10×YNB（
13.4%酵母氮源，含硫酸铵不含氨基酸）：
溶解
13.4gYNB于100mL水中，过滤除菌，加热至YNB完全溶解，存于4℃。
500×B（
0.02%生物素）：
溶解20mg生物素于100mL水中，过滤除菌，放于4℃。
100×AA（
0.5%各种氨基酸）：
溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于
100mL
水中，过滤除菌，存于4℃。
10×D（20%葡萄糖）：
溶解200g D-葡萄糖于1 000mL水中，高压灭菌15min或过滤除菌，可放1 年。
500×生物素(
0.02%)：
溶解20mg生物素于100mL水中，过滤除菌，放于4℃，可放1年。
100×H（
0.4%组氨酸）：
溶解400mg L-组氨酸于100mL水中，低于50度加热以促溶解，过滤除菌，
可放1年。
10×M（5%甲醇）：
混合5mL甲醇与95mL水，过滤除菌存于4℃，可放2个月。
10×GY（10%甘油）：
混合100mL甘油与900mL水，过滤或高压灭菌，室温放置，可存放1年以上。
100×AA（
0.5%各种氨基酸）：
溶解各50mg L-谷氨酸，L-蛋氨酸，L-赖氨酸，L-亮氨酸，L-异亮氨酸于
100mL
水中，过滤除菌，存于4℃，可放1年。
1mol/L磷酸钾缓冲液pH
6.0：
32mL 1mol/L K2HPO4，868mL 1mol/L KH2PO4，调整pH值为
6.0±
0.1（如
果需调pH值，用磷酸或KOH）。过滤或高压灭菌，室温下可放1年以上。
100mg/mL遗传霉素：
用无菌水制备30mL100mg/mL遗传霉素贮存液，过滤除菌，存于-20℃。
用来制备含不同终浓度遗传霉素平板：
0.25，
0.5，
0.75，
1.0，
1.5，
1.75，
2.0，
3.0，
4.0。5%酵母提取物，10%胰蛋白陈，10%NaCI，pH
7.0；高压灭菌后4℃保存。
LB平板培养基
在LB液体培养基中加入琼脂粉15g，高压灭菌，冷却至45℃左右时倒平皿，4℃保存。
LA平板培养基
待LB液体培养基冷却至45℃左右加入Amp (100μg/mL)，摇匀后倒平皿，4℃保存。
YPD培养基：
1%酵母提取物，2%胰蛋白膝，2%葡萄糖；RDB
转化固体培养基：
(Regeneration DextroseMedium+ Histidine)（lmol/L山梨醇，l%葡萄糖，
1.34%YeastNitrogenBasewithAmmoniumSulfate with amino acids(YNB)，
0.004%Biotin，
0.005%谷氨酸，
0.005%甲硫氨酸，
0.005%赖氨酸，
0.005%亮氨酸，
0.005%异亮氨酸，
1.5%xx；）100mL：
超纯水80ml，山梨醇18g(186g/L)，琼脂糖2g（20g/L）121℃灭菌20分钟，待温度将至60℃以后，在超净台内加入10*YNB 10ml,10*D（20%葡萄糖）10ml,500*B（
0.02%生物素）
0.2ml100*AA（含每种氨基酸
0.5%）1ml.混匀，倒平板。
YPD-遗传霉素平板：
1%酵母浸出物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%不同量的遗传霉素
4.0，250mL（8-10个遗传霉素平板）。取1gG418溶于1ml1M的HEPES液或PBS中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。具体方法如下：1g包装的G418瓶子中，加入10ml HEPES溶液，浓度为100 mg/ml完全溶解后，
0.22 um过滤，－20度保存。HEPES缓冲液配方如下：90 ml水中，
0.8 g NaCl,
0.037 g KCl,
0.0135 g Na2HPO
4.2H2O,
0.1 g葡萄糖，
0.5 g HEPES,溶解，NaOH调PH至
7.05,定容至100ml。
0.50mg/ml，
0.75mg/ml，
1.0mg/ml，
2.0mg/ml，
4.0mg/ml五个梯度MD：
选择培养基：
(MinimalDextroseMedium+Histidine)（
1.34%YNB，
0.004%Biotin，2%葡萄糖，
1.5%琼脂；）待温度将至60℃以后，在超净台内加入10*YNB 10ml, 10*D （20%葡萄糖）
10ml, 500*B（
0.02%生物素）
0.2ml，混匀，倒平板。
MM：
选择培养基：
(Minimal Methanol+ Histidine )（
1.34%YNB，
0.004%Biotin，
0.05%甲醇，
1.5%xx；）
100mL：
向90mL超纯水中加入琼脂糖2g（20g/L），121℃灭菌20分钟，待温度将至60℃以后，在超净台内加入10*YNB 10ml, , 500*B（0.02%生物
素）
0.2ml，5mL甲醇混匀，倒平板。
BMGY：
（1%酵母提取物，2%蛋白陈，100mmol/L磷酸缓冲液(pH
6.0)，
1.34% YNB，
0.004% Biotin，l%甘油(V/V)；）
1L：
酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO4 3g/L，KH2PO
411.8G/L，
超纯水890Ml，121℃灭菌20分钟，待温度将至60℃以后，在超净台内加入10*YNB 100ml,500*B（
0.02%生物素）1ml，甘油10mL。
BMMY：
0.5%甲醇代替
甘油，其余成分与BMGY相同。
1L：
酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，K2HPO43g/L，KH2PO4
11.8G/L，超纯水895Ml，121℃灭菌20分钟，待温度将至60℃以后，在超净台内加入10*YNB 100ml，500*B（
0.02%生物素）1ml，5mL甲醇。
主要溶液
2*SDS样品缓冲液：
25mL 4*Tris?HCl，PH
6.8(
0.lmol/L)20mL甘油[20%(w/v)]
4g SDS[4%(w/v)]2mL2-巯基乙醇或
3.1g DTT
1mg溴酚兰[
0.001%(w/v)]
加蒸馏水至l00mL并混匀，等量分装成lmL于-70℃贮存。
5*SDS电泳缓冲液：
15.lgTris碱(
0.125mol/L)
72.0g甘氨酸(
0.96mol/L)
5.0g SDS[
0.5%(w/v)]
使用前稀释至1XSDS电泳缓冲液，贮存液不必调教pH值，稀释后溶液pH
8.3，考xxxx染色
固定液：
50%(v/v)甲醇10%(v/v)乙酸40%重蒸水染色液：
50%(v/v)甲醇
0.05%(v/v)考马斯亮兰R-25040%重蒸水10%(v/v)乙酸配制时先用甲醇溶解考马斯亮兰，再加入乙酸和水。溶液可保存6个月，若出现沉淀，滤除即可。
脱色液：
7%(v/v)乙酸5%(v/v)甲醇88%重蒸水
一、大肠制备感受态细胞需灭菌的设备大离心管：
小离心管：50ml大枪头5mlLB培养基：10%甘油1挑单个大肠接入LB液体培养基，培养过夜37℃摇床，并做抗性对照。
2以1：100比例接菌，进行大摇（2ml接入200ml培养基中37℃摇床）
3OD达到
0.5-
0.7时，冰上放置20min。4℃离心，4000g，15min.弃上清，不溜残余4加入等体积的10%甘油轻轻重悬。4℃离心，4000g，15min.弃上清，不溜残余5加入体积的10%甘油轻轻重悬。4℃离心，4000g，15min.弃上清，不溜残余
6加入体积的10%甘油轻轻重悬。4℃离心，4000g，15min.弃上清，不溜残余
7加入适量灭菌10%甘油，一般500ml菌液加入2ml甘油，重悬，8分装，每管40ul，先冻与液氮，然后放入-80℃保存
二、毕赤酵母GS115电转化感受态的制备
1．在含5mLYPD的50mL离心管中，培养P. pastoris，30℃过夜；
2．取
0.1-
0.5mL过夜培养物，接种含50mL新鲜培养基的摇瓶，过夜生长至OD
600＝1.3-
1.5；
3．在4℃，1 500 r/min离心5min收集细胞，用5mL预冷的灭菌水悬浮细胞；
4．如上离心，用5 mL预冷的灭菌水悬浮细胞；
5．如上离心，用2mL预冷的1mol/L山梨醇悬浮细胞；
6．如上离心，用1 mL预冷的1mol/L山梨醇悬浮细胞，至终体积约
1.5mL（可
冻存80μL等量的电感受态细胞，但转化效率会下降很多）。
三、xx酵母电转化
1．取80μL上述细胞与5-10μL经S线性化DNA（约5-20ug）混合，转入预冷的
0.2cm电转杯中；
2．在冰上放置5min；
3．根据所使用装置推荐的S. cerivisiae参数进行电击(1 500V，5ms)；
4．立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇至杯中，将内容物转移至灭菌离心管中；
5．分成200-600μL等份，涂于RDB平板上，进行His营养缺陷筛选；
6．在30℃孵育平板3-5d，至His+克隆产生。
四．G418筛选多拷贝基因
1）取出长有克隆的3块板，可考虑先挑10－20个菌落先表达；
2）第一块加入2ml灭菌的ddH
2o，用涂布棒打匀，洗后，菌液吸入第二块；
3）第二块加入1ml，洗之，吸入第三块；
4）菌液吸入EP管，可适量补充ddH
2o；
5）混匀后取适量稀释约50倍，4ul×50＝200ul每块G418板，G418浓度从
0.25－4.0mg/ml各一块；
6）注意涂布均匀，可适量补充ddH
2o，
7）300C烘箱培养，2－5day，其余菌液可40C保存
注：
a）手册推荐方法：
第4）步将菌液转入EP管中，振荡5－10秒，用分光光度计布～105cells；注意agar的存在会干扰分光光度计的读数。
五．表达：1）从G418板挑单克隆入4ml/管MGY接种，300C，250rpm，2天左右至OD＝2－6，颜色乳白；2）取1ml菌液于EP管中保种，余3ml菌液离
心，1500g，5min，菌体换3ml BMMY，加千分之五甲醇，300ul/管；3）每隔24小时加千分之五甲醇；4）至表达之日起2天后每天取样80ul，留作电泳分析；5）表达4天结束，1500g离心，5min，分别收集上清和沉淀；6）上清用作蛋白分析，跑SDS-PAGE电泳，WesternBlotting分析，ELISA分析，样品浓缩，纯化分析等
六．质粒提取（碱裂解）
（1）溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl(pH
8.0),10 mmol/L EDTA (pH
8.0),配制200ml。
取葡萄糖（C
6H
12O
6.H
2O）
1.982 g，双蒸去离子水160 ml，
0.5 mol/L EDTA 4ml，1mol/L Tris-HCl(pH
8.0) 5 ml，定容至200 ml，高压灭菌后4℃保存。
（2）溶液II：
0.2 mol/L NaOH, 1%SDS。配制100 ml，现用现配。
10 mol/L NaOH 2 ml，双蒸去离子水80 ml，10%SDS 10 ml，最后用双蒸去离子水定容至100 ml，室温保存。
（3）溶液III：
配制100 ml。
5 mol/L乙酸钾60 ml，冰乙酸
11.5 ml，双蒸去离子水
28.5 ml。
（4）5 mol/L乙酸钾（200 ml）乙酸钾
98.14 g，溶解于160 ml双蒸去离子水中，搅拌溶解后定容至200 ml。
（5）3 mol/L乙酸钠（NaAc）（pH
5.2)取乙酸钠（CH
3COONa.3H
2O)
204.1g，溶解于200 ml双蒸去离子水中，用冰乙酸调pH
5.2，双蒸去离子水定容至500 ml，高压灭菌后4℃保存。
（6）10 mol/L NaOH溶液（100 ml）NaOH晶体40 g，加水至100 ml。称取SDS 10g，溶解于80 ml水中，68℃助溶，加数滴1 mol/L HCl调pH
7.2,定
容至100 ml。
（8）
0.5 mol/L EDTA（pH
8.0)（100 ml）。
Na
2EDT
A.2H
2O
18.61 g, H
2O 70 ml，边搅拌边加入NaOH固体调节pH，接近pH
8.0
时才充分溶解，大约需NaOH 2g。最后加水至100 ml。
2、质粒的提取
（1）吸取
1.5毫升菌液至
1.5 ml Eppendorf离心管中，3 000 rpm离心3分钟，
弃上清液。
（2）加上
1.5毫升菌液，重复操作（１）。
（3）用移液器尽可能除去上清液，加入预冷150微升溶液Ｉ，震荡。
（4）加入200微升溶液Ⅱ,缓慢地上下翻转离心管约10次，勿震，混合均匀。
室温下放置５分钟。
（5）加入150微升溶液Ⅲ，上下翻转离心管约10次，混合均匀，冰浴10分钟。
４℃，12,000 rpm离心5分钟。
（6）用移液器将上清液转移到新的
1.5mlEppendorf离心管中，加入１倍体积
（400微升）异丙醇抽提，12 000 rpm离心５分钟。
（7）弃上清，加入1ml70%乙醇洗涤沉淀一次，离心5-10min
（8）弃上清，烘干10min。
（9）加20微升TE缓冲液（含20ul/ml RNase）溶解DNA沉淀，37℃半小时，-20℃
保存。
1.pPIC9K+pulluGene（histag）——GS115（His缺陷筛）——G418筛——GS115-Pullu——酶活性鉴定
2.pulluGene分析——选择tRNA Genes——设计引物以GS115基因组为模板PCR——tRNA Genes
3.pFLDa+ tRNA Genes——GS115-Pullu（zeocin筛）——GS115-Pullu-plus——酶活鉴定——表达量比较