contentof Baicalin as markers. Results The optimized water extraction technology was that the amount ofwater is 8 times as much as the weight of the drugs were added, extracted 2 times,the first extractedtime is 1.5 hours, thescondextractedtime1hour .Conclusion The optimized extraction technologywas stable and feasible.
Keywords：Shaqing Runke granule; Orthogonal test; Baicalin
前言
沙清润咳颗粒为中药复方制剂，由南沙参、黄芩、麻黄等多味中药组成，具有生津润燥、止咳化痰的功效，临床多用于急性气管-支气管炎的治疗。黄芩入药部位为根，性寒味苦，具有清热燥湿，泻火解毒，凉血止血的功效，临床上多用于肺热咳嗽、高热烦渴、肠炎痢疾、黄疸及化脓性感染等症。近年来随着对其活性成分黄芩苷和黄芩素的深入研究，发现黄芩根提取物尤其是黄酮类化合物具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、解热镇痛、抗氧化等作用[1]，其中黄芩苷含量最高，为黄芩中公认的活性成分[2]。结合处方的临床需要我们选取黄芩中黄芩苷含量为
考察指标优选处方的最佳提取工艺。近年来黄芩苷的含量测定方法有分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法、脉冲极谱法、黄芩苷-聚氯乙烯膜电极法等[3]，本实验采用紫外分光光度法测定黄芩苷的含量。
正文
1 试验材料
1.1试验药材：黄芩等均采自江西汇仁药业有限公司
1.2试验试剂：黄芩苷对照品；水为双蒸水；乙醇，盐酸及其它试剂均为分析纯
1.3仪器设备：
752紫外分光光度计（上海欣贸仪器有限公司）
ZNHW型智能恒温电热套（巩义市予华仪器有限责任公司)
HH-4型电热恒温水浴锅（国华电器有限公司）
KQ5200DA型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）
SHZ-D型予华牌循环水真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)
DZF-6020真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)
马头牌BP.Ⅱ型架盘药物天平（上海医用激光仪器厂）
2 方法与结果
2.1 正交试验设计
采用煎煮法提取黄芩苷，以黄芩等药物水提取液中黄芩苷含量为指标，选用L 9 (34)正交表安排试验，对工艺中加水量、提取时间、提取次数三个因素进行考察，每个因素选3 个水平。见表1。
表1 黄芩水提取因素水平表
水平
因素
（A）（B）（C）
加水量（倍）提取时间（min）提取次数(次)
1 6 30 1
2 8 60 2
3 10 90 3
2.2 水提液中黄芩苷含量测定
2.2.1 黄芩苷提取方法
黄芩苷的提取方法：复方加水煎煮→趁热分离出滤液→40℃下加盐酸调pH 1～2→80℃下保温→静置→分离出沉淀→洗涤干燥→黄芩苷粗品，其含量用紫外分光光度法测定。
2.2.2 黄芩苷含量测定方法
标准曲线的绘制：精确称取黄芩苷标准品0.5g，用50%乙醇溶解并定容于100ml容量瓶，配制5 mg/ml黄芩苷标液，分别吸取标液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0ml 于100 ml容量瓶中，用50%乙醇定容，紫外可见分光光度计278 nm[4]处测吸光值，得到吸光度-浓度回归曲线为：y = 0.062x - 0.021，R2 = 0.998 2，见图1。
图1 黄芩苷标准曲线图
样品含量的测定：精确称取实验所得黄芩苷粗品0.5g用50%乙醇溶解定容于100 ml容量瓶。用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，吸取续滤液2.5 ml于10ml容量瓶中，用50%乙醇定容。另取50%乙醇作空白，于278 nm波长处测吸光度，由回归方程式计算出对应浓度，按下式计算黄芩苷含量。
黄芩苷含量（%）=［对应浓度（μg/ml）×4］/样品重(g)
2.3 试验结果及分析
2.3.1 试验结果
按正交试验安排表进行试验，见表2，分别测定各提取液中浸膏得率及黄芩苷含量，并进行直观分析、极差分析、方差分析和各水平间方差分析，见表3、表4、表5、表6。
表2 正交试验安排与结果表
试验号
因素黄芩苷含量
（mg）A B C D
1 1 1 1 1 6.62
2 1 2 2 2 11.20
3 1 3 3 3 11.50
4 2 1 2 3 9.40
5 2 2 3 1 11.31
6 2 3 1 2 8.05
7 3 1 3 2 11.40
8 3 2 1 3 8.20
9 3 3 2 1 11.80
K1 29.32 27.42 22.87 25.36
K2 28.76 30.71 32.40 21.87
K3 31.40 31.35 34.21 31.28
K’1
K’2
K’3
R 2.08 3.93 9.34
表3 方差分析表
方差来源离差平方和自由度均方差 F 显著性.
Corrected Model
(修正模型)
28.998(a) 6 4.833 23.861 0.041 Intercept（截距）889.630 1 889.630 4392.271 0.000 加水量 1.290 2 0.645 3.184 0.239 提取时间 2.964 2 1.482 7.318 0.120 提取次数24.744 2 12.372 61.082 0.016 Error（误差）0.405 2 0.203
Total（总和）919.033 9
表4 加水量各水平对黄芩苷提取的影响
加水量（I）加水量（J）均值差值（I-J）标准误差Sig
1 2 0.1867 0.36746 0.662
3 -0.6933 0.36746 0.200
2 1 0.1867 0.36746 0.662
3 0.8800 0.36746 0.139
3 1 -0.6933 0.36746 0.200
2 0.8800 0.36746 0.139
表5 提取时间各水平对黄芩苷提取的影响
提取时间（I）提取时间（J）均值差值（I-J）标准误差Sig
1 2 -1.0967 0.36746 0.096
3 -1.3100 0.36746 0.070
2 1 -1.0967 0.36746 0.096
3 0.2133 0.36746 0.620
3 1 -1.3100 0.36746 0.070
2 0.213
3 0.36746 0.620
表6 提取次数各水平对黄芩苷提取的影响
提取次数（I）提取次数（J）均值差值（I-J）标准误差Sig
1 2 -3.1767 0.36746 0.013
3 -3.7800 0.36746 0.009
2 1 3.1767 0.36746 0.013
3 -0.6033 0.36746 0.242
3 1 3.7800 0.36746 0.009
2 0.603
3 0.36746 0.242
2．3．2 试验结果分析
由表3方差分析表分析可知，对黄芩苷提取效果的影响，各因素影响大小为A ﹤B﹤C，并且因素C具有显著性影响（P﹤0.05）。有直观分析和极差分析可知，各因素水平间影响大小为：A3>A2>A1，B3>B2>B1，C3>C2>C1，所以提取工艺应选择A3B3C3。对各因素水平间方差分析可知：C因素1水平和2水平间具有显著性差异，2水平和3水平间没有显著性差异，为降低成本因此最终最佳工艺确定为A3B3C2，即加水10倍量，提取2次，每次90min。
2．4最佳工艺的验证实验
以最佳工艺进行三批验证实验，黄芩苷提取量分别为11.9mg、11.8mg、12.0mg，RSD为0.1%。
3 讨论
目前黄芩的提取溶剂既有水提也有醇提，有文献报道了对水提和醇提两种方法进行的对比试验研究，结果表明水提取的黄芩苷含量要高于醇提的[5]，结合本复方中其他中药有效成分的提取以及提取成本的问题，我们最终选取以水位溶剂进行正交试验考察并进行了工艺的选择。
黄芩根为清热解毒常用中药，目前已从中分离出黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等黄酮类化合物40 余种，其中与活性成分黄芩苷共存的有黄芩酶在适宜条件下可酶解黄芩苷，从而使黄芩苷含量降低，基于此，在黄芩的提取过程中多采用热水投料的方式[6]。
参考文献：
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文献综述
黄芩
摘要：黄芩(ScutcllanabaicalensisGeorgi)是我国大宗主特产药材，分布较广，野生黄芩分布于我国淮河以北的广大地区，主产于黑龙江、吉林、辽宁、山东等地，可以采用显微、薄层、高效液相及红外光谱等方法进行鉴别。黄芩含有黄芩苷、黄芩素等40余种黄酮类化合物。黄芩主要具有抗炎、抗病毒、抗变态反应、抗氧化、抗肿瘤等作用。
关键词：黄芩苷；药理；化学成分；含量测定
黄芩(ScutcllanaBaicalensisGeorgi)是我国的传统常用中药，是唇形科植物黄芩的干燥根。最早收载于《神农本草经》，列为中品。性寒、味苦，归肺、心、肝、胆、大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效，可用于湿热泻痢、肺热咳嗽、热病烦渴、黄疸、目赤肿痛、积热吐血、胎动不安、痛肿疮疖等症。黄芩用途很广，其应用和开发越来越受到国内外医药界的关注，需求量也随之剧增。本文主要对它的化学成分、药理作用、临床应用、提取、鉴别等方面作一综述。
1.化学成分
黄芩中主要含有黄酮类成分，如黄芩苷(Baicalin)、黄芩素(Baicalein)、汉黄芩素(Wogonin)、汉黄芩苷(Wogonoside)、千层纸素-A(Oroxylin-A)。目前已从黄芩中分离出48种黄酮化合物，其中主要有11种二氢黄酮类(Flavonones)、2种查尔酮体类(Chalcones)及一种二氢黄醇酮类(Flavanonols)。
黄芩含有丰富的微量元素，主要是铁、锰、铜、锌、镍、铬、锶等微量元素，其中含量较多的是前4种。另外，华北和湖南产黄芩分别含有钴和钼。
2.药理作用
2.1 对中枢神经系统的作用【1】
黄芩有解热作用，其成分黄芩苷元，其作用稍强于阿司匹林。黄芩通过加强皮层抑制过程而发挥镇静作用。
2.1.2 对心血管系统的作用
黄芩、酊剂、浸剂、煎剂、醇或水的提取物，黄芩苷可降低血压，其降压机理是直接康张血管或直接作用于血管感受器，反射性的引起降压。
2.1.3 对消化系统的作用
黄芩苷有解毒、保肝作用，可促使胆汁的分泌，具有利胆作用，并可降低升高的血胆红素。黄芩煎剂对小肠的运动有抑制作用，可缓解小肠平滑肌痉挛。
2.1.4 对呼吸系统的作用
黄芩及其所含黄芩苷，黄芩苷元能抑制抗原于IgE结合，可破肥大细胞的酶激活系统（SH-酶），从而抑制肥大细胞释放组织胺等过敏性介质的释放，可缓解气管过敏性收缩，而成为较好的临床抗变态反应剂。
2.1.5 对抗原微生物作用【2】
黄芩有较广的抗菌谱，在试管内，对志贺菌属、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、白喉棒状球菌、炭疽芽胞杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、伤寒沙门菌、变形分支杆菌、霍乱弧菌等有不同程度的抗菌作用。
2.1.6 对抗原衣原体作用
过去一直认为肺炎衣原体与肺炎、咽炎、鼻窦炎、支气管炎的发生有关，近年的研究显示其可能与冠心病的发生有关【3】。肺炎衣原体的致病物质可能包括肺炎衣原体的脂多糖和热休克蛋白。一直以来TOLL受体（TLRs）被认为参与脂多糖的信号识别【4】。最近，Sebastion报道肺炎衣原体通过TCRs促进人血管平滑肌的增值，该过程与动脉粥样硬化的发生有关。
黄芩苷和阿奇霉素能保护血管内皮细胞从而阻断动脉粥样硬化的发病过程【5】。黄芩苷还可以抑制肺炎衣原体的感染所致的免疫反应，并减轻肺炎衣原体感染和高脂饱食引起动脉粥样硬化的损害【6】。
2.1.7 对脑缺血再灌注损伤的保护作用
大量研究表明，脑缺血再灌注可引起线粒体结构和功能异常，而线粒体异常会引起其它细胞器及整个细胞的变化，从而进一步加重损伤。李伟华【7】等利用缺氧缺糖结合复糖的方法对神经细胞造成明显损伤，导致SH-SY5Y细胞皱缩、
变圆，并可见有部分细胞飘起，细胞调亡率显著提高，黄芩苷组和栀子苷组细胞改变改变较模型组明显减轻，细胞形态清晰，贴壁良好，细胞调亡率较模型组降低，从而说明黄芩苷、栀子苷组对缺血缺糖再灌注损伤的神经细胞具有明显的保护作用。
2.1.8 对肝损伤的保护作用
利用D－氨基半乳糖及D－氨基半乳糖与内毒素合用建立的小鼠急性肝损伤模型，测定小鼠血清中谷草转氨酶（GOT）、谷丙转氨酶（GPT）的含量。结果，腹腔注射200mg.kg-1黄芩苷可以明显降低因D－氨基半乳糖及D－氨基半乳糖与内毒素合用所致肝损伤小鼠血清中已升清的GOT及GPT含量。提示黄芩对受损的小鼠、肝脏有一定的保护作用。【8】
2.1.9 对人牙周膜成纤维细胞的保护作用
李会英【9】利用现代技术，四唑盐（MTT）比色实验和透膜电子显微镜技术（TEM）研究黄芩苷对脂多糖抑制HPL3活性，损伤HPL3超微结构的影响以及可能的作用原理，结果提示黄芩苷能显著促进成纤维细胞增值，与降解脂多糖及作用于细胞膜表面阻止脂多糖进入细胞内部有关。
2.1.10 抗寄生虫作用
阴道毛滴虫为常见的的性传播疾病原体，临床上常用硝唑作为抗阴道虫的药物，除具有毒性及不良反应外，目前已出现耐药性。采用微量倍比稀释法分别测定黄芩苷、黄连素对6株阴道毛滴虫临床虫株的最低致或浓度（MLL）,并以甲硝唑作对比。结果黄芩苷、黄连素对6株阴道毛滴虫临床虫株的最低致死质量浓度范围均数分别为0.299、0.417g.l-1。两者的差异具有显著性【10】。
3 临床应用
黄芩为常用中药，随着社会的发展，它在医药领域里有新的临床应用：
3.1 黄芩的抗癌症作用【11】
本品所含汉黄芩素有较强的抗癌活性，体外对白血病细胞、S180都有以致作用；体外对JTC26抑制率为100％，但对正常的细胞也有抑制作用。
3.2降血脂和抗氧化作用【12】
黄芩的黄酮类成分有显著降低血脂的作用，黄芩苷元和黄芩苷能显著降低肝组织和血浆中胆固醇甘油三脂浓度，并生高HDL水平。黄芩有抗氧化作用，显
著抑制过氧化脂质的生成，其主要成分是黄芩苷、黄芩苷元、汉黄芩苷元、黄芩新素Ⅱ等。
3.3 此外，黄芩【13】可利尿，并能增加动物胆汁排渉量，对离体和在体小肠均有抑制作用，对乙酰胆碱所致小肠痉挛有解痉作用。另外，发现黄芩水提物对前列腺素、生物碱合成有抑制作用。
3.4 黄芩现代常用于细菌性痢疾、肠炎、小儿急性呼吸道感染，急、慢性支气管炎，急性扁桃体炎，钩端螺旋体病，传染性肝炎，高学压，流脑，肾盂肾炎，沙眼等。
4．黄芩苷的提取
黄芩苷提取方法主要有温浸法、煎煮法、微波法、超滤法等。这里我们主要介绍煎煮法。
黄芩→粉碎→称取黄芩粗粉20 g→加水煎煮→趁热分离出滤液→40℃下加盐酸调pH 1～2→80℃下保温→静置→分离出沉淀→洗涤干燥→黄芩苷粗品，其含量用紫外分光光度法测定。煎煮法提取黄芩苷的最佳工艺条件为：粒度40目，煎煮2次，物料比1∶10和1∶5，时间60 min和30 min，双层滤布过滤再离心分离，70℃保温60 min，酸沉静置3 h抽滤，50%乙醇洗涤2次，干燥得黄芩苷产品［6］。
按下式计算黄芩苷收率：黄芩苷收率(%)=M/M0×100%
式中:M -所得黄芩苷粗品重量M0 -提取时用黄芩的重量
5.黄芩苷含量测定方法
文献报道的含量测定方法较多，主要有高效液相色谱法、薄层扫描法和紫外分光光度法等。
5.1 高效液相色谱法[14]
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-磷酸（47：53：0.2）为流动相；检测波长为280nm。理论板数按黄芩苷峰计算应不得低于2500。
供试品溶液的制备：取本品中粉约0.3g，精密称定，加70%乙醇40ml，加热回流3小时，放冷，滤过，滤液置100ml量瓶中，用少量70%乙醇分次洗涤容
器和残渣，洗液滤入同一量瓶中，加70%乙醇至刻度，摇匀。精密量取1ml，置10ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
5.2 薄层扫描法
谢玲[15]等用双波长薄层扫描法测定芩柏烧伤液中黄芩苷的含量。采用
CS-900双波长薄层扫描仪，硅胶GF254板，以氯仿-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（7：3：1：1）为展开剂，双波长反射线性扫描：λS=297nm，λR=365nm。样品用石油醚脱脂后，经过D101型大孔吸附树脂处理，收集40%乙醇洗脱液。
张武标[16]等用薄层扫描法测定复方逍遥合剂中黄芩苷含量。采用Scanner 3 型薄层扫描仪，固定相为聚酰胺薄膜，以乙酸为展开剂，于275nm波长处测定吸收度。
5.3. 紫外分光光度法[17]
5.3.1 张涛等采用络合物萃取-紫外分光光度法测定平痤散中黄芩苷的含量。采用751-GW型分光光度计，测定方法与条件为：精密量取对照品溶液适量(含黄芩苷180μg以内)，置分液漏斗中并加水稀释至15ml,依次精密加入0.05%硫酸铜溶液4ml,氨水溶液3ml,2.4%溴化十六烷基三甲铵溶液3ml混匀以形成络合物,精密加入正丁醇10ml振摇萃取3min,加4ml饱和氯化钠水溶液破乳；放置分层后取正丁醇层离心,用干燥滤纸过滤,以取对照品溶液0.0ml的正丁醇萃取液为空白,在20～35℃左右于(262±1)nm 处测定吸收度。
5.3.2 标准曲线的绘制。
精确称取黄芩苷标准品50 mg，用50%乙醇溶解并定容于100 ml容量瓶，配制0.5 mg/ml黄芩苷标液，分别吸取标液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 ml于100 ml容量瓶中，用50%乙醇定容，紫外可见分光光度计278 nm处测吸光值，得到吸光度-浓度回归曲线为y = 0.058x - 0.010 2，r2 = 0.998 2。
5.3.3 样品含量的测定。
精确称取实验所得黄芩苷粗品50 mg用50%乙醇溶解定容于100 ml容量瓶。用干燥滤纸过滤，弃去初滤液，吸取续滤液2.5 ml于100 ml容量瓶中，用50%乙醇定容。另取50%乙醇作空白，于278 nm波长处测吸光度，由回归方程式计算出对应浓度，按下式计算黄芩苷含量。
黄芩苷含量（%）=［对应浓度（μg/ml）×100×40］/样品重(mg)
6.结语
黄芩及其有效成分黄酮类化合物具有广泛的药理活性，除了传统意义上的抗炎、抗变态、抗病毒以及解热和保肝等生物活性之外，近年来对其抗氧化、抗肿瘤和抗HIV21病毒的研究日趋深入，开发黄芩及其活性成分作为抗血栓、降血压、治疗冠心病和糖尿病以及防治肿瘤和艾滋病药物的前景十分广阔。
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致谢
在此真诚感谢关志宇老师，江西中医学院药剂学科组的领导和其他各位老师们。老师们严谨的治学态度、敏捷的学术思维、求实的工作作风、平易近人的待人风格以及在我本人学习上的具体指导与帮助对我科研技能的提高有着深远的影响。在此谨向老师致以最崇高的敬意和诚挚的感谢!
对百忙中参加本论文评审、答辩工作的各位教授、老师表示衷心的感谢，谢谢你们提出宝贵意见。
此致
敬礼
07药学（1）班汪源
2011年5月
江西中医学院毕业论文原创性声明
本人郑重声明：所呈交的论文是本人在老师指导下独立进行研究所取得的科研成果。除了文中特别加以标注引用的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果和作品。对本论文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确的方式表明。本人完全明白本声明的法律后果由本人承担。
签名：
年月日
关于毕业论文使用授权的声明
本人完全了解江西中医学院有关保留、使用毕业论文的规定。相关规定的内容是：学校有权保留所送交论文的原件，允许本论文被查阅和借阅；学校可以公布本论文的全部或部分内容，可以影印或其他复制手段保存本论文和汇编本论文。
签名：
年月日