一种简单快速植物组织冰冻切片方法( ) 热带亚热带植物学报 2008, 16 4: 386,389
Jou rna l of Trop ica l and Sub trop ica l Bo tany
一种简单快速植物组织冰冻切片方法
3 宁代锋 , 尹增芳 , 张菁 , 孙海燕
()南京林业大学森林资源与环境学院 , 南京 210037
摘要 : 比较不同冷冻方法对植物细胞超微结构的影响 , 结果表明 : 直接包
埋法处理的植物细胞超微结构保存较
好 , 而液氮冷冻处理的植物细胞内膜系统损伤严重。建立了一种直接包埋冷冻和适当回温相结合的方法 , 不仅
可以制作出植物细胞基本结构保存完整的组织切片 , 而且避免了使用冰冻保
护剂的弊端。其操作程序是 : 样品
固定 ?冰冻与包埋 ?适当回温 ?快速切片 ?展片 ?染色。此法制作的切片可
进行不同的染色和组织细胞化学测
定 , 具有操作简便 , 易于推广的特点。
关键词 : 冰冻切片 ; 直接包埋法 ; 液氮冷冻 ; 回温 ; 超微结构
( ) 文章编号 : 1005 - 3395 2008 04 - 0386 - 04 中图分类号 : Q94 - 336 文献标识码 : A
A S im ple and Rap id Cryo2section ing M ethod in Plan t T issue
3ZHAN G J ing, SUN H a i2yan N IN G D a i2feng, Y IN Zeng2fang,
( )Co llege of Fo re st R e sou rce and Environm en t, N an jing Fo re stry U n ive rsity, N an jing 210037 , Ch ina A b stra c t: The effec ts of d iffe ren t freezing trea tm en ts on u ltra struc tu re of p lan
t ce lls du ring c ryo2sec tion ing w e re comp a red. The re su lts show n tha t the ce ll u ltra struc tu re w a s we ll p re se rved w ith d irec t c ryoem bed m e thod, w h ile the endom em b rane system in the ce ll w a s in ju red seve re ly w ith liqu id n itrogen c ryop re se rva tion. W e p ropo sed a m e thod com b in ing w ith c ryoem bed and mode st thaw ing, by w h ich no t on ly cou ld ge t in tegra ted sec
tion s w ith the ba sic struc tu re p re se rved, bu t a lso cou ld avo id the abu se of u sing cyro 2p ro tec ted reagen t. The p rocedu re con sisted of seve ra l step s a s fo llow s: fixing ? refrige ra tion and em bedd ing ? mode st thaw ing ? rap id sec tion ing ? sec tion fla
tting ? sta in ing. The sec tion s m ade by d irec t c ryoem bed w ith mode st thaw ing cou ld be sta ined and chem ica l de te rm ined in d iffe ren t ways. B e side s, the cha rac te ristic of th is p rocedu re is simp le and ea sy to be p romo ted.
Key word s: C ryo sec tion ing; C ryoem bed; L iqu id n itrogen c ryop re se rva tion; Thaw ing; U ltra struc tu re
植物组织冰冻切片作为一种快速、简便、高效、损伤细胞的内膜系统 ,
影响其在植物细胞学研究
中的应用。为了解决上述植物冰冻切片中存在的易操作的技术 , 可以缩短
常规石蜡切片缓慢而复
问题 , 本文采用直接包埋冷冻和适当回温相结合杂的处理过程 , 减少对样
品组织结构的损伤。在
的方法 , 取得了较好的切片效果。细胞免疫化学和原位杂交等研究中 , 冰冻切片能
更好地保存细胞内生物分子的活性 , 显示出独特 1 材料和方法作用。冰冻切片技术在动物和人体的组织研究中
[ 1- 3 ] 1. 1 材料已广泛应用 , 但由于植物细胞含水量大 , 在低
实验材料选取南京林业大学校园苗圃内南林 95温冰冻过程中容易形成冰晶 , 硬度变大 , 难以切出
( ) 杨Pop u lu s ×eu ram e ricana‘N an lin95π1 a生茎。结构完整的组织切片 , 而且细胞内产生的冰晶会
收稿日期 : 2007 - 08 - 13 接受日期 : 2007 - 11 - 23
( ) ()基金项目 : 国家自然科学基金项目 30671657 ; 江苏省自然科学基金项目 B K2005132 资助 3 通讯作者 Co rre spond ing au tho r
1. 2 植物材料的冰冻处理方法埋剂 , 切片即刻附着在解剖针上 , 随后用解剖
直接包埋法启动切片机降温开关 , 使箱温切片转移到机箱外的载玻片上展片。
染色, 一般不需待切片完全展开时降低并维持在 - 20?, 冰冻台的温度降低到 - 20?。
殊处理就可以直接在切片上进行染色或组织将经过预处理的材料包埋 , 然后转入冰冻切片机内
分析。如图版 ?: 1 所示 , 杨树茎横切面结的样品台上 , 使材料迅速冷却并固着在样品台上。整 , 未出现细胞结构破损的现象。图版 ?: 2 液氮冷冻法液氮冷冻法是将材料经常规杨树茎细胞壁自发荧光的冰冻切片图像 , 杨方法固定和清洗后 , 先用包埋剂包裹在适当大小导管、木纤维细胞、韧皮纤维细胞及髓部薄壁的盒内 , 再用液氮迅速冷冻。冷冻时间约为 20 s, 结构清晰。
随后尽快将样品移至冰冻切片机腔内 , 样品经 1 h
左右的回温后再用包埋剂粘在样品台上进行冰冻 2 结果切片。
在电镜下观察不经过冷冻处理、液氮冷冻 1. 3 电镜制样观察和直接冷冻包埋的杨树 1 a 生茎薄壁细胞的
结构 , 结果表明不经过冷冻处理的杨树茎薄将直接包埋和液氮冷冻的材料回温后分别进
胞结构完整 , 可以观察到细胞内清晰的液泡膜行常规电镜制样 , 超薄切片机切片 , 醋酸双氧铀和及细胞核、线粒体、质体、内质网等细胞器的膜柠檬酸铅染色 , H 2600型透射电镜观察拍照。() 图版 ?: 3 。
1. 4 冰冻切片的制作流程液氮冷冻处理后的杨树茎薄壁细胞的超
构显示内膜系统损伤较为严重 , 由图版 ?: 5 样品固定 ? 冰冻与包埋 ? 适当回温 ? 快
看出薄壁细胞质壁分离现象严重 , 细胞内质速切片 ? 展片 ? 染色观察
样品固定将切取的杨树茎立即投入含
( )4 %多聚甲醛、100 mmo l /L 磷酸缓冲液 pH 7. 2 的 , 质膜及部分细胞器的膜上出现嗜锇颗膜解体
固定液中 , 4 ?下固定 2,3 h, 100 mmo l /L 磷酸缓观察中还发现部分细胞损伤极为严重 , 表现
( )冲液 pH 7. 2 浸洗 2 ,3 次后备用 , 也可不固定直膜结构不清晰 , 细胞器解体 , 表明细胞膜系统接将新鲜组织进行包埋。 () 严重的破坏图版 ?: 6 。
冰冻包埋启动切片机降温开关 , 把箱温与液氮冷冻的材料相比 , - 20 ?条件下直降低并维持在 - 20 ?, 冰冻台的温度降低到 - 冻包埋的杨树茎薄壁细胞损伤程度明显较轻
20 ?。待冰冻切片机内的温度合适时 , 把经过预处泡膜结构清晰 , 细胞器结构完整 , 内膜系统上理的样品或新鲜组织直接用包埋剂包裹在样品台锇颗粒出现 , 但局部内质网库槽膨胀 , 部分细上 , 使材料迅速冷却并固着在样品台
上。包埋时选 () 现轻微的质壁分离现象图版 ?: 4 。
( 用进口包埋剂 OCT Op tim um cu tting temp e ra tu re
3 讨论 ) compound, 涂抹均匀 , 使样品深埋其中。
植物细胞有细胞壁和大液泡 , 含水量大 , 回温处理把样品台连同已经冷却的材料
温冰冻过程中容易形成冰晶 , 硬度变大 , 难以 , 拧紧机头的螺丝 , 摇动机身外移至切片机的机头结构完整的组织切片。材料硬度太大是造成的旋转杠杆进行修块切片 , 直到切到自己需要的切片破碎的主要原因。我们采用直接包埋和部位 , 此时的切片大部分都是破碎的 , 然后将样品回温相结合的方法 , 有效地解决了这一问题 , [ 4 ] 是把握最佳切片温度。张建国认为最好是台连同包埋块拿出切片机箱 , 室温下放置 20 ,30
s, 进行回温处理 , 使包埋块变软。
切片将回温处理后的样品包埋块迅速放尚有小部分组织未冰冻发硬时开始修
出切片平入切片机箱进行切片 , 这样处理可切出较完整的 , 见切出最佳切片时即用载玻片吸贴试切数下
μ切片 , 切片厚度为 10,20 m , 但切片过程必须在) 佳切片温度为 - 23 ,- 20 ?, 大约只有 10 s,
15,20 s内完成 , 超过这一时间 , 材料会冻硬 , 切该温度切片易碎。我们曾实验切未完全冻硬
388 热带亚热带植物学报第 16卷
b isbenzim ide H33258 Pneumocystis ca rin ii and L e ishm an ia 另
外 , 植物组织低温冰冻会不可避免的造成
con ta in ing m a te ria ls [ J ]. Pa rasito l R e s, 1998 , 84: 559 - 564. 冰晶损伤 , 而冰晶损伤会明显影响植物细胞的超 ) (张建国 . A new c ryo2section ing m e thod [ J ]. Ch in J [ 4 ] Zhang J G [ 7 ] 微结
构。孙龙华等用电镜观察了红豆草 () ( ) C lin Exp e r Pa tho
l 临床与实验病理学杂志 , 1994 , 10 2 : () O nob rych is vic iaefo lia采用不同降温方法保存后( )177 - 178. in Ch ine se ( ) ( ) [ 5 ] Chen D 陈丹 , Zhao J 赵洁 . Su itab le c ryo2section ing 的超微
结构 , 发现用快冻法保存的细胞存活率为 (techn ique in flo ral o rgan s of p lan t [ J ]. J W uhan Bo t R e s 武汉植零 , 其结构变化很大 , 而采用慢冻法保存后存活率 ) ( ) ( )物学研究 , 2005 , 23 3 : 285 - 290. in Ch ine se [ 8 ] () () () [ 6 ] L in Y H 林月惠 , L i H B 李寒冰 , H e X Q
贺新强 . 为 66 % , 其细胞结构变化较少。曾继吾等认为
App lica tion of c ryo2sec tion ing techn ique in h igh ly lign
ified tissue 细胞严重伤害主要发生在液氮冷冻的降温及解冻 () ( ) ( [ J ]. Ch in B u ll Bo t 植物学通报 , 2001 , 18 1 : 118 - 120. in 的过程中。这与本实验的结果相似 , 用液氮冷冻 )Ch ine se 植物材料细胞超微结构损害严重 , 而直接包埋法 () () [ 7 ] Sun L H 孙龙华 , J ian L C 简令成 . C ryop re se rvation of 对细胞膜系统的保存相对较好。 sainfo in tissue cu ltu
re s and the ir u ltra struc tu ra l ob se rva tion [ J ].
国内有关冰冻切片技术的报道普遍采用冰冻 () ( ) ( )A c ta Bo t Sin 植
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W 曾继吾 , Yi G J 易干军 , Zhang Q M 张秋明 , e t 保护剂的方法 , 陈
丹等用蔗糖保护 2液氮速冻
[ 6 ] a l. Ce ll u ltra struc tu re of p ap aya shoo t2tip du ring c ryop re serva tion 法 , 从而获得薄而且结构完整的切片 ; 林月惠等 () ( ) ( [ J ]. A c ta Ho rt Sin 园艺学报 , 2005 , 32 1 : 15 - 19. in 用甘油作冷冻保护剂对高度木质化的材料进行冰 )Ch ine se 冻切片。采用冰冻保护剂
是为了脱去细胞内一部
分自由水 , 降低其冰点 , 提高其重结晶点 , 以尽快图版说明越过冰晶形
成期 , 使细胞在快速冷冻时进入玻璃 CW : 细胞壁 Ce ll wa ll; Ch: 叶绿
体 Ch lo rop la st; N: 细胞核化态而减少冰晶形成。然而 , 冰冻保护剂本身也 N ucleu s; M: 线粒体 M itochond ria; V: 液泡 V acuo le; Pm: 质
膜
P la sm a lemm a; O G: 嗜锇颗粒 O sm iop h ilic globu le. 会对材料造
成伤害 , 脱水会使细胞发生质壁分离 ,
细胞膜和一些细胞器发生不可逆变化 , 给细胞带图版 ? [ 8 ] 来损伤。用
直接包埋冷冻 2适当回温法没有加入 1. 未染色处理的冰冻切片; ×100
2. 冰冻切片的荧光图像 , 示细胞壁自发荧光; ×100 任何冷冻保护剂处理 , 避免了冷冻保护剂对植物
3. 对照薄壁细胞的超微结构 , 示液泡、细
胞膜、细胞核、质体 ; 细胞生理状态的影响。×6000
4. 直接包埋法冷冻处理薄壁细胞的超微结构 , 示液泡、细胞膜、质冰冻
切片法相对于其他切片法而言 , 适于开展细体; ×17 000 胞免疫化学和原位杂交等研究。这类研究工作除了 5. 液氮冷冻处理薄壁细胞的超微结
构 , 示液泡、细胞膜、质体 ; 要求实验样品尽可能的保持结构原状外 , 还应使待测×8 000
6. 液氮冷冻处理薄壁细胞的超微结构 , 细胞膜破裂 , 细胞器分散。分子
保持免疫原性 , 不发生流失或漂移 , 力求“原位×10 000 原量固定”。冰冻切片法不需要样品经过长时间的脱
[ 5 ] 水包埋 , 能更好地保证抗原分子的稳定性。
总之 , 冰冻切片是植物细胞学研究的一种简 Exp lana tion of p la te 便有效的方法 , 我们在实验中摸索的直接包埋冷 P la te I 冻 2适当回温的冰冻切片方法 , 取得了良好的效果,None sta ined sec tion s; ×100 1.
希望能促进植物冰冻切片技术的发展和推广。F luo re scence in the sec tion, show ing ce ll wall au tofluo rescence; 2.
×100 参考文献 The u ltra stuc tu re s of no rm al p a renchym a ce lls, show ing vacuo le, 3. [ 1 ] Sandy D , Pe ter K. V isua lisa tion of m yco rrh iza l fuga l struc tu re s and p la sm a lemm a, nuc leu s, ch lo rop last; ×6 000
quan tifica tion of their su rface and vo lum e u sing laser scann ing The u ltra stuc tu re s of p arenchym a ce lls w ith d irec t c ryoem bed, 4. ( ) confoca l m icro scop y [ J ]. M yco rrh iza, 1999 9 : 205 - 213. show ing vacuo le, p la sm a lemm a, ch lo rop last; ×17 000 [ 2 ] Sa thyane san S N , A n ton ia D , Ro se T, e t a l. A simp lified m e thod The u ltra stuctu re s of p arenchym a ce lls w ith frozen in liqu id n itrogen, 5. show ing vacuo le, p la sm a lemm a, ch lo rop last; ×8 000 fo r com b ined imm unoh istochem istry and in situ hyb
rid iza tion in
fre sh2frozen, c ryocu t mou se b rain sec tion s [ J ]. B ra in R e s The u ltra stuctu re s of p arenchym a ce lls w ith frozen in liqu id
n itrogen, 6. show ing ce ll m em b rane b roken and o rganelle s d isp e rsed. ×10 000 ( ) P ro toco ls, 2002 9 : 214 - 219.
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N IN G D a i2feng e t a l. : P la te I 宁代锋等 : 图版 ?
石蜡切片免疫组化染色步骤 1、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 Histogrip TM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： 1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。 1.2 Histogrip TM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60o C烤箱烘烤一小时，装盒备用。 1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60o C烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。 2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。 2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 3、抗原热修复： 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml 的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。 3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。 3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 4、免疫组化染色步骤： （以美国ZYMED公司SP试剂盒为例） 4.1石蜡切片脱蜡至水。 4.2 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。 4.3蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
全部实验步骤 1 取新鲜组织于4%多聚甲醛固定24小时 2 30%蔗糖脱水48小时以上 3 -250C包埋（冰冻切片机内） 4冰冻切片 冰冻切片步骤 冰冻切片免疫组化染色步骤： 冰冻切片4~8μm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。用3%过氧化氢孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗，5分钟×2次。下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。(见我发的前面的帖子) 你确定你是冰冻切片吗？？？ 冰冻切片不能用热修复啊！！！ 以下是我的步骤： 1 冰冻切片室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，PBS洗，5分钟×2。 2 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 3 PBS冲洗，5分钟×3次。 4 滴加滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育30分钟。 PBS冲洗，5分钟×3次。 5 滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。 6 PBS冲洗，5分钟×3次。 7 显色剂显色（DAB）。 8 自来水充分冲洗，复染，封片。 冰冻切片免疫组化染色用的灭活内源性过氧化物酶，最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20分钟。此配方不易产生脱片。 配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次新鲜配制。 冰冻切片免疫组化染色步骤 冰冻切片4~8mm，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。 下接免疫组化染色操作步骤。
冰冻切片的免疫组化染色步骤 速冻组织 将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约 10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。 冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。 室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。也可根据需要选择其它的固定方式。 PBS洗，5分钟×3。 用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。 PBS洗，5分钟×3。 下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。 石蜡切片免疫组化染色步骤 三步法（以SP试剂盒为例） 1. 石蜡切片脱蜡至水。 2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。 3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS 冲洗，2分钟×3次。 4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。 5. PBS冲洗，2分钟×3次。 6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。 7. PBS冲洗，2分钟×3次。 8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。 9. PBS冲洗，2分钟×3次。 10. 显色剂显色（DAB或AEC）。
1.做冰冻切片用的固定后样品能在蔗糖溶液放多久？ 问：本人将样品固定过后冲洗过后，放入蔗糖溶液，因有事耽搁，放了一个星期了，不知是否还可切片．还有固定过后冲洗用普通蒸馏水冲洗可以吗？我是做免疫组化 答：1、不知道你放置的蔗糖浓度是多少，如果是30%最好是三天之内，50%的浓度可以方久一点，一两个月应该没什么问题。因为蔗糖是高渗环境，不会影响实验结果。祝好运吧！ 2、我认为组织在20％蔗糖放一周还是可以切片的，至于固定后的冲洗，可以免掉，也可用0.01MPBS涮洗一下，蔗糖液的量要多加一些 2、关于冰冻切片的问题(冰冻切片,免疫荧光,蔗糖,脱水)问：请拟准备做免疫荧光的标本,经前固定灌注后取全脑,后固定4小时后,30%的蔗糖脱水过夜,再用OCT包埋后保存在-80的冰箱,冰冻切片后HE染色,发现整个视野都是大小不等的圆形洞洞,不知道是什么原因. 答:1、个人认为可能是以下几个方面的问题: 30%的蔗糖脱水过夜---- 一般我所采取的是灌注固定后取脑,然后放入30%蔗糖的多聚甲醛溶液中,待脑下沉到底后(大约2天)再切片,用这样的高渗糖既可以防止冰晶又可以继续后固定.单纯的蔗糖过夜应该是不够的.
从30%蔗糖的多聚甲醛溶液中捞出脑后应放入液氮迅速冷冻然后进行切片,不建议用-80度冰箱,曾经用过-80度冰箱结果脑片出现许多冰晶孔.
2、用0.01M的PBS配置的4%多聚甲醛灌注固定后，20%蔗糖（沉底）→30%蔗糖（沉底），然后直接进冰冻切片机急冻15~20min，我们实验室的技术员曾说过，脑标本千万不能用OCT 包埋、液氮冷冻。只要蔗糖脱水彻底，是不会形成冰晶的；而用OCT包埋、液氮冷冻，你没做过，时间不好把握——时间长了，组织会冻裂；时间不够，冷冻效果不好，切片不好切。 3、这个就是实验室和实验室操作方法有所区别了,我说的方法肯定是没有问题的,我们都是这样操作没有出现过冰晶,不用OCT包埋,但确实用液氮,冻10秒,不会冻裂,效果良好. 4、液氮速冻可以防止组织冰晶的形成 冰冻切片心得 1. 取脑一定要在冰上操作,液体也一定用冷的 2. 30%蔗糖一定要充分,最好中间换液一次, 20%的可以不做 3. 沉淀后冻存,一定要快冻, 最好在干冰上操作. 4. 最重要的一点, 灌注的时候, 不要用0.1M PB, 用0.01M PBS. 以前不知道,很多书上写的都是0.1M PB,后来自己用了发现还是有洞. 为了这个,我还专门作了对照实验,结果0.01M PBS更好一些, 原因不知道为什么, 但是事实如此. (理论上高浓度液体更利于保护细胞不会因为冰冻损伤) 5. 如果做磷酸化的抗体,一定记得在灌注液里加一定的抑制剂,如NaF等.
甲状腺癌术中冰冻切片误诊的诊断与治疗 【摘要】目的探讨甲状腺癌术中冰冻切片误诊的诊断和治疗的对策。方法回顾性分析本院22例术中冰冻切片误诊的甲状腺癌患者的临床资料。结果再次手术13例,行患侧残余腺叶并峡部及对侧腺叶次全切除术10例,加全组淋巴结清扫术2例,患侧残余腺叶并峡部切除术3例。二次手术石蜡病理切片提示残余癌3例,1例残余腺体未见癌组织,肿大的淋巴结见癌组织,残癌率为30.77%。结论对于临床高度怀疑甲状腺癌而冰冻切片未能确诊的病例一期行患侧腺叶全切术或次全切除术是可行的,可以避免二次手术。 【关键词】甲状腺癌;病理学检查;再手术 甲状腺癌在头颈部肿瘤中发病率较高,约占头颈部恶性肿瘤的5.1%。由于大多数甲状腺癌分化良好,生长缓慢,恶性程度低,主要采用手术治疗,首次手术方式选择正确与否对预后尤为重要。而术中冰冻切片是目前诊断甲状腺癌最可靠的方法,外科医生常根据其结果来决定手术方式。但冰冻切片存在着一定的假阴性率,本文对术中冰冻病理诊断为甲状腺良性肿瘤,而术后石醋切片为甲状腺癌的22例资料进行分析。 1 资料和方法 1.1 一般资料本组22例,男6例,女16例,男女比为1: 2.7,年龄14~73岁,平均38.5岁。22例均以颈部肿物就诊,病程为10 d~11年,肿物大小在1~7 cm,位于左侧5例,右侧8例,双侧9例;所有病例双侧颈部均未扪及肿大淋巴结。 1.2 辅助检查结果术前18例行B超检查,拟诊甲状腺腺瘤9例,甲状腺腺瘤囊性变3例,结节性甲状腺肿4例,甲状腺占位性病变2例;1例行CT检查提示弥漫性甲状腺肿,甲状腺推移、压迫气管。所有病例均未发现颈部有肿大淋巴结,病灶未见有钙化影,所有病例术前未行穿刺活检术。 1.3 术中冰冻切片结果甲状腺良性病变18例,结节性甲状腺肿3例,甲状腺良性肿瘤,未排除恶变可能1例。术后石蜡病理切片检查为甲状腺癌,其中滤泡癌7例,乳头状癌15例。伴结节性甲状腺肿4例。 1.4 治疗情况首次手术方式:患侧腺叶局部切除术10例,次全切除术3例,双侧局部肿块切除术3例,双侧腺叶全(次)切除术6例,1例加同侧颈前淋巴结清扫术。二次手术行患侧残余腺叶并峡部及对侧腺叶次全切除术10例,加全组淋巴结清扫术2例,患侧残余腺叶并峡部切除术3例,其余9例未再次手术。 2 结果 2.1 再次术后病理情况二次手术石蜡病理切片提示残余癌3例,1例残余腺体未见癌组织,肿大的淋巴结见癌组织,其余9例切除标本未见癌组织残留,残癌率
冰冻切片与漂片免疫组化 以前做冰冻切片,总是遇到问题,后来查文献,自己又做实验比较,总算找到了又快又好地办法, 拿出来和大家分享一下. 1. 取脑一定要在冰上操作,液体也一定用冷的 2. 30%蔗糖一定要充分,最好中间换液一次, 20%的可以不做 3. 沉淀后冻存,一定要快冻, 最好在干冰上操作. 4. 最重要的一点, 灌注的时候, 不要用0.1M PB, 用0.01M PBS. 以前不知道,很多书上写的都是0.1M PB,后来自己用了发现还是有洞. 为了这个,我还专门作了对照实验,结果0.01M PBS更好一些, 原因不知道为什么, 但是事实如此. (理论上高浓度液体更利于保护细胞不会因为冰冻损伤) 5. 如果做磷酸化的抗体,一定记得在灌注液里加一定的抑制剂,如NaF等. 蔗糖俺用25%/PBS 的，不用换液，只要过夜12个小时就能沉下去了。包埋的时候不用冲洗，但是要注意一定要用吸水纸擦干蔗糖溶液，否则切片有麻烦 我做切片的时候，先用20％蔗糖（PB配）沉底，再用30％蔗糖沉底，这样脱水比较充分。一般是等切片机温度达到-22度之后，再将包埋好的脑组织放入。脱水不充分也会导致切片有洞，而且片子容易向内卷，很不好贴。一直这样做了很久，效果都还不错。 取脑后，直接投到液氮？？我试过，由于脑组织水分多，下液氮后直接就碎了～～ 防止脑袋冻碎办法： 先准备好一个保温杯，倒入适量的液氮，然后在杯身中放一个纸杯（塑料或玻璃杯禁用），再在杯中放一金属片，以防止纸杯翻倒，动物脑袋取好后，先放在一张小锡箔纸上，然后连锡箔纸一起转移至杯中的金属片上面，盖上保温杯盖，3-5分钟后，见大脑表片颜色变白，表示冷冻完全，随即将大脑用锡箔纸包好，转入-80度冰箱长期保存。 脑片切好后保存方法： 1、先用手指在玻片（已挂好胶）后均匀轻轻过一下，将脑片组织贴在玻片上。 2、37度干燥箱中烘干。 3、放入切片盒中，盖紧盒盖，并用胶带将切片盒封严，外用样品袋包扎严实，即可防止水汽进入。于-20度可保存半年以上，于-80度可保存一年以上。 切忌经常打开盒子。
免疫组化方法（冰冻切片） A. 所需溶液和试剂 1.二甲苯 2.无水乙醇（100% 和95%，变性无水乙醇，组织学级） 3.苏木精（可选） 4.固定剂：请参考产品说明书选取合适的固定剂。 a.10%中性福尔马林 b.丙酮 c.甲醇 d.3%甲醛溶液：配制时，将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X PBS中。 5.10X Tris缓冲盐水（10X TBS）：在800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷（Trizma base ，C4H11NO3）和80 g 氯化钠（NaCl）。用浓盐酸将pH调节到7.6。 6.漂洗（缓冲）液：1 X Tris缓冲盐水（TBS）。100 ml 10 X TBS加900 ml水至1L。 7.甲醇/过氧化氢：配制时，将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。保存在-20°C。 8.封闭液：1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。 9.配制时，将500 μl山羊血清和30 μl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。 10.检测系统：根据厂家说明书使用。已有的检测系统*。 11.DAB试剂或合适的底物：按产品说明配制。 B. 切片 1.对于保存在-80°C的样品：切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。这可以避免切 片时样品断裂。 2.将样品切成大约6-8 μm厚，铺在带正电性的玻片上。 3.固定前，可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。（这有助于切片贴紧玻片） C. 固定 注意：参考产品说明书（抗体）选择合适的固定剂 1.玻片上的切片风干后，选用如下合适的固定剂进行固定。 a.10%中性福尔马林：室温10分钟。立即进行染色操作。 b.冰丙酮：-20°C 10分钟。风干。立即进行染色操作。 c.甲醇：-20°C 10分钟。立即进行染色操作。 d.3%甲醛溶液：室温15分钟。立即进行染色操作。
微小组织快速冰冻切片法 自1891年Halsted和Accarty将冰冻切片技术列为正式诊断方法以来,国内外病理同仁在这方面做了大量工作,随着技术的不断完善,冰冻切片已成为病理科的常规工作,这为术中诊断提供了条件。随着人们生活水平的不断提高和医学科学技术的不断发展,人们对健康越来越重视,临床医生和患者常常要求对直径小于0.3 cm的微小组织作出快速诊断,由于组织小,有时难以制片和诊断,影响了此项工作的全面开展。为解决这一问题,在实际工作中,我们不断摸索、改进、完善,总结出了一种较实用的微小组织快速冰冻切片法,现介绍如下。 1材料与方法 1.1材料①微小组织包括纤维胃镜活检标本,肾穿刺标本,脱落细胞沉淀后剩余物等,均为我院门诊及住院部送检。②原西德产Leitz 1720型低温恒冷冰冻切片机。③组织包埋托的改进:找一直径为0.8～1 cm,高约1 cm的圆柱形铜质材料,一端可上螺丝,在机器所配的组织包埋托中央打一小孔,将铜质的圆柱体用螺丝与组织包埋托固定,铜质圆柱体周围缠以3～4圈医用胶布,周围略高于铜质圆柱体。④包埋剂:取适量甲基纤维素,然后加入适量蒸馏水调成糊状,煮沸,放凉,再加入适量麝香草酚,分装于空的超声耦合剂瓶内,贮存于4℃冰箱待用。 1.2方法①开机预冷:提前开机,将低温恒冷切片机冷台及切片刀冷至-22℃左右。②滴加包埋剂:在改进后的组织包埋托上滴加包埋剂,待冷冻好后修平,将微小组织平放于修好的平面上,冷冻片刻,修切,若是长条组织,如肾穿刺标本,组织与组织包埋托旋钮呈60°角,若是多块组织则应放置于同一平面,且不互相重叠。③切片:用手术刀片切去组织周围多余的包埋剂。使之成为长方形或正方形,然后开始切片,切片厚度3～5 μm。④固定:95%乙醇或乙醚酒精混合液(乙醚,95%乙醇等量混合)固定5～10 s。⑤染色:苏木素1～2 min,0.5%盐酸酒精分化1 s,0.25%氨水返蓝,伊红染1 min,95%乙醇3 s,无水乙醇3 s,在烘片机上烤干,封片。 2结果 组织切片完整,可连续切片,HE染色组织结构清晰,色彩鲜艳,细胞核、细胞质对比明显。 3讨论 快速低温恒冷冰冻切片是手术中病理诊断的方法之一,具有较广泛的应用,在很大程度上决定了手术的方式和治疗方案的确定,因此质量较好的冰冻切片,对病理医生和临床医生都至关重要。对于大块组织的冰冻切片基本不成问题,既可用一块组织多切,又可再次取材,然而,对于直径小于0.3 cm的微小组织来说,材料显得尤为珍贵,要作出正确的诊断,就必须要有一张高质量的冰冻切片。笔者将原组织包埋托进行改进,使切片刀与组织包埋托的接触面缩小,这样便于观察组织,又不至于损伤刀口,修切时防止将组织切完,有利于切片。
冰冻切片快速病理诊断30年总结 秦皇岛市肿瘤医院病理科康文喜谢芳芳王小聪李英邮编：066001 术中冰冻切片快速病理诊断是1818年由Pieter de Riemer首先创造发明的，1891年Halsted和Accarty将冰冻切片技术列为正式诊断方法。目前国内外已将此项技术普遍应用于临床，解决手术中的病理诊断问题。并日益受到外科医生和患者的欢迎和肯定。随着冰冻切片技术和临床外科手术的发展，要求做冰冻的病例逐年增多，截止到2012年10月份，本院病理科开展快速冰冻病理诊断30余年，共完成冰冻快速病理诊断1476例，积累了一定的经验和教训，为了更进一步提高冰冻快速病理诊断水平，提高冰冻诊断准确率，降低误诊率，作者将30年来所有冰冻切片快速病理诊断病例进行总结分析如下。 1 材料和方法 1.1 一般资料本组1476例大部分来自本院住院病人，小部分来自其他医院。其中男897例，女579例，年龄最大81岁，最小5个月。 1.2 病变部位乳腺1052例，软组织42例，胃33例，淋巴结33例，骨12例，腹膜9例，睾丸及附睾8例，甲状腺47例，小肠15例，大肠25例，膀胱5例，脊椎5例，阑尾10例，胆道14例，阴茎19例，卵巢53例，脑及脑膜3例，前列腺3例，肝12例，肾26例，脊髓2例，喉2例，子宫42例，精索1例，纵隔1例，腹膜后1例，眼1例。 1.3 方法本组1476例均采用德国进口莱卡冰冻切片机切片，HE染色，普通光学显微镜观察。 1.4 结果1476例中，恶性肿瘤687例，良性肿瘤388例，瘤样病变170例，炎症202例，结核29例，确诊1457例，未能确诊15例，误
诊4例。 2. 讨论 冰冻切片质量差，最初很多著名的病理学家如Ewing、Brewer、Simpson等曾经怀疑冰冻切片的准确性，1960年Cryostat冰冻切片机正式应用于临床后，冰冻切片质量有了很大提高，但和石蜡切片相比仍很逊色，对准确的冰冻病理诊断带来一定困难，尤其对年轻的病理科医生来说难度较大，缺乏经验的病理科医生难以胜任此项工作，下面根据自己个人的经验发表一点看法。 2.1 冰冻切片快速病理诊断的优缺点：冰冻切片快速病理诊断的优点是在手术过程中随时取材，迅速做出准确可靠的病理诊断，同时也减少了病人二次手术的痛苦。缺点是切片厚，细胞大，层次多，易造成错觉。另外冰冻切片诊断要求报告快，没有更多思考讨论余地，一旦报错，将造成严重的无法弥补的后果。 2.2 准确率：本文对1476例冰冻切片进行了统计分析，结果准确率为98.7%，未能确诊率为1.02%，误诊率为0.3%，与国内报道相比准确率相仿，而误诊率低于各家报道。 2.3 未能确诊和误诊的原因：⑴取材不当：恰当准确的取材是正确诊断的必备条件，取材不当就不可能得出正确的病理诊断。当临床切取肿物困难时，所送检的肿物标本不一定是肿物中心组织，很可能是肿物边缘组织，这种组织大部分是肿物周围的正常成分，或仅带有少量肿物，此时应多切几个切面进行观察，在把握不足的情况下可多取几块组织做切片，以防漏诊。⑵切片质量不佳：切片过厚，组织未能展平出现折叠，组织缺损，染色深浅不均等都直接影响诊断结果。
大鼠肾脏冰冻切片的体会 发表时间：2016-03-01T14:17:27.000Z 来源：《中国综合临床》2015年9月供稿作者：张丽娥[导读] 福建省南平市第二医院病理科福建建阳３５４２００冰冻切片不仅要求病理技师在短时间内制出高质量的切片,还需要病理技师具有娴熟的技术,对冰冻切片机功能的熟练掌握合理应用. 张丽娥 福建省南平市第二医院病理科福建建阳３５４２００ 【中图分类号】R５８７．２【文献标识码】B 【文章编号】１００１－５３０２(２０１５)０９－０８５７－０１ ０．引言由于肾脏组织质地柔软,含水量高,或在取材过程中肾组织与水分接触, 突遇低温,易形成冰晶,快速冷冻切片的制作难度大,我们通过对大鼠肾脏的冰冻制片,总结经验如下. １材料使用德国产Leica—CM１９５０型冰冻切片机,Leica一次性刀片,冷冻组织包埋剂(O．C．T．),AF固定液,改良Gill苏木素染色液,２％碳酸氢钠返蓝液,逐级梯度酒精,中性树胶. ２方法２．１取材及包埋２．１．１取新鲜大鼠肾脏标本常规取材,标本要新鲜,无需固定,严禁浸入甲醛, 酒精,生理盐水等液,尤其是不可以用酒精固定,酒精固定后组织将无法冷冻.２．１．２将样本托放入冰冻切片机的冻台上预冷,加少许O．C．T．,在OCT 未完全冻结前快速的将组织放于样本托上,在组织周围适量的补充O．C．T,待包埋剂约１/３未冻结时压上冷冻锤,打开加强冷冻,使组织快速冷冻.２．１． ３冰冻切片机温度设定在－１６oC—－１８oC为宜.冷冻时间一般为１min~２min.冷冻时间过长,组织易变硬变脆,细胞结构会发生改变,难于切片.２．１．４包埋组织时应将组织周边多留出O．C．T．用于牵引展开切片,O．C．T．中的小气泡应尽量去除,以免切片时挤压旁边组织产生皱褶,影响切片效果. ２．２切片组织切片厚度设定为５um－６um.刀具提前安放好,调整好刀具角度,切片时控制好操作窗,以利保温.肾脏组织细胞比较致密,若时间过长会变脆且易碎,在冰冻切片时可用手指轻压组织回温,再进行切片. ２．３固定切片后立即放入AF固定液固定３０s—１min,不可待切片干后再固定,这样会造成细胞核染色质不清晰,呈现毛玻璃样改变,细胞胞浆边界不清等组织细胞的退变现象. ２．４染色封片固定好的冰冻切片在苏木素染液中染色３０s—５０s,经１％盐酸分化,２％碳酸氢钠水溶液返蓝,伊红染色,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片. 制好的切片核浆对比分明,红蓝适度,颜色鲜艳,达到理想染色效果. ３讨论与分析:３．１冰晶是由于冷冻缓慢,冷冻时间过长,胞质内与组织间隙未结合的水分析出形成的.肾脏因其组织结构,在组织冷冻过程中,组织内易产生大量的冰晶影响冰冻切片的诊断,为了防止组织内冰晶的产生,最佳的办法一是使用冻锤:新鲜标本包埋后放入冷冻台时,不能将冻锤马上按压在组织上,那样会使组织受挤压变形.应该待O．C．T．凝固６０％~７０％时,再将冻锤轻压在组织上, 这样既能防止冰晶的产生,又能得到较平整的切面;另一种方法为使用液氮冷冻,可将组织放入液氮中２s－３s,待组织冻至８０％时即可取出制片,否则过冻会引起组织发脆,冻头与组织分离[２]. ３．２将包埋剂放入－１０OC或－４OC冰箱内保存,包埋剂要使用OCT,而不能用胶水等替代,因OCT 的主要成分为PVP,其能通过渗透的作用将细胞内的水分移出,减少冰晶形成. ３．３冰冻的速度与样品的表面积和体积成正比,取材时组织块尽可能薄,０．２cm 为宜,扁平状冷冻速度快,切片的前几张冰晶少,越后冰晶越多,切片不能求快,而要确保切片质量,力争一次完成一张高质量的切片[１]. ３．４可预先做好OCT冻头,将冻头上的OCT 修平,有利于将组织放平,再在冰冻机内在肾组织上滴加OCT,有利于OCT迅速降温,避免组织复温,减少冰晶形成. ３．５肾脏冰冻制片时易产生不规则裂痕,与切片时温度和切片速度有关,操作时应注意操作窗不要开太大,免工作箱的温度升高;OCT的用量太少易产本皱褶,滴加OCT时要上下俩端多,俩侧少,同时要注意OCT不要有小气泡. ３．６冰冻切片机应安放在冷室内,避免压缩机反复工作,仪器要定期维护,除霜,清洁消毒. 总之,冰冻切片技术是病理科最重要的常规工作之一,也是较难掌握的病理实验技术.要做好一张冰冻切片需要病理技术人员具有严格的责任心、严谨的工作态度、丰富的工作实践经验[３]在日常的工作中还需不断摸索经验提高切片质量,冰冻切片不仅要求病理技师在短时间内制出高质量的切片,还需要病理技师具有娴熟的技术,对冰冻切片机功能的熟练掌握合理应用. 参考文献[１] 陈乐真,徐庆中,陈国璋手术中病理诊断图鉴１版北京:科学技术文献出版社,２００５:２(还需卷数期数页码等现在还没查询查询后补上)[２] 范慧,陈立华,刘宇冷冻切片的制作体会及常见问题分析．诊断病理学杂志,２００８,１３８(还需卷数期数页码等现在还没查询查询后补上)[３] 吴艳霞．冰冻切片的制作方法分析．吉林医学,２００９,３０(６):４９３．
冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。 1.取材： 应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。 2.速冻： 为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需要，一般在取材后就要立刻对组织块进行速冻，使组织温度骤降，缩短降温的时间，减少冰晶的形成。 液氮速冻切片法是实验室最常用的速冻切片方法。具体做法是将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。 3．固定： 样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min 让OCT胶浸透组织。取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。 组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。 4.切片： 恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm。切片时，低温室内温度以-15℃～-20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及
远程术中冰冻切片检查与诊断 一.简介及意义 冰冻切片检查与诊断（简称“术中冰冻”）是将手术中切除的病理组织在冰冻切片机中快速制片，经过特殊染色后供病理医师进行病理诊断的一种诊断方法；是临床医师在实施手术过程中，就与手术方案有关的疾病诊断问题请求病理医师快速进行的会诊方式，如果诊断为恶性肿瘤，就可以直接根据结果选择手术方式及范围，从而有效地避免了二次手术及损伤。 二．方法及原理 将手术中切除的病理组织无需固定、直接送检，在冰冻切片机中快速制片，经过特殊染色后供病理医师进行病理诊断，冰冻切片取材后剩余、未曾冷冻的组织（冻剩）均会制备石蜡切片并进行常规病理诊断。 三．应用范围 适用范围 1.需要确定病变性质（如肿瘤或非肿瘤、良性肿瘤或恶性肿瘤等），以决定手术方案时。 2.了解恶性肿瘤的扩散情况，包括肿瘤是否浸润相邻组织、有无区域淋巴结转移等。 3.确定肿瘤部位的手术边缘有无肿瘤组织残留。 4.确认切除的组织，例如甲状旁腺、输卵管、输精管及异位组织等。 不适用范围 1．疑为恶性淋巴瘤者。 2．过小的标本(标本长径≤0.2cm者)和含水分较多的脑组织。 3．术前易于进行常规活检者（例如：肠镜、胃镜、支气管镜、穿刺组织标本等）。 4．脂肪组织、骨组织和钙化组织。 5．需要依据核分裂计数判断良、恶性的软组织肿瘤。 6．主要根据肿瘤生物学行为特征（如浸润、转移）而不能依据组织形态判断良、恶性的肿瘤。 7．已知具有传染性的标本(例如结核病、病毒性肝炎、艾滋病等)。 8．钳夹、烧灼后的标本不能进行冰冻切片。
四、送检流程 1、预约： 1）项目开展时间为全周，工作时间是上午8:30－下午17:00。遇法定假期以具体通知为主。具体安排为：周一、三、五在本院病理科完成，周二、四、六、日送到金域检验中心病理科完成。推荐冰冻尽量安排在周一、三、五来完成。 2）预约方式：需要进行术中冰冻的临床科室需至少提前一天17:00前预约第二天手术。致电给病理科，登记患者姓名和手术时间等信息。 ① ②、电话预约客服中心(4001-111-120)工作时间为周一至周六8:00-21:00、周日8:00-17:30。 2、手术： 送检保存：手术标本送检冰冻时，无需加固定液，不要沾水，过小标本可用拧后的生理盐水湿棉布包裹防止坏死。 3、配送:由专门医护人员直接将手术标本从手术室送至本院病理科，并做好相关登记。 4、标本处理：标本处理依次经过标本接收、取材、冰冻切片、染色及封片等步骤制作成玻片，处理时间在20分钟内。 5、诊断： ①、病理医生上班时：直接阅片作病理诊断，做出诊断报告不超过10分钟。 ②、病理医生休息时：通过数字化远程病理系统将制片扫描上传，由金域检验中心病理室的病理医生（提前预约好）阅片作病理诊断。金域病理中心在收到远程图片后做出诊断报告不超过10分钟。 6、报告：病理医生做出诊断后，即时发送电话报告或传真报告，随后会再发出一份常规石蜡报告，确保结果准确性。
2.1.5 免疫荧光技术检测PTEN 蛋白表达。 2.1.5.1 标本制备 1) 取材：对照组和模型组分别随机选取15 只大鼠于0d、1d、3d、7d、14d时相点进行免疫荧光技术检测，每个时相点3 只， 麻醉后（水合氯醛3.5%，1ml/100 克，腹腔注射)， 先用生理盐水灌注（生理盐水的量不能少于250ml，最好300ml 以上）， 将血液冲净后用4%多聚甲醛灌注，0.1g/mol 磷酸缓冲液配制的4 C 4%多聚甲醛（PH=7.4）约250ml 灌注至肢体僵硬，待充分固定后断头取脑组织，组织厚度约为3~5mm。灌注一定要充分，肝脏变硬呈瓷白色为最佳； 2)固定：4℃4%多聚甲醛固定24h。 3)灌流固定好的脑组织不需后固定可直接脱水； 脱水：用30%蔗糖（4%多聚甲醛配置）固定脱水10~24h，换新液继续脱水，组织沉底后即可包埋； 4)包埋：包埋器（本实验采用奶片盒或大片剂含片盒替代包埋器）内先放入少量OCT，将组织块放入（放组织时动作要慢，轻轻下压，小心组织移位和产生气泡），放好后继续加入OCT 至全部包裹组织为止，将标注的纸条放于包埋块周边，以明确分组及定位大脑的前后切面位置。将包埋好的组织块直接放入-80℃冰箱冷冻，冻好后用锡纸包好-80℃保存备用； 5)切片：切片前先将恒冷箱切片机调至-20℃预冷20min，同时将组织从-80℃冰箱内取出，置于恒冷箱切片机内30min，将组织块用OCT 粘贴在托物台固定，冠状面连续切片，然后进行切片。 6)贴片染色标本切片厚度为15~20um，漂片染色（蛋白表达量低的采用）切片厚度为30~40um。选用多聚赖氨酸预处理的载玻片进行贴片，贴片时玻片应从一侧贴附切片，如果不平可用小毛笔蘸少许纯水轻轻抚平。 7)将贴好的切片置于37℃温箱烤1h，烤干后即可进行染色或装入切片盒密封-80℃保存备用。 2.1.5.2 免疫荧光染色步骤 1) 取出冰冻切片，室温放置30min，PBS 洗10min×3 次； 2) 0.4%Triton-100 浸泡10min（1000ml PBS+4ml Triton-100）； 3) PBS 洗10min×3 次； 4) 抗原修复（高压锅限压阀冒气后计时1.5min，冷水降压，自然冷却）； 5) PBS 洗10min×3 次；用组化笔在距离组织2mm 处划圈； 6) 5%驴血清（与二抗源性相同）封闭1h； 7) 一抗：甩去多余血清，不洗。滴加PBS配置的一抗，4℃过夜。阴性对照用PBS替代一抗； 8) PBS 洗10min×3 次； 9) 二抗：滴加Alexa Fluor488 标记的驴抗羊荧光二抗（均为1：200配置），20~25℃室温避光孵育2h； 10) PBS 洗10min×3 次； 11) Hochest33342 复染核10~20min； 12) PBS 洗10min×3 次； 13)抗荧光衰减封片剂封片，置于避光盒内； 14) Olympus F1000 激光共聚焦显微镜用488nm 波长的激光器激发绿色，计算机进行数据采集和成像。
免疫组化实验步骤 细胞和组织的固定 （一）固定 为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。不同抗原，其稳定性也不相同，因而对固定剂的耐受性差异较大 （二）固定剂 用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。 1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K 链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。 1）4%多聚甲醛为我们常用固定剂 2）Bouin’s液 该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫组化染色。Kayhko认为用于标记B细胞的J链较好，但Bullock则认为它可导致Igg γ重链变性，故必需加大第一抗体的浓度。 2．丙酮及醇类固定剂 系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。 丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4。C低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内5-10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。 以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多，不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记
创作编号： GB8878185555334563BT9125XW 创作者：凤呜大王* 1.做冰冻切片用的固定后样品能在蔗糖溶液放多久？ 问：本人将样品固定过后冲洗过后，放入蔗糖溶液，因有事耽搁，放了一个星期了，不知是否还可切片．还有固定过后冲洗用普通蒸馏水冲洗可以吗？我是做免疫组化答：1、不知道你放置的蔗糖浓度是多少，如果是30%最好是三天之内，50%的浓度可以方久一点，一两个月应该没什么问题。因为蔗糖是高渗环境，不会影响实验结果。祝好运吧！ 2、我认为组织在20％蔗糖放一周还是可以切片的，至于固定后的冲洗，可以免掉，也可用0.01MPBS涮洗一下，蔗糖液的量要多加一些 2、关于冰冻切片的问题(冰冻切片,免疫荧光,蔗糖,脱水) 问：请拟准备做免疫荧光的标本,经前固定灌注后取全脑,后固定4小时后,30%的蔗糖脱水过夜,再用OCT包埋后保存在-80的冰箱,冰冻切片后HE染色,发现整个视野都是大小
不等的圆形洞洞,不知道是什么原因. 答:1、个人认为可能是以下几个方面的问题: 30%的蔗糖脱水过夜---- 一般我所采取的是灌注固定后取脑,然后放入30%蔗糖的多聚甲醛溶液中,待脑下沉到底后(大约2天)再切片,用这样的高渗糖既可以防止冰晶又可以继续后固定.单纯的蔗糖过夜应该是不够 的. 从30%蔗糖的多聚甲醛溶液中捞出脑后应放入液氮迅速冷冻然后进行切片,不建议用-80度冰箱,曾经用过-80度冰箱结果脑片出现许多冰晶孔. 2、用0.01M的PBS配置的4%多聚甲醛灌注固定后，20%蔗糖（沉底）→30%蔗糖（沉底），然后直接进冰冻切片机急冻15~20min，我们实验室的技术员曾说过，脑标本千万不能用OCT包埋、液氮冷冻。只要蔗糖脱水彻底，是不会形成冰晶的；而用OCT包埋、液氮冷冻，你没做过，时间不好把握——时间长了，组织会冻裂；时间不够，冷冻效果不好，切片不好切。 3、这个就是实验室和实验室操作方法有所区别了,我说的方法肯定是没有问题的,我们都是这样操作没有出现过冰晶,不用OCT包埋,但确实用液氮,冻10秒,不会冻裂,效果良好.
有关细胞和组织学技术 一、细胞和组织 免疫组织化学技术是用标记物或显色物标记的抗体检测细胞和组织内的抗原，从而达到诊断和研究疾病的目织标本质量的好坏有着密切的联系。由于各种抗原的生化、物理性质不同，如温度高低、酸碱度强弱及各种化学的细胞和组织学结构将有助于抗原的准确定位。因此，细胞和组织标本的采集制备在免疫组织化学技术中占有十 （一）细胞标本的取材 目前，免疫组化技术已经应用于细胞学诊断，如鉴别低分化癌与恶性淋巴瘤、黑色素瘤、低分化肉瘤等。应用于淋巴白血病和恶性淋巴瘤的分类分型。近年来，培养细胞的免疫组化技术在鉴定细胞的种类、分化程度、研究均起到了积极作用。 细胞标本的取材有以下3种方法: 1．印片法主要应用于活组织检查标本和手术切除标本。新鲜标本以最大面积剖开，充分暴露病变区，玻片上，立即浸入细胞固定液内5-10min，取出后自然干燥，低温保存备用。 优点是简便省时，细胞抗原保存较好。缺点是细胞分布不均匀，玻片上细胞重叠，影响标记效果。 2．穿刺吸取涂片法主要应用于实质器官的病变区，如肝、肾、肺、淋巴结、软组织等。用细针穿刺吸抹在载玻片上，力求细胞分布均匀。如穿刺液较多，细胞丰富，可用洗涤法：将穿刺液滴入盛有1-2ml Hanks液（低速离心5-10min后，弃上清液，将沉淀制成细胞悬液（浓度约2×106细胞/ml），吸取1滴于载玻片上，轻轻涂 该法穿刺吸取直接涂片的优点是操作简便，细胞形态保持较好。缺点是细胞分布不均匀。洗涂法片虽可弥补 3．体液沉淀涂片法主要用于胸水、腹水、尿液、脑脊液等体液多、细胞少的标本。体液采取后，必须量的多少选用不同的处理方法：①细胞数量极多者，可吸取少量液体直接涂在玻片上。②细胞数量较少者，可将液体自离心10min，弃上清液，将沉淀涂片，略干后固定备用。 如用细胞离心涂片器(Cytospin )，可将标本用上述离心沉淀法制成2×106细胞/ml的细胞悬液，吸取50μl加入细胞分布在直径约6mm的小圆圈内，每个圆圈内的细胞数约105个(Danos,1976)。 培养细胞标本的取材可根据培养的细胞特性分别采取不同的方法。某些细胞有贴壁生长的特性，如纤维母细入培养液内即可收集到理想的细胞标本。某些细胞只能在培养液中生长，可用上述体液沉淀离心涂片法处理。 制备细胞涂片应注意：①标本反复离心洗涤，细胞的粘附性降低，在免疫组化染色过程中容易脱片，因此，试剂和便于镜下观察和记数，应将细胞集中到直径0.6-1.0cm的圆圈内，细胞总数以105个为宜。③粘液丰富的标宜作免疫组化标记。 （二）组织标本的取材 组织标本主要取之于活组织检查标本、手术切除标本、动物模型标本以及尸体解剖标本等。前三者均为新鲜
术中快速冰冻诊断 1、什么叫“冰冻切片”？ 冷冻切片是利用物理降温的方法将新鲜的组织标本冷冻使其产生一定的硬度进行切片的技术方法。与石蜡切片相比，由于冷冻切片不需脱水包埋因此制片速度快，是为手术进行中的临床医师提供病理诊断的良好方法。冷冻切片的不足是组织细胞的形态略逊于石蜡切片。冷冻切片目前最广泛应用于临床手术中的病理诊断，手术医生根据病理诊断结果决定手术范围。 2、什么叫“术中快速冰冻切片病理诊断（快速活检）”？ 手术中快速活体组织病理学检查是临床医师在实施手术过程中，就与手术方案有关的疾病诊断问题请求病理医师快速进行的急会诊，它是一种高技术、高难度、高风险的项目，是临床病理实践中最重要、最难的一项工作。快速活检要求病理医师在很短时间内，根据对切除标本的巨检和组织块快速冷冻切片（或快速石蜡切片）的观察，向手术医师提供的参考性病理诊断意见。与常规石蜡切片的病理诊断相比，快速活检会诊具有更多的局限性和误诊的可能性。有的病例难以快速诊断，需要等待常规石蜡切片进一步明确诊断。因此，应向临床医师说明快速活检的：①局限性、②适用范围、③慎用范围和④不宜应用范围。 3、“快速活检”的适用范围： ①需要确定病变性质（如肿瘤或非肿瘤／良性肿瘤或恶性肿瘤等），以决定手术方案的标本。 ②了解恶性肿瘤的扩散情况，包括肿瘤是否浸润相邻组织、有无区域淋巴结转移等。 ③确定肿瘤部位的手术切缘有无肿瘤组织残留。 ④确认切除的组织，例如甲状旁腺、输卵管、输精管及异位组织等。 4、“快速活检”的慎用范围： 涉及截肢和其他会严重致残的根治性手术切除的标本。需要此类手术治疗的患者，其病变性质宜于手术前通过常规活检确定。 5、“快速活检”的不宜应用范围： ①疑为恶性淋巴瘤。 ②过小的标本（检材长径≤0.2cm者）。 ③术前易于进行常规活检者。 ④脂肪组织、骨组织和钙化组织。 ⑤需要依据核分裂象计数判断良、恶性的软组织肿瘤。 ⑥主要根据肿瘤生物学行为特征而不能依据组织形态判断良、恶性的肿瘤。 ⑦已知具有传染性的标本（例如结核病、病毒性肝炎、艾滋病等）。