人类胚胎干细胞基础技术
高级培训班
2010-12
目录
1. 绪论 (3)
2. 饲养层细胞的制备 (4)
2.1 从胎鼠获得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF） (4)
2.2 MEF的传代 (5)
2.3 MEF的冻存 (5)
2.4 MEF的失活 (6)
3. 饲养层细胞的准备 (7)
4. ES/iPS细胞的复苏 (9)
5. ES/iPS细胞的传代 (10)
6. ES/iPS细胞的冻存 (12)
7. 人类胚胎干细胞的无滋养层培养 (13)
7.1 人类胚胎干细胞条件培养基（CM）的收集 (13)
7.2 无饲养层人胚胎干细胞系的培养及传代 (13)
8. 拟胚体的形成 (14)
9. 胚胎干细胞全能性的鉴定 (15)
9.1碱性磷酸酶活性检测 (15)
9.2干细胞表面marker的免疫染色检测 (16)
9.3干性因子的去甲基化程度分析 (17)
9.4干细胞内源基因的表达分析 (19)
9.5端粒酶活性检测 (21)
9.6核型检测 (21)
9.7拟胚体形成 (21)
9.8畸胎瘤形成实验 (22)
10. 干细胞技术培训及服务一览表 (23)
11. 附录 (24)
1.绪论
本操作手册将为您详细介绍人胚胎干细胞/iPS细胞培养的基础知识、技术细节及相关的产品信息。目的是为了让您更好地培养您购买的细胞，请按照此手册进行培养操作直至获得可靠的冻存细胞。上海斯丹赛生物技术有限公司专业提供各类胚胎干细胞/iPS细胞及成套产品服务，为您的干细胞研究提供一站式解决方案。
2.饲养层细胞的制备
材料与仪器
?成纤维细胞完全培养基，货号EFM-01
?胰酶，货号M-005-1
?成纤维细胞冻存液（2x），货号EFFM-01
?基质胶（Matrigel matrix），BD Pharmingen，货号356235
?CF-1小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），货号MEF-CF1-01
?T25透气培养瓶，NUNC，货号156367
?T75透气培养瓶，NUNC，货号156499
? 2 ml移液管，NUNC，货号159617
?5ml移液管，NUNC，货号159625
?10 ml移液管，NUNC，货号159633
?15ml离心管，货号366036
?50ml离心管，货号373660
?冻存管，NUNC，货号377267
?Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头
?生物安全柜，货号
?CO2培养箱，Thermo，HERA cell 150i
?电子计数器，millipore，货号PHCC00000
?电动移液器，Thermo Scientific Finnpipette C1，货号4580800
?低速离心机，Thermo Scientific CL10
?液氮罐，Thermofisher，货号CN50900
2.1从胎鼠获得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）
1. 拉断颈椎处死怀孕12-13天的CF-1小鼠，浸入70％的酒精中消毒。
2. 将小鼠放在超净台无菌的解剖盘中，在腹中线处做一横向切口。
3. 剪开的皮肤拉向切口的上下两侧，提起腹膜，将其剪开，充分暴露腹腔。
4. 找出子宫，一只手用无菌钝口镊子轻轻提起子宫，另一只手持无菌镊子小心分离子宫周围的结缔组织。当两侧子宫都与其相连的组织分离好后，用剪刀将左右两侧的子宫在输卵管与子宫角的衔接处剪下，小心剪下子宫的联体部分，置于无菌的60mm培养皿中。
5. 用无菌的剪刀在子宫头与子宫尾分别剪去输卵管及子宫角部分。
6. 将子宫置于15ml离心管中，用10mlPBS洗三遍。
7. 用尖镊子撕开子宫壁和胎膜，取出胎鼠，放在新的培养皿中。
8. 用8mlPBS 将胎鼠洗三遍。
9. 用灭菌的眼科剪刀去除胎鼠的胚囊，释放胚胎，并胚胎计数。
10. 将胚胎移到干净的培养皿中，PBS洗三次。
11. 用镊子小心的去除胚胎的头和肝脏，PBS洗三次。
12. 将胚胎转移至新的培养皿中，用无菌剪刀将组织充分剪碎，加入0.25％胰酶同时吹打几分钟使其消化均一并彻底酶解。
13. 用同样体积的MEF完全培养基中和胰酶。
14. 一个T75瓶加10ml MEF完全培养基，按照每2-3个胚胎一个T75瓶，将已消化的胚胎加入培养瓶中，放在5％CO2培养箱中培养，培养瓶注明细胞名称，代数及日期。
2.2MEF的传代
1. 将T75瓶中的MEF培养基吸出。
2. 加入大约3ml胰酶，于37℃的CO2培养箱中放置3-5分钟
3. 取出瓶子，轻轻晃动，可以看见白色的细胞层开始从瓶子的底壁掉落。确保瓶盖是拧紧的。用手掌根轻拍瓶侧3-5次。在灯下观察细胞是否已从瓶子上脱落。
4. 加入同等体积（3ml）的MEF培养基，混匀，吹打几次以形成单细胞悬浮液。▲Note: 这一培养基是包含血清的，将会完全抑制胰酶的活性。
5. 补加42mlMEF培养基到瓶子中，使总体积达到50ml，混匀。
6. 将上述细胞悬浮液均分至5个新的T75瓶子中，每瓶10ml。
7. 放在5％CO2培养箱中培养，逐日观察。
2.3MEF的冻存
1. 吸去培养液，加3ml0.25％胰酶至完全覆盖瓶底（以T75为例）。
2. CO2培养箱中孵育3-5分钟，不时轻拍瓶壁，使细胞层脱落。
3. 加入同等体积的MEF培养液中和胰酶，吹打混匀。
4. 将其转移至15ml离心管，用电子计数器进行细胞计数后，以1000rpm的速度离心5分钟。
5. 移去上清，用少量新鲜的MEF培养液重悬细胞沉淀。
6. 缓慢加入等量的MEF细胞冻存液（2x）并混匀。
7. 分装上述细胞悬液于2ml冻存管中，每管0.25ml。
8. 在冻存管上注明细胞名称，代数，数目，冻存时间。
9. 将冻存管放到冻存盒中，-80℃冰箱过夜。
10. 最后将冻存管转移至液氮罐中以便长期保存。
2.4MEF的失活
1. MEF传代到3－5代时，当细胞铺满培养瓶后（以T75为例），加3ml 0.25％胰酶，放入37℃的CO2培养箱孵育3-5分钟。
2. 加入同等体积的MEF培养液中和胰酶，用移液枪吹打几次以形成单细胞悬浮液。
3. 将所有细胞悬液混合到一个50ml离心管中，补加适量新鲜的MEF培养液。
4. 取0.5ml上述细胞悬液，转移至新的15ml离心管中，用4.5ml培养液稀释，混匀。
5. 用电子计数器计数细胞。
6. 将原来的50ml离心管封口，使用gama射线辐照仪，50－80戈雷辐照。
7. 辐照完后，以1000rpm的速度离心5分钟。
8. 移去上清，用适量新鲜的MEF培养液重悬细胞。用于培养人胚胎干细胞的饲养层细胞标准浓度是～30,000 cells/cm2。按照此标准铺板。具体铺板步骤请见3饲养层细胞的准备。对于暂时不用的细胞，将其冻存，需要时复苏。具体冻存步骤请见2.3 MEF的冻存。
3.饲养层细胞的准备
材料和仪器
?CF-1小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），货号MEF-CF1-01
?成纤维细胞完全培养基，货号EFM-01
?基质胶（Matrigel matrix），BD Pharmingen，货号356235
?CO2培养箱，Thermo，HERA cell 240
?Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头
?T25透气培养瓶，NUNC，货号156367
? 2 ml移液管，NUNC，货号159617
?5ml移液管，NUNC，货号159625
?10 ml移液管，NUNC，货号159633
?电动移液器，Thermo Scientific Finnpipette C1，货号4580800
3.1加入足量的基质胶均匀铺到瓶（或孔板或皿）底部，以能覆盖全部底部为准，譬如T25透气培养瓶以超过0.5ml为宜。
3.2 37℃培养箱放置至少30min。
3.3从培养箱中取出瓶（或孔板或皿），轻轻推送板子将未被基质胶覆盖的地方再次覆盖，然后立即吸弃基质胶。
3.4加入适量成纤维细胞完全培养基（37℃预孵育超过10min），譬如T25透气培养瓶以加入4ml为宜。
3.5从液氮中取出冻存的失活过的MEF细胞，立即投入37℃水浴中，迅速解冻（1min之内）。
3.6根据预实验将相应数量的饲养层细胞加到之前已经准备好的瓶（或孔板或皿）中，混匀。推荐的饲养层细胞密度为3万cells/cm2。
Point
饲养层细胞需在ES/iPS细胞传代前两至三天准备。
饲养层细胞的密度最适宜是80－90％, 太密或是太稀疏都容易使干细胞分化。
请在铺被前先做预实验估算细胞的复苏存活率，以一个T25培养瓶计算，若存活率为90%，则铺入的细胞量应为83.3万。
▲Note: 饲养层细胞铺了10天之后推荐不再使用。
Table2培养容器的面积和需要接种的MEF细胞悬浮液的体积（接种细胞的浓度为1.5×105
▲Note: 上述细胞接种密度按人类ES/iPS细胞培养的标准计。
4.ES/iPS细胞的复苏
材料和仪器
?人类ES/iPS细胞（SiDSH -01, SiDSH -03），货号HIPS-01/03
?人类胚胎干细胞完全培养基，货号HESM-01-500
?CO2培养箱，Thermo，货号HERA Cell 240
?Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头
?电动移液器，Thermo Scientific Finnpipette C1，货号4580800
?T25透气培养皿，NUNC，货号156367
?5ml移液管，NUNC，货号159625
?15ml离心管，NUNC，货号366036
4.1 解冻人ES/iPS细胞，从液氮中取出冰冻的人类ES/iPS细胞冻存管，立即投入37℃水浴中快速的旋转以迅速解冻（控制在1min之内）。
▲Note: 水不要淹没瓶盖
4.2当只有一片冰晶存在时，从水中取出冻存管。用消毒酒精棉将冻存管外壁擦拭一遍，以去除水缸中的微生物。
4.3将细胞转移到一个预装有2ml人类胚胎干细胞完全培养基的15ml离心管中，混匀。200×g（1000rpm）, 离心5 分钟。
4.4吸弃上清液。用4ml的人类胚胎干细胞完全培养基重悬细胞沉淀。
4.5转移悬浮液到一个预铺有饲养层细胞的T25瓶中，补加人类胚胎干细胞完全培养基至总体积为5ml。
4.6将瓶放入37℃的CO2培养箱中，观察细胞每天的生长情况。
Point
复苏的第二天无需更换培养液，从第三天起每天更换新鲜的人类胚胎干细胞完全培养基。
复苏后第5天左右可以看见微小的克隆出现，之后逐渐长大。
复苏后第10-12天传代，具体情况视ES细胞生长情况而定。
5.ES/iPS细胞的传代
材料和仪器
?人类胚胎干细胞培养液（含bFGF 货号HESM-01-500 ；不含bFGF 货号HESM-02-500）
?Ⅳ型胶原酶（货号M-001）
?已经包被好饲养层细胞的培养瓶/板
?Thermo-Fisher Finnpipette F3移液器和灭过菌的枪头
?T25透气培养皿，NUNC，货号156367
?5ml移液管，NUNC，货号159625
?15ml离心管，NUNC，货号366036
?电动吸引器
Point
当出现以下情况之一即可以进行细胞传代：
1．MEF滋养层细胞生长超过两周。
2．克隆太大，或太密集。
3．当培养的ES克隆中出现越来越多的分化。
人的ES细胞传代（以T25培养瓶为例）
5.1 从培养瓶中吸出旧的人胚胎干细胞培养液
5.2 立即加入3-4ml的Ⅳ型胶原酶到瓶中，温柔的摇晃培养瓶使之覆盖到所有的细胞。
▲Note: Ⅳ型胶原酶需在37度预热。
5.3 将T25瓶重新放回37度培养箱中，放置约20min－30min。
5.4 消化期间可以处理预铺了饲养层细胞准备用来传代的新的培养瓶，处理如下：吸弃里面的成纤维细胞完全培养基，加入1ml人类胚胎干细胞培养液（不含bFGF）洗涤feeder（只要将瓶底盖过），吸弃，然后加入4-5ml新的人类胚胎干细胞完全培养基，以备传代。
5.5 待克隆消化下来后，取出培养瓶，将瓶中液体连同脱落的克隆转移到15ml 离心管里。加入2ml的人类胚胎干细胞培养液（不含bFGF），混匀。
5.6 待干细胞团块沉降下来后，吸弃上清液。
5.7 加入2ml新鲜的人类胚胎干细胞培养液（不含bFGF）洗涤细胞（即吹打重悬），待细胞沉降下来后，吸弃上清。
5.8 加入2ml新鲜的人类胚胎干细胞完全培养基重悬细胞，并用移液枪吹打克隆到适合大小，然后根据自己需要按比例传代。
Point：
在消化过程中，最好每隔10min拿出来观察一下，看是否已经开始消化。随着克隆的消化，克隆边缘部分卷起，当克隆大部分卷起，直至轻轻晃细胞就会脱落时，表明消化充分。注意：消化时间约为20－30min，根据经验，这一时间段可以将未分化的干细胞克隆消化下来，而分化的克隆就不会消化下来，所以，消化时间不宜过长，这样可以剔除分化的克隆。而如果消化不充分，会导致传代后的细胞结块。所以，要掌握好时间。 如果细胞不易沉降，则可以1000－1200rpm离心30sec－1min使细胞沉降。
传代比例通常为1：6或1：8。
传代后的注意事项：
1．传代后的第一天，不需更换新的培养液，从第二天起，每天换液。
2．传代周期为6－7days，但要视细胞状态而定，传代可以改善细胞状态。
3．传代的前两至三天预铺feeder。
6.ES/iPS细胞的冻存
材料和仪器
?人ES/iPS细胞（生长到可传代的状态，同上描述）
?人胚胎干细胞培养基（货号：HESM-01-500）
?Ⅳ胶原酶（货号M-001）
?人胚胎干细胞冻存液（2x）（货号：HESFM-01）
?15ml离心管，NUNC，货号366036
?液氮罐，Thermo，货号CN50900
?冰
?镊子
?Thermo F3移液器和灭过菌的枪头
?2ml冻存管，NUNC，货号377267
?冻存管架，NUNC，货号376589
Point：
人的胚胎干细胞可以在液氮中长期冻存。
为了得到人类胚胎干细胞的高存活率，在开始冻存步骤之前，准备好所有的材料和仪器。
冻存管在使用之前应该在冰上预冷，且应该事先将必须的信息（如细胞的名称，传代次数，细胞数目，冻存日期等）标记在管子的标签上。
冻存步骤（以T25瓶为例）：
6.1当细胞生长良好时，消化细胞（具体步骤同上述传代过程）。
6.2将消化下的细胞洗涤两次。
6.3用2ml新鲜的人胚胎干细胞培养基重悬细胞并吹打至传代大小。
6.4待克隆沉降下来后，吸弃上清。
6.5加入0.25ml新鲜的人胚胎干细胞培养基重悬细胞
6.6加入0.25ml人胚胎干细胞冻存液（2x），快速混匀。
6.7将上述0.5ml细胞悬液转移至2ml冻存管中。
6.8迅速将冻存管放入冻存盒中，-80℃冰箱过夜。
6.9最后将冻存管转移至液氮罐中以便长期保存。
7.人类胚胎干细胞的无滋养层培养
材料与仪器
7.1人类胚胎干细胞条件培养基（CM）的收集
1.配制人类胚胎干细胞培养液。
2.培养瓶加入适量明胶（覆盖瓶底即可），放入5％CO2培养箱孵育30分钟左右。
3.吸掉明胶，将辐照过的饲养层细胞按照55,000 cells/cm2浓度铺板。
4.待细胞贴壁后，换人类胚胎干细胞培养液培养液（按照0.5 ml/cm2)。
5.24小时左右开始收集培养液，之后每天收集，可持续收集7-10天。
6.CM可存放在-20℃冰箱中一个月。
7.2无饲养层人胚胎干细胞系的培养及传代
1.在培养瓶中加入适量matrigel（覆盖瓶底即可）放入培养箱孵育1小时左右。
2.吸去matrigel，将饲养层培养的人胚胎干细胞传代洗涤后，最后细胞转移到此培养瓶中，加CM培养。
3.在人胚胎干细胞克隆生长5天左右传代。吸去培养液，加dispase 5％CO2培养箱消化至克隆大部分脱壁。
4.加适量培养液，用移液管轻轻吹打使克隆脱壁。
5.将细胞悬液转移到15ml离心管中，用移液管吹打几次使细胞克隆至适当大小。
6.吸取适量混匀的悬液至小离心管中，离心沉淀，用胰酶消化成单细胞，加培养液中和，细胞计数。
7.以1000rpm的速度离心5分钟。
8.吸去上清，加CM培养液重悬细胞。
9.按照～90,000–170,000 cells/cm2将细胞接种到已铺好matrigel的培养瓶中，补加适量CM。轻轻晃动培养瓶，使克隆均匀分布在瓶底，放入5％CO2培养箱培养。
8.拟胚体的形成
材料与仪器
拟胚体（embryonic body,EB）来源于多能干细胞，且由多种分化的细胞类型组成。它可以模拟胚胎早期发育的过程，是一种很好的在体外研究早期发育中细胞和分子间作用的模型。
拟胚体的制备：将得到的iPS细胞系扩增培养后，按正常传代步骤消化下来，洗涤去除MEF细胞，将细胞吹打至小团块（比正常传代大小再小一些），然后悬浮培养在MEF培养液中。3天后换第一次液，之后每2-3天换液一次，直至收集。收集EB后用TRIZOL裂解，抽提RNA, 反转录，通过real-time PCR的方法（见real-time PCR检测的具体protocol）检测各胚层marker的表达情况。
9.胚胎干细胞全能性的鉴定
胚胎干细胞全能性的鉴定主要包括以下几个方面：
●碱性磷酸酶活性检测
●干细胞表面marker的免疫染色检测
●干性因子的去甲基化分析
●干细胞内源基因的表达分析
●端粒酶活性检测
●核型检测
●拟胚体形成
●畸胎瘤形成实验
下面分述各种鉴定的方法以及详细的操作步骤：
9.1碱性磷酸酶活性检测
材料
?PBS buffer
?4% Paraformaldehyde
?Alkaline Phosphatase Detection Kit：Sidansai，货号AP-1kit
? 1 x Rinse Buffer (e.g. TBST: 20mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.05% Tween-20)
碱性磷酸酶染色步骤：
a.Aspirate media and fix ES or iPS cells with a fixative (e.g. 4% Paraformaldehyde
in PBS) for 1-2 minutes. Note: Do not overfix. Fixing cells longer than 2 minutes will result in the inactivation of alkaline phosphatase.
b.Aspirate fixative and rinse with PBS buffer.
c.Aspirate and rinse with 1 X Rinse Buffer. DO NOT allow wells to dry.
d.Prepare reagents for Alkaline Phosphatase staining (BufferA: BufferB:
BufferC=100:38:28)
e.Add enough stain solution to cover each well (e.g. 0.5mL for a well of a 24-well
plate). Incubate in dark at room temperature for 15 minutes.
f.Aspirate staining solution and rinse wells with 1 X Rinse Buffer. Cover cells with
1 X PBS to prevent drying and then count the number of colonies expressing AP
(red stem cell colonies), versus the number of differentiated colonies (colorless).
9.2干细胞表面marker的免疫染色检测
可用的试剂盒包括：
表达于人类ES/iPS细胞中的标志物包括：
Stage-specific embryonic antigen-3(SSEA3)
Stage-specific embryonic antigen-4(SSEA4)
Tumor-related antigen-1-60(TRA-1-60)
Tumor-related antigen-1-81(TRA-1-81)
OCT4
SOX2
Nanog
表达于小鼠ES/iPS细胞中的标志物包括：
Stage specific embryonic antigen-1(SSEA-1)
OCT4
SOX2
Nanog
免疫染色步骤：
1.首先把细胞固定在4％多聚甲醛（4％PFA）中，室温放置30min;
2. 在无水乙醇中浸泡两次，每次20min（或3次，10min/次）
注意：此步骤仅限于核蛋白，如Oct4，Nanog或Rex1等，不能用于膜蛋白如SSEA
和Tra等
3. 将上述溶液吸干，先用1X PBS洗涤一次，再用抗体稀释液（0.2%BSA和0.1%TritonX100溶于PBS）洗涤两次；
4. （此步骤可不操作，进行此步骤是为了更好的封闭非特异反应）用封闭液（含
1%BSA+4% normal serum+0.4%TritonX100的PBS溶液）封闭细胞；
5. 将一抗稀释在抗体稀释液中，加到样品上，室温2h或4度放置过夜；
6. 用PBT（0.1%TritonX100）洗涤细胞3－5次；
7. 将二抗稀释在抗体稀释液中，并加到细胞样品上，室温放置1h;
注意：从步骤7开始，样品要注意避光！
8. 用PBT洗涤3次；
9. 将DAPI (1mg/ml in PBS)母液以1:1000 用PBS稀释, 室温放置5min;
OR: 将JASMIN（hochest）母液以1:1000用PBS稀释，室温放置5min;
10. 用PBS洗涤5min,两次；
11. 再用4％多聚甲醛室温固定30min；
12. 最后再用PBS洗涤两次，每次5min.
9.3干性因子的去甲基化程度分析
Bisulphite Squencing 法分析甲基化状态
（一）Bisulphite 处理基因组DNA
1、将基因组DNA置于冰上，液体石蜡冰上预冷。
2、给每个样品准备6个Ep管，每管加300ul液体石蜡。
3、准备样品：
1）每个样品取210ng的DNA，稀释到21ul。
2）新配2M的NaOH（用超纯水配，1.6g NaOH/20ml水），每管样品中加4ul （使之终浓度为0.3M）NaOH。
3）50℃，15min。
4、准备2％低熔点argrose：0.02g/ml，用双蒸水配。100℃5min，之后置于50℃待用。
5、向3中的DNA液中加入50ul 2％低熔点argrose，混匀（保持50℃）。
6、吸取上述argose和DNA混合液，加10ul/管于第二步预冷的矿物油中。冰上至少30min，使beads坚硬。
7、向beads中加入500ul 2.5M Sodium metabisulphite （新配），摇匀，使beads 位于分层上。离心甩一下。
8、50℃避光反应4h～12h，不超过16h～18h（一般12h）。
附：Sodium metabisulphite的配制总体积：20ml
I. Hydroquinone 220mg
H2O 2ml
50℃避光溶解（黄红色）
II. Sodium bisulphate 7.6g Array H2O 8ml
2M NaOH 5ml
50℃避光溶解，每隔10min晃一次，溶30min
I，II分别配好后，在暗处混合，混合后颜色变浅，降为室温即可使用。
终止反应，洗脱：
1、1ml TE ph8.0洗3次，10min/次。
2、0.5ml 0.2M NaOH 洗2次，每次15min（时间不可缩短）。
3、1ml TE ph8.0洗3次，10min/次。
4、每管beads加100ul TE，4℃保存。
（二）Bisulphite PCR
方式：巢式PCR
引物：2对
第一轮outside-forward，outside-reverse；
第二轮inside-forward，inside-reverse
注意事项：
1、第一轮的模板为beads，吸出的时候要小心，防止滑落或者弄碎。在其他都加
好之后再加beads。
2、第二轮的模板是第一轮反应的产物，为胶状，加入之前应在55度化开。
（三）纯化PCR产物(参见相关Kit说明书)
（四）连接至T-vector
体系：基本按照T-vector说明书，Solution I的体积应占总体积的一半，T-vector 每个反应0.5ul。
比如，PCR产物浓度高时可用以下体系（PCR产物浓度较低时适当增加体积）：（纯化好的PCR产物） 3 ul
T-vector 0.5 ul
3.5 ul
16℃连接过夜，第二天转化。最后挑克隆，抽质粒并且送测序即可。
9.4干细胞内源基因的表达分析
实时定量PCR检测内外源基因的表达
9.4.1抽提RNA
1.将培养板每孔上清吸掉，用移液管加500μl TRIZOL反复吹打来裂解细胞至
均一通亮的液态后，收集到1.5ml离心管中（也可将细胞收集在离心管中后再用TRIZOL裂解）。
2.每500μl TRIZOL 加0.1 ml 氯仿。盖紧样品管盖，用力摇晃试管15 秒并将
其在室温孵育2-3 分钟。在2-8℃下12,000×g 的离心力高速冷冻离心15 分钟。离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA 无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为所加TRIZOL 容量的50%。
3.将水样层转移到一干净的试管中，通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。
最初均化时的每500lμlTRIZOL 对应0.25ml 异丙醇。将混合的样品在15-30℃条件下孵育10 分钟并在2-8℃下12,000×g 的离心力高速冷冻离心
10 分钟。RNA沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管
壁和管底。
4.移去上层悬液。用75%的乙醇洗涤RNA 沉淀一次，每500μl 的TRIZOL加
0.5 ml 的75%乙醇。旋涡振荡混合样品并在2-8℃下以7,500×g的离心力高
速冷冻离心5 分钟。
5.在操作的最后，简单干燥RNA沉淀。取DEPC水来溶解RNA，并在55-60℃
下孵育10 分钟。紫外分光光度计测RNA浓度。
9.4.2反转录RNA（用反转录Kit）
1.取5μgRNA加适量DEPC水至11μl，再加1μl Oligo dT Primer 共12μl体
系混匀，70℃5分钟。
2.置冰上，加4μl反转录缓冲液，1μlRNA 抑制剂，2μldNTP混匀，37℃5
分钟。
3.置冰上，加1μl反转录酶混匀，42℃1小时。
品质部培训教材Page 1 of 20 版本：A版品质部培训教材 目录 第一章：通用基础知识----------------------------------------------- （2-3） 第二章：通用品质技术知识----------------------------------------------- （3-7） 第三章：通用工艺知识----------------------------------------------- （8-10）第四章：通用标准---------------------------------------------- （10-15）第五章：程序文件知识---------------------------------------------- （15-16）附件：---------------------------------------------- （17-21） 附件1：品质常用术语-------------------------------------------------------------- （17-18） 附件2：锂电池行业国际/国家/企业标准------------------------------------------------ （20） 附件3：筛网目数与粒径对照表----------------------------------------------------------- （21）
第一章品质部员工通用基础常识 1、国家法定假日：元旦一天，春节三天，清明节一天，端午节一天，五月一日一天，八月十五日一天、十月一日三天，总共十一天法定假。 2、火警电话是119，急救电话是120，匪警电话是110，电话故障拨112，交通事故拨122。 3、员工试用期一般为三个月，优秀者可提前满试用期，需要延长试用期者，最多可延长至六个月。所有员工上班时须提前五分钟到 岗，以便进行交接；下班时须整理好工作环境，交接清楚后方可离岗。 4、火警现场员工，如有可能，须在第一时间关闭现场各种电源，然后向起火方向相反之救生门撤离，如有较大浓烟，应立即蹲下， 用湿衣服或湿毛巾捂住口。消防设施必须齐全，并定期进行检查。消防器材放在指定位置，并处于完好状态。 5、填写文件记录时，内容应正确完整，字迹清晰，不得随意更改涂写，如果填写错误，要用划线方式更改并签名注明日期，不得使 用涂改液。品质月报须在每月二日前完成，如果二日是周六或周日，则向后顺延；所有报表及文件，请在当日内存档；请保持您的报表清楚明了，注意日期及签名是否完整，请不要在报表上使用涂改液;归档文件应在封面注明年份、日期，记录名称及部门资讯，以便查询。所有岗位必须受到相关培训后方可上岗，没有受到培训之人员，有权要求上司对其进行相关培训。 6、上班及开会最少提前3-5分钟到会；如因不可预知之原因不能按时参加，请提前通知您的上司或会议召开人； 所有班组，必须实施早会制度，以确保各种信息在品质部能得到充分沟通，时间及长短可以由当班组长确定，但一定要召开。 7、在上班前，请仔细地检查一下自己，你的着装是否符合公司要求；在上班时间，有任何电话，包括公事或私事，请走出车间接听， 请控制在3分钟内； 8、如果别的部门需要您离岗协助，请先会知您的上司并得到同意后方可离岗；上司安排您的工作时，请您确认您是否接受过相关培 训或对标准清楚明了，如果没有，请对您的上司说明，请求支援；事情完成，请向您的上司汇报；如果属品质部应知应会的，您有权要求您的上司对您或安排您进行培训；如果得不到满意答复，可以越级上诉；报告不越级，上诉可以越级；上司交待您要完成一件事情，如果在实施过程中您遇到之前不曾预料或不可越过的困难，请及时向您的上司汇报；如果完成，请记得要向您的上司回复。 9、电话铃响三声，请您务必接听，第一句话请说：你好；出差在外，如有疑难问题，请记得随时请教您的上司，请记得与公司随时 保持了联络； 10、如果您对品质部有什么建议或抱怨，请不要保持沉默，请及时向您的上司反映---因为大家相信您所做的一切，都是在为品质部 这个团队的成长在努力； 11、没有错误的客户，只有永远正确的客户，任何时候，请注意您的言行，不可非议客户，任何时候，请您尊重我们的客户，不论 这个客户对我们多么的重要或者多么的不重要；请品质部所有同仁认真对待每一宗客户投诉，从来没有哪一宗错误是单独存在的，一定有很多错误发生时才会导致一宗客户投诉的出现；请尊重我们品质部的每一位同仁，请尊重比克天津公司的每一位同仁。请务必记住：尊重他人就是尊重我们自己；请在所有人面前坚持您的判断，因为您可以对所有人说：我坚持因为我专业； 12、在上下班时，第一件事情或最后一件事情检查您的周围环境是否符合5S要求；用完的工具或文件，请务必记得回归原位，因为 我们的同仁可能随时需要它；下班前走出车间的最后一件事情是请问自己：我今天所有的事情都做完了吗？如果您有培训需求，请知会您的上司。您的成长，就是品质部和您一起成长。 13、所有须检来料，请检查完毕后方可上线，未作检查来料不得上线生产；所有来料品质超出允收标准时，请及时填写进料检验报 告，交上司处理，经上司审批并签上处理意见后，转发给各相关部门；如果你发现未经检查或标识的来料在生产线上使用，请制止或及时通知你的上司；盖章时请将章盖正并清晰明了。所有出货须经OQC检查，未经OQC检查的产品，不得以任何理由流出公司；在检查产品时候，请注意各种包装物的洁净程度。如果我们不能做到，我们就没有理由要求其它部门做到这一点； 14、请随时提醒您自己注意：是否所有的产品都有相应的标识，是否所有的产品都正确存放于应存放的位置；所有要求输入电脑的 数据库之报表，请务必在第二个工作日过完前输入，如果您有适当的理由不能按时完成，请将您的理由会知给您的上司；所有涉及要退货的原材料，请IQC在第一时间知会您的上司，由他来处理； 15、品质部发出的品质异常联络单及矫正预防处理单，必须在三个工作日内追回，若因任何原因不能追回，必须有充分的理由，并 跟踪此案顺利关闭为止；
【精益生产培训】精益生产基础知识培训 一、【课程介绍】 精益生产（LeanProduction）源于日本丰田汽车公司所创造的丰田生产方式 --- TPS （ToyotaProductionSystem）?其基本理念是通过寻找和消除生产过程中各种各样的浪费现象达到彻底降低成本的目的。它提出的准时化生产一一JIT （Just inTime）和自働化（Jidoka）极大地促进了日本工业的飞速发展，被称为“改变世界的机器”。 精益生产的运用，使丰田公司获得前所未有的生产绩效，它的利润因此超过福特与通用汽车公司利润的总和。近20年来，福特、通用电器、诺基亚、格兰仕、格力等全球卓越企业，皆以精益生产权威丰田公司作为学习标杆；世界500 强企业也纷纷引进这一先进的管理模式实施生产改造。这种管理模式作为能“抵御风险的生产系统”而被全球制造业所瞩目，被称为“最低成本的生产系统”。 21世纪，全球企业在相互激烈的竞争中进入微利时代。“精益生产”在几十年实践中得以成熟并完善。越来越多的中国企业成为精益制造者，而不再坐等昂贵的资本投入来扩大规模。精益是可以使您的工厂得到有效发展的最有前景的生产方式。 二、【课程对象】 制造业企业总经理、副总经理、生产总监、供应链总监、精益/生产经理、物流经理、采购经理、质量经理、物料经理、卓越制造经理、供应商等（本课程尤 其适合制造业企业全体干部集体参会、思考、研讨本企业的生产浪费、JIT、库存、资金周转率、缩短生产周期等相关问题，召开会后会，效果极佳）。 三、【课程收益】 （1）明确企业现场中的七大浪费，理解精益生产的精髓，最大限度地减少浪费 （2）学习准时化物料系统及实施技术，掌握混流生产及均衡生产技术，建立连续流和物料 超市控动系统 （3）掌握精益生产的一系列方法、工具 （4）学会利用生产过程中的设计、管理改进等方法，提高企业盈利能力 （5）采用精益化的控动生产系统，有效控制过程中的库存，降低制造循环时间，提高过程的循环效率（库存、资金周转率）及客户满意率 （6）如何迅速将存货削减，如何大幅缩短生产周期 （7）为精益生产在企业的具体实施打下坚实的基础 四、【教学特色】 采用讲授、游戏、头脑风暴、案例分析等多种方式，把高水平企业生产现场通过影像VCD资料搬到培训课堂。通过观看及分组讨论相结合，引导学员充分体会、领悟精益生产的精髓。 五、【培训大纲】 第一部分精益生产的理念及技术体系 ?精益生产的理念思想 ?精益生产的原理与效果
化工基础知识、安全知识培训（讲义） 一、为什么要讲化工基础知识和安全知识？ ——处理站是一个对工业废物特别是危险废物进行综合利用或无害 化处理处置的环保专业机构，似乎与化工厂没有多大关系。事实上，而我们面对的废物都是化学废物，所采用的处理手段都是化工厂常用的化工手段，二者并没有实质的区别。从广义上讲，处理站可以说是一个特殊的化工厂。因此，在从事废物处理前，掌握一定的化工基础知识很有必要。 我们常接触的化学品：三酸三碱、液氨、高锰酸钾、双氧水。详见信息卡。下面简单介绍酸碱类化工原料基础知识。 1、酸类 这里主要介绍三种重要的无机强酸：硫酸、硝酸和盐酸。 （1）硫酸：分子式为HSO，分子量98.07。硫酸是用途十分广泛的基本化工原料，可用于制造各种硫酸盐类，42如硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸镍等。 A.物理性质：纯品为无色透明油状液体，工业品有时略带浅褐色。
浓度98.3%的硫酸在15℃时密度为1.84克/厘米，3沸点338℃，为不挥发性酸。浓硫酸在340℃以上时将分解成SO和水。3B.化学性质：浓硫酸是一种无机强酸，有极强的脱水性和氧化性。浓硫酸能使棉布、纸、木料等碳水化合物脱水碳化，如与人体皮肤接触，能引起严重的化学烧伤。硫酸化学性质活泼，能与多种金属及氧化物、氢氧化物反应生成硫酸盐，与许多有机物在一定条件下也是会发生磺酸化反应。浓度为75%以下的硫酸对钢铁有强烈的腐蚀作用。 1 C.注意事项：用水稀释浓硫酸时，千万注意应该把浓硫酸慢慢地注 入水中，并且不断地搅拌，而不能把水注入浓硫酸中，以免暴沸或局部过热而溅出酸液。 （2）硝酸：俗称硝镪水，分子式为HNO，分子量63.01。广泛用于化肥、国防、染料、制药等工业。3物理性质：纯品为无色透明发烟液体，是三种无机强酸之一。浓硝酸在常温下会分解出红棕色的NO 气体，加热2或暴露在日光下可加速分解，因此有时见到的浓硝酸呈红棕色。熔点-42℃，沸点86℃。25℃时的密度为1.50克/厘米。硝酸与水能以任何比例混合。3A.化学性质：除金、铂等少数金属以外，浓硝酸能使许多金属溶解转变为硝酸盐；如与有机物接触，往往因硝酸的强烈氧化性而使其分解。因此浓硝酸碰到人体会灼伤皮肤。一份浓硝酸与三份浓盐酸混合后的混合液称王水。王水的腐蚀性更强，能溶解包括金、铂在内的绝大多数金属。 B.注意事项：在用水稀释浓硝酸时，也应将浓硝酸往水中缓慢加入，并不断搅匀。同时避免皮肤直接接触和吸入挥发出来的气体。
TL9000基础培训教材
特菲(TFE)治理信息咨询有限公司2001年8月1日
一、概述: 1987年国际标准化组织创立了ISO 9000标准。标准公布后，在世界范围内得到了迅速的推广和广泛的认可，成为全世界衡量质量治理水平与质量保证能力的公共标准。九十年代，美国三大汽车公司和航天企业在ISO9000的基础上，分不开发了自己的专门标准QS9000和AS9000。随着电讯行业的全球化，在该行业中设立一套统一的质量体系要求，差不多成为全世界电讯企业的共同需求。1996年春，以贝尔公司为首的一些电讯业知名服务提供商提出要制定一个统一的质量体系标准，并于1997年10月成立了QuEST论坛（Quality Excellence for Suppiers of Telecommunications Forum）。QuEST论坛是一个电讯业服务提供商和产品制造商之间合作和沟通的世界论坛，其目标是统一所有电讯业的质量体系标准，在现有标准和实践的基础上制订和保持一个通用的电讯业质量体系治理标准TL9000。论坛负责该标准的制定、公布和修改，并保持TL9000和其它标准的一致性。 TL9000标准共分两大部分--质量体系要求和质量体系指标。质量体系要求为电讯产品（硬件、软件和服务）的供方建立了一套通用的质量体系
要求，这些要求是在现有的行业标准（包括ISO9000国际标准）的基础之上制定的；质量体系指标定义了一系列最差不多绩效指标，以衡量和评价质量体系运行的结果。 二、TL9000的目标： ?.培养能经济有效地保证电讯产品使用性和可靠性的质量体系；?.建立并保持一套通用的质量体系要求； ?.减少电讯业质量体系标准的数量； ?.定义有效的成本绩效指标，以评价和改善质量体系运行的结果；?.促进持续改善； ?.加强客户和供应商的关系； ?.规范行业的认证过程。 三、TL9000产生的背景和意义: 电讯业的全球化是TL9000标准产生的要紧缘故。 许多电讯业的服务提供商最初都属于AT&T，1984年AT&T 分裂时开始独
安全生产教育培训的基本要求 生产经营单位的安全教育培训工作是贯彻生产经营单位方针、目标，实现安全生产和文明生产，提高员工安全意识和安全素质，防止产生不安全行为，减少人为失误的重要途径。 安全生产教育培训的目的：提高管理人员和施工人员的安全生产责任感和自觉性，认真学习有关安全生产的法律法规和安全生产基本知识；普及和提高施工人员的安全技术知识，增强安全操作技能，从而保护自己和他人的安全与健康。 《安全生产法》对安全生产教育培训作出了明确规定： 第二十条规定：生产经营单位的主要负责人和安全生产管理人员必须具备与本单位所从事的生产经营活动相应的安全生产知识和管理能力。 第二十一条规定：生产经营单位应当对从业人员进行安全生产教育和培训，保证从业人员具备必要的安全生产知识，熟悉有关的安全生产规章制度和安全操作规程，掌握本岗位的的安全操作技能。未经安全生产教育和培训合格的从业人员，不得上岗作业。 第二十二条规定：生产经营单位采用新工艺、新技术、新材料或者使用新设备，必须了解、掌握其安全技术特性，采取有效的安全防护措施，并对从业人员进行专门的安全教育和培训。 第二十三条规定：生产经营单位的特种作业人员必须按照国家有关规定经专门的安全作业培训，取得特种作业操作资格证书，方可上岗作业。 第三十六条规定：生产经营单位应当教育和督促从业人员严格执行本单位的安全生产规章制度和安全操作规程；并向从业人员如实告知作业场所和工作岗位存在的危险因素、防范措施以及事故应急措施。
第五十条规定：从业人员应当接受安全生产教育和培训，掌握本职工作所需的安全生产知识，提高安全生产技能，增强事故预防和应急处理能力。 安全理论基本知识 一、安全和安全生产 安全——是指免除了不可接受损害风险的一种状态。即消除能导致人员伤害，发生疾病、死亡，或造成设备财产破坏、损失，以及危害环境的条件。安全是相对危险而言的，在现实条件下，实现绝对的安全是不可能的，我们所说的安全是指相对安全。安全工作就是力求减少事故的发生和减少事故的损失。 安全生产——是指为了使生产过程在符合物质条件和工作秩序下进行的，防止发生人身伤亡和财产损失等生产事故，消除或控制危险、有害因素，保障人身安全与健康、设备和设施免受损坏、环境免遭破坏的总称。 二、危险 危险——是指造成事故的一种现实的或潜在的条件。 危险源——是指存在着导致伤害、疾病或财产损失、作业环境破坏或其他损失的根源或状态。是可能产生不良结果或有害结果的活动、状况或环境的潜在的或固有的特性。 危险度——是指一项活动或一种情况下，各种危险的可能性及其后果的量度，是对失败的相对可能性的主观估计。 三、事故 1、事故和事故隐患：
企业安全基础知识教育培训教材
目录 基础知识 (3) 法律法规 (5) 1、引用文件 (5) 2劳动保护的具体内容 (5) 3员工的安全生产八大权利 (5) 4员工的安全生产四项义务 (6) 5工伤认定基本知识 (6) 6职业病防治 (8) 7特殊作业工种内容 (9) 安全管理 (10) 1安全管理十须知 (10) 2安全生产十不准 (13) 3安全生产的“三宝” (14) 安全防护 (16) 1安全用电主要应对措施 (16) 2车辆伤害主要应对措施 (16) 3物体打击主要应对措施 (16) 4高处作业坠落安全措施 (17) 5乘坐电梯安全防护措施 (17) 6如何做好安全防护 (18)
基础知识 1新员工“三级”安全教育的概念： 三级安全教育是指新入职员工的公司级安全教育、部门级安全教育、班、组级安全教育。 2什么是安全生产，它的意义是什么？ 安全生产： 是指在劳动生产过程中，通过努力改善劳动条件，克服不安全因素，防止事故的发生，使企业生产在保证劳动者安全健康和国家财产及人民生命财产安全的前提下顺利进行。 包括两个方面的安全： ①人身安全（包括劳动者本人及相关人员）； ②设备安全、安全生产工作：为搞好安全生产而开展的一系列活动。 3什么是安全技术？ 安全技术： 为了预防或消除事故根源，对生产过程中可能存在着有害于工人人身安全健康或有损于机器设备的燃烧、爆炸、触电、绞辗、高空坠落、尘毒污染等危险因素，从设计、工艺、生产组织、操作等方面所采取的各种技术措施。 4什么是安全生产责任制？ 安全生产责任制:
根据安全生产法律法规和企业生产实际，将各级领导、职能部门、工程技术人员、岗位操作人员在安全生产方面应该做的事及应负的责任加以明确规定的一种制度。 5方针与原则 安全生产方针： 安全第一，预防为主，综合治理。 消防方针： 预防为主，防消结合。 安全生产管理的基本原则： 管生产必须管安全。 6员工安全生产的主要职责： ①遵守有关设备维修保养制度的规定； ②自觉遵守安全生产规章制度和劳动纪律； ③爱护和正确使用机器设备、工具，正确佩戴防护用品； ④关心安全生产情况，向有关领导或部门提出合理化建议； ⑤发现事故隐患和不安全因素要及时向组织或有关部门汇报； ⑥发生工伤事故，要及时抢救伤员、保护现场，报告领导，并协助调查工作； ⑦努力学习和掌握安全知识和技能、熟练掌握本工种操作程序和安全操作规程； ⑧积极参加各种安全活动，牢固树立“安全第一”思想和自我保护意识；
质量管理基础知识 培训教材 第一章质量管理的基本概念 第一节质量常用术语 1、质量 一组固有特性满足要求的程度。 2、要求 明示的、通常隐含的或必须履行的需求或期望。 3、顾客 接受产品的组织或个人。顾客可以是组织内部的或外部的。 4、顾客满意 顾客对其要求已被满足的程度的感受。 5、体系（系统）
相互关联或相互作用的一组要素。 6、管理体系 建立方针和目标并实现这些目标的体系。 7、质量管理体系 在质量方面指挥和控制组织的管理体系。 8、质量方针 由组织的最高管理者正式发布的该组织总的质量宗旨和方向。 9、质量目标 在质量方面所追求的目的。 10、最高管理者 在最高层指挥和控制组织的一个人或一组人。 11、质量管理 在质量方面指挥和控制组织的协调的活动。在质量方面的指挥和控制活动，通常包括制定质量方针和质量目标以及质量策划、质量控制、质量保证和质量改进。 12、质量策划 质量管理的一部分，致力于制定质量目标并规定必要的运行过程和相关资源以实现质量目标。 13、质量控制 质量管理的一部分，致力于满足质量要求。 14、质量保证 质量管理的一部分，致力于提供质量要求会得到满足的信任。 15、质量改进
质量管理的一部分，致力于增强满足质量要求的能力。 16、持续改进 增强满足要求的能力的循环活动。制定改进目标和寻求改进机会的过程是一个持续过程，该过程使用审核发现和审核结论、数据分析、管理评审或其他方法，其结果通常导致纠正措施或预防措施。 17、组织 职责、权限和相互关系得到安排的一组人员及设施。 18、相关方 与组织的业绩或成就有利益关系的个人或团体。 19、产品 过程的结果。有下述四种通用的产品类别： 1)服务（如运输）； 2)软件（如计算机程序、字典）； 3)硬件（如发动机机械零件）； 4)流程性材料（如润滑油）。 20、程序 为进行某项活动或过程所规定的途径。 21、特性 1)物理的（如：机械的、电的、化学的或生物学的特性）； 2)感官的（如：嗅觉、触觉、味觉、视觉、听觉）； 3)行为的（如：礼貌、诚实、正直）； 4)人体工效的（如：生理的特性或有关人身安全的特性）； 5)功能的（如：飞机的最高速度）。
成套电器设备安装接线基础知识培训教材 培训教材 成套安装接线基础知识 作为一个从事成套电气设备行业的员工：要做好本职工作，他必须要掌握有关成套电器设备在用电配电系统中起的作用。同时懂得一些技术知识及最基本的装配、接线技能要求，做到安全生产、文明生产。要学会看懂、领会有关的图纸。图纸是工程技术界的共同语言，设计部门用图纸表达设计思想意图；生产部门用图纸指导加工与制造；使用部门用图纸指导使用、维修和管理；施工部门用图纸编制施工计划、准备材料组织施工等。 从事成套设备行业的员工要想做好本职工作，就必需要树立文明生产的观念。 在日常生产过程中处处以有关工艺要求来提高质量意识，明确质量就是企业的生命的重要性，要讲究工作效益，创造一个良好的工作环境，有了一个舒畅的工作环境，才能更好地提高工作效益，也就是要处处注意周围的环境卫生，同时在日常的工作中，同事之间要互相配合、互相尊重、互相关照；在技术方面要相互交流经验，不断完善自己，养成对完工工作任务做到自检、互检、后报检的良好工作习惯，来确保质量，为企业创造更好的效益。 要想做好本职工作：（1）每个员工必须做到应该知道什么？熟悉什么？能看懂什么？就成套电器产品而言，每个员工应该知道产品的结构形式、用途；应该熟悉产品的性能、内部的结构、主要的技术参数；应该看懂系统图（一次方案图）、平面布置图、原理图、二次接线安装图。（2 ）每位员工必须知道什么是三按生产： 按图纸生产；按工艺生产；按技术规范生产。质量管理方面“五不”，①材料不合格不投料；②上道工序不 合格不流入下道工序；③零件、元器件不合格不装配；④装配不合格不检验；⑤检验不合格不出厂。在日常工作中要有一个比较合理的、完整的装配接线计划。电力的生产、输送、分配和使用，需大量的各种类型的电器设备，以构成电力发、输、配的主系统。这些设备主要是指发电机、变压器、隔离开关、断路器、电压互感器、电流互感器、电力电容器、避雷器、电缆、母 线等。它们在电力系统中通常称为一次设备，把这些设备连接在一起组成的电路称为一次接线，也称主接线， 也就是一次方案回路。为了使电力生产、传输、分 配和使用的各环节安全、可靠、连续、稳定、经济、灵活的运行，并随时监视其 工作情况，在主系统外还需装置相当数量的其它设备，如测量仪表、自动装置继电保护远动及控制信号器具等，这些设备通常与电流、电压互感器的二次绕组直流回路或厂用所用的低压回路连接起来，它们构成的回路称为二次回路，接线称二次接线。描述二次回路的图纸称为二次接线或二次回路（其中包括辅助回路）图。 二次接线的图纸一般有三种形式，即原理图、原理展开图和安装接线图（我们通常所用的是二次接线图）。 在二次接线图中所使用的图形符号和文字符号，它不但用于代表二次接线图中的各电器设备与元件的所在位置，而且反映它所发挥的作用。在二次接线图中，断路器、隔离开关、接触器的辅助触头及继电器的触点，所表示的位置是这些设备在正常状态的位置。所谓正常状态就是指断路器、隔离开关、接触器及继电器处于断路和失电状态。所谓常开、常闭触点是指这些设备在正常状态即断路或失电状态下辅助触点是短开或闭合 的。 二次接线的原理图是用来表示继电保护测量仪表、自动装置的工作原理的。通常是将二次接线和一次接线中与二次接线有关部分画在一起。在原理图上，所有仪表、继电器和其他电器都是以整体形式表示的，其相互联系的电流回路、电压回路、直流回路都是综合在一起，而且还表示有关的一次回路的部分。这种接线图的特点是能够使看图者对整个装置的构成和动作过程有一个明确的整体概念，
精益生产管理基础知识-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN
精益生产管理基础知识 的准确定义：兵装集团精益生产体系 十二大模块：领导能力、人才培训、班组建设与管理、形象塑造及行为规范、制造工程与过程控制、设备及工装管理、质量管理、物流及计划管理、成本控制、信息化建设与应用、职业健康安全管理、环境管理。 3.八大意识：学习意识、危机意识、精益意识、参与意识、创新意识、集体意识、成本意识、持续改进意识。 衡量指标： 安全----S 质量----Q 交付----D 成本----C 士气----M 环境----E 5.精益生产的基本思想：消除浪费（七大浪费） 过量的生产浪费；生产不良产品是浪费；停工等待是浪费；多余的动作是浪费；搬运零件是浪费；加工本身的浪费；库存的浪费。 :整理（SEIRI）整顿（SEITON）清扫（SEISOU）清洁(SEIKETSU) 素养（SHITSUKEI）安全（SAFETY） :全员生产维护 特点是三全：全效率、全系统、全员
9.润滑“5定”：即定点、定质、定量、定时、定人 (四巧)技术：取消、合并、重排、简化 11.价值流：区分产品生产过程中的增值活动和非增值活动；价值流的分析的目的：消除非增值活动。 12.快速转换：以团队工作为基础，通过分析过程的每个组成要素，采用适当的技术和装置缩短切换时间和生产周期。 :单点教育 14.标准作业：是将作业人员、作业顺序、工序设备的布置、物流过程等问题作最合适的组合，以达到生产目标而设立的作业方法。 15.看板：分为管理看板、生产看板、物流看板，看板管理的目的是确保必须的产品在必须的时间按必须的数量旨在出来。 16.五品、四数： 五品：合格品、返修品、废品、在制品、半成品 四数：投入数、产出数、废品数、返修品数 计划、执行、检查、标准化 5Y--连续问 5个为什么， 2W--什么时候、什么地点， 2H--怎样改进、需要哪些资源。 19.应用的技术和工具有哪些
冲压设备基础知识培训教材 压力机机械结构原理 一：压力机的种类 冷冲压用压力机主要分为：曲柄压力机，螺旋压力机（摩擦压力机），多 工位自动压力机，冲压液压机，冲模回转头压力机，高速压力机，精密冲裁压力机，电磁压力机等。钣金厂所用的压力机主要是曲柄压力机。 二：曲柄压力机的工作原理和特点 曲柄压力机主要是通过曲柄机构增力和改变运动形式（将旋转运动变成直线往复运动）。它主要是利用飞轮来储存和释放能量，使压力机产生工作压力来完成冲压作业。 曲柄压力机有曲拐式、曲轴式、偏心齿轮式等几种。 曲柄压力机一般由于曲轴、曲拐、偏心齿轮在设计加工时就确定了其偏心距，所以机床的工作行程是不可改变的。 三：曲柄压力机的形式和用途 1.通用冲床：适用于多种冲压工序，如冲裁、浅拉伸\弯曲和压印等。 2.拉伸冲床：有上传动和下传动之分，单动、双动、三动等拉延冲床。 3.专用冲床：用来专门冲压某个复杂零件用的冲床。 4.精冲冲床：专门用于冲裁精密零件的冲床。 5.精压机：用于精密挤压、校平、压印等。 6.高速冲床：多用于生产大批量制品自动成形作业。 四：曲柄压力机的构成 冷冲压用曲柄压力机的结构除曲轴形式（曲拐式、曲轴式、偏心齿轮式）有差异，其余部份基本相似，曲柄压力机一般由以下几部份组成： 1.工作机构：曲柄连杆机构，由曲轴、连杆、滑块组成。 2.传动系统：包括皮带传动、齿轮传动等机构。 3.操纵系统：离合器—制动器等。 4.支承部件：机身结构。 5.能源系统：电动机、飞轮。 6.除上述部份外，还有多种辅助装置，如润滑系统，保险装置，气垫等。五：压力机各组成部份的构成和作用说明 1.机身：机身是将压力机所有的机构联结起来，并保证全机所要求的精度 和强度。一般由床身、底座、工作台，立柱、上横梁等组成。有开式结构和闭式结构。 2.传动轴和曲轴：电动机通过皮带把能量传递给飞轮，再通过传动轴经小 齿轮、大齿轮传给曲轴并经曲轴、连杆，将曲轴的旋转运动变成滑块的直线往复运动。 3.连杆：连杆由上下轴瓦装在曲轴上，下端与滑块相连。是旋转运动与直
安全基础知识
安全基础知识 安全管理科学理论与安全管理技术方法（安全管理的基本概念和原理） 一、安全管理基础 1、什么是安全管理：是指以国家的法律、规定和技术标准为依据，采取各种手段，对企业生产 的安全状况，实施有效制约的一切活动。（内容包括行政管理；技术管理；工业卫生管理； 2、职业安全卫生管理的目的：是企业管理的重要组成部分，它是调整劳动关系的重要内容，是 生产经营的重要保证，是企业获取经济效益的必要条件。 3、安全生产保障的三大对策：工程技术的对策、安全教育的对策、安全管理的对策。工程技术 对策就是要尽量通过采用先进的生产工艺技术，采取有效的安全技术措施，从硬件上达到技术所要求的安全生产科学标准；教育对策就是对企业职工进行全员教育，提高职工的安全知识和技能，提高职工的安全素质，从而防止人因事故；管理对策就是通过强制管理和科学管理使人员、技术、设备和工具、生产环境等各种安全生产要素得到有机的协调。 4、安全生产管理的基本原则：①生产与安全统一的原则，即在安全生产管理中要落实“管生产必 须管理安全”的原则；②三同时原则：新建、改建、扩建的项目，其安全卫生设施和措施要与主体工程同时设计，同时施工，同时投产运营；③五同时原则：企业领导在计划、布置、检查、总结、评比生产的同时，还应计划、布置、检查、总结、评比安全；④三同步原则，企业在考虑经济发展、进行机制改革、技术改造时，安全生产方面要与之同步规划、同步组织实施、同步运作投产；⑤三（四）不放过原则：发生事故后，要做到事故原因没查清，当事人和群众未受到教育，整改措施未落实三不放过。事故责任者没有受到严肃处理不放过 5、安全管理的对象：是安全生产系统（它包括的要素是：生产的人员、生产的设备和环境、生 产的动力和能量，以及管理的信息和资料）“人、机、料、法、环”
设备基础知识
目录 第一章：泵的基础知识 第一节：离心泵 第二节：计量泵 第三节：螺杆泵 第四节：滑片泵 第五节：屏蔽泵 第二章：汽轮机 第三章：螺杆压缩机 第四章：搅拌器 第五章：换热器
第一章泵的基础知识 第一节：离心泵 1.离心泵的主要性能参数 离心泵的主要性能参数有流量、扬程、功率、汽蚀余量和效率等。 （1）流量：泵的流量有体积流量和质量流量之分，体积流量是泵在单位时间内所抽送的液体体积，即是从泵的 压出口截面所排出的液体体积。体积流量用Q表示,其 单位为m3/s、 m3 /min、m3/h或L/s。有时也用质量流 量表示，质量流量则是泵在单位时间内所抽送的液体质 量，质量流量q表示，单位为kg/s、kg/min、和t/h。（2）扬程：泵的扬程H——单位重量液体流过泵后的总能量的增值。或者作功元件对泵排出的单位重量液体所 作的有效功（单位为m—液柱）。 （3）功率：泵的功率是指泵的输入功率，以P表示，即是原动机传递给泵轴的功率，又叫轴功率。有时叫制动 功率BHP，是一台泵完成待定量的工作所需要的功率。
泵出输入功率外，还有输出功率，即是液体流过时由泵传递给它的有用功率，又叫水力功率HHP，输出功率有时叫做水功率，是泵输送液体所需要的功率，不包括损失。也就是质量流量ρQ与单位质量的流体通过泵时能量的增值gH 的乘积，以Pu表示： Pu= ρQH/1000（KW） (4) 效率：泵效率（总效率）η是衡量泵工作是否经济的指标，定义为： η= Pu/P, 即有效功率与轴功率的比值 除了以上所述，离心泵还有一个重要性能参数就是泵的允许吸上真空度〔H s〕或允许汽蚀余量〔NPSH〕，单位均以米——液柱表示。 离心泵的主要性能参数之间存在着一定的关系，可用实验测定。将实验结果标绘于坐标纸上，得出一组曲线，称为离心泵的特性曲线。图1-3-2为某型号离心泵在转速为 2900r/min时的特性曲线。 2．离心泵的汽蚀 2.1.汽蚀机理及其危害 在叶片入口附近的非工作面上存在着某些局部低压区，当处于低压区的液流压力降低到对应液体温度的饱和蒸汽压时，液体便开始汽化而形成气泡。气泡随液流在流道中流动
开平市富利来塑胶企业有限公司 ISO9000质量管理体系 基础知识培训教材 企业内部培训教材，请勿转载或复制 编辑：jack.shi 2005年4月15日
第一章重要术语 1.过程 process 一组将输入转化为输出的相互关联或相互作用的活动。 注1：一个过程的输入通常是其他过程的输出。 注2：组织为了增值通常对过程进行策划并使其在受控条件下运行。 注3：对形成的产品是否合格不易或不能经济地进行验证的过程，通常称之为“特殊过程”。 2.产品 product 过程的结果。 注1：有下述四种通用的产品类别： ——服务（如运输）； ——软件（如计算机程序、字典）； ——硬件（如发动机机械零件）； ——流程性材料（如润滑油）。 许多产品由不同类别的产品构成，服务、软件、硬件或流程性材料的区分取决于其主导成分。例如：外供产品“汽车”是由硬件（如轮胎）、流程性材料（如：燃料、冷却液）、软件（如：发动机控制软件、驾驶员手册）和服务（如销售人员所做的操作说明）所组成。 注2：服务通常是无形的，并且是在供方和顾客接触面上至少需要完成一项活动的结果。服务的提供可涉及，例如： ——在顾客提供的有形产品（如维修的汽车）上所完成的活动； ——在顾客提供的无形产品（如为准备税款申报书所需的收益表）上所完成的活动； ——无形产品的交付（如知识传授方面的信息提供）； ——为顾客创造氛围（如在宾馆和饭店）； 软件由信息组成，通常是无形产品并可以方法、论文或程序的形式存在。 硬件通常是有形产品，其量具有计数的特性。流程性材料通常是有形产品，其量具有连续的特性。硬件和流程性材料经常被称之为货物。 注3：质量保证主要关注预期的产品。 3.质量quality
\\ 化工基础知识、安全知识培训 （讲义） 一、为什么要讲化工基础知识和安全知识？ ——处理站是一个对工业废物特别是危险废物进行综合利用或无害化处理处置的环保专业机构，似乎与化工厂没有多大关系。事实上，而我们面对的废物都是化学废物，所采用的处理手段都是化工厂常用的化工手段，二者并没有实质的区别。从广义上讲，处理站可以说是一个特殊的化工厂。因此，在从事废物处理前，掌握一定的化工基础知识很有必要。 我们常接触的化学品：三酸三碱、液氨、高锰酸钾、双氧水。详见信息卡。下面简单介绍酸碱类化工原料基础知识。 1、酸类 这里主要介绍三种重要的无机强酸：硫酸、硝酸和盐酸。 （1）硫酸：分子式为H2SO4，分子量98.07。硫酸是用途十分广泛的基本化工原料，可用于制造各种硫酸盐类，如硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸镍等。 A.物理性质：纯品为无色透明油状液体，工业品有时略带浅褐色。浓度98.3%的硫酸在15℃时密度为1.84克/厘米3，沸点338℃，为不挥发性酸。浓硫酸在340℃以上时将分解成SO3和水。 B.化学性质：浓硫酸是一种无机强酸，有极强的脱水性和氧化性。浓硫酸能使棉布、纸、木料等碳水化合物脱水碳化，如与人体皮肤接触，能引起严重的化学烧伤。硫酸化学性质活泼，能与多种金属及氧化物、氢氧化物反应生成硫酸盐，与许多有机物在一定条件下也是会发生磺酸化反应。浓度为75%以下的硫酸对钢铁有强烈的腐蚀作用。
C.注意事项：用水稀释浓硫酸时，千万注意应该把浓硫酸慢慢地注入水中，并且不断地搅拌，而不能把水注入浓硫酸中，以免暴沸或局部过热而溅出酸液。 （2）硝酸：俗称硝镪水，分子式为HNO3，分子量63.01。广泛用于化肥、国防、染料、制药等工业。 物理性质：纯品为无色透明发烟液体，是三种无机强酸之一。浓硝酸在常温下会分解出红棕色的NO2气体，加热或暴露在日光下可加速分解，因此有时见到的浓硝酸呈红棕色。熔点-42℃，沸点86℃。25℃时的密度为1.50克/厘米3。硝酸与水能以任何比例混合。 A.化学性质：除金、铂等少数金属以外，浓硝酸能使许多金属溶解转变为硝酸盐；如与有机物接触，往往因硝酸的强烈氧化性而使其分解。因此浓硝酸碰到人体会灼伤皮肤。一份浓硝酸与三份浓盐酸混合后的混合液称王水。王水的腐蚀性更强，能溶解包括金、铂在内的绝大多数金属。 B.注意事项：在用水稀释浓硝酸时，也应将浓硝酸往水中缓慢加入，并不断搅匀。同时避免皮肤直接接触和吸入挥发出来的气体。 （3）盐酸：分子式为HCl，分子量36.46。盐酸是一种无机强酸，学名为氢氯酸，是氯化氢的水溶液。 A.物理性质：纯品盐酸为无色透明有刺激性气味的液体，当含有铁离子等杂质时呈微黄色。熔点-114.2℃，沸点85.08℃，密度1.64克/升。 B.化学性质：盐酸能与许多金属反应而使之溶解，能与金属氧化物、碱和部分盐类起化学反应。浓盐酸（36%）在潮湿的空气中能冒烟，触及氨气因生成氯化铵微小颗粒而呈白色烟雾状。 C.注意事项：盐酸对人体皮肤有强腐蚀性，其气体（氯化氢）对动植物有害。 2、碱类
安全用电基本知识 电力作为一种最基本的能源，是国民经济及广大人民日常生活不可缺少的东西。由于电本身看不见、摸不着，它具有潜在的危险性。只有掌握了用电的基本规律，懂得了用电的基本常识，按操作规程办事，电就能很好地为人民服务。否则，会造成意想不到的电气故障，导致人身触电，电气设备损坏，甚至引起重大火灾等。轻则使人受伤，重则致人死亡。所以，必须高度重视用电安全问题。 一、触电 1、触电的危害 当人体触及带电体，或者带电体与人体之间闪击放电，或者电弧及人体时，电流通过人体进入大地或其他导体，形成导电回路，这种情况，就叫触电。触电时人体会受到某种程度的伤害，按其伤害程度不同可分为电击和电伤两种。 电击是指电流通过人体时所造成的内伤。它可以使肌肉抽搐，内部组织损伤，造成发热发麻，神经麻痹等。严重时将引起昏迷、窒息，甚至心脏停止跳动而死亡。通常说的触电就是电击。触电死亡大部分由电击造成。 电伤是指触电时，人体与带电体接触不良部分发生的电弧灼伤，或者是人体与带电体接触部分的电烙印，由于被电流熔化和蒸发的金属微粒等侵入人体皮肤引起的皮肤金属化。这此伤害会给人体留下伤痕，严重时也可能致人死亡。电伤通常是由电流的热效应，化学效应或机械效应造成的。 电击和电伤也可能同时发生，这在高压触电事故中是常见的。 2、触电电流的大小对人体的危害程度 (1)当人体流过工频1mA或直流5mA电流时，人体就会有麻、刺、痛的感觉。
(2)当人体流过工频20～50mA或直流80mA电流时，人就会产生麻痹、痉挛、刺痛，血压升高，呼吸困难。自己不能摆脱电源，就有生命危险。 (3)当人体流过100mA以上电流时，人就会呼吸困难，心脏停跳。 一般来说，10mA以下工频电流和50mA以下直流电流流过人体时，人能摆脱电源，故危险性不太大。 3、与触电电流大小有关的因素 触电对人体的伤害程度主要表现为触电电流的大小。引起触电电流大小的变化，与以下因素有关。 (1)人体电阻： 人体电阻主要是皮肤电阻，表皮0.05～0.2mm厚的角质层的电阻很大，皮肤干燥时，人体电阻约为6～10kΩ，甚至高达100kΩ；但角质层容易被破坏，除了质层的皮肤电阻约为800～1200Ω；内部组织的电阻约为500～800Ω。 (2)触电电压： 电压越高，危险性就越大。人体通过10mA以上的电流就会有危险。因此，要使通过人体的电流小于10mA，若人体电阻按1200Ω算，根据欧姆定律：U=IR=0.01×1200=12V。如果触电电压小于12V，电流小于10mA，人体是安全的。我国规定：特别潮湿，容易导电的地方，12V为安全电压。如果空气干燥，条件较好时，可用24V或36V电压。一般情况下，12V、24V、36V是安全电压的三个级别。 (3)触电时间：触电时间越长，后果就越严重。触电电流与时间的关系为：电流的毫安乘以持续时间，以mA·s表示。我国规定50mA·s为安全值。超过这个数值，就会对人体造成伤害。
化工基础知识、安全知识培训 （讲义） 一、为什么要讲化工基础知识和安全知识？ ――处理站是一个对工业废物特别是危险废物进行综合利用或无害化处理处置的环保专业机构，似乎与化工厂没有 多大关系。事实上，而我们面对的废物都是化学废物，所采用的处理手段都是化工厂常用的化工手段，二者并没有实质的区别。从广义上讲，处理站可以说是一个特殊的化工厂。因此，在从事废物处理前，掌握一定的化工基础知识很有必要。 我们常接触的化学品：三酸三碱、液氨、高锰酸钾、双氧水。详见信息卡。下面简单介绍酸碱类化工原料基础知识。 1、酸类 这里主要介绍三种重要的无机强酸：硫酸、硝酸和盐酸。 （1）硫酸：分子式为H2SO4，分子量98.07。硫酸是用途十分广泛的基本化工原料，可用于制造各种硫酸盐类，如硫酸亚铁、硫酸铜、硫酸镍等。 A.物理性质：纯品为无色透明油状液体，工业品有时略带浅褐色。浓度98.3%的硫酸在15 C时密度为1.84克/厘米3, 沸点338 C,为不挥发性酸。浓硫酸在340 C以上时将分解成SO3和水。 B.化学性质：浓硫酸是一种无机强酸，有极强的脱水性和氧化性。浓硫酸能使棉布、纸、木料等碳水化合物脱水碳化，如与人体皮肤接触，能引起严重的化学烧伤。硫酸化学性质活泼，能与多种金属及氧化物、氢氧化物反应生成硫酸盐， 与许多有机物在一定条件下也是会发生磺酸化反应。浓度为75% 以下的硫酸对钢铁有强烈的腐蚀作用
C.注意事项：用水稀释浓硫酸时，千万注意应该把浓硫酸慢慢地注入水中，并且不断地搅拌，而不能把水注入浓硫酸中，以免暴沸或局部过热而溅出酸液。 (2)硝酸：俗称硝镪水，分子式为HN03，分子量63.01。广泛用于化肥、国防、染料、制药等工业。 物理性质：纯品为无色透明发烟液体，是三种无机强酸之一。浓硝酸在常温下会分解出红棕色的NO2 气体，加热 或暴露在日光下可加速分解，因此有时见到的浓硝酸呈红棕色。熔点-42 C,沸点86 C。25 C时的密度为1.50克/厘米3。硝酸与水能以任何比例混合。 A.化学性质：除金、铂等少数金属以外，浓硝酸能使许多金属溶解转变为硝酸盐；如与有机物接触，往往因硝酸的强烈氧化 性而使其分解。因此浓硝酸碰到人体会灼伤皮肤。一份浓硝酸与三份浓盐酸混合后的混合液称王水。王水的腐蚀性更强，能溶解包括金、铂在内的绝大多数金属。 B.注意事项：在用水稀释浓硝酸时，也应将浓硝酸往水中缓慢加入，并不断搅匀。同时避免皮肤直接接触和吸入挥发出来的 气体。 (3)盐酸：分子式为HCI，分子量36.46。盐酸是一种无机强酸，学名为氢氯酸，是氯化氢的水溶液。 A.物理性质：纯品盐酸为无色透明有刺激性气味的液体，当含有铁离子等杂质时呈微黄色。熔点-114.2 C,沸点85.08 C, 密度 1.64 克/升。 B.化学性质：盐酸能与许多金属反应而使之溶解，能与金属氧化物、碱和部分盐类起化学反应。浓盐酸( 36% )在潮湿的空气 中能冒烟，触及氨气因生成氯化铵微小颗粒而呈白色烟雾状。 C.注意事项：盐酸对人体皮肤有强腐蚀性，其气体(氯化氢)对动植物有害。 2、碱类