2020版：中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应
用专家共识（完整版）
病原学诊断始终是感染性疾病诊断中最重要的环节。传统的病原学诊断是临床医师根据患者的临床表现做出一系列鉴别诊断，然后针对这些进行检测，通常一项检测只能对应一种病原体，而宏基因组学第二代测序(metagenomics next generation sequencing,以下简称二代测序)技术检测能覆盖更广范围的病原体。本专家共识就二代测序的临床应用范围、样本采集、分析解读和诊断效能等方面进行证据总结和意见推荐。
一、证据强度和证据质量的分级定义
证据强度：A为强烈推荐；B为推荐，但其他替代方案也可接受；C为推荐强度低，寻求替代方案；D为从不推荐。证据质量：Ⅰ为证据来自随机对照试验，Ⅱ为证据来自非随机对照试验，Ⅲ为证据仅来自专家意见。
二、二代测序的临床需求与应用范围
(一)背景及概述
推荐意见1：若怀疑细菌、真菌、DNA病毒、寄生虫、不典型病原体感染且需进行二代测序检测时，建议采用DNA检测；若怀疑RNA病毒感染时，则建议采用RNA检测(A，Ⅱ)。
推荐意见2：对于临床疑似感染的病重、病危或免疫抑制、免疫缺陷患者，建议在完善传统实验室及分子生物学检测的同时，采集疑似感染部位的标本进行二代测序(B，Ⅱ)。
二代测序检测能覆盖较大范围的病原体，病毒、细菌、真菌、寄生虫都能被同时检测，不论临床样本培养成功与否，只要含有可检测到的DNA 或RNA即可[1,2,3,4,5,6]。从接收样本至完成数据分析，二代测序的周转时间根据测序技术、方法和生物信息学分析方法的不同而不同，已有报道为6 h至7 d不等(平均48 h)[7,8]。
二代测序在感染性疾病诊断领域中的优势在于其能检测到其他传统手段无法检测到的病原体。因此，二代测序可能在应用于临床疑难杂症或免疫抑制患者时有更大意义。另外，二代测序也被报道可用于"排除"检测，即检测阴性有助于排除感染性疾病的诊断，但前提条件是测序覆盖度足够高，能确保样本中存在的病原微生物被检测出来[1]。二代测序的其他潜在应用还包括病原体的耐药基因检测、医院感染控制的监测，以及社区传染性疾病暴发的监测，但这些应用通常需要极高的覆盖深度[9]。
从传统培养转向分子生物学诊断需要临床医师及临床微生物学家的思维转变。传统的微生物学是建立在体外分离培养的基础上，而实际上许多环境中或人体的致病微生物难以被培养，或许只能通过二代测序才能被发现[4]。所以临床医师及临床微生物学家很有必要熟悉这个新工具，知晓其优势和局限性。
目前，尚鲜见针对二代测序结果解读的规范，包括序列数阈值，以及灵敏性、特异性评估的统一临床标准等。就像所有其他新技术，在解释数据和报告数据方面仍有很大的困难与挑战[10]。如能进一步规范二代测序在临床感染性疾病中的应用，就可给予临床实践非常重要的线索和信息，协助临床诊断。
(二)二代测序的适用范围
1．二代测序在临床疑似中枢神经系统感染中的适用范围
推荐意见3：对于怀疑中枢神经系统急性感染的患者，如有条件，推荐在抽取脑脊液时同步留取2 mL脑脊液标本保存于-16～20 ℃冰箱。在完成常规生物化学检查和培养之后，若3 d内未获得明确的病原学依据且经验性抗感染治疗无效，推荐对留存的脑脊液标本进行二代测序检测。若未留存标本，可重新采集标本(A，Ⅱ)。
推荐意见4:对于疑似中枢神经系统病毒感染的患者，如有条件，推荐在抽取脑脊液时同步留取2 mL脑脊液标本保存于-16～20 ℃冰箱。在传统PCR分子检测(包括多重探针分子PCR方法)后若未能获得明确的病原学依据，推荐对留存的脑脊液标本进行二代测序检测。若未留存标本，可重新采集标本(A，Ⅱ)。
推荐意见5：对于慢性中枢神经系统感染及需要随访病原学证据的患者，可首选二代测序进行检测(A，Ⅱ)。
中枢神经系统感染的临床表现和实验室检查包括以下一种或多种：发热(体温>38 ℃)、头痛、脑膜刺激征、呕吐、抽搐、局灶性神经功能障碍、意识改变或嗜睡、脑脊液中白细胞数量增加、脑脊液中蛋白质水平升高和(或)葡萄糖水平降低、脑成像显示感染的改变。
目前，在常见病原体之外，二代测序在中枢神经系统感染中已成功检测到多种新发及少见病原体，如羊布鲁菌、星状病毒、热带假丝酵母、狒狒巴拉姆希阿米巴等[8]。对于慢性中枢神经系统感染的患者，二代测序检测罕见、少见病原体的能力可显著提高患者病原学确诊的概率。在一项针
对结核性脑膜炎患者的队列研究中，二代测序被证实可提高患者的病原体检出率[11]。
对于中枢神经系统感染进展的临床动态监测，主要以临床表现、脑脊液常规实验室检查结果和脑脊液培养为指导。在某些情况下的特异性免疫试验如隐球菌乳胶凝集试验，可间接监测病原体的载量情况。由于二代测序可检测病原体及其匹配的序列数，所以能直接并结合宿主内标背景值半定量地显示病原菌载量的动态变化[12]。
对于急性中枢神经系统感染的患者，在完成常规生物化学检查和培养之后，若仍未获得明确的病原学依据，建议将二代测序作为二线首选检测手段。对于疑似中枢神经系统病毒感染的患者，在传统PCR检测后若未能获得明确的病原学依据，建议将二代测序作为二线首选检测手段。对于慢性中枢神经系统感染及需要随访病原学证据的患者，可首选二代测序进行检测。
2．二代测序在临床疑似血流感染中的适用范围
推荐意见6：对于怀疑血流感染的患者，如有条件，推荐在抽取血培养标本时同步留取2 mL血标本，分离血浆后保存于-16～20 ℃冰箱，血培养3 d未报阳且经验性抗感染治疗无效时，推荐对留存血标本进行二代测序检测。若未留存标本，可重新采集标本(A，Ⅱ)。
推荐意见7：对于怀疑继发性血流感染的患者，在原发感染灶的病原学检测为阴性或因各种因素无法送检合适标本的情况下，可考虑将血标本的二代测序检测作为二线检测方法(B，Ⅲ)。
血流感染包括各种病原微生物(包括细菌、真菌、病毒、寄生虫等)入侵血流所引起的感染。除单纯性血流感染外，血流感染还包括感染性心内膜炎、导管相关性血流感染等复杂性感染。血流感染可为原发性，亦可继发于局灶性感染。应注意的是，只要患者具有器官功能障碍且合并任何类型的感染均可诊断为脓毒症，因而脓毒症患者并不一定存在血流感染。血流感染的典型症状主要为畏寒、寒战、发热和毒血症的症状，此外尚包括原发感染灶及迁徙性感染灶的临床表现。部分血流感染患者还具有某些危险因素，包括近期的有创操作史、血管内植入物和吸毒史等。血流感染患者常有外周血白细胞及中性粒细胞计数异常、CRP及ESR升高等实验室检查异常现象，但此类异常缺乏特异性。细菌性血流感染患者还常有降钙素原水平显著升高的现象。
血流感染的非选择性二代测序检测范围涵盖细菌、真菌、病毒(鼻病毒、腺病毒、CMV等)、不典型病原体(柯克斯体、巴尔通体等)。由于大部分血流感染的病原体[包括细菌、真菌、寄生虫(如疟原虫)、部分病毒(如疱疹病毒)]均以DNA作为遗传物质，所以推荐将DNA二代测序作为血流感染的首选检测方法，仅在不能排除RNA病毒感染(如肾综合征出血热、登革热、病毒性肺炎等)时推荐进行RNA测序[13]。
目前，由于缺乏抗感染治疗对二代测序诊断性能影响的高等级研究，所以在血流感染中二代测序检测的最佳时间窗仍未确定。研究提示，二代测序在患者起病后1～2周的时间内仍可保持高于培养的阳性率，但其仍可随时间推移下降[13]。此外，血培养与血二代测序存在优势互补的情况。故目前推荐在患者起病后尽快进行二代测序检测，如有条件，可在采取血
培养标本的同时留取血液标本保存于-16～20 ℃环境，以备后续的二代测序检测。在已经接受治疗的患者中进行血二代测序作为补充检测仍有较大价值。
3．二代测序在临床疑似局灶性感染中的适用范围
推荐意见8：对于怀疑局灶性感染的患者，在对局灶部位完成常规的生物化学、培养或PCR检测后，若未能获取病原学诊断结果，推荐将二代测序作为二线首选检测手段(B，Ⅱ)。
局灶性感染是除血流感染、中枢神经系统感染、呼吸道感染外，以局部组织出现感染性症状如红、肿、热、痛、扪及波动感、有脓液渗出为表现的一类疾病。部分局灶性感染可通过辅助检查手段，如超声检查、影像学检查、侵袭性检查(内镜、穿刺等)，发现疑似感染性病灶(组织或积液)，伴或不伴炎症相关指标升高等[14]。
局灶性感染的主要特点为临床表现多样，可伴有不典型的临床症状如疲劳、体质量减轻、胃肠道症状等。特定感染可有其特征性的临床表现，如皮肤软组织感染可表现为红、肿、热、痛，严重者可见脓液渗出；关节腔感染可表现为局部疼痛、肿胀，关节腔内积聚大量浆液性、纤维素性或脓性渗出液，关节囊膨胀、按压有波动感、运动障碍等；尿路感染可有较为明显的尿路刺激症状；眼部感染可表现为不同程度的疼痛、畏光、流泪、视力下降、眼睑痉挛，结膜水肿、充血，结膜囊的黄色分泌物增多、玻璃体混浊等。严重者或伴全身毒血症的症状，如发热、寒战，甚至休克等。
目前，已有多项研究报道二代测序可提高皮肤软组织感染、骨关节感染、眼内感染、尿路感染、浆膜腔感染、其他组织感染中的病原学检测能
力[15,16,17]，二代测序在局灶性感染标本中的较高灵敏性可能与局灶性感染标本中的致病病原体相对载量较高有关。在组织感染方面，对创伤弧菌、非结核分枝杆菌、结核分枝杆菌等均有较强的诊断价值[18,19]。在眼部感染中，除了对常见的病毒、细菌、真菌性眼内炎有诊断价值以外，还对不常见的病原体如弓形虫、棘阿米巴、风疹病毒、隐球菌等感染有较强的提示作用[20,21,22]。在尿路感染中，研究显示其可用于耐药细菌的检测[23]。
4．二代测序在临床疑似呼吸道感染中的适用范围
推荐意见9：对于呼吸道感染患者，若3 d内未通过传统实验室检查获得明确的病原学依据且经验性抗感染治疗无效，推荐留取呼吸道标本进行二代测序检测(A，Ⅱ)。
推荐意见10：对于高度怀疑病毒性肺炎且病情持续进展的患者，可先完善呼吸道病毒多重PCR检测，若为阴性，再行二代测序检测，并应同时进行核酸RNA反转录(A，Ⅱ)。
临床上当患者出现典型的呼吸道感染症状：上呼吸道症状，如鼻塞、流泪、流涕等鼻咽部卡他症状，以及咽痛等；下呼吸道症状，如咳嗽、发热、咳痰、气急、哮鸣、胸部不适、胸痛、咯血等；全身症状，如畏寒、发热、寒战等；体征上存在氧饱和度下降、呼吸急促、发绀、咽部黏膜红肿、口腔疱疹、溃疡、扁桃体肿大、有肺实变体征或听诊发现双肺有干湿啰音等；实验室检查见血白细胞计数偏高、炎性因子偏高；影像学检查见肺部炎症表现。在排除其他疾病后，均需考虑呼吸道感染。当免疫抑制人群或住院患者出现相关症状时，更需考虑呼吸道感染，尤其是肺部感染的
可能。当有肺部慢性疾病如慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、支气管扩张的患者出现病情急性加重时，也应考虑是否存在感染诱发因素。
根据二代测序原理，可对包括呼吸道定植菌群和引起感染的病原菌同时进行检测。可在24～72 h内鉴定标本中可能存在的常规方法无法鉴定的罕见病原体、病毒等。并可对多重感染进行鉴定[1,24]。
目前，二代测序成本仍较高，商业化的二代测序检测产品基于成本的考虑，其相对固定的数据覆盖度(如20 M特异性序列)对不同类型呼吸道临床样本的灵敏度低于荧光PCR等传统分子检测方法。因此，其不能替代传统检测方法(除非加大测序覆盖度使其灵敏度大于传统分子检测方法)，而是应作为传统方法无法明确感染病原体时的补充。对于普通呼吸道感染，先完善传统方法的检测；若无法明确且患者病情迁延不愈时，可将二代测序作为首选检测手段。对于高度怀疑病毒性肺炎的患者，如在病毒高发季节急性起病、血白细胞计数正常或偏低、病情进展快，可先完善呼吸道病毒多重PCR检测以及培养等；若为阴性，再行二代测序检测，并应同时进行核酸RNA反转录。对于免疫抑制患者出现呼吸道感染或病情危重，在送检传统病原学检测方法的同时，应尽快行呼吸道标本(尽量靠近病灶)二代测序检测，以尽早明确罕见病原体或混合感染。
三、二代测序的流程与质量控制
推荐意见11：采集样本送检二代测序必须严格遵守无菌原则(A，Ⅱ)。
推荐意见12：样本应直接从患者感染部位的体液或组织中进行采集(A，Ⅱ)。
推荐意见13：当患者存在感染表现但病情危重或不能耐受有创操作时，可考虑采集患者的血液标本送检(B，Ⅱ)。
推荐意见14：实验室在充分保障生物安全性的前提下，应建立完整的核酸检测流程(样本采集，样本前处理/核酸抽提及文库建立，质量控制及生物信息分析，二代测序结果的实验室判读)(A，Ⅲ)。
推荐意见15：每批次实验中都应包括内参照、阴性对照品和阳性对照品。每批次实验均需严格评估是否存在操作或环境带来的污染。单个样本测序数据量特异性序列片段数建议不低于2×107条(即20 M特异性序列数)，此外建议测序序列读长不少于单端50 bp(A，Ⅲ)。
推荐意见16：对数据进行分析时，建议采用临床应用级别的数据库，审慎使用公共数据库(A，Ⅲ)。
推荐意见17：建议二代测序检测病原体的报告应涵盖该批次实验中的内参照、阴性对照品和阳性对照品结果，并记录相关质量控制标准，如单个样本数据量、序列读长，以及相关的质控参数(A，Ⅲ)。
(一)样本采集
针对患者感染部位的不同，采集的样本类型主要包括静脉血、脑脊液、痰液、肺泡灌洗液、胸腔积液、腹水、组织、咽拭子、局灶穿刺物等多种类型。不同类型的样本采集需遵循以下原则：①对于无菌体液，如静脉血、脑脊液、胸腔积液、腹水等，需按照严格的无菌操作采集样本，采集前对局部或周围皮肤进行消毒处理，消毒液需与皮肤作用一定时间，待皮肤干燥后再取样，一般收集第2管标本送检。采集的样本须置于无菌容器内。
②对于有菌部位的样本，如痰液、肺泡灌洗液、咽拭子等，应标明样本的
采集部位，在样本采集过程中应尽量避免引入该部位的正常菌群，以免干扰后续检测结果。
采集的样本应尽量选取感染部位的体液或组织，可提高检测结果的可信度。若感染部位的样本采集难度较大，可选择外周血液标本，但有可能会降低检测结果的准确性[25]。
所有采集的感染部位样本均应及时送检。标本远距离运输需采用冷链运输，并保证无菌原则。应严格遵守相应测序厂商的运输标准作业程序(standard operation procedure，SOP)，尽可能避免冻融环节。对于不能及时送检的样本，应按照前述各个标本的相应要求进行保存[26]。(二)样本前处理/核酸抽提及文库建立
不同样本类型均来源于疑似感染部位，具有潜在的感染性，在样本处理前需进行灭活处理。对于痰液样本，由于本身黏性较高，为方便后续实验操作，灭活后还需进行液化处理；对于血液样本，需根据实际检测需求决定是否离心进行血浆分离；对于组织样本，为提高核酸提取效率，需预先将其切碎后进行操作。
所有的检测样本均来自人体的不同部位，因此在样本中本身就包含了大量人源细胞(或人源基因组/转录组成分)，而且不同类型的样本中人源细胞(或人源基因组/转录组成分)含量也不一致，为提高检测结果的灵敏性，在不影响样本中病原体含量的前提下，可通过差异离心法或过滤等选择性地去除部分人源细胞(或人源基因组/转录组成分)。
不同部位的样本经过处理后都要进行核酸提取，核酸的质量是决定二代测序成功的关键，因此不同实验室应建立完整的核酸检测流程，通过测
定核酸的完整性或降解程度，制订合格样本的标准。此外，文库制备流程对核酸样本有严格要求，需对每次提取的核酸样本进行定量检测，以确保核酸量满足后续实验要求。针对不同样本类型对提取的核酸进行文库制备，文库制备流程一般包括核酸片段化、末端修复、标签接头连接和PCR 文库等。
提取试剂盒及全流程中各种试剂的选择，都应考虑生产过程中的工程菌和环境污染微生物的核酸残留信息，以及对检测所造成的影响。在操作过程中应严格采取无菌流程，污染防控对标本结果的质量控制至关重要。每批次实验中都应包括内参照、阴性对照品和阳性对照品，以评估每批次样本中是否存在操作或环境带来的污染以及检测流程是否存在异常。(三)质量控制及生物信息分析
质量控制体系应包含多个质量控制点，依次为样本运输温控、提取浓度与纯度、出库浓度、文库片段分布、下机总数据量、测序质量(Q20、Q30比率)等，分别监控运输温度、核酸提取、文库构建、下机数据可靠性等方面，任何不符合质量控制标准的检测都应及时终止，重新检测，或在无法重新检测的情况下可提供预警，以供临床参考。
全流程的质量控制标准应包含但不限于如下几项：①每批次实验中都应包括内参照、阴性对照品和阳性对照品。②在缺乏有效的人源宿主去除步骤的情况下，建议单个标本测序数据量特异性序列片段数不低于2×107条(即20 M特异性序列数)。③为确保序列比对的准确性，避免因同源错配导致的序列比对错误，建议测序序列单端读长不少于50 bp。目前，国际上采用的二代测序仪也可进行双端测序，但双端测序所花费的经济成本
及时间均高于单端测序，所以不在临床标本感染病原体检测中作为首要推荐。推荐采用临床应用级别的数据库，对临床病原体的不同种、不同型别有满足需求的区分度。生物信息分析流程应有统一标准，以自动化为主，以人工纠错为辅，不应带有过多的人工判读成分。建议二代测序检测报告应涵盖该批次实验中的内参照、阴性对照品和阳性对照品结果，并记录相关质量控制标准，如测序质量、单个样本数据量、序列读长、检出病原微生物序列数、相对丰度等。
(四)二代测序结果的实验室判读推荐
目前，不同的测序平台其二代测序病原体检测的判读阈值可能不同，但是应建议将下列标准用于所有二代测序病原体检测流程。满足"(三)质量控制及生物信息分析"中质量控制标准的下机数据，在进入分析解读流程后应遵循以下原则：①剔除试剂、环境、测序和生物信息分析流程中引入的假阳性病原体信息，将样本中含有的病原体核酸信息真实地呈现给临床。
②原则上报告病原体信息应准确到种(检出序列数极少或极高相似度的病原体复合群除外)，同时应包含相应的属信息。③建议根据病原体出现的频度和临床致病性等信息，将临床高度关注、健康人样本中极少出现的病原体核酸信息单独呈现(即高度致病可能性)，同时将某些部位(如呼吸道、皮肤、肠道等)的常见、低(或无)致病性病原体(定植菌等)单独呈现。④建议对报告中呈现的所有病原体引用权威文献进行关键信息的注释，以便临床能快速做出判断。报告中应有适度的微生物相关信息及相关文献帮助临床医师理解报告结果。
四、二代测序结果的临床应用建议及其临床判读、验证
已有的报道和研究均提示，二代测序对包括中枢神经系统感染、血流感染和呼吸道感染在内的各部位感染均有一定的临床应用价值。在某些临床场景中，二代测序不仅有助于进行快速、精准的诊断，而且也对制订抗感染治疗方案及后续疗效评估具有指导作用。2016年，美国食品与药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)发布了二代测序体外诊断产品的指南草案；2018年，二代测序被写入《中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南(2018年版)》[27]；2019年，关于二代测序的《宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识》发布[25]。
推荐意见18：二代测序结果应在与患者临床表现及实验室检查密切结合的前提下进行解读和验证(B，Ⅲ)。
推荐意见19：对于疑似中枢神经系统、血流、呼吸道感染或需排除感染性疾病的患者，根据推荐意见1至13采集合适的样本进行二代测序，根据送检样本类型结合患者的临床表现及其他结果辅助判断或排除诊断，同时应注意排除检出病原体定植的情况(B，Ⅱ)。
2014年，有基于二代测序对1例中枢神经系统钩端螺旋体感染病例进行临床诊断的报道[6]。随后全球范围内陆续报道了通过对脑脊液及脑组织进行二代测序检测而确诊的中枢神经系统感染病例，其病原谱包括病毒、细菌、真菌、寄生虫等[28,29,30]。一项前瞻性研究纳入10例中枢神经系统神经炎症患者，对其脑组织进行二代测序检测，除了协助3例明确病原学诊断外，还提示二代测序阴性结果有助于排除感染性疾病的诊断[31]。另一项系统综述通过检索25篇论文共对44例以二代测序为诊断方法的疑
似脑炎患者进行综合分析，其中16例同时可通过PCR等方式确诊，另外28例则为其他检测方法难以明确诊断的新发或少见/罕见病原菌感染病例，提示二代测序可协助临床疑难感染的诊断[8]。
还有一项研究以健康志愿者为阴性对照，对78例脓毒症患者的血浆进行二代测序检测，检出病毒阳性15例，细菌及真菌阳性17例；提示二代测序联合血培养较单用血培养可显著提高病原体的检出率[32]。而对于呼吸道感染，相关研究主要集中在病毒所致感染。2015年，研究发现低覆盖度(<1 M特异性序列数)二代测序对鼻咽拭子的病毒检出率虽然低于反转录PCR，但其有助于确定病毒亚型和血清型，也说明了测序数据覆盖度的重要性[33]。二代测序在缩短诊断周转时间方面也具有一定优势[34]。我国一项对178例重症肺炎患者的回顾性研究结果提示，二代测序可帮助进行早期病原学诊断，指导抗菌药物的应用，从而降低患者的病死率[35]。
推荐意见20：对于二代测序结果为阴性，但根据其他辅助检查结果(如培养结果)高度提示感染可能的尚不能排除感染的患者，建议必要时再次取样重复二代测序检测(B，Ⅱ)。
若二代测序结果符合患者的临床表现和其他实验室检查，推荐根据二代测序结果指导临床决策。若患者二代测序结果阳性且符合临床表现，但缺乏除二代测序结果外的其他实验室支持证据，应进行PCR验证(在具有合适引物的条件下)，并建议临床进一步完善可获得的传统实验室检查加以验证。若患者二代测序结果阳性，但临床表现或实验室检查结果不支持该结果，则不能仅根据二代测序结果进行诊断，而应以传统实验室检查结果为首要临床参考依据。对于二代测序结果为阴性，但根据其他辅助检查结
果(如培养结果)高度提示感染可能的尚不能排除感染的患者，建议必要时再次取样重复二代测序检测。
五、二代测序在临床感染性疾病中针对不同病原体类型的诊断效能
推荐意见21：在中枢神经系统感染中，目前证据提示二代测序检测细菌、寄生虫、病毒的效果较好，而中枢神经系统真菌感染仍需更大样本量的临床试验来检验其检测效能(B，Ⅱ)。
由于二代测序在中枢神经系统感染中的应用仍以病例报道为主，所以可参考的大型研究较少。脑脊液通常含有较低的病原体量，故病原体检测更具挑战性。在5项关于脑脊液的二代测序研究中，诊断率分别为0(0/36)、1.6%(2/125)、6%(4/62)、19%(3/16)和30%(3/10)[36,37,38,39,40]，在无细胞的脑脊液上清液中只能检测到无细胞病毒或无细胞微生物核酸，会导致较低的检出率，提示临床应采用脑脊液而非上清液作为二代测序标本[8]。
国外一项研究显示，与传统临床实验室检查结果比较，二代测序的灵敏度为73%，特异度为99%，阳性预测值为81%，阴性预测值为99%[2]。另一项前瞻性研究对脑膜炎、脑炎和(或)脊髓炎患儿中收集到的20份脑脊液阳性样本进行二代测序检测，与传统的脑脊液微生物检测相比，二代测序检测诊断致病病原体的灵敏度为92%，特异度为96%[9]。我国患儿的脑脊液测序数据显示，55.56%的二代测序检测结果与临床传统方法学一致，其中主要的病原体为细菌[30]。另一项研究发现在疑似中枢神经系统感染的初治患者中，与培养相比，二代测序具有90%的灵敏度，其检出率较培养提高了约25%[41]。已有的研究结果提示二代测序检测细菌、寄生
虫、病毒的效果较好，而中枢神经系统真菌感染仍需更大样本量的临床试验来验证其检测效能。
推荐意见22：对于脓毒症患者，推荐联合采用传统实验室培养和二代测序来提高病原学的检出率(B，Ⅱ)。
血流感染的异质性较大，目前尚缺乏针对血流感染者的大型二代测序诊断效能研究。现有的研究结果提示，血液样本二代测序与血培养保持了高度的一致性，是可靠的病原学检测方法。一项中国的研究显示，以培养为金标准，二代测序的灵敏度和特异度分别为72.7%和89.6%；此外，二代测序还表现出了比血培养更高的额外检测效能，成为血培养的有力补充[32]。若以培养联合二代测序、桑格法测序验证作为金标准，则二代测序的阳性率较单用血培养有显著提升(23.08%比12.82%)[32]。另一项关于脓毒症休克的研究中，二代测序的阳性率在起病前3周内波动于71%左右，而血培养阳性率仅在起病时达33%，此后波动于10%～20%[42]。
推荐意见23：对于局灶脓肿或组织感染患者，二代测序的总体灵敏性和特异性均较好，其中对细菌检测的灵敏性优于真菌(A，Ⅱ)。
在关于局灶性感染的病原体检测报道中，个案报道较多。但已有研究证实，二代测序在包括局灶脓液、感染部位组织、感染性的体液标本中的灵敏性均优于传统实验室检测。在骨关节感染中，二代测序与临床培养阳性标本的一致率可达83%～94.8%，在培养阴性的标本中可额外检出49.3%～93%的病原体[43,44]。肺组织二代测序对细菌感染的灵敏度可达100%，特异度为76.5%；对真菌感染的灵敏度为57.1%，特异度为61.5%；
对细菌和真菌的阳性预测值分别为42.9%和44.4%，阴性预测值分别为100%和72.7%[45]。
推荐意见24：对于呼吸道感染，二代测序在病毒及少见病原体的检测中体现出较好的检测效能；但在细菌、真菌等病原体的检测中，二代测序尚不能准确判断菌群定植或感染状态，仍需依赖临床医师结合患者病情进行进一步分析(A，Ⅱ)。
推荐意见25：对于结核分枝杆菌、伤寒沙门菌、布鲁菌等胞内菌，以及具有细胞壁的真菌，二代测序的检测效能会相对降低，应对上述菌群设置特定的序列数阈值(A，Ⅲ)。
在二代测序检测呼吸道病原体的研究中，一项研究对67份儿科呼吸道感染患者的鼻咽拭子标本同时进行了多重PCR和二代测序检测，两者的一致率为93%；二代测序漏诊了其中3例，但多重PCR同样未检测到其中2例患者感染的病毒；同时，二代测序检测到了PCR靶向范围外的11株病毒[46]。在成人上呼吸道感染领域，一项研究探索了二代测序在89份成人急性上呼吸道感染鼻咽拭子标本中的应用，发现二代测序的灵敏度为77.55%，特异度为80.49%～100.00%；在二代测序漏诊的标本中，相应病原体的实时PCR循环阈值显著更高，提示病原体载量低，在低数据量覆盖度的情况下可能影响二代测序的检出率[33]。另一项研究评估了二代测序在24份流行性感冒病毒阳性的呼吸道标本(包括肺泡灌洗液、痰液和咽拭子)中的检测性能；24份标本中，18份的二代测序结果与PCR完全一致，另外6份不一致的标本中，病毒实时PCR循环阈值均高于35[47]。还有研究将二代测序应用于16例急性下呼吸道感染患者的鼻咽抽吸物标
本，其中15份标本中都检出了病毒，结果与PCR完全一致[48]。在重症肺炎患者中，培养和二代测序的一致性达55.5%，且二代测序有更高的灵敏度[35]。综上所述，目前已发表的关于二代测序应用于临床标本的检测效能研究发现，当样本中病原微生物含量较高时，二代测序的总体检测效能与PCR差距不大；但当病毒载量较低时，当前二代测序(20 M左右特异性序列数)会出现假阴性，在灵敏度方面不如PCR，需要通过进一步增加数据量来提高检测灵敏度。
二代测序可对不明、少见、不典型病原体进行检测。一项中国的研究对561例患者(其中呼吸道感染255例)的各种标本行二代测序检测(其中肺泡灌洗液＋痰标本共292份)；结果提示与培养相比，二代测序对结核分枝杆菌、厌氧菌、真菌的检出率均显著高于培养；以临床诊断为金标准，二代测序比培养显著提高了灵敏度(50.7%比35.2%)，而特异度无显著区别[24]。另一项研究对13例诊断为社区获得性肺炎的免疫抑制患者进行二代测序检测，结果二代测序和培养都检测到5株阳性细菌；但是在真菌检测方面，二代测序对肺孢子菌的灵敏度明显高于培养[49]。在临床应用中，对于结核分枝杆菌、伤寒沙门菌、布鲁菌等胞内菌，以及具有细胞壁的真菌，二代测序的检出效能会相对降低，应对上述菌群设置特定的序列数阈值或结合捕获技术以提高测序数据的覆盖度[24,50]。
综上，在呼吸道有菌环境下的二代测序结果的判读尚无统一标准。关于二代测序应用于细菌、真菌检验效能的研究尚不多。目前的数据提示与培养相比，二代测序能显著提高灵敏度。但对于结核分枝杆菌等病原体，与临床诊断相比，二代测序的诊断还需更多探索。
推荐意见26：对于新发、罕见、疑难感染性疾病，以及免疫缺陷患者，二代测序能显著提高病原体的检出率，可作为上述疾病的一线检测手段(A，Ⅲ)。
虽然二代测序检测成本高，但其在免疫缺陷患者和重症患者的病原学诊断中体现出较高的临床应用价值[51]。在使用糖皮质激素合并感染的人群中，二代测序指导下的抗感染治疗方案的成功率为81.8%，显著高于经验性抗感染治疗的52.6%[52]。对于新发、罕见或疑难感染性疾病，更具有传统培养及其他靶标分子诊断技术所不具备的优势。如2015年报道的首例杂色松鼠1博尔纳病毒(variegated squirrel Bornavirus-1，VSBV-1)所致的脑炎病例和2018年报道的首例人感染猪疱疹病毒眼内炎病例[53,54]，二代测序均在诊断过程中起到了不可替代的作用。因此建议对于上述疾病，二代测序可作为一线检测手段。
六、二代测序在成本经济效益分析下的临床应用推荐
推荐意见27：目前，开展二代测序的成本仍较高，尚不能作为轻症感染性疾病的一线检测手段(A，Ⅲ)。
自2014年二代测序首次被用于临床感染病例的病原学诊断以来，其正越来越广泛地被应用于临床实践。但目前二代测序检测的成本仍显著高于传统实验室检测方法。在国内，完成1次二代测序检测的费用仍较高；在美国，也需花费上千美元。与之相比，完成1次血培养约40元人民币，完成1次16 S PCR检测则需约50元人民币。高成本仍是制约二代测序在国内广泛开展的主要因素之一。
随着技术的进一步成熟，未来二代测序病原体检测应进一步在成本下降、诊断标准完善、质量控制提升等方面进行完善。同时应进一步增加大样本量的研究，以建立中国感染病原体宏基因组学检测的标准规范。
宏基因组学概述
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宏基因组学概述 王莹，马伊鸣 （北京交通大学土木建筑工程学院环境140２班） 摘要:随着分子生物学技术的快速发展及其在微生物生态学和环境微生物学研究中的广泛应用，促进了以环境中未培养微生物为研究对象的新兴学科——微生物环境基因组学(又叫宏基因组学、元基因组学，英文名Mｅｔａｇenomics)的产生和快速发展。宏基因组学通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNＡ,构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能．在短短几年内,宏基因组学研究已渗透到各个领域，包括海洋、土壤、热液口、热泉、人体口腔及胃肠道等,并在医药、替代能源、环境修复、生物技术，农业、生物防御及伦理学等各方面显示了重要的价值。本文对宏基因组学的主要研究方法、热点内容及发展趋势进行了综述 关键词:宏基因组宏基因组学环境基因组学基因文库的构建 Mａcｒo summary of Ｍetagenｏｍｉcs WanｇＹｉng，Ma Ｙi-Mｉｎｇ (BeｉjinｇＪiaoｔｏngUniｖeｒsiｔy, Inｓtitute of civiｌ enｇｉneerｉｎｇ,）Key ｗords:Metａgenｏmｅ; Ｍetagenoｍiｃs;The eｎviｒｏｎｍental genｏmics 宏基因组学（Meｔａgeｎomｉｃｓ)又叫微生物环境基因组学、元基因组学。它通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNＡ,构建宏基因组文库,利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。它是在微生物基因组学的基础上发展起来的一种研究微生物多样性、开发新的生理活性物质（或获得新基因）的新理念和新方法。其主要含义是:对特定环境中全部微生物的总DNA(也称宏基因组，metａgeｎomｉc)进行克隆,并通过构建宏基因组文库和筛选等手段获得新的生理活性物质；或者根据ｒDNA数据库设计引物,通过系统学分析获得该环境中微生物的遗传多样性和分子生态学信息。 1.起源 宏基因组学这一概念最早是在19９８年由威斯康辛大学植物病理学部门的Jo Haｎｄelsman等提出的,是源于将来自环境中基因集可以在某种程度上当成一个单个基因组研究分析的想法，而宏的英文是"meta－"，具有更高层组织结构和动态变化的含义。后来伯克利分校的研究人员Kevin Chen和LｉoｒPaｃｈｔer将宏基因组定义为"应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落,而不需要在实验室中分离单一的菌株"的科学。 2 研究对象 宏基因组学(Ｍeｔagenｏｍics)是将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体自上而下地研究微生物与自然环境或生物体之间的关系。宏基因组学不仅克服了微生物难以培养的困难, 而且还可以结合生物信息学的方法, 揭示微生物之间、微生物与环境之间相互作用的规律, 大大拓展了微生物学的研究思路与方法, 为从群落结构水平上全面认识微生物的生态特征和功能开辟了新的途径。目前, 微生物宏基因组学已经成为微生物研究的热点和前沿, 广泛应用于气候变化、水处理工程系统、极端环境、人体肠道、石油污染、生物冶金等领域, 取得了一系列引人瞩目的重要成果。 3 研究方法
宏基因组分析和诊断技术在急危重症感染应用的专家共识 感染是急危重症患者死亡的主要原因之一。近年来，随着新发病原微生物的出现、耐药病原微生物的增多以及免疫抑制宿主的增加，感染的发病率和死亡率仍居高不下，脓毒症(严重感染)患者病死率高达50%[1-3]。最新调查研究发现，中国脓毒症相关性标化死亡率为66.7例/10万人口，全国每年共有脓毒症相关性死亡病例近103万例[3]。重症感染起病急、进展快、病原体复杂，短时间内能否明确致病病原微生物至关重要。 传统的病原微生物检测方法主要包括形态学检测、培养分离、生化检测、免疫学和核酸检测。因操作简单、快速、技术要求不高，同时具有一定的诊断敏感性和特异性，目前仍在临床上广泛使用。但传统的检测方法在敏感性、特异性、时效性、信息量等方面存在局限，而且对于未知或者罕见的病原微生物，无法快速识别。 基于宏基因组新一代测序技术(metagenomics next-generation sequencing，mNGS)不依赖于传统的微生物培养，直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，然后与数据库进行比对分析，根据比对到的序列信息来判断样本包含的病原微生物种类，能够快速、客观地检测临床样本中的较多病原微生物(包括病毒、细菌、真菌、寄生虫)，且无需特异性扩增[4-8]，尤其适用于急危重症和疑难感染的诊断。 为了规范运用mNGS进行病原微生物的诊断、正确解读检测结果和指导治疗，我们组织了急危重病、感染病学和病原微生物学相关领域的专家，制定了本共识。 1 mNGS分析和诊断技术是急危重症感染快速、精准诊疗的发展方向 新一代测序技术是一个开放的分析和诊断系统，目前已经纳入的病原体有8000多种，其中包括3000余种细菌、4000余种病毒、200余种真菌和140种寄生虫，为疑难危重症及罕见病原微生物感染的诊断提供了有效的技术手段。 自2008年成功应用于临床诊断新发病原体感染以来[9-10]，目前mNGS技术已经逐步用于临床疑难感染诊断，如华山医院张文宏团队[11]用mNGS协助确诊猪疱疹病毒的跨物种传播，并给予针对性治疗使患者痊愈，深圳市第三人民医院用mNGS确诊了一例罕见阿米巴脑炎[11-12]。 mNGS对脓毒症、免疫抑制宿主并发严重感染、重症肺部感染等疾病具有较高的临床应用价值，能够快速、精准地找到病原体；另外对于抗菌药物治疗方案的制定和治疗效果的评估具有一定的指导作用[9-16]。Long等[17]研究发现血培养联合mNGS诊断细菌或真菌感染，阳性率较单用血培养显著升高。以健康人群为基线，建立每种微生物在正常人群中的分布情况模型，进而计算脓毒症指数来评估检出微生物的核酸数量，Crumaz等[18]发现在脓毒症患者血液标本中病原菌的脓毒症指数绝对值、丰度显著升高，而且其变化与临床治疗效
全基因组关联分析(Genome-wide association study;GWAS)是应用基因组中 数以百万计的单核苷酸多态性(single nucleotide ploymorphism ，SNP)为分子 遗传标记，进行全基因组水平上的对照分析或相关性分析，通过比较发现影响复杂性状的基因变异的一种新策略。 随着基因组学研究以及基因芯片技术的发展，人们已通过GWAS方法发现并鉴定了大量与复杂性状相关联的遗传变异。近年来，这种方法在农业动物重要经济性状主效基因的筛查和鉴定中得到了应用。 全基因组关联方法首先在人类医学领域的研究中得到了极大的重视和应用，尤其是其在复杂疾病研究领域中的应用，使许多重要的复杂疾病的研究取得了突破性进展，因而，全基因组关联分析研究方法的设计原理得到重视。 人类的疾病分为单基因疾病和复杂性疾病。单基因疾病是指由于单个基因的突变导致的疾病，通过家系连锁分析的定位克隆方法，人们已发现了囊性纤维化、亨廷顿病等大量单基因疾病的致病基因，这些单基因的突变改变了相应的编码蛋白氨基酸序列或者产量，从而产生了符合孟德尔遗传方式的疾病表型。复杂性疾病是指由于遗传和环境因素的共同作用引起的疾病。目前已经鉴定出的与人类复杂性疾病相关联的SNP位点有439 个。全基因组关联分析技术的重大革新及其应用，极大地推动了基因组医学的发展。(2005年, Science 杂志首次报道了年龄相关性视网膜黄斑变性GWAS结果,在医学界和遗传学界引起了极大的轰动, 此后一系列GWAS陆续展开。2006 年, 波士顿大学医学院联合哈佛大学等多个研究机构报道了基于佛明翰心脏研究样本关于肥胖的GWAS结果(Herbert 等. 2006);2007 年, Saxena 等多个研究组联合报道了与2 型糖尿病( T2D ) 关联的多个位点, Samani 等则发表了冠心病GWAS结果( Samani 等. 2007); 2008 年, Barrett 等通过GWAS发现了30 个与克罗恩病( Crohns ' disrease) 相关的易感位点; 2009 年, W e is s 等通过GWAS发现了与具有高度遗传性的神经发育疾病——自闭症关联的染色体区域。我国学者则通过对12 000 多名汉族系统性红斑狼疮患者以及健康对照者的GWAS发现了5 个红斑狼疮易感基因, 并确定了4 个新的易感位点( Han 等. 2009) 。截至2009 年10 月, 已经陆续报道了关于人类身高、体重、 血压等主要性状, 以及视网膜黄斑、乳腺癌、前列腺癌、白血病、冠心病、肥胖症、糖尿病、精神分 裂症、风湿性关节炎等几十种威胁人类健康的常见疾病的GWAS结果, 累计发表了近万篇 论文, 确定了一系列疾病发病的致病基因、相关基因、易感区域和SNP变异。) 标记基因的选择： 1)Hap Map是展示人类常见遗传变异的一个图谱, 第1 阶段完成后提供了 4 个人类种族[ Yoruban ,Northern and Western European , and Asian ( Chinese and Japanese) ] 共269 个个体基因组, 超过100 万个SNP( 约1
宏基因组测序在感染性疾病病原学诊断中的应用 感染性疾病一直是世界范围内疾病主要致死原因之一。WHO监测统计数据显示，在2016年全球约5690万例死亡患者中，有3项感染性疾病（下呼吸道感染、腹泻病、结核病）位列前10大死因，共造成的死亡数约占总死亡数的10%，其中下呼吸道感染造成约300万例患者死亡，腹泻病造成约140万例患者死亡，结核病造成约130万例患者死亡。感染性疾病的病原体十分复杂，包括细菌、病毒、真菌及寄生虫等，而在目前的临床微生物检测工作中，微生物实验室对病原体的诊断主要还是依赖自19世纪即开展的培养、染色镜检等传统检测方法，以及后续发展的核酸扩增检测（例如PCR）、分子免疫学检查（例如ELISA）等检测手段，这使得临床医生对感染性疾病的病原学诊断、病情评估及治疗方案制定等存在许多困难。目前仍有约60%的感染性疾病病例的病原体是诊断不明的。由于宏基因组测序（mNGS）对病原学诊断具有无偏移、全覆盖、高效率等优势，越来越多的学者尝试将其应用于临床病原学诊断之中。在此，我们回顾了近些年宏基因组测序在病原学诊断中的临床应用进展情况。 １．临床宏基因组学 宏基因组的概念最早在1998年被学者提出，指在一份独立的土壤标本中，所有微生物的基因组信息的总和，包括那些无法培养的生物体的基因组信息。后来，宏基因组的概念不仅仅局限于描述环境来源的标本，还被逐渐沿用于描述临床来源标本中的生物遗传信息特征。临床宏基因组学指为获取临床相关的微生物信息而对临床来源的标本中所有的核酸序列进行测序分析的一门学科间。宏基因组测序主要是通过以新一代测序为代表的高通量测序技术，对临床来源的标本进行宏基因组学分析，以获取病原体的物种分类、血清型、耐药性、毒力等一系列生物信息。由于宏基因组测序不依赖病原体培养结果且可以不对可疑病原体的标志核酸序列进行靶向扩增，这使得检测结果更具客观性和全面性，且更迅捷，这是对传统实验室检测手段的有效补充。《中国成人医院获得性肺炎与呼吸机相关性肺炎诊断和治疗指南（2018年版）》也指出临床宏基因组学能明显提高病原体诊断的敏感性，部分病原体检测花费的时间更短，尤其对罕见病原体的诊断具有优势，可审慎地应用于临床实践之中。正是得益于测序技术的不断进步与发展，
全基因组重测序数据分析 1. 简介(Introduction) 通过高通量测序识别发现de novo的somatic和germ line 突变，结构变异-SNV，包括重排 突变（deletioin, duplication 以及copy number variation）以及SNP的座位；针对重排突变和SNP的功能性进行综合分析；我们将分析基因功能（包括miRNA），重组率（Recombination）情况，杂合性缺失（LOH）以及进化选择与mutation之间的关系；以及这些关系将怎样使 得在disease（cancer）genome中的mutation产生对应的易感机制和功能。我们将在基因组 学以及比较基因组学，群体遗传学综合层面上深入探索疾病基因组和癌症基因组。 实验设计与样本 （1）Case-Control 对照组设计； （2）家庭成员组设计：父母-子女组（4人、3人组或多人）； 初级数据分析 1．数据量产出：总碱基数量、Total Mapping Reads、Uniquely Mapping Reads统计，测序深度分析。 2．一致性序列组装：与参考基因组序列（Reference genome sequence）的比对分析，利用贝叶斯统计模型检测出每个碱基位点的最大可能性基因型，并组装出该个体基因组的一致序列。3．SNP检测及在基因组中的分布：提取全基因组中所有多态性位点，结合质量值、测序深度、重复性等因素作进一步的过滤筛选，最终得到可信度高的SNP数据集。并根据参考基 因组信息对检测到的变异进行注释。 4．InDel检测及在基因组的分布: 在进行mapping的过程中，进行容gap的比对并检测可信的short InDel。在检测过程中，gap的长度为1~5个碱基。对于每个InDel的检测，至少需 要3个Paired-End序列的支持。 5．Structure Variation检测及在基因组中的分布: 能够检测到的结构变异类型主要有：插入、缺失、复制、倒位、易位等。根据测序个体序列与参考基因组序列比对分析结果，检测全基因组水平的结构变异并对检测到的变异进行注释。
宏基因组学的一般研究策略 摘要: 宏基因组学是目前微生物基因工程的一个重要方向与热点。它把微生物的总群体特性与基因组学实验手段结合了起来，包括从环境样品中提取总DNA、再用可培养的宿主微生物建立文库及筛选目的克隆和基因。该法是研究不可培养微生物、寻找新的基因和开发新活性产物的重要新途径。它避开了微生物分离、纯化和培养的步骤,大大扩展了微生物资源的利用范围。本文旨在介绍宏基因组学的一般研究方法并结合我们的实验情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。 关键词: 宏基因组学, 不可培养微生物, 文库构建, 文库筛选，研究策略 Strategies for accessing metagenomics for desired applications Abstract: Metagenomics is a new field of microbial genetic engineering. It has the characteristics of microbial ecology and the methodology of genomics. Metagenomics includes genomic DNA isolation, library construction and screening strategies, and can be used in the discovery of new gene and biocatalysts and in the study of uncultured microorganism. Metagenomics can overcome the advantages of isolation and cultivation procedures in traditional microbial method, and thus greatly broaden the space of microbial resource utilization. In this paper, we mainly reviewed the metagenomic methodology, together with the latest advances and novel strategy in this research field. Keywords：Metagenomics; Uncultured microorganism；Library construction；Library screening Research strategies 大自然中蕴藏着无数具有重要价值的微生物及其活性产物,也是新基因及生物学资源的重要源泉，对其进行研究成为微生物学和分子生物学研究的一个重要方向。然而人们现在能够培养与利用的不到环境中总微生物的1%[1]。宏基因组学(metagenomics)是直接从环境样品中提取全部微生物的总DNA, 避开了分离、纯化和培养微生物的过程来构建宏基因组文库,用基因组学的研究策略来研究环境样品中的总微生物的组成及其在群落中的功能等。现在,宏基因组学技术方法已在微生物多样性,微生物细胞间的相互作用,新基因和新型生物催化剂的开发，新的抗生素的开发及环境生态等方面得到了广泛应用[2]。本文旨在介绍宏基因组学的一般实验方法并结合我们的研究情况,对这一崭新领域中的最新研究策略进行了简要综述。深化了我们对这一学科的认识,促进了该学科的进步。 1 宏基因组学研究策略 1.1宏基因组学概要 宏基因组学是Handelsman等于1998年提出的[3], 可见是一门很新的学科，其随着基因组实验手段，生物信息学和测序技术等的日新月异也迅猛发展了起来，这个新学科是以环境样品的总微生物基因组为实验对象，通过测序分析、文库评价、产活性物质及其基因的克隆的获取和基因功能的鉴别，对微生物种群组成与生物量、生态学关系、生物化学关系与环境关系以及功能活性进行研究[4]。其主要过程包括样品和基因的富集和提取; 宏基因组文库的构建; 目的基因的筛选; 目的基因活性产物的表达(图1)。 1.2 微生物及其基因的富集 在文库筛选过程中由于目的基因比例较小, 对环境中微生物的富集不但可提高基因总量，有利于基因的提取，还可增加目的基因的比例，如Kouker 等用橄榄油富集产脂肪酶的微生物收到了很好的效果[5 ]，橄榄油不仅可作为底物，还可诱导脂肪酶的合成。目前富集技术主要分为细胞水平和基因水平。其中细胞水平主要是用选择培养基来富集某些微生物, 常
宏基因组测序技术检测标准 简介： 宏基因组测序介绍 宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，通过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就可以直接对环境中所有微生物进行测序。可以真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。目前又可以分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。下面就是对这两者的具体介绍。 一、16s DNA/18s DNA/ITS测序 16sDNA是最常用的微生物物种分子鉴定的标签，，通过对样品中16sDNA测序可以鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。目前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，可以很好的避免此类问题。 二、宏基因组全测序 在这种测序方式中，我们可以假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。这样我们就可以研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。可以发现新的基因，可以进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。此外，该项测序不单可以针对DNA水平，也可以针对全RNA进行基因表达水平的研究。 样品处理：
宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。尽量留足备份样品。核酸提取： 宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = ， 260/230 = ，电泳检测DNA 应是完整的一条带。 测序Sequencing 1)16S/18S测序： Sanger测序： 用于低通量的16S/18S DNA测序，提取宏基因组后，首先通过PCR将16S/18S 序列扩增出来，再将其连接到克隆载体上，导入感受态细胞，涂平板做蓝白斑筛选，选出阳性克隆提质粒，对质粒进行测序反应，测序反应后纯化后用ABI 3130或ABI 3730进行毛细管电泳测序。 由于其测序准确率比较高，而通量非常低，现通常用做二代测序结果的验证。454 Platform： 454平台主要包括两种测序系统：454 GS FLX+ System和454 GS Junior System。454 GS FLX+ System测序读长可以达到600-1000bp，通量450-700M，GS Junior System测序读长在400bp左右，通量在35M。
利用病毒宏基因组学寻找在瓜德罗普不同蚊种中稳定独特的核心真核病毒 Stable distinct core eukaryotic viromes in different mosquito species from Guadeloupe, using single mosquito viral metagenomics 利用病毒宏基因组学寻找在瓜德罗普不同蚊种中稳定独特的核心真核病毒 作者：Chenyan Shi 等 期刊：Microbiome 时间：2019.8 影响因子: 10.465 DOI：10.1186/s40168-019-0734-2 一、研究背景 对人类来说，蚊子这种无脊椎动物是一种非常重要的病毒载体，近年来的研究证明其身上携带着大量未被研究的病毒。以往的研究通常对大量的蚊子进行宏基因组测序，而不评估单个蚊子的病毒多样性。为了解决这个问题，作者使用优化的病毒宏基因组学实验操作流程(NetoVIR)来比较2016年和2017年从瓜德罗普岛不同地点收集的埃及伊蚊和埃及库蚊的病毒量。（注：瓜德罗普是法国的海外省，位于加勒比海小安的列斯群岛中部。属热带雨林气候，平均气温26℃。） 二、实验结果 1.利用单只蚊子进行病毒宏基因组的可行性 作者将单只蚊子和混合蚊（5只蚊子）分别测序组装成contigs，然后比对注释分类为真核生物，细菌，古生菌，真核病毒，噬菌体，待确认噬菌体(噬菌体TBC)，未归类病毒和暗物质（未被比对软件识别的contigs）共8个分类。通过比较单只蚊子与混合蚊在每个分类下reads数量占比、映射到nr contigs 数目、病毒读数比例(真核病毒、噬菌体和未分配病毒)，发现单只蚊子样本的总读数和病毒读数比例与混合蚊样本相比无显著差异，证明了单只蚊子进行病毒宏基因组学研究的可行性。
宏基因组测序技术 检测方法
宏基因组测序技术检测标准 简介： 宏基因组测序介绍 宏基因组学是以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，经过现代基因组技术手段包括功能基因的筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及环境之间的关系进行研究的新的微生物研究方法。随着高通量测序技术的发展，为宏基因组学研究提供了新的理想研究方法。高通量测序的方法无需分离环境中各种微生物，也无需构建克隆文库就能够直接对环境中所有微生物进行测序。能够真实客观的反映环境中微生物的多样性、种群结构、进化关系等。当前又能够分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列的测序研究。下面就是对这两者的具体介绍。 一、16s DNA/18s DNA/ITS测序 16sDNA是最常见的微生物物种分子鉴定的标签，，经过对样品中16sDNA测序能够鉴定其中微生物物种的丰度和分布情况。当前，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。因为16s DNA序列比较相似，读长短的话，难以进行有效的比对，而454平台的平均读长在400bp左右，能够很好的避免此类问题。 二、宏基因组全测序
在这种测序方式中，我们能够假定一个环境中的所有微生物就是一个整体，然后对其中所有的微生物进行测序。这样我们就能够研究样品中的功能基因以及其在环境中所起的作用而不用关心其来自哪个微生物。能够发现新的基因，能够进行基因的预测，甚至有可能得到某个细菌基因组的全序列。另外，该项测序不单能够针对DNA水平，也能够针对全RNA进行基因表示水平的研究。 样品处理： 宏基因组样品收集主要有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。样品采集遵照样品采集规范（人）所规定的操作来进行。尽量留足备份样品。 核酸提取： 宏基因组核酸提取主要有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法都适用，对于固体样品如粪便宜采用直接裂解的方法。核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = 1.8-2.0， 260/230 = 1.8-2.0，电泳检测DNA应是完整的一条带。 测序Sequencing 1)16S/18S测序： Sanger测序： 用于低通量的16S/18S DNA测序，提取宏基因组后，首先经过PCR将16S/18S序列扩增出来，再将其连接到克隆载体上，导
病毒宏基因组学方法优缺点及意义 病毒宏基因组学方法优缺点及意义 随着时代的发展和生物科学技术的进步，新兴的病毒宏基因组学为解决这些问题提供了契机，以下是一篇关于病毒宏基因组学探究的论文范文，供大家阅读参考。 病毒个体微小，多数病毒直径在100nm(20~200nm)，较大的病毒直径300~450nm,较小仅为18~22nm,结构简单，不能独立复制需要依赖于宿主细胞复制繁殖，被许多生物学家认为是处于生命和非生命交叉区域的存在物。据估计目前对病毒的发掘还不到1%[1],对病毒的研究具有广阔的前景和现实意义。病毒独特的结构和特性给病毒的研究和鉴别带来许多困难，主要体现在两个方面：第一，病毒没有专门的宿主细胞系，60%以上的病毒无法成功的进行离体培养[2]或在培养中不能表达致病性;第二，病毒基因本身变异率高，通过与宿主间的相互作用进化，增加核酸多样性，产生新病毒，导致宿主范围扩大、跨物种传播[3].对细菌的研究可以通过保守的16sRNA的分析来定位分类信息、进化关系和种群多样性等。对于真菌有18sRNA及ITS序列。然而病毒不像细菌真菌，没有固定保守的进化标记基因。 所以一些传统研究方法的应用受到限制，不能完全满足病毒研究的需要。如电镜观察病毒的灵敏性不高，细胞培养病毒可能观察不到细胞病变，血清学反应中不但难以获得高价抗体而且容易出现交叉反应导致错误结果，传统PCR方法对未知序列及高变异的病毒研究难以发挥作用。加之近年来病毒流行病的频繁发生及其可怕的传染性，对人类及动植物的健康产生严重威胁，如HIV病毒、SARS病毒、禽流感病毒和在西非等地肆虐的埃博拉病毒[4]等，给人们造成了巨大的恐慌和经济损失。因此，对病毒基因组的研究、致病源的探索、病毒在生物体和环境中如何存在及传播、病毒病防治的研究已迫在眉睫。 随着时代的发展和生物科学技术的进步，新兴的病毒宏基因组学为解决这些问题提供了契机，宏基因组学(Metagenomics)的概念是1998年由Handelsman[5]首次提出，对特定环境中基因组的总和进行研究，包括培养的和未培养的.微生物。病毒宏基因组学(Viral metagenomics)就是宏基因组学在病毒领域的应用，即从环境或生物组织中浓缩病毒粒子的遗传物质进行生物学信息分析的技术。它的应用需要一些交叉学科的创新技术的支持，随机
病毒宏基因组学方法优缺点及意义【可编辑版】病毒宏基因组学方法优缺点及意义病毒宏基因组学方法优缺点及意义 病毒个体微小，多数病毒直径在100nm，较大的病毒直径300~450nm,较小仅为18~22nm,结构简单，不能独立复制需要依赖于宿主细胞复制繁殖，被许多生物学家认为是处于生命和非生命交叉区域的存在物。据估计目前对病毒的发掘还不到1%,对病毒的研究具有广阔的前景和现实意义。病毒独特的结构和特性给病毒的研究和鉴别带来许多困难，主要体现在两个方面: 第一，病毒没有专门的宿主细胞系，60%以上的病毒无法成功的进行离体培养或在培养中不能表达致病性;第 二，病毒基因本身变异率高，通过与宿主间的相互作用进化，增加核酸多样性，产生新病毒，导致宿主范围扩大、跨物种传播.对细菌的研究可以通过保守的16sRNA的分析来定位分类信息、进化关系和种群多样性等。对于真菌有18sRNA及ITS序列。然而病毒不像细菌真菌，没有固定保守的进化标记基因。 所以一些传统研究方法的应用受到限制，不能完全满足病毒研究的需要。如电镜观察病毒的灵敏性不高，细胞培养病毒可能观察不到细胞病变，血清学反应中不但难以获得高价抗体而且容易出现交叉反应 导致错误结果，传统PCR方法对未知序列及高变异的病毒研究难以发挥作用。加之近年来病毒流行病的频繁发生及其可怕的传染性，对人类及动植物的健康产生严重威胁，如HIV病毒、SARS病毒、禽流感病毒和在西非等地肆虐的埃博拉病毒等，给人们造成了巨大的恐慌和经济损失。因此，对病毒基因组的研究、致病源的探索、病毒在生物体和环境中如何存在及传播、病毒病防治的研究已迫在眉睫。 随着时代的发展和生物科学技术的进步，新兴的病毒宏基因组学为解决这些问题提供了契机，宏基因组学的概念是1998年由Handelsman首次提出，对特定环境
宏基因组学研究方法及应用概述彭昌文 (山东省济宁学院生物学系 273155) 颜 梅 (山东省曲阜师范大学生命科学学院 273165) 摘 要 本文简要介绍了宏基因组的概念,概述了其原理及应用。 关键词 宏基因组 宏基因组学 环境基因组学 基因文库的构建 迄今,人们对微生物世界的认识基本都来源于对占细菌总种数不到1%的微生物的单个种群的孤立研究结果。然而微生物是通过其群落而非单一种群来执行在自然界物质与能量循环中的作用的,对微生物群落作为整体的功能认识远远落后于对其个体的认识。这种状况不利于全面认识微生物在自然界所扮演的重要角色。为了获得完整的环境微生物基因表达产物,早在1978年许多学者就提出了直接从环境中提取微生物DNA的思路,1998年,AR I A D phar maceutical公司的科学家Handels man等首次提出宏基因组的概念[1]。宏基因组(the genomes of the total m icrobi ota found in nature)是指生境中全部微生物基因的总和[2]。它包含了可培养的和未培养的微生物的基因总和,微生物主要包括环境样品中的细菌和真菌。而宏基因组学就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象,以功能基因筛选和测序分析为研究手段,以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系等为研究目的的新的微生物研究方法,也称为微生物环境基因组学、元基因组学或生态基因组学。它主要研究从环境样品获得的基因组中所包含的微生物的遗传组成及其群落功能,为充分认识和开发利用非培养微生物,并从完整的群落水平上认识微生物的活动、最大限度地挖掘微生物资源,提供了可能,已成为国际生命科学技术研究的热点和前沿。 1 宏基因组学的研究方法 宏基因组学的研究过程一般包括从环境样品中提取基因组DNA,克隆DNA到合适的载体,导入宿主菌体,筛选目的转化子等工作,可分为三个步骤。 1.1 宏基因组的提取 在宏基因组筛选过程中,目的基因是整个核苷酸链中的一部分,因此样品前期的富集能够提高筛选命中率。DNA的提取是宏基因文库构建的关键步骤。提取步骤通常需要满足两个条件:既要尽可能提取样品所有微生物的基因,又要保持片段的完整和纯度。目前所开发的DNA提取方法有两种:细胞提取法和直接裂解法。直接裂解法包括物理法(冻融法、超声法、玻璃球珠击打法、液氮碾磨法)、化学法(常用化学试剂有表面活性剂、盐类、有机溶剂等)及酶裂解法。另外,依据提取样品总DNA前是否分离细胞,可以分为原位裂解法和异位裂解法。原位裂解法可以直接破碎样品中的微生物细胞而使DNA 得以释放,由于无需对样品微生物进行复苏,且黏附颗粒上的微生物细胞亦能被裂解,所得DNA能更好地代表样品微生物的多样性。此法操作容易、成本低,DNA 提取率高,但由于机械剪切作用较强,所提取的DNA 片段小(1～50kb),通常适用于构建小片段插入文库(以质粒和λ噬菌体为载体)的DNA提取。异位裂解法则先采用物理方法将微生物从样品中分离出来,然后采用较温和的方法抽提DNA。此法条件温和,可获得大片段DNA(20～500kb),纯度高,但操作繁琐、成本高、得率低,通常适用于构建大片段插入文库(以柯斯质粒或者细菌人工染色体为载体)的DNA提取。1.2 宏基因组文库的构建 宏基因组文库的构建需适宜的克隆载体。通常用于DNA克隆的载体主要包括质粒、黏粒和细菌人工染色体等。质粒一般用于克隆小于10kb的DNA片段,适用于单基因的克隆与表达。黏粒的插入片段可达40kb左右,细菌人工染色体插入片段可达350kb,可用来制备由多基因簇调控的微生物活性物质的完整代谢途径的相关片段文库。1.3 目的基因的筛选 目的基因的筛选方法包括序列分析和功能分析两种。序列分析适用于小片段DNA文库的基因筛选;而功能分析通常适用于大片段DNA文库的筛选。序列分析筛选不依赖于重组基因在外源宿主中的表达,因为所使用的寡聚核苷酸引物是直接通过DNA序列中的保守区域设计的,反映了氨基酸序列的保守性,可获得未知序列的目的基因。该方法对DNA量的要求不高,筛选到新活性物质的可能性较大。序列分析的另一个手段是对宏基因组克隆测序,无论是全部或随机测序都是发现新基因的有效手段。 对于功能分析而言,首先需获得目的克隆,然后通过序列和生化分析对其进行表征。此法能快速鉴定出全新且有开发价值的活性物质,可用于医药、工农业等行业。由于此法检出率较低,工作量较大,且受检测手段的限制,所以常要借助于高通量筛选。 2 宏基因组学的应用 2.1 在生态学方面的应用 当今微生物生态学研究的主要目的之一是将微生物与其所在环境中的代谢过程相联系。应用16s r DNA作为系统发育锚去鉴定属于某种微生物的克隆,然后对基因进行测序,从而获得
全基因组从头测序(de novo测序) https://www.doczj.com/doc/9d2051750.html,/view/351686f19e3143323968936a.html 从头测序即de novo 测序，不需要任何参考序列资料即可对某个物种进行测序，用生物信息学分析方法进行拼接、组装，从而获得该物种的基因组序列图谱。利用全基因组从头测序技术，可以获得动物、植物、细菌、真菌的全基因组序列，从而推进该物种的研究。一个物种基因组序列图谱的完成，意味着这个物种学科和产业的新开端！这也将带动这个物种下游一系列研究的开展。全基因组序列图谱完成后，可以构建该物种的基因组数据库，为该物种的后基因组学研究搭建一个高效的平台；为后续的基因挖掘、功能验证提供DNA序列信息。华大科技利用新一代高通量测序技术，可以高效、低成本地完成所有物种的基因组序列图谱。包括研究内容、案例、技术流程、技术参数等，摘自深圳华大科技网站 https://www.doczj.com/doc/9d2051750.html,/service-solutions/ngs/genomics/de-novo-sequencing/ 技术优势: 高通量测序：效率高，成本低；高深度测序：准确率高；全球领先的基因组组装软件：采用华大基因研究院自主研发的SOAPdenovo软件；经验丰富：华大科技已经成功完成上百个物种的全基因组从头测序。 研究内容: 基因组组装■K-mer分析以及基因组大小估计；■基因组杂合模拟（出现杂合时使用）； ■初步组装；■GC-Depth分布分析；■测序深 度分析。基因组注释■Repeat注释； ■基因预测；■基因功能注释；■ ncRNA 注释。动植物进化分析■基因家族鉴定（动物TreeFam；植物OrthoMCL）；■物种系统发育树构建； ■物种分歧时间估算（需要标定时间信息）；■基因组共线性分析； ■全基因组复制分析（动物WGAC；植物WGD）。微生物高级分析 ■基因组圈图；■共线性分析；■基因家族分析； ■CRISPR预测；■基因岛预测（毒力岛）； ■前噬菌体预测；■分泌蛋白预测。 熊猫基因组图谱Nature. 2010.463:311-317. 案例描述 大熊猫有21对染色体，基因组大小2.4 Gb，重复序列含量36%，基因2万多个。熊猫基因组图谱是世界上第一个完全采用新一代测序技术完成的基因组图谱，样品取自北京奥运会吉祥物大熊猫“晶晶”。部分研究成果测序分析结果表明，大熊猫不喜欢吃肉主要是因为T1R1基因失活，无法感觉到肉的鲜味。大熊猫基因组仍然具备很高的杂合率，从而推断具有较高的遗传多态性，不会濒于灭绝。研究人员全面掌握了大熊猫的基因资源，对其在分子水平上的保护具有重要意义。 黄瓜基因组图谱黄三文, 李瑞强, 王俊等. Nature Genetics. 2009. 案例描述国际黄瓜基因组计划是由中国农业科学院蔬菜花卉研究所于2007年初发起并组织，并由深圳华大基因研究院承担基因组测序和组装等技术工作。部分研究成果黄瓜基因组是世界上第一个蔬菜作物的基因组图谱。该项目首次将传
宏基因组学概述 王莹，马伊鸣 （北京交通大学土木建筑工程学院环境1402班） 摘要：随着分子生物学技术的快速发展及其在微生物生态学和环境微生物学研究中的广泛应用，促进了以环境中未培养微生物为研究对象的新兴学科——微生物环境基因组学(又叫宏基因组学、元基因组学，英文名Metagenomics)的产生和快速发展。宏基因组学通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA，构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能．在短短几年内，宏基因组学研究已渗透到各个领域，包括海洋、土壤、热液口、热泉、人体口腔及胃肠道等，并在医药、替代能源、环境修复、生物技术，农业、生物防御及伦理学等各方面显示了重要的价值。本文对宏基因组学的主要研究方法、热点内容及发展趋势进行了综述 关键词：宏基因组宏基因组学环境基因组学基因文库的构建 Macro summary of Metagenomics Wang Ying, Ma Yi-Ming （BeijingJiaotongUniversity, Institute of civil engineering,） Key words: Metagenome; Metagenomics; The environmental genomics 宏基因组学（Metagenomics）又叫微生物环境基因组学、元基因组学。它通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA,构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。它是在微生物基因组学的基础上发展起来的一种研究微生物多样性、开发新的生理活性物质（或获得新基因）的新理念和新方法。其主要含义是：对特定环境中全部微生物的总DNA （也称宏基因组，metagenomic）进行克隆，并通过构建宏基因组文库和筛选等手段获得新的生理活性物质；或者根据rDNA数据库设计引物，通过系统学分析获得该环境中微生物的遗传多样性和分子生态学信息。 1.起源 宏基因组学这一概念最早是在1998年由威斯康辛大学植物病理学部门的Jo Handelsman等提出的，是源于将来自环境中基因集可以在某种程度上当成一个单个基因组研究分析的想法，而宏的英文是"met a-"，具有更高层组织结构和动态变化的含义。后来伯克利分校的研究人员Kevin Chen和Lior Pachter 将宏基因组定义为"应用现代基因组学的技术直接研究自然状态下的微生物的有机群落，而不需要在实验室中分离单一的菌株"的科学。 2 研究对象 宏基因组学(Metagenomics)是将环境中全部微生物的遗传信息看作一个整体自上而下地研究微生 物与自然环境或生物体之间的关系。宏基因组学不仅克服了微生物难以培养的困难, 而且还可以结合生物信息学的方法, 揭示微生物之间、微生物与环境之间相互作用的规律, 大大拓展了微生物学的研究思路与方法, 为从群落结构水平上全面认识微生物的生态特征和功能开辟了新的途径。目前, 微生物宏基因组学已经成为微生物研究的热点和前沿, 广泛应用于气候变化、水处理工程系统、极端环境、人体肠道、石油污染、生物冶金等领域, 取得了一系列引人瞩目的重要成果。 3 研究方法 宏基因组学的研究过程一般包括样品和基因(组)的富集；提取特定环境中的基因组 DNA；构建宏基因组 DNA 文库；筛选目的基因；目的基因活性产物表达(图 1)五个步骤。
宏基因组测序讲解
宏基因组测序 目的 研究藻类物种的分类，研究与特定环境与相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部，微生物与环境，与宿主的关系。技术简介 宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系为研究目的的新的微生物研究方法。一般包括从环境样品中提取基因组 DNA, 进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。 宏基因组( Metagenome)(也称微生物环境基因组Microbial Environmental Genome, 或元基因组) 。是由 Handelsman 等 1998 年提出的新名词，其定义为"the genomes of the total microbiota found in nature" , 即生境中全部微小生物遗传物质的总和。它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，目前主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。而所谓宏基因组学 (或元基因组学， metagenomics) 就是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象，以功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多样