?综
述?
野生型ｐ５３诱导基因１研究进展’
邹瀛波８综述，郭伟，蒋耀光△审校
（第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军胸外科中心，重庆４０００４２）
关键词：野生型ｐ５３诱导基因１；ｐ５３；凋亡；肿瘤
中图分类号：Ｒ７３０．２；Ｒ７３０．５４
文献标识码：Ａ
文章编号：１６７１－８３４８（２０１０）０５－０５３８—０３
ｐ５３基冈是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因。过去２０多年来，人们对ｐ５３基因的认识经历了癌蛋白抗原，癌基
因到抑癌基因的３个认识转变，现已认识到，引起肿瘤形成或细胞转化的突变型ｐ５３蛋白是野生型ｐ５３基因突变的产物。是一种肿瘤促进冈子。它可以抑制正常ｐ５３蛋白的功能。而野生
型ｐ５３基冈是一种抑癌基因，它的失活对肿瘤形成起重要作
用‘“。
目前研究已经证实，ｐ５３可以诱导多种基因的表达，然而到目前为止，研究者尚未发现仅影响ｐ５３依赖凋亡途径的单一基因。在野生璎ｐ５３诱导基因ｌ（ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ
ｐ５３－ｉｎｄｕｃｅｄ
ｇｅｎｅ
１，
ｗＩＧｌ）被发现之前。研究者猜测ｐ５３诱导的凋亡可能与一种还
未被命名的ｐ５３相关基因的表达有关，同样。ｐ５３在诸如分化和发育过程中的功能可能依赖于这一特殊基因的调节。之后的研究结果表明ＷＩＧ－１有町能是影响ｐ５３依赖凋亡途径的调节基因【２］。因此，对于ＷＩＧ－１基因的进一步研究。将有可能为阐明
ｐ５３诱导生理途径的分子机制提供有益的思路和见解。
１
ＷＩＧ－１的发现
１９９５年，Ｌｅｏｎｅ等［３］通过对Ｊ３Ｄ小鼠Ｔ淋巴瘤细胞周期
和凋亡进行研究后发现，在温度敏感的结构中表达的野生型
ｐ５３（温度敏感ｐ５３基因）能够诱导ｐ５３阴性的Ｊ３Ｄ小鼠Ｔ淋
巴瘤细胞出现Ｇ．期停滞和细胞凋亡。ｐ５３通过一段特殊序列
与ＤＮＡ结合，并激活带有特殊ｐ５３ＤＮＡ基因的转录子，这种
特殊的ｐ５３ＤＮＡ和它们的启动子结合在一起。ｐ５３的这种由
特殊序列激活的功能对于ｐ５３介导的体外生长抑制作用是至
关重要的ｎ］。这些发现表明。特殊的ＤＮＡ结合序列及其活性
对于ｐ５３的肿瘤抑制起到了决定性作用。对结果进行进一步
分析后发现ｒ一个新的ｐ５３诱导的基因——ｗＩｐｌ．其７．６
ｋｂ
的和２．２ｋｂ的转录子在温度敏感的ｐ５３转染的Ｊ３Ｄ细胞中的
表达是Ｅ调的。细胞经７射线照射后过表达的ＮＩＨ３Ｔ３和ｐ２１町以诱导ＷＩＧ－１的转录。全身７射线照射町以诱导鼠的
脑、睾丸、肾、脾和肺组织ＷｌＧ－１表达水平上调。而在未接受ｙ
射线照射的脑，睾丸和肾组织中也町检测到ＷＩＧ－Ｉ的基础表达［４］。进一步的研究表明．ＷＩＧ－１是一种由ｐ５３基阑诱导表达的锌指蛋白。在其分子中含有３个锌指结构，ＷＩＧ－１蛋白中的３个锌指结构能够与特定蛋白、ＲＮＡ及ＤＮＡ结合。人类ＷＩＧ－１与包括小干扰ＲＮＡ和ｍｉｃｒｏＲＮＡ在内的不同类型的双链ＲＮＡ结合后．能够发挥抑制细胞牛长的作用¨Ｊ。
另外，有研究者发现。用阿霉索等抗肿瘤药物处理携带野
生型ｐ５３基因的Ｂ淋巴细胞，在ｐ５３过表达的同时可以检测到
ＷＩＧ－１的表达水平上调［“。结果进一步表明ＷＩＧ－１的表达可
以由ｐ５３诱导，因此，ＷＩＧ－１是一个ｐ５３诱导基因。
目前已发现的ＷＩＧ－１同源体有：啮齿类动物细胞中的
ＰＡＧ６０８（ｐ５３一ａｃｔｉｖａｔｅｄ
ｇｅｎｅ
６０８，ｐ５３激活基因６０８）和哺乳动
物细胞中的ＺＭＡＴ－３（ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒ，ｍａｔｒｉｎｔｙｐｅ
３，锌指基质蛋白
３）。ＰＡＧ６０８在啃齿类动物所有组织中都町以检测到其表达，而在胰腺、脑和肺组织中的表达水平最高¨Ｊ。
２
ＷｌＧ－１的结构与定位
ＷＩＧ－１定位于细胞核，编码包含３个Ｃｙｓ２ｈｉｓ２型锌指的锌指蛋白，ＷＩＧ－１的锌指是由５６～７５个氨基酸连接而成的，定
位于人类３号染色体长臂的２６．３区（３ｑ２６．３），见图１
Ｌ８Ｊ。
图１
ＷＩＧ－１定位图
ＷＩＧ－１在转录水平的选择性拼接可以产生两种转录变异体（转录变异体１及转录变异体２），两种变异体序列中仅仅有一个氨基酸不同。相对于转录变异体ｌ，转录变异体２在５’端
的非编码区缺少一个片段，在编码区存在一个替代剪接位点，
其开放读码框没有ＧＣＡ密码子，编码序列含有２８８个氨基酸。ＷＩＧ－１在生物进化过程中高度保守，其锌指蛋白氨基酸序列及结构在人类与鱼类中几乎完全一致［９］。这些锌指区域类似
于早先发现的双链ＲＮＡ结合蛋白，ｄｓＲＢＰ－ＺＦａ和ＪＡＺ。小鼠
Ｗ１Ｇ－１与ＪＡＺ和ｄｓＲＢＰ－ＺＦａ一样是一个核蛋白，与其具有结构相似性。这种Ｃｙｓ２ｈｉｓ２型锌指蛋白代表了一大类具有识别特殊ＤＮＡ序列的蛋白。然『『｜ｉ，这种蛋白也与单链ＲＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡ杂合体，ｄｓＤＮＡ（双链ＤＮＡ）和其他蛋白相互作用。同ＪＡＺ一样，ＷＩＧ－】也定位于核内，这与小鼠ｗｌＧ－１蛋白和已观察到的人与大鼠ＷＩＧ－１蛋白在核内与核仁内的定位是一致
的。由于ＷＩＧ－１与ｄｓＲＮＡ（双链ＲＮＡ）而不是ｓｓＲＮＡ（单链
ＲＮＡ）相作用，所以ＷＩＧ－１代表了一类与以往发现所不同的
ｐ５３诱导基因【ｌ…。
３ＷＩＧ－１的功能
３．１
与ｄｓＲＮＡ的结合活性目前研究己经证实小鼠ＷＩＧ－１
通过其第１个锌指区域与ｄｓＲＮＡ相结合。异常表达ＦＩ。ＡＧ标记的鼠ＷＩＧ－１蛋白定位于细胞核，在某些细胞中定位于核仁，而ＧＦＰ标记的鼠ＷＩＧ－Ｉ则主要定位于核仁，ＷＩＧ－１优先与ｄｓＲＮＡ结合，而不是ｓｓＲＮＡ或者ｄｓＤＮＡ，ＷＩＧ－１的第１个锌指区域对于ｄｓＲＮＡ结合功能至关重要，而锌指２和３则不是必需的。在哺乳动物细胞中表达的ＷＩＧ－１蛋白显示出与ｄｓＲＮＡ的高度亲和性，而在所有ｐ５３诱导表达的基因中，类似
＊
基金项目：国家自然科学基金资助项目（３０８０１１３７）。
。
第三军医大学大坪医院野战外科研究所全军胸外科中心在读博士研究生?联
系电话：１５１２３００９６１７ｉＥ－ｍａｉｌ：ｚｙｂｍｅｎ（国１６３．ｃｏｒｎ．
△通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｙａｏｇｕａｎｇｊｉａｎｇｃｑ（园ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｒｎ．
挚
一
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万方数据
ＷＩＧ－Ｉ的ｄｓＲＮＡ结合活性是首次发现。这表明ｗＩＧｌ与ＪＡＺ和ｄｓＲＢＰ－ＺＦａ等ｄｓＲＮＡ结合蛋白具有结构相似性，也进一步提示ｄｓＲＮＡ结合在ｐ５３依赖的生理反应中可能具有重要作用Ⅲ］。
ＷＩＧ－Ｉ由野生型ｐ５３诱导七调表达。是ｐ５３介导的转录活化的一个直接靶点。已有研究证实其是一个由ｐ５３直接转录的基因，并且是一个善意的目的基因，ＷＩＧｌ的３个锌指区域包含在其第２、第４外显子核苷酸序列中，其与ｐ５３结合的同一序列相关。其中的２个锌指区域ＢＭ２和ＢＭ３，与重组ｐ５３共同形成ＤＮＡ蛋白杂合体【ｌ“。
ＷＩＧ－１的第１个锌指区域对于在体外或活体细胞中结合ｄｓＲＮＡ至关重要。野生型ＷＩＧ－１和ＺＦｌ、ＺＦ２点突变型ＷＩＧ－１都具有抑制细胞克隆形成能力的作用。证明这两个ＺＦ突变对ＷｌＧ－Ｉ抑制细胞增殖功能未造成重要的影响，但进一步的研究发现突变型ＷＩＧ－１的复制效率要低于野生型Ⅵ兀Ｇ１［１“。
有研究发现，人类ＷＩＧ－１也结合ｄｓＲＮＡ，ＷＩＧ－Ｉ与活细胞中内生ｄｓＲＮＡ的互相作用表明这种相互作用是与生理性相关的，但是它的确切机制和作用目前仍不清楚。ＷＩＧ－１通过其Ｎ末端的锌指区域与５０～１００ｂｐ长的ｄｓＲＮＡ结合，ＷＩＧ－１结合的２１ｂｐ的ｄｓＲＮＡ与ｓｉＲＮＡ具有结构相似性。这些结构相似性，包括它们独特的锌指分布规律，表明它们的功能是相近的Ｉｓ］。
３．２抑制细胞增殖ＷＩＧ－１分子中锌指区域的发现，提示其可能是一种核苷酸结合蛋白，但目前对其在ｐ５３依赖的生理反应中所起的作用和机制仍知之甚少。小鼠与大鼠ＰＡＧ６０８和人的ＷＩＧ－Ｉ蛋白具有高度同源性，分别有９７．９％和８７％的氨基酸序列相同［１“。当大鼠ＰＡＧ６０８在人类肿瘤细胞中过表达时，有较弱的促进凋亡活性。这也提示ＷＩＧ－Ｉ町能具有启动细胞凋亡的功能。Ｉｓｓｅｉ等［１４３进行的克隆实验结果表明，人ＷＩＧ－１能够显著抑制食管鳞癌细胞增殖，其抑制率可达２５％～３０％。
有研究者认为ＷＩＧ－１可能与ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）调节的细胞生长和生存有关，并且具有启动ｐ５３诱导的细胞生长停滞和（或）诱导凋亡的作用，ＷＩＧ－１与特殊的ｍｉＲＮＡ相结合能够增加由ｍｉＲＮＡ和它的ｍＲＮＡ形成的有缺陷的小二重区域的稳定性‘“】。
在Ｗ１Ｇ－Ｉ启动子中，几个ｐ５３结合序列的存在反映了由ｐ５３和其家族成员ｐ６３、ｐ７３介导的是一个相当复杂的转录调，－节过程。ｐ６３、ｐ７３和ｐ５３一样，能够结合相同的序列并上调目前已知的几种ｐ５３目的基闪。ｐ５３以ＳＰｌ或ＳＰｌ相关蛋白作为一个共同因子，目的是达到ｐ２１和Ｂａｘ启动子的最大活化。在ＷｌＣｒ－Ｉ启动子中富含ＧＣ的区域也可以提供ＳＰＩ结合位点［１“，这与ｐ５３作用是非常类似的，但ＷＩＧ－１是否能与ｐ６３及ｐ７３相结合进而发挥其功能尚有待进一步研究。
ＷＩＧ－１的ｍＲＮＡ在脑与睾丸组织中表达水平相似，而在肺、肾、脾脏经过全身７射线照射后表达上调。其中原因有可能是７射线照射能够激活上述组织中ｐ５３的表达。ＷＩＧ－Ｉ启动子有两个功能性的ｐ５３结合位点，使ＷＩＧ－Ｉ可能具有ｐ５３依赖性转录调控功能．这也证明了ＷＩＧ－１是一种善意的ｐ５３目的基因Ｌ１２］。ＷＩＧ－１与核糖体ＲＮＡ相结合能干扰核糖体的合成。从而导致蛋白复制的抑制以及生长抑制。并最终导致细胞死亡，因此町能起到抑制肿瘤细胞增殖的作用【Ｉ“。
４Ｃｙｓ２ｂｉｓ２型锌指蛋白的功能
锌指蛋白是指含有通过结合Ｚｎ２＋稳定的短的可以自我折叠形成“手指”结构的一类蛋白质，由于其自身的结构特点，可以选择性地结合特异的靶结构，使锌指蛋白在基因的表达调控、细胞分化、胚胎发育等生命过程中发挥重要作用。
根据锌指结构序列和功能的不同将其分为９大类，ＴＦⅢＡ锌指（Ｃｙｓ２ｈｉｓ２），类固醇一甲状腺素受体（Ｃｙｓ８），ＧＡＬ４锌指（Ｃｙｓ６）。环状锌指（Ｃｙｓ３ＨｉｓＣｙｓ４），逆转录病毒粒子（Ｃｙｓ２ｈｉｓＣｙｓ），Ｉ。ＩＭ锌指（Ｃｙｓ２ｈｉｓＣｙｓ５），ＧＡＴＡ一１锌指（Ｃｙｓ４），Ｎｕｐ４７５锌指（Ｃｙｓ３Ｈｉｓ），ｒｅｑｕｉｕｍ锌指（Ｃｙｓ４ＨｉｓＣｙｓ３）。根据锌指蛋白保守结构域的差异，又可以将其分为Ｃ２ｈ２型（Ｋｒｔｉｐｐｅｌ相关型）、Ｃ４型和Ｃ６型等３个类群。根据锌指的空间结构来综合分类，认为每一种锌指都可以在８组不同的折叠群中找到相应的归类，其分类为：类Ｃ２ｈ２锌指，高音谱号锌指、钢卷尺状锌指、箝口膨出状锌指、类Ｚｎ２ＰＣｙｓ６锌指、类ＴＡＺ２锌指、锌结合短环锌指、金属硫蛋白锌指【１”。
Ｃｙｓ２ｈｉｓ２型锌指蛋白的功能主要为两个方面：调控基因转录（即与核酸的相互作用）以及锌指蛋白之间的相互作用。Ｃｙｓ２ｈｉｓ２型锌指蛋白能特异性地识别ＤＮＡ，主要是由于其ＤＮＡ结合域具有与ＤＮＡ双螺旋互补的特殊表面结构，依靠其指型空『日Ｊ结构伸入到ＤＮＡ双螺旋的大沟内，通过ａ螺旋与ＤＮＡ碱基发生特异性接触【ｌ“。另外，Ｃｙｓ２ｈｉｓ２型锌指不仅能与ＤＮＡ发生相瓦作用，也可以识别ＲＮＡ，如ＴＦⅢＡ既可以与５ｓｒＤＮＡ结合，也可以与该基因的转录产物５ＳｒＲＮＡ结合形成７ＳＲＮＰ复合物【ｌ“。Ｃｙｓ２ｈｉｓ２型锌指蛋白还能与ＤＮＡ－ＲＮＡ杂交双链分子的特异性结合。转录激活因子ＳＰｌ与ＷＩＧｌ一样同属Ｃｙｓ２ｈｉｓ２型锌指蛋白，ＳＰｌ主要通过调控富含ＧＣ启动子的基因表达，参与调节细胞功能，如细胞增生、凋亡、分化和肿瘤形成。近年来的研究表明锌指之间可以互相作用。锌指与锌指或锌指蛋白与锌指蛋白通过相互作用，能够识别更多不同的ＤＮＡ或阻止锌指同ＤＮＡ结合，进一步发挥调控基闪转录的作用［１“。
５小结与展望
以往研究证实，３ｑ２５～２７区在包括肺鳞状细胞癌、头颈部鳞癌、宫颈癌，卵巢癌以及前列腺癌等多种人类恶性肿瘤中均存在异常扩增【５Ｊ，众多研究者相信在该区域极有呵能筛选到可用于肿瘤基因诊断和治疗的候选分子。ｗｌｐｌ基因由于具有对细胞生长周期和凋亡的调控作用，加之其定位在３ｑ２５～２７区。使得研究者相信ＷＩＧ－１有可能是潜在的候选肿瘤标志劬和基因治疗靶点。由于研究时间尚短。ＷＩＧ－１在恶性肿瘤发生发展中所起的作用及其分子机制还有待进一步研究。随着对ＷＩＧ－Ｉ功能及其机制了解的不断深入，有望为ｐ５３介导的肿瘤抑制途径研究领域带来新的观点和突破。
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（收稿日期：２００９—０８—１０修回日期：２００９－０９－１０）
肿瘤干细胞耐药机制及对策
孙芬芬综述，叶小群△８审校
（南昌大学第二附属医院呼吸科，江西南昌３３０００６）
关键词：肿瘤干细胞；耐药机制；对策
中图分类号：Ｒ７３０．５３文献标识码：Ａ文章编号：１６７１—８３４８（２０１０）０５一０５４０一０３
肿瘤治疗的障碍之一是出现多药耐药（ｍｕｈｉｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔ—ａｎｃｅ，ＭＤＲ），多数化疗方案可以消灭大部分肿瘤细胞但始终缺乏从根本上铲除肿瘤的方法。对肿瘤多药耐药发生机制的研究和寻找开发逆转耐药的药物是当前肿瘤化疗研究的重要课题。近年来，科学家陆续从实验中找到并分离出肿瘤干细胞而提出“肿瘤干细胞假说”，这一假说为肿瘤治疗开拓了新思路。随着对肿瘤干细胞（ｃａｎｃｅｒｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＣＳＣｓ）研究＿的深入，发现ＣＳＣｓ和正常干细胞有很多相似之处，如同样具有自我更新和分裂增殖能力、耐药、ＤＮＡ修复活性和抗凋亡等。其耐药性帮助ＣＳＣｓ抵抗化疗药物的毒性作用，从而为肿瘤增殖和复发留下“种子”。本文就ＣＳＣｓ及其耐药机制相关研究进行综述。
１ＣＳＣｓ的概念
ＣＳＣｓ的概念由１．ａｐｉｄｏｔ等在１９９４年首次提出，认为在瘤体内存在类似于干细胞功能的一类细胞群体．将这类具有形成肿瘤能力的细胞群体称为ＣＳＣｓ。Ｂｏｎｎｅｔ等首先分离出类似正常干细胞的白血病干细胞。体外培养和动物实验证明其具有成瘤能力。实体瘤干细胞的分离最早是２００３年Ａ１一Ｈａｊｊ等从乳腺癌细胞中分离鉴定出具有干细胞类似生物学特性的细胞群体。采用类似的研究方法，其他实体瘤ＣＳＣｓ也被陆续分离出来。
通过对多药耐药的长期研究。研究人员已经找到了一群与肿瘤多药耐药相关的蛋白，其中ＡＢＣ转运蛋白被发现与ＣＳＣｓ密切相关。人类多药耐药基因１（ＭＤＲｌ基因）编码Ｐ－糖蛋白（Ｐ－ｇｐ／ＡＢＣＢｌ）。其作用是作为各种抗癌药物外排泵。最近研究表明雌激素能下调乳腺癌耐药蛋白（ＢＣＲＰ／ＡＢＣＧ２）的表达和多药耐药基因转导Ｐ－ｇｐ的表达水平。因此调节Ｐ－ｇｐ的表达水平在乳腺癌的治疗中可能是一种有效的策略ｎ］。深入理解多药耐药的分子基础和开发临床试剂及治疗策略是防止耐药性发生的关键［２】。
。第三军医大学新桥医院呼吸科在读博士生。△通讯作者，电话：（０７９１）６３００５０７；Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｘｑ－ｌｉ＠ｔｏｍ．ｔｏｍ．万方数据
p53基因的30年 在人类基因组所包含的数万条基因中，它是研究的最为透彻的一个。在已经进入临床试验的抗肿瘤基因治疗药物中，超过40个都选择了以它为靶点。在美国国立生物医学信息中心的生物医学文献数据库（pubmed）中，有关它的研究文献已经超过了50000篇，而且这一数字仍在稳定的增长。没错，它就是p53基因，时至今日，对这一基因的研究已经走过了30年的坎坷历程。 十年蹉跎两茫茫 1979年，英国癌症研究基金会、美国普林斯顿大学的研究者Lionel Crawford，David P. Lane等人首次追踪到了p53基因的踪迹。这些研究者或许没有料到，他们的发现开启了现代肿瘤研究与治疗的新时代。 不久以后，俄罗斯科学家 Peter Chumakov从小鼠体内克隆到了这个基因你的完整版本。因为这一基因在细胞中翻译后产生的蛋白质（protein）的分子量为53千道尔顿，故而被命名为p53。 不过，在发现伊始，p53基因并未受到重视，甚至在最初的10年中，p53一直被视为能够诱发肿瘤产生的癌基因。导致这样南辕北辙认识的症结在于科学家在研究时并未找对p53基因的正确版本。众所周知，一条基因由一系列脱氧核糖核酸按照相应的顺序彼此串联而成，如果其中的某个或某些核苷酸发生改变就意味着这条基因发生了突变，而起初研究者拿到的基因就是p53的突变版本，按照这一版本翻译成的蛋白质自然就无法行使正常p53基因的功能。 蹉跎十年之后，美国约翰霍普金斯医学院的分子生物学家Bert Vogelstein最终找到了正确的p53基因，即野生型p53。不但如此，科学家的发现还为这一基因摘掉了癌基因的恶名：与此前认识恰恰相反的是，p53是一个在人体内发挥广泛作用的强有力的抑癌基因。 新桃换旧符 藉由p53真正功能的重新认识，科学家发现了一系列与肿瘤相关的基因。对这些基因的深入挖掘不但让人们对癌症的本质有了更新的了解，而且还为肿瘤的基因治疗奠定了基础。现在科学家已经公认，癌症发生的肇因是由于细胞增殖与凋亡、细胞的分化与抑制、免疫与逃避免疫、血管的生成与抑制以及转移与抑制转移之间的精细平衡被打破的缘故。这些平衡归根结底是癌基因与抑癌基因间的平衡。 然而，平衡的打破并非一蹴而就，因此癌症的发生发展是一个持续时间很长的过程。根据现有的统计数据，大约在50%以上的癌症中都发现有p53基因的突变，如果将癌症的发作比作一列倾倒中的多米诺骨牌，那么p53基因很有可能位居这列骨牌的前列。 在人体这个迄今为止最为复杂的系统中，倘若一个细胞想要改变其现有状态（如从静止到生长分化状态的改变），必须接收到一系列相关指令后，这一过程才能进行。在这其中，p53就扮演了“分子警察”的作用——通过对细胞周期的调控来控制细胞的增殖生长。
P53基因 人體抑癌基因。該基因編碼一種分子量為53kDa的蛋白質，命名為P53。p53基因的失活對腫瘤形成起重要作用。但是事物必然有它的兩個方面，p53是一個重要的抗癌基因使癌細胞自殺，防止癌變；還具有幫助細胞基因修復缺陷的功能。 這種功能對於受化療藥物作用而受傷的癌細胞，則起修復作用，而不是使癌細胞自殺。造成被修復的癌細胞在治療後成為新的腫瘤。 編碼53kDa的蛋白質 類型人體抑癌基因 功能防止癌變，修復缺陷 基因種類腫瘤抑制 1簡介編輯 p53是一種腫瘤抑制基因（tumor suppressor gene）。在所有惡性腫瘤中，50%以上會出現該基因的突變。由這種基因編碼的蛋白質（protein）是一種轉錄因數（transcriptional factor），其控制著細胞週期的啟動。許多有關細胞健康的信號向p53蛋白發送。關於是否開始細胞分裂就由這個蛋白決定。如果這個細胞受損，又不能得到修復，則p53蛋白將參與啟動過程，使這個細胞在細胞凋亡（apoptosis）中死去。有p53缺陷的細胞沒有這種控制，甚至在不利條件下繼續分裂。像所有其它腫瘤抑制因數一樣，p53基因在正常情況下對細胞分裂起著減慢或監視的作用。細胞中抑制癌變的基因“p53”會判斷DNA變異的程度，如果變異較小，這種基因就促使細胞自我修復，若DNA變異較大，“p53”就誘導細胞凋亡。 p53是重要的腫瘤抑制基因，自從該基因在1979年被首次報導以來，有關研究論文在Medline上可查到20000餘篇。人們最初認為p53基因是一種癌基因，但隨著近十年研究的深入，p53作為抑癌基因的功能逐漸被揭示出來。在人類50%以上的腫瘤組織中均發現了p53基因的突變，這是腫瘤中最常見的遺傳學改變，說明該基因的改變很可能是人類腫瘤產生的主要發病因素。 p53基因突變後，由於其空間構象發生改變，失去了對細胞生長、凋亡和DNA 修復的調控作用，p53基因由抑癌基因轉變為癌基因。 p53介導的細胞信號轉導途徑在調節細胞正常生命活動中起重要作用，它與細胞內其它信號轉導通路間的聯繫十分複雜，其中p53參與調控的基因已超過160種，因此，Levine 等學者提出了p53基因網路的概念： 他們認為不能孤立地觀察各個基因的生物學功能，而應該將它們組合起來看待。 p53蛋白主要分佈於細胞核漿，能與DNA特異結合，其活性受磷酸化、乙醯化、甲基化、泛素化等翻譯後修飾調控。正常p53的生物功能好似“基因組衛士（guardian of the genome）”，在G1期檢查DNA損傷點，監視基因組的完整性。如有損傷，p53蛋白阻止DNA複製，以提供足夠的時間使損傷DNA修復；
DNA测序技术的发展及其最新进展 摘要：自从诺贝尔奖得主桑格于1977年发明了第一代DN测序技术以来，DNA测序技术已经作为重要的实验技术广泛的应用于现代生物学研究当中。经过了几十年的发展，DNA测序技术日臻成熟，并且以单分子测序为特点的第三代测序技术也已经诞生。本文主要就每一代测序技术原理和特点及其最新进展做简要介绍。 关键词：DNA测序技术；第三代DNA测序技术；最新进展 The Development and New Progress of DNA Sequencing Technology Abstract: Since Nobel Prize Winner Sanger have founded the first generation of DNA Sequence technology in 1977, DNA sequencing technology has been widely used in modern biological researches as an important experimental. Over decades of year’s development, DNA sequence technology mature gradually and the third generation sequencing technologies characterized by single-molecule sequencing have also emerged. The mechanisms and features of each generation of sequencing technology and their latest progress will be discussed here. Key Words: DNA Sequence technology ; third generation DNA sequencing ;latest development 1.引言 DNA测序技术是分子生物学研究中最常用的技术,它的出现极大地推动了生物学的发展。自从1953年Watson和Crick发现DNA双螺旋结构后[1]，人类就开始了对DNA序列的探索，在世界各地掀起了DNA测序技术的热潮。1977年Maxam和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法[2]。同一时期,Sanger发明了双脱氧链终止法[3]。20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序的时代。这些技术统称为第一代DNA测序技术。最近几年发展起来的第二代DNA测序技术则使得DNA测序进入了高通量、低成本的时代。目前,基于单分子读取技术的第三代测序技术已经出现,该技术测定DNA序列更快,并有望进一步降低测序成本,推进相关领域生物学研究。本文主要介绍DNA测序技术的发展历史及不同发展阶段各种主要测序技术的特点，并针对目前新一代DNA测序技术及目前国际DNA测序最新进展做简要综述。
生物芯片研究进展 摘要 生物芯片是切采用生物技术制备或应用于生物技术的微处理器是便携式生物化学分析器的核心技术。通过对微加工获得的微米结构作生物化学处理能使成千上万个与生命相关的信息集成在一块厘米见方的芯片上。生物芯片发展的最终目标是将从样品制备、化学反应到检测的整个生化分析过程集成化以获得所谓的微型全分析系统或称缩微芯片实验室。生物芯片技术的出现将会给生命科学、医学、化学、新药开发、生物武器战争、司法鉴定、食品和环境卫生监督等领域带来一场革命。本文主要阐述了生物芯片技术种类和应用方面的近期研究进展。 关键词 生物芯片，疾病诊断，研究运用，基因表达 基因芯片的种类 基因芯片产生的基础则是分子生物学、微电子技术、高分子化学合成技术、激光技术和计算机科学的发展及其有机结合。根据基因芯片制造过程中主要技术的区别，下面主要介绍四类基因芯片。 一、光引导原位合成技术生产寡聚核苷酸微阵列 开发并掌握这一技术的是Affymetrix公司，Affymetrix采用了照相平板印刷技术技术结合光引导原位寡聚核苷酸合成技术制作DNA芯片，生产过程同电子芯片的生产过程十分相似。采用这种技术生产的基因芯片可以达到1×106/cm2的微探针排列密度，能够在一片1厘米多见方的片基上排列几百万个寡聚核苷酸探针。 原位合成法主要为光引导聚合技术（Light-directed synthesis），它不仅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。光引导聚合技术是照相平板印刷技术（photolithography）与传统的核酸、多肽固相合成技术相结合的产物。半导体技术中曾使用照相平板技术法在半导体硅片上制作微型电子线路。固相合成技术是当前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法，技术成熟且已实现自动化。二者的结合为合成高密度核酸探针及短肽列阵提供了一条快捷的途径。 Affymetrix公司已有诊断用基因芯片成品上市，根据用途可以分为三大类，分别为基因表达芯片、基因多态性分析芯片和疾病诊断芯片，基因表达分析芯片和基因多态性分析芯片主要用于研究机构和生物制药公司，可以用来寻找新基因、基因测序、疾病基因研究、基因制药研究、新药筛选等许多领域，Affymetrix公司主要生产通用寡聚核苷酸芯片；疾病诊断芯片则主要用于医学临床诊断，包括各种遗传病和肿瘤等，目前Affymetrix公司生产
P53基因概述及应用实例 姓名;赵飞 1.P53基因概述 1.1 P53基因的发现 1979年，在大家都在研究SV40病毒的癌蛋白时，好几个科研小组都无意中分别独立发现了P53蛋白。当时在伦敦癌症研究所(London Research Institute)工作的David Lane和Lionel Crawford发现，用感染了SV40病毒的动物血清与SV40大T抗原发生免疫沉淀反应时能共沉淀下来一个分子量约为53kDa的宿主细胞蛋白。另外三个科研小组也都在1979年同时发表文章报道了同样的结论，他们分别是法国的Pierre May科研小组、美国纽约的Robert Carroll科研小组和英国的Alan Smith科研小组。 1.2P53基因的命名 在这个基因在发现之初，每一个发现它的实验室分别给这种分子量为53 kDa的蛋白质取了各自的名字，并且使用这些名字发表了很多论文，这样就造成极大的混乱。它的真正命名是在1983年在英国牛津举办的第一届国际P53蛋白研讨会上，来自各国的代表专门就这个蛋白的命名进行了讨论。经过一番激烈争论之后，大家一致认为，P53这个名字最为合适，自此被保留下来一直沿用至今。其实P53这个名字根本就不是一个名字，只是因为这个蛋白在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试验中表现出的分子量大约为53 kDa才因此而得名。后来大家才发现，这个表观分子量其实也只是一个大概的估计，因为该蛋白富含脯氨酸，所以在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试验中的迁移率偏慢，表现出来的分子量要比它实际的分子量大。该蛋白的实际分子量只有43.7 kDa，而小鼠体内P53蛋白的分子量会更小。 1.3P53 基因的功能 P53基因是因编码一种分子质量为53 kDa 的蛋白质而得名，是一种抗癌基因。其表达产物为基因调节蛋白( P53 蛋白) ，当DNA 受到损伤时表达产物急剧增加，可抑制细胞周期进一步运转。一旦P53 基因发生突变，P53 蛋白失活，细胞分裂失去节制，发生癌变，人类癌症中约有一半是由于该基因发生突变失活。因此说这个基因具有两面性。 1.4 P53基因三十年的发展史 最初10年里，P53一直被视为能够诱发肿瘤产生的癌基因。1979年，英国癌症研究基金会、美国普林斯顿大学的研究者Lionel·Crawford，David·P.·Lane等人首次追踪到了P53基因的踪迹，不久以后，俄罗斯科学家Petet·Chumakov从小鼠体内克隆到了这个基因的完整版本。但此时P53基因并未受到重视，甚至在最初的几年中，一直被视为能够诱发肿瘤产生的癌基因。导致这样南辕北辙认识的症结在于科学家在研究时并未找对P53基因的正确版本。十年之后，美国约翰霍普金斯医学院的分子生物学Bert·Vogelstein最终找到了正确的P53基因，即野生型P53。不但如此，科学家的发现还为这一基因摘掉了癌基因的恶名：与此前认识恰恰相反的是，P53是一个在人体内发挥广泛作用的强有力的抑癌基因。 第二个10年里，科学家发现P53蛋白实际上是一种转录因子，可以胁迫诱导。基于P53真正功能的重新认识，科学家发现了一系列与肿瘤相关的基因。对这些基因的深入挖掘不但
基因芯片的制备及应用摘要基因芯片技术是90年代中期以来快速发展起来的分子生物学高新技术是各学科交叉综合的崭新科学。其原理是采用光导原位合成或显微印刷等方法将大量DNA探针片段有序地固化予支持物的表面然后与已标记的生物样品中DNA分子杂交再对杂交信号进行检测分析就可得出该样品的遗传信息。基因芯片技术目前国内外都取得了较大的进展该技术可用于DNA测序基因表达及基因组图的研究基因诊断新基因的发现药物筛选给药个性化等等所以为二十一世纪生物医药铺平道路将为整个人类社会带来深刻广泛的变革促进人类早日进入生物信息时代。关键词基因芯片微阵列基因诊断药物筛选一、基因芯片的制备基本过程1 DNA方阵的构建选择硅片、玻璃片、瓷片或聚丙烯膜、尼龙膜等支持物并作相应处理然后采用光导化学合成和照相平板印刷技术可在硅片等表面合成寡核苷酸探针或者通过液相化学合成寡核苷酸链探针或PCR技术扩增基因序列再纯化、定量分析由阵列复制器或阵列机及电脑控制的机器人准确、快速地将不同探针样品定量点样于带正电荷的尼龙膜或硅片等相应位置上再由紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。2 样品DNA或mRNA的准备。从血液或活组织中获取的DNA/mRNA样品在标记成为探针以前必须进行扩增提高阅读灵敏度。Mosaic Technologies公司发展了一种固相PCR系统好于传统PCR 技术他们在靶DNA上设计一对双向引物将其排列在丙烯酰胺薄膜上这种方法无交叉污染且省去液相处理的繁锁Lynx Therapeutics公司提出另一个革新的方法即大规模平行固相克隆这个方法可以对一个样品中数以万计的DNA片段同时进行克隆且不必分离和单独处理每个克隆使样品扩增更为有效快速。在PCR扩增过程中必须同时进行样品标记标记方法有荧光标记法、生物素标记法、同位素标记法等。3 分子杂交样品DNA与探针DNA互补杂交要根据探针的类型和长度以及芯片的应用来选择、优化杂交条件。如用于基因表达监测杂交的严格性较低、低温、时间长、盐浓度高若用于突变检测则杂交条件相反。芯片分子杂交的特点是探针固化样品荧光标记一次可以对大量生物样品进行检测分析杂交过程只要30min。美国Nangon公司采用控制电场的方式使分子杂交速度缩到1min甚至几秒钟。德国癌症研究院的Jorg Hoheisel等认为以肽核酸为探针效果更好。4 杂交图谱的检测和分析用激光激发芯片上的样品发射荧光严格配对的杂交分子其热力学稳定性较高荧光强不完全杂交的双键分子热力学稳定性低荧光信号弱不到前者的1/351/52不杂交的无荧光。不同位点信号被激光共焦显微镜或落射荧光显微镜等检测到由计算机软件处理分析得到有关基因图谱。目前如质谱法、化学发光法、光导纤维法等更灵敏、快速有取代荧光法的趋势。二、基因芯片的应用 1 测序基因芯片利用固定探针与样品进行分子杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品的序列这种测定方法快速而具有十分诱人的前景。Mark chee等用含135000个核苷酸探针的阵列测定了全长为16.6kb的人线粒体基因组序列准确率达99。Hacia等用含有48000个寡核苷酸的高密度微阵列分析了黑猩猩和人BRCA1 基因序列差异结果发现在外显子11约3.4kb长度范围内的核酸序列同源性在98.2到83.5之间示了二者在进化上的高度相似。2基因表达水平的检测用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况。Schena等采用拟南芥基因组内共45个基因的cDNA微阵列其中14个为完全序列31个为EST检测该植物的根、叶组织内这些基因的表达水平用不同颜色的荧光素标记逆转录产物后分别与该微阵列杂交经激光共聚焦显微扫描发现该植物根和叶组织中存在26个基因的表达差异而参与叶绿素合成的CAB1基因在叶组织较根组织表达高500倍。Schena 等用人外周血淋巴细胞的cDNA文库构建一个代表1046个基因的cDNA微阵列来检测体外培养的T细胞对热休克反应后不同基因表达的差异发现有5个基因在处理后存在非常明显的高表达11个基因中度表达增加和6个基因表达明显抑制。该结果还用荧光素交换标记对照和处理组及RNA印迹方法证实。在HGP完成之后用于检测在不同生理、病理条件下的人类所有基因表达变化的基因组芯片为期不远了。 3 基因诊断从正常人的基因组中分离出DNA 与DNA芯片杂交就可以得出标准图谱。从病人的基因组中分离出DNA与DNA芯片杂交就可
P53基因的功能 1 阻滞细胞周期 在细胞周期中，P53的调节功能主要体现在G1和G2/M期校正点的监测，与转录激活作用密切相关。P53下游基因P21编码蛋白是一个依赖Cyclin(细胞周期蛋白)的蛋白激酶抑制剂，一方面P21可与一系列Cyclin-cdk （细胞周期蛋白依赖性激酶）复合物结合，抑制相应的蛋白激酶活性，导致低磷酸化Rb 蛋白（视网膜母细胞瘤蛋白）堆积，后者使E2F转录因子（参与细胞周期调控的细胞因子）不能活化，引起G1期阻滞；另外P53的另外3个下游基因Cyclin B1,CADD45 和14-3-3σ则参与G2/M期阻滞。 2 促进细胞调亡 Bcl-2（调控线粒体外膜通透性的基因家族）可阻止凋亡形成因子如细胞色素C等从线粒体释放出来，具有抗凋亡作用，而Bax （促凋亡基因）可与线粒体上的电压依赖性离子通道相互作用，介导细胞色素c的释放，具有凋亡作用，p53可以上调Bax的表达水平，以及下调Bcl-2的表达共同完成促进细胞凋亡作用。P53还可通过死亡信号受体蛋白途径诱导凋亡，T NF受体（在真核细胞表达具有生物活性的可溶性肿瘤坏死因子）和Fas蛋白（一种细胞膜抗原，主要功能是介导细胞凋亡）。 3 维持基因组稳定
DNA受损后，由于错配修复的累积，导致基因组不稳定，遗传信息发生改变。P53可参与DNA的修复过程，其DNA结合结构域本身具有核酸内切酶的活性，可切除错配核苷酸，结合并调节核苷酸内切修复因子XPB和XPD的活性，影响其DNA重组和修复功能。 4 抑制肿瘤血管生成 肿瘤生长到一定程度后，可以通过自分泌途径形成促血管生成因子，刺激营养血管在瘤体实质内增生。P53蛋白能刺激抑制血管生成基因Smad4等表达，抑制肿瘤血管形成。在肿瘤进展阶段，P53基因突变导致新生血管生成，有利于肿瘤的快速生长，这常常是肿瘤进入晚期的表现。ASDDA p53既可阻滞细胞周期，也可诱导细胞凋亡。两种作用方式都是为了维护基因组的稳定，但二者的性质截然不同。前者是为DNA的修复或某种应激状态的改善创造时机。即便不能完全修复DNA的损伤，只要还能容忍，细胞依旧可以存活，但可能会留下基因组不稳定的后患；后者则是从根本上去除造成基因组不稳定的因素，以绝后患。显然，p53的这两种作用方式不能同时并存，二者之间有选择。 究竟p53在被激活后选择何种作用方式，要由活性p53的数量与应激细胞的损伤程度两方面来决定。当通过暂时转染方式让p53在肿瘤细胞内高水平表达时，即可诱导凋亡；而采用温度敏感突变或可诱导系统让p53低水平表达时，则只能导致细胞周期阻滞。但从根本上讲，应激细胞的DNA损伤程度等因素才是决定p53选择何种
微生物基因组研究进展及其意义 近年来，病原微生物的基因组研究取得了飞速的进展。所谓基因组研究是指对微生物的全基因进行核苷酸测序，在了解全基因的结构基础上，研究各个基因单独或数个基因间相互作用的功能。由于过去人们大多从表型分析入手，寻找已知功能的编码基因，实际只了解微生物中极少数的基因，如链球菌的链激酶基因、结核杆菌编码的热休克蛋白基因等。还有大量未知基因未被发现。通过基因组研究，则从根本上揭示了微生物的全部基因，不仅可发现新的基因，还可发现新的基因间相互作用、新的调控因子等。这一研究将使人类从更高层次上掌握病原微生物的致病机制及其规律，从而得以发展新的诊断、预防及治疗微生物感染的制剂、疫苗及药品。此外，新发现的微生物酶及蛋白还可能有在工农业生产上的应用价值。因此，全球除已完成了70余株覆盖重要病毒科的病毒代表株全基因组研究外，据美国基因组研究所（The Institute for Genomic Research, TIGR）报道，目前已完成了19种微生物基因组测序，其中11种与人类及疾病相关（嗜血流感杆菌，生殖道支原体，肺炎支原体，幽门螺杆菌，枯草杆菌，伯氏疏螺旋体，结核杆菌，梅毒螺旋体，沙眼衣原体，普氏立克次体）。另外，还有40余种微生物已被登记正在进行测序，预计在1999～2000年完成〔1〕。 病毒基因组研究进展 病毒因其基因组小，是进行基因组研究最早的生物体。早在1977 年已完成了噬菌体DNA的全基因测序。存在于脊髓灰质炎疫苗中的SV40，是最早完成全基因测序的与疾病相关的病毒；此后，许多病毒均已完成了全基因测序，并根据序列的开放阅读框架（ORF）对编码蛋白进行了推导。已对相当一些病毒蛋白进行了重组表达，还对一些病毒基因编码的调控序列进行了研究。除一般大小的病毒已完成了基因组测序，对大基因组病毒，疱疹病毒科，如水痘病毒基因组为0.125Mb(Mega-basepair,兆碱基对)〔2〕。巨细胞病毒，基因组为0.229Mb〔3〕。我国已对痘苗病毒天坛株（约0.2Mb）进行了全基因测序，发现与国外的痘苗毒株序列有明显的差异〔4〕。我国还对甲、乙、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒进行了国内毒株的全基因测序。近来还对国内2株发现的虫媒病毒毒株完成了全基因测序。我国从不同来源的标本中发现了不少乙肝病毒变异株，有的具有特殊的生物学特性〔5〕。对病毒基因中调控因子的分析，发现了与乙肝病毒增强子作用的新细胞核因子〔6〕。 因此，目前对病毒的基因组研究已进入了后基因组阶段，即从全基因水平研究病毒的生物学功能，同时发现新的基因功能。对于医学病毒学当前主要方向是研究病毒基因组中与致病及诱生免疫应答相关的基因，从而揭示和解决迄今尚未解决的问题，以达到控制或消灭一些重要病毒感染的目的。 建议目前可进行后基因组研究的领域为： 1．病毒持续性感染：基因组中与持续性感染相关的基因，基因变异或调控因子研究。已报道的乙肝病毒的前核心基因出现终止密码突变，
生物芯片技术研究进展 张智梁 摘要：随着DNA测序技术的发展和几种同时监测大量基因表达的新技术出现，人类基因组DNA序列分析可能很快完成，并由此产生了生物信息学，而DNA芯片技术应运而生。生物芯片主要是指通过微电子、微加工技术在芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、DNA、蛋白质、组织、糖类及其他生物组分进行快速、敏感、高效的处理和分析，是近些年来发展迅速的一项高新技术。生物芯片主要包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片等。 关键词：生物芯片；研究进展；应用 生物芯片是指通过微电子、微加工技术在芯片表面构建的微型生物化学分析系统，以实现对细胞、DNA、蛋白质、组织、糖类及其他生物组分进行快速、敏感、高效的处理和分析，其实质就是在面积不大的基片(玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)表面上有序地点阵排列一系列已知的识别分子，在一定条件下，使之与被测物质(样品)结合或反应，再以一定的方法(同位素法、化学荧光法、化学发光法、酶标法等)进行显示和分析，最后得出被测物质的化学分子结构等信息。因常用玻片／硅片等材料作为固相支持物，且制备过程模拟计算机芯片的制备技术，所以称之为生物芯片技术。这项技术是由美国旧金山以南的的一个新兴生物公司首先发展起来的。S.P.AForder及其同事于90年代初发明了一种利用光刻技术在固相支持物上光导合成多肽的方法，并在此基础上于l993年设计了一种寡核苷酸生物芯片，直至l996年制造出世界上第一块商业化的DNA芯片。在此期间国际上掀起了一片DNA芯片设计的热潮，出现了多种类型的DNA芯片技术。DNA芯片在产生的短短几年时间内技术不断，现已经显现出在基因诊断、基因表达分析和新基因的发现、蛋白组学方面的应用、基因组文库作图等生物医学领域中的应用价值。 l、生物芯片的分类 目前常见的生物芯片分为3类：第1类为微阵列芯片，包括基因芯片、蛋白芯片、细胞芯片和组织芯片；第2类为微流控芯片(属于主动式芯片)，包括各类样品制备芯片、聚合酶链反应(PCR)芯片、毛细管电泳芯片和色谱芯片等；第3类为以生物芯片为基础的集成化分析系统(也叫“芯片实验室”，是生物芯片技术的最高境界)。“芯片实验室”可以完成如样品制备、试剂输送、生化反应、结果检测、信息处理和传递等一系列复杂工作。这些微型集成化分析系统携带方便，可用于紧急场合、野外操作甚至放在航天器上。 2、生物芯片的应用 2．1基因测序基因芯片利用固定探针与样品进行分子杂交产生的杂交图谱而排列出待测样品的序列，这种测定方法快速，具有十分诱人的前景。芯片技术能辨别单核苷酸多态性(SNPs)，当基因组序列中的单个核苷酸发生突变，就会引起基因组DNA序列变异。Hacia等用含有48000个寡核苷酸的高密度微阵列分析了黑猩猩和人BRCAl基因序列差异，结果发现在外显子11约3．4kb长度范围内的核酸序列同源性为83．5％～98．2％，提示了二者在进化上的高度相似性。Check 等通过运用DNA微集阵列分析研究与早期心血管疾病相关的候选基冈一丁SP基冈家族，结果发现TSP-1和TSP-4基因错义变异与早期冠状动脉疾病相关，它们在m液凝固和动脉修复中起重要作用，而丁SP一2基冈非编码区的突变却在心脏病的发生过程有一定的保护作用。在卵巢癌发展过程中，基因TP53起到临界
CHO细胞表达系统研究进展 影响外源基因在哺乳动物细胞中表达水平的因素很多，层次也很广泛，涉及复制、转录和转录后、翻译和翻译后等各级水平，其中mRNA的转录是真核基因表达谓节的基本控制点，它的翻译对表达水平也有一定作用。研究表明，所有提高转录水平的策略均与蛋白质编码序列无关，主要是通过载体构建基因转染方法和选择不同标记来调控。而提高翻译水平则主要是通过增强与核糖体结合能力和改造编码基因的结构来实现。 转录水平的调控可以概括为顺式作用元件(cis acting element)与反式作用因子(trans-acting factor)的相互作用。它们分别由表达载体和宿主细胞提供。因此，表达载体的元件组成及结构是ClIO细胞高效表达外源基因的关键因素之一。借助真核基因表达调控的理论，可以将较强的顺式作用元件集中到一个载体中，使其方便而高效地用于外源基因的表达。目前在这一理论指导下，已经构建了许多来源于细菌质粒的表达载体，它们包含着适当的顺式作用元件和选择标记。顺式作用元件主要有启动子一增强子元件、转录剪切和Poly A信号等。 1、启动子 启动于是影响外源基因表达效率的关键因素因为细菌的主要启动子和增强子在动物细胞中不起作用，所以这些调控元件大多从启动效率高而且生物背景清楚的病毒基因组中分离。各种启动子效率可用报告基因在细胞中测定。SV40、AdMLP、LTR和CMV启动子在CHO细胞中效果良好。刘文军等比较了SV40、L TR和CMV在ClIO细胞中的表达活性，认为三种启动子的转录活性依次为CMV启动子>SV40启动子> LTR启动子，前者分别是后两者的l0倍和30倍左右。 来源于噬菌体的一些启动子，如17启动子也可用于动物细胞。17启动子能被T7RNA聚合酶特异识别，依此建立起来的偶联系统具有常规表达系统不能实现的高效表达特性。除了这些常用的启动子之外，还有多种强的启动子被用于CHO细胞表达载体中。如肽链延长因子基因的启动子，金属硫蛋白(MT)基因的启动子等。在启动子周围其它核苷酸序列对其转录活性也有影响。改变CMV和AdMLP之后EPO基因的前
P53基因功能及前沿研究现状
一．P53基因的功能 p53 基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因之一,是当前肿瘤分子生物学研究的热点。自1979年Lane等[1] 发现p53 基因以来,人们对它的认识经历肿瘤抗原、癌基因、抑癌基因三个阶段。近年的深入研究表明p53作为一种抑癌基因发挥着越来越重要的作用。人类50％以上p53都发生了突变，导致了肿瘤的发生。[2]P53基因定位于染色体17p13.1,长20kb,含有11个外显子，编码393个氨基酸组成的相对分子量为53*103的蛋白质。P53蛋白是一个转录因子，参与细胞周期调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等。主要执行DNA 损伤“检查点”功能，若DNA受损，p53蛋白水平迅速升高并激活其下游的p21/WAF1/CIP1基因表达，这是一组周期素依赖蛋白激酶的抑制剂，使细胞停滞于G1期，执行DNA修复。若修复失败，p53则通过激活BAX基因通路诱导凋亡。约50%的人类肿瘤与p53基因的等位失活或突变有关。 突变型P53则具有癌基因的作用，促进细胞恶性转化。P53基因的突变常发生在结肠癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤。 P53基因功能失活机制有以下几种：1、P53基因自身突变，导致P53蛋白丧失与DNA结合的能力，这是P53基因失活的重要机制。2、MDM2癌基因的负调节。MDM2是P53蛋白的靶基因，P53蛋白刺激MDM2基因的表达，而MDM2蛋白可与P53蛋白结合，一直P53蛋白接到的反式激活、增殖抑制和诱导凋亡的功能，同时MDM2蛋白可以催化p53蛋白的降解，从而形成一个反馈调节环，负调节p53蛋白的活性。3、
深度DNA测序技术在基因组测序中的研究策略和进展 摘要：回顾了经典DNA测序技术原理，重点阐述了深度测序技术在基因组测序中的研究策略，并结合目前比较常见的二代测序仪来分析比较相互之间的特点和优势，最后，对即将到来的三代测序法的研究进展给予了简单的介绍。 关键词：深度DNA测序基因组测序仪 DNA测序技术的发展过程漫长而艰辛，然而，我们现在获取的大部分DNA序列信息还是依靠基于Sanger在1977年建立的“DNA双脱氧链末端终止测序法”的DNA测序技术获得的。另外就是Maxam和Gilbert建立的“化学降解测序法”。在过去的七年当中，DNA测序技术的发展至少受到来自四个方面的影响：首先是人类基因组计划的出现，这项计划的实施过程中，科学家们面临了巨大的经费问题，因为传统的Sanger测序法无论怎么优化，都无法大幅度降低测序的成本，这很大程度促进了人们对在测序过程中如何降低成本的技术方面的研究。第二，人类以及其他主要模式生物参考序列数据库的建立使得短片段阅读（short-read）成为可能,这极大的促进了短片段测序技术的发展。第三，新型分子生物学技术的不断涌现导致了越来越多的诸如RNA表达染色体构象等生物现象的出现，这就需要有高通量DNA测序手段去解释这些问题，这也极大的促进了新型测序技术的发展。第四，其他学科领域的技术的发展，例如计算机技术，数据存储及分析技术，聚合酶工程技术等，极大地支持了DNA测序技术的应用。本文主要是对目前新一代DNA测序（也叫深度测序）技术（Next-generation DNA sequencing technologies）的研究策略及目前国际DNA测序最新进展做一简要的综述。 1.Sanger测序法 先来回顾一下经典的DNA测序法，从上世纪九十年代早期开始，几乎所有的DNA测序都是利用半自动化的毛细管电泳Sanger测序技术完成的（图1-a）。后来出现了高通量测序法，这种方法首先要对DNA预处理，获取大量的待测序模板即质粒或PCR产物。然后在测序一种发生测序生化反应，这个过程会产生大量长短不一（因为终止位点不一样），末端被荧光标记的延伸产物。再用分辨率高的毛细管凝胶电泳分离这些延伸产物，通过对延伸产物末端四种不同荧光颜色的区分，利用计算机软件自动“读
P53基因与癌症和衰老相关性的概述 摘要：p53基因抑制肿瘤是众所周知的，但可能也影响与肿瘤抑制无关的衰老过程。p53对各种应激做出反应，诱导细胞凋亡或阻滞细胞周期，以抑制肿瘤的发展。然而，在非癌衰老过程中p53的作用是复杂的。一方面，p53基因能诱导细胞衰老或凋亡来抑制癌症，但其后果就是加快了衰老。另一面，P53可以减缓生长和减少与生长有关的应激使细胞存活，最终延缓衰老。要想阐明其在衰老过程中的作用，并针对P53或P53转录靶点来治疗癌症和改善衰老，就必须更好地了解p53功能的多样化。 关键词：DNA损伤，细胞生长；细胞衰老；细胞凋亡，无氧酵解 引言：p53基因是一种转录因子，其在哺乳动物中抑制肿瘤的发生已经得到了广泛研究（1→3），但越来越多的证据表明，p53基因也影响衰老过程。但是，p53究竟是怎样影响衰老的还不是很清楚。p53调控大量有致癌作用的基因的转录，包括细胞周期阻滞（P21，GADD45，14-3-3s，RPRM），细胞凋亡（Scotin，killer，FAS，BBC3，PERP，53BP1，BAX，LRDD，PMAIP1），抑制有氧糖酵解（GLUT1，TIGAR，己糖激酶，磷酸甘油酸变位酶），促进氧化磷酸化（OXPHOS）（SCO2，AIF），细胞生长（PTEN，AMPK测试，TSC2，IGF-BP3）（4），以及蛋白质的翻译（sestrins）（5）。P53还具有与转录无关的其他作用，包括调节微RNA加工（6），DNA修复（7），线粒体蛋白存活（8）和核糖体合成（9,10）。因此，p53是维持基因组完整性，调节细胞生长和细胞增殖的关键，是抑制肿瘤的核心（11）。同时，p53通过一个非癌症相关
乳酸杆菌基因表达系统的研究进展 徐义刚1,2,崔丽春1 (1.东北林业大学,黑龙江哈尔滨150040; 2.东北农业大学动物医学院,黑龙江哈尔滨150030) 摘要乳酸杆菌是人及动物肠道中重要的益生菌,被公认为安全级(generall y recognized as safe,GRA S)微生物。乳酸杆菌表达系统是近几年发展起来的一种表达系统,随着乳酸杆菌分子生物学的发展、各类表达调控元件的分离,相继发展了乳酸杆菌的克隆载体、表达载体和整合载体。乳酸杆菌具有免疫佐剂、吸附黏膜、抗胆汁酸能力,以乳酸杆菌为载体,作为外源基因的传递和表达系统,研制口服疫苗,刺激黏膜免疫系统产生有效的免疫应答,具有重要开发前景。 关键词乳酸杆菌;外源基因;表达系统 中图分类号Q939.11+7文献标识码A文章编号1005-7021(2007)03-0087-05 Progress on G ene E xpressi on Syste m of Lact obacill us XU Y-i gang1,2,C U I L-i chun1 (1.N ort h e a stF orest ry Univ.H arbin150040;2.C oll.of Veteri nary M e d.N ort h e a st Agric.Un i v.H arbi n150030) A bstrac t Lactobacill us is a k i nd o f i m portant prob i o ti c i n gastro-i ntesti nal tracts o f hu m an and most an i m a l s,and t hey are conside red to be safe bacter i a w it h a GRA S(generall y regarded as safe)status.T he express i on syste m s o f Lactobacillus is a k i nd of expression sy stem tha t have been deve l oped i n recent yea rs,and as t he deve l op m en t of mo-lecu l ar b i o l ogy o f Lactobacillus,and the sepa ration o f var i ous expressi on regu l a t o ry ele m ents,t he c l on i ng vector,the expressi on vector,and the i ntegrati on v ector have been deve loped one a fter ano t https://www.doczj.com/doc/9c13713197.html,ctobacillus possesses many properties such as i m mune ad j uvant,adsorpti on mucosa,ant-i b ile ac i d capab ili ty;take Lactobacillus as a vector trans-fero r and expressi on syste m s o f exogenous gene to study ora l vacc i ne,sti m u l ate mucosa i m m une syste m to produce e-f fecti ve i m mune responses,a ll o f these possess i m portant deve l op m ent prospect. K eywords Lact obacillus;exogenous gene;expressi on syste m 乳酸菌(Lactic ac i d bacteria,LAB)是人及动物肠道中极为重要的益生菌群之一,该菌为兼性厌氧的革兰氏阳性菌,是乳品工业发酵的重要菌类,是在食品、医药工程领域具有重要应用前景的食品级微生物,包括乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌等十几个属。20世纪80年代,人们开始致力于乳酸菌生物学性质和分子机制的研究,乳酸杆菌在农业、食品领域所具有的重大经济意义及对人体和动物健康的重要性,越来越引起人们的关注。随着乳酸杆菌分子生物学的发展和电转基因技术的建立,以及各类表达调控元件的分离和克隆,已经建立和发展了一系列乳酸杆菌基因表达载体和传递系统,为探索其新的应用潜力提供了基础,其中利用乳酸杆菌作为抗原传递载体进行粘膜疫苗免疫的研究,是该领域研究的前沿和热点。本文主要对乳酸杆菌表达系统方面的进展作一综述。 1乳酸杆菌作为外源基因表达宿主菌的优势 乳酸杆菌作为主要的益生菌广泛应用于食品及饲料加工业,在功能食品、医疗保健、微生态制剂等领域的应用具有诱人的前景[1]。目前,乳酸杆菌制剂已被应用于肠道的微生态治疗[2]。乳酸 收稿日期:2006-09-19 作者简介:徐义刚男,博士。从事病原微生物与免疫学研究。87 微生物学杂志2007年5月第27卷3期J OURNAL OF M ICROBIOLOGY M ay2007V o.l27N o.3
进化基因组学研究进展 刘超 （山东大学生命科学学院济南250100） 摘要：进化基因组学是利用基因组数据研究差异基因功能、生物系统演化、从 基因在水平探索生物进化的学科。随着近年来基因组数据的不断增加，进化基因组学得到了长足的发展。进化基因组学主要包括从基因组水平理解和诠释生物进 化和新基因分析研究探索两方面的内容。本文介绍了进化基因组学研究的主要内容和较为常用的方法，以及近年来在细菌、酵母、果蝇进化基因组学方面的研究进展。 关键词：进化基因组学系统进化比较基因组学新基因 前言 随着基因测序技术的不断进步以及基因组学的飞速的发展，人们积累了大量的基因组学数据，利用所得的大量的基因组数据与进化生物学相结合，在基因组水平研究生物进化机制，随即产生了进化基因组学(Evolutional Genomics)。 近年来进化基因组学取得了长足的进展，在研究差异基因功能、生物系统演化、从基因在水平探索生物进化的终极方式等方面有重大突破，对人类理解生命现象和过程有重要作用。 1进化基因组学研究内容 研究系统进化学通常包括两个关键步骤：一方面，在不同物种中鉴定同源性特佂，另一方面利用构建系统进化树的方法比较这些特征，进而重新构建这些物种的进化历史[1]。针对这两个关键步骤，传统系统进化学，常采用基于形态学 数据和单个基因研究的同源性状鉴定和重建系统进化树（常包括距离法、最大简约法、概率法）[1]的方法来研究。在目前拥有丰富基因组数据的条件下，我们 可以分析基因组数据，利用进化基因组学研究系统进化。
目前进化基因组学的研究内容主要集中于两个方面：（1）在比较不同生物的基因数据的基础上，从基因组水平理解和诠释生物进化；（2）通过对新基因的分析研究探索基因进化过程的规律两个方面[2]（如图1）。在进行全基因组进化分析方面，进化基因组学主要集中于构建系统进化树、研究基因组进化策略、研究生物功能变化和进化机制、进化和生态功能基因组学[2]、基因注释的等方面；在新基因方面主要分析基因产生机制和新基因固定及其动力学研究。 图1 进化基因组学主要研究内容 目前进化基因组学的研究有力的解决了一些基础性的进化问题，但也出现了一些未来需要急需解决的挑战。例如生物进化的本质和目前重建系统进化树方法 的限制[1]。 2研究进化基因组学的方法 研究进化基因组学的方法主要包括利用基因组数据分析和研究新基因的产 生和演化两种。 2.1利用基因组数据进行系统进化分析 利用基因组数据进行系统进化分析，常有基于基因序列的方法和基于全基因特征的方法。（如图2）