超氧化物歧化酶的研究与应用
霍荣辉
运城学院，运城，2006142121
摘要：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD)，是一类广泛存在于生物体内的金属酶，能够催化超氧阴离子自由基(O2-)发生歧化反应，平衡机体内的氧自由基，己成为化学及生物化学研究领域中热门的研究课题。作为生物体内超氧阴离子自由基的清洁剂，SOD 在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能，在医学、食品、化妆品等领域得到越来越多的应用。目前，世界各地学者对SOD的研究方兴未艾，深入研究SOD不仅有着重大的理论意义，也有着重大的实际应用价值。现从分类、分布、结构、性质、催化机理、制备、应用等方面探讨了超氧化物歧化酶的基础研究进展。
关键字：超氧化物歧化酶；SOD；自由基；应用；研究
1SOD概述：
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是一种广泛存在于生物体内，能清除生物体内的超氧阴离子自由基(O2-)维持机体中自由基产生和清除动态平衡的一种金属酶。具有保护生物体，防止衰老和治疗疾病等作用。
1938年Mann和Keilin[1]首次从牛红细胞中分离出一种蓝色的含铜蛋白质(Hemocuprein)，1969年Mccord及Fridovich[2]发现该蛋白有催化O2，发生歧化反应的功能，故将此酶命名为超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD，EC1.15.1.1)。现已发现了3种类型的SOD：Cu/Zn SOD、Mn-SOD、Fe-SOD[3]。
2SOD的分布、分类及理化性质
2.1SOD的分布与分类
SOD是一类清除自由基的蛋白酶，对需氧生物的生存起着重要的作用，是生物体防御氧毒性的关键。迄今为止，科学家已从细菌、真菌、原生动物、藻类、昆虫、鱼类、植物和哺乳动物等生物体内都分离得到了SOD。基于金属辅基不同，这些SOD至少可以分为Cu/ Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD三种类型。
表1 SOD的分类及分布
注: Fe- SOD 也可能存在于真核藻类及植物叶绿体基质中[4]
2.2SOD的催化机理
超氧化物歧化酶作用的底物是超氧阴离子自由基(O2-)，它既带一个负电荷，又只有一个未成对的电子。在不同条件下，O2-既可作还原剂变成O2，又可作氧化剂变成H2O2，H2O2又在过氧氢酶(Catalase，CAT)的作用下，生成H2O和O2，由此可见，有毒性的O2-在H2O2又在过氧氢酶(Catalase，CAT)的作用下，生成H2O 和O2，由此可见，有毒性的O2-在SOD和CAT共同作用下，变成了无毒的H2O 和O2。超氧化物歧化酶是机体内天然的自由基清除剂，催化超氧阴离子自由基(O2-)发生歧化反应，清除的超氧阴离子自由基(O2-)对机体的作用。SOD催化O2-的反应如下：
2O2-+2H+ SOD H2O2+O2
2H2O2CAT 2H2O+O2(CAT为过氧化物酶)
H2O2+2GSH GSHPX GSSG+2H2O(GSHPX为谷胱甘肽过氧化物酶)
3SOD的结构和活性影响因素
3.1SOD的结构
超氧化物歧化酶(SOD)从结构上可分为两族：Cu/Zn-SOD为第一族，Mn-SOD 和Fe-SOD为第二族。天然存在的SOD，虽然活性中心离子不同，但催化活性部位却具有高度的结构同一性和进化的保守性，即活性中心金属离子都是与3或4个组氨酸(His)、咪唑基(Mn-SOD含1个天门冬氨酸羧基配位)和1个H2O分子呈畸变的四方锥或扭曲的四面体配位。CuZn-SOD作为SOD结构上的第一族，是人们对于SOD结构研究的突破口，也是人们了解最多的一种SOD。比较不同来源的Cu/Zn-SOD的氨基酸序列可以发现，它们的同源性都很高[6]。有些氨基酸还很保守，在所有序列中都不变，这暗示着这些氨基酸与活性中心有关。Cu/Zn-SOD每个分子由两个亚基通过疏水作用和氢键力缔合成二聚体,肽链内部由半胱氨酸C55和C144的巯基构成的二硫桥对亚基缔合起重要作用。Richardson用0.2nmX-射线衍射晶体结构分析得到Cu/Zn-SOD三维结构，指出SOD的活性部位是以Cu为中心的一个“疏水口袋”(见图1)[5]。
图1 天然Cu/Zn-SOD活性中心结构
Cu和Zn处在疏水口袋底部，相距约0.63nm。Cu(Ⅱ)与四个组氨酸残基咪唑环上N原子配位形成变形的平面四方形结构，其轴向位置上还结合着一个水分子，Zn(Ⅱ)则与三个组氨酸和一个天冬氨酸配位形成畸变的四面体结构，Cu(Ⅱ)与Zn(Ⅱ)之间通过共同连接一分子组氨酸而形成“咪唑桥”结构。
Mn-SOD和Fe-SOD同属于SOD结构上的第二族，Mn-SOD是由203个氨基酸残基构成的四聚体，Mn(Ⅲ)是处于三角双锥配位环境中，其中一轴向配位为水分子，另一轴向被蛋白质辅基的配位His-28占据，另3个配基His-83、His-170和Asp-166位于赤道平面。Fe-SOD的结构比较简单且与Mn-SOD类似，且活性中心是由3个His，1个Asp和1个H2O扭曲四面体配位而成[7]。
3.2SOD的活性影响因素
SOD的催化活性主要与SOD活性中心的氨基酸残基、金属离子及其配位环境、“咪唑桥”的变化有关。SOD活性中心的精氨酸和组氨酸对SOD的催化活性具有极其重要的意义。这两个氨基酸离中心金属离子非常近,而且均带有正电荷,能诱导底物O2-.，进入活性中心，并可在催化过程中提供H+以加快歧化反应速度。如这两个氨基酸残基被破坏或修饰，SOD将会失活。SOD中心金属离子的作用也不相同。对于Cu/Zn SOD，Zn(Ⅱ)的作用一是调节咪唑基与Cu的相互作用，二是稳定活性中心的结构。若除去酶分子中Zn (Ⅱ)而保留原有环境中时Cu(Ⅱ)，SOD 仍有相当高的活性。Cu(Ⅱ)与酶催化作用有关,起着传递电子的作用。若除去Cu(Ⅱ)，则SOD将会失活，重新加入Cu(Ⅱ)后SOD的酶活性恢复。另一方面，Cu(Ⅱ)所处的环境对活性有重要影响。若以其它金属离子代替Cu(Ⅱ)，同时用Cu(Ⅱ)代替Zn(Ⅱ)，则酶失去全部活性。另外，只有结合态的Cu(Ⅱ)才直接与活性有关，但在一定浓度范围内，增加游离的Cu(Ⅱ) 的浓度可显著提高SOD活性[8]。
对“咪唑桥”配合物进行催化的研究表明，在催化过程中，“咪唑桥”在与铜相
连的一侧的N原子迅速地发生了质子化和去质子化的变化[9]，对酶的催化活性有重要影响。
3.3SOD的活性检测
SOD的活性测定方法一般分直接测定法和间接测定法。
3.3.1直接法
直接测定法的原理是直接测定SOD催化反应的底物反应速度或产物生成速度。常见的直接测定方法有EPR法、脉冲辐解法、超氧化钾法等。直接法需专用的仪器，故此类方法一般实验室较难应用。
应用脉冲射解技术进行毫微秒级快速动力学跟踪，及快速冰冻结合电子自旋共振(ESR)波谱观察，来直接获取SOD和O2-的动力学信息，如极谱氧电极法。3.3.2间接法
间接测定法是通过某种能产生O2-的系统，使O2-进行另一个便于检测的反应，测定特征波长下的光吸收变化速率，计算SOD对这个反应的抑制程度从而间接定量SOD活性。常见的间接测定方法有黄嘌呤氧化酶-细胞色素C法、邻苯三酚自氧化法、微量邻苯三酚自氧化法、黄嘌呤氧化酶-NBT法、NBT光还原法等。
由产生超氧自由基的系统和检测O2-的系统所组成，如NBT还原法、黄膘呤氧化酶法和邻苯三酚自氧化法等各种间接法都存在不同程度的问题，应用时应有所考虑。
4SOD的分离与提取
4.1动物SOD的分离提取
动物SOD是最早为人民所认知的，它的分离提取技术也较为成熟。人民相继从牛、猪、羊、马等动物红细胞、肌肉、肝脏组织中分离和纯化出SOD。SOD常用纯化制备方法有离子交换法、疏水色谱法、凝胶过滤法和金属螯合亲和层析法等。以牛血SOD提取方法为例，主要有以下几个步骤：溶血液制备、选择性热变性、超滤浓缩、丙酮沉淀、柱层析、冷冻干燥。
4.2植物SOD的分离提取
由于疯牛病的影响，欧盟规定从1997年月1月开始，不准使用牛血SOD作为食品添剂，植物SOD的开发研究开始彰显其重要性。我国近年来在植物SOD的研究领域有大量相关进展报道。许平[10]袁艺[11]、赵文芝[12]、余旭亚[13]等分别从大蒜、桑叶、沙棘、仙人掌中提取出SOD并进行相关研究，由于SOD活性测定方法并不统一，因此未能进行横向比较。SOD的提取方法主要有分步盐析法、有机溶剂沉淀法、层析柱法等。
4.3微生物SOD的分离提取
4.3.1酵母SOD的提取
有下列几种方法破壁制备SOD粗酶液：超声波处理法（JC-2型超声波处理仪处理5min）、细胞自溶法（提取5h）、酶裂解法（2%蜗牛酶液，30℃保温7.5h）、氯仿-乙醇法。将酵母菌种进行摇瓶培养，经离心收集后的菌体悬浮在磷酸盐缓冲液中，超声破壁。离心出去残渣，得粗酶提取液。将此液按5：3的比例加入乙醇、氯仿，搅拌2h，离心初杂蛋白，上清液加入0.75倍冷丙酮，得白色沉淀，将沉淀溶解于0.025mol·L-1pH 7.6磷酸盐缓冲液，透析过夜，除去小分子物质，离心后上DEAE-32柱，然后2.2~50mmol·L-1pH7.6磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集具有SCD活性的洗脱液[14]。
4.3.2细菌SOD的提纯
菌体用超声波破菌、3000r·min-1离心除去核酸碎片，上清液用纸浆过滤，活性部分用15%饱和度(NH4)2SO4盐析、离心收集酶蛋白，用缓冲液溶解，超滤除去小分子物质，上DE-32柱(1.5×9.0cm)，用0～0.2 mol·L-1NaCl缓冲液梯度洗脱，得到分离的SOD，冷冻干燥，备用[15]。
5SOD的研究动态
5.1结构性能改造
由于受到①半衰期短；②相对分子质量大，不易透过细胞膜；③口服时易受胃蛋白酶分解；④体内特异性等因素的限制，SOD很难作为药用酶广泛应用于临床中。对SOD进行化学修饰,既能保留天然酶的活性,又能提高其稳定性。SOD化学修饰的方法主要有：①对SOD的氨基酸残基进行化学修饰，主要是对非活性部位进行修饰,目的是提高其稳定性同时保留较高的生物活性；②用水溶性大分子(如聚乙二醇、聚蔗糖、右旋糖酐和聚烯属烃基氧化物等)对SOD进行共价修饰以提高酶学特性；③对SOD进行酶切改造，降低相对分子质量、减小抗原性。研究表明：经过化学修饰后的SOD基本上保持了天然酶的活性,在耐热、耐酸碱和抗胃蛋白酶分解等方面均有很大提高。
5.2SOD模拟研究
5.2.1活性中心模拟
由于天然SOD自身存在的缺点，因此寻找和合成一类既能避免天然SOD不足，又具有SOD催化活性的物质—SOD模拟物的研究非常活跃。SOD模拟物具有相对分子质量小、稳定性高、在体内半衰期长及脂溶性好的优点。最令人感兴趣的是Cu/Zn-SOD活性中心的模拟，可视为以咪唑桥联的Cu(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)异双核配合物[16]。现今对Mn2SOD模拟物的研究逐渐增多，而Fe-SOD模拟物合成难度较大且SOD活性较低，故其模拟研究较少[17]。近年来国内外学者对氨基酸配合物和大环类配合物进行了广泛探讨。谢英等人合成了以二肽为配体的铜-(N-正十二
碳酰双甘肽)配合物，这是一个带功能基的长链铜(Ⅱ)氨基酸配合物，同时用脉冲辐解法测定了其SOD活性，较好地模拟了SOD[18]。毛宗万等人研究了具有Cu/Zn-SOD酶活性中心类似结构的模型化合物，深入地讨论了不同的咪唑桥联方式和不同配位构型对模型化合物催化O2-活性的影响。结果表明，咪唑桥N原子沿四方锥配位底面位置与Cu(Ⅱ)配位的模拟物活性大大高于咪唑桥N原子沿四方锥轴向与Cu(Ⅱ)配位的模拟物，活性差异的原因很可能与生成Cu(Ⅰ)中间体的稳定性有关[19]。在多核配合物方面,廖展如等根据天然SOD 活性部位结构合成了多种含苯并咪唑的Cu(Ⅱ)、Fe(Ⅱ)、Mn (Ⅱ)、Co(Ⅱ)、Ni(Ⅱ)、Zn (Ⅱ)的配合物，指出配合物活性与其模拟天然SOD结构微环境程度的大小有关，并将其应用于植物抗冷胁迫实验。在进行低温胁迫后，经过SOD模拟物处理对水稻幼苗成活率明显的高于未处理的幼苗[20-25]，这些研究成果为研究开发新型农药开辟了新的途径。Patel等合成了一系列以水杨醛丙氨酸席夫碱为配体的Cu(Ⅱ)-Cu(Ⅱ)，Cu(Ⅱ)-Ni (Ⅱ)，Cu(Ⅱ)-Zn(Ⅱ)咪唑桥联的双核配合物和相关的单核配合物并测定其SOD活性。结果表明，双核配合物比单核配合物具有更高的SOD活性这可能与双核配合物的结构更加类似于天然SOD的活性中心有关[26]。
5.2.2胶束模拟
由于SOD在生物体内发挥其效用时所处的环境大多是非均相的，一些学者采用表面活性剂在水中形成的胶束体系来模拟上述非均相反应环境。金虬等人的研究表明由CTAB(阳离子型表面活性剂)和SDS(阴离子型表面活性剂)形成的胶束体系可使多种Cu(Ⅱ)-氨基酸配合物的SOD活性得到提高[27]。但该体系结构比较复杂，较难弄清其催化O2-歧化的机理,这方面的研究有待进一步拓展和深化。5.3SOD 与植物抗逆性
植物在生长发育过程中可能受到诸如病原菌、水份、大气污染、辐射、温度、光照盐碱度和重金属等因素的胁迫。这些胁迫均能使植物产生过量的活性氧和自由基,引起细胞结构和功能的破坏。SOD是清除活性氧过程中第一个发挥作用的抗氧化酶,在植物体内起重要作用。近年来，国内外学者对SOD与植物抗逆性之间的关系做了大量研究。任安芝等人对干旱胁迫下内生真菌感染的黑麦草叶中的SOD及其同工酶进行了系统的研究。研究表明：随着干旱程度的提高，黑麦草叶片中SOD及其同工酶活性显著提高，内生真菌的感染使宿主植物SOD活性对干旱胁迫的反应更为敏锐[28]。这些研究为在沙漠等干旱地区提高植被成活率提供了理论依据和方法。
6SOD的应用和展望
6.1应用
6.1.1SOD在抗衰老中的作用
人体随着年龄的增加，皮肤会变得粗糙、发皱、变黑和形成老年斑,其中老年斑是皮肤衰老的典型现象，即在老年人的面部、手部皮肤上出现黑褐色斑块或斑点。老年斑主要由黑色素组成，而自由基在黑色素形成、反应和组成中起重要作用。在有空气存在时，光照黑色素可使其耗氧增加，产生O2-和羟自由基。
反应如下:
黑色素HV 黑色素自由基
O2黑色素HV O2-
在衰老的皮肤和脑中存在的另两类色素是脂褐素和蜡样质，也可使皮肤变黑和粗糙。这两种物质均由自由基引起。脂褐素和蜡样质本身也含大量自由基，可以通过多种途径产生O2-。自由基虽是造成人体衰老的重要原因，但机体并不是易衰老的，机体内也存在着抗衰老的物质。机体内存在着一系列的自由基清除剂(如: SOD、CAT、GSH-PX)和一些抗氧化物(如：维生素A、维生素E、维生素C等)。其中，SOD是非常重要的，它可以不断地清除由光照黑色素耗氧过多而产生的
O2-，防止过多的黑色素的形成。它不断地清除由脂褐素和蜡样质产生的O2-，避免过多的脂质发生过氧化，而减少脂褐素和蜡样质的形成，防止衰老。
6.1.2SOD在疾病治疗中的作用
人类机体所处的环境复杂，体内经常不断地产生自由基，特别在病理过程中，产生大量的O2-，这些O2-反过来促进病情加重，因而SOD在清除O2-中则显得异常重要。
肺气肿是由于肺组织的中性白细胞含弹性蛋白酶及弹性蛋白酶抑制剂不平衡所致。弹性蛋白酶抑制剂有α-蛋白酶抑制剂及支气管粘膜蛋白抑制剂两种，均可受O2-攻击而失活，导致肺气肿。
环境污染物(如：O3、氮、硫等)能提高肺的巨噬细胞的活力而不断释放O2-，吸烟也会使自由基大量进入肺内。在肺中，O2-产生破坏性极强的-OH等，O2-和·OH攻击弹性蛋白酶抑制剂，使其失活，而造成肺气肿。
类风湿关节炎、全身性红斑狼疮等自身免疫性疾病是由于机体丧失阻止自身组分的抗体形成,而产生自体抗体。这些抗体与正常的机体级组分结合，引起吞噬细胞吞噬而表现出病理状态。吞噬细胞在吞噬过程中产生大量的O2-，O2-攻击机体而加剧病变。
机体受原子弹、氢弹的辐射冲击，从事放射辐射工作而防护不良的工作人员，受电离辐射后，形成各种不同产物，且产物又发生连锁反应，生成许多自由基而攻击人体，导致辐射病。
(人体内) H2O x-射线γ-射线x-射线γ-射线O2-+·OH +·H
SOD的增加能抑制因辐射而引起的肿瘤的形成，并增加成纤维细胞的分化能
力，有效地防止肿瘤的恶性发展。
另外，某些药物中毒、氧中毒、大气污染综合症和老年性白内障等疾病的发生均与O2-相关联。
机体内的O2-可以引起各种疾病，SOD作为O2-的天然清除剂，在正常情况下, O2-与SOD保持动态平衡，但在病理状态下，产生过量的O2-，机体本身产生的SOD 能完全清除这些过多的O2-，这些过多的O2-则对机体产生危害。SOD可以催化O2-进行歧化反应，减轻O2-对上述疾病的作用。
机体内含有SOD,并且机体组织中的SOD还会随着年龄的增加而增加，如
J.Hollander研究[29]发现随着人年龄的增加，腓肠肌中SOD的活性也在增加。但是，机体自身产生的SOD是有限的,因此在疾病治疗中可以通过注射或口服SOD药物增加机体中的SOD，达到治疗疾病的作用。
目前，许多研究者根据SOD的无致敏性和无抗原性的特点，采用SOD制剂来治疗疾病。如直接注射SOD制剂于发炎的关节部位来缓解类风湿关节炎；口服SOD治疗药物和抗生素中毒已经取得较好的效果；SOD还可促进骨折后细胞分裂、增殖、促进骨折后骨的生长，缩短骨折愈合时间[30]。
SOD不但可用于疾病的治疗，也可用于临床检查，如用SOD作为矽肺诊断的指标。矽肺是由于粉尘中的SiO2引起自由基反应启动膜的脂质过氧化反应而导致膜损伤，引起肺泡巨噬细胞破坏与分解而造成矽肺。通过测定SOD的含量来作为一个矽肺诊断指标。
6.1.3SOD在化妆品中的应用
研究证明[31]，SOD添加于化妆品中可起到4方面的作用：一是有明显的防晒效果，光照使皮肤变黑的主要原因是氧自由基损害，SOD可有效防止皮肤受电离辐射(特别是紫外线)的损伤，从而起到防晒效果；二是SOD为抗氧酶，能有效防止皮肤衰老、祛斑、抗皱；三是有明显的抗炎效果，对防治皮肤病有一定效果；四是SOD具有一定的防治斑痕形成的作用。
6.1.4SOD在农业上的应用
SOD在转基因植物中的过量表达能不同程度地提高植物对逆境的抵抗能力，MnSOD基因的过量表达在一程度上可以提高植物转基因植物对氧胁迫的耐受性。通过基因工程手段，增加植物内的SOD的表达，可以大大增强植物的抗逆性。如[3]将存在于线粒体中的Mn-SOD导入烟草、苜蓿的叶绿体后，其转基因植株可以增加对臭氧及干旱胁迫的抗性。拟兰芥[32]的Fe-SOD基因转化烟草叶绿体，
Fe-SOD的过量表达能够增强叶绿体质膜和光合系统Ⅱ对MV(甲基紫精)和高盐
过氧化胁迫的抗性。
6.1.5SOD在食品工业中的应用
SOD在食品工业中的应用也比较广泛。在食品中加入SOD可以增强抗衰老、
抗炎、抗辐射、抗疲劳等保健作用。SOD还可以在罐头食品、果汁、啤酒等食品中作为抗氧化剂，防止过氧化化物酶引起的食品变质和腐败现象；还可以作为水果和蔬菜的保鲜剂。
6.2展望
目前，对SOD分子的修饰、模拟等方面的技术改造已取得了可喜的成果，但是在SOD的应用研究方面，也有一些问题急待解决。如：①在临床应用方面，要进一步阐明SOD在体内的抗氧化过程，要延长SOD在体内的半衰期，减少其对机体的毒副作用等；②在食品工业方面，要确保口服SOD有效性，使之不被胃蛋白酶分解等；③在化妆品应用方面，要准确地测定SOD的活性大小，同时要明确化妆品基质对SOD活性和稳定性的影响。
如果以上问题能够得到很好的解决，相信SOD的研究与应用必将有个美好的前景，造福人类。
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超氧化物歧化酶 超氧化物歧化酶，别名肝蛋白、奥谷蛋白，简称：SOD。SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。超氧化物歧化酶是1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD的研究己有七十多年的历史。1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。 SOD（超氧化物歧化酶）是国际上公认的具有人体垃圾“清道夫”、“抗衰王”、“美容骄子”之称，是对抗“百病之源”活性氧自由基最有力的物质，是近半个世纪以来社会科学界、医学界、生物界最举世瞩目的价值发现，它的研究与发展代表着生物医药的高科技技术发展的前沿，在科技成果及学术领域占据重要的国际地位。SOD（超氧化物歧化酶）被国家列入生物医药“国家十一五规划”重点项目。2011年是“国家十二五规划”的第一年，SOD行业将再次跻身国家当前优先发展的高科技产业化项目，标志着中国健康产业链SOD新兴行业的崛起, 使全人类迈入健康经济时代。利用超氧化物歧化酶（SOD）产业化建设，一方面可架构生物医药、保健食品、日用美容化妆品、化工化学、农业五大版块经济支柱的绿色产业链循环经济圈发展。另一方面打造SOD科技应用成果转化的孵化器平台引领生化医药美容化妆品食品等行业的新型健康原料的应用，有利于促进再生资源利用，产生巨大的社会效益和经济效益。 一、反应机理 超氧化物岐化酶,它催化如下的反应： 2O2-+2H+→H2O2+O2 O2-称为超氧阴离子自由基，是生物体多种生理反应中自然生成的中间产物。它是活性氧的一种，具有极强的氧化能力，是生物氧毒害的重要因素之一。 SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，它通过上述反应可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但体内的过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）会立即将其分解为完全无害的水。这样，三种酶便组成了一个完整的防氧化链条。 SOD属于金属蛋白酶，按照结合金属离子种类不同，该酶有以下三种：含铜与锌超氧化物歧化酶（Cu-ZnSOD ）、含锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD ）和含铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD ）。三种SOD都催化超氧化物阴离子自由基，将之歧化为过氧化氢与氧气。 目前，人们认为自由基（也称游离基）与绝大部分疾病以及人体的衰老有关。所谓的自由基就是当机体进行代谢时，能夺去氧的一个电子，这样这个氧原子就变成自由基。自由基很不稳定，它要在身体组织细胞的分子中再夺取电子来使自己配对，当细胞分子推陈出新动一个电子后，它也变成自由基，又要去抢夺细胞膜或或细胞核分子中的电子，这样又称会产生新的自由基。如，超氧化物阴离子自由基、羟自由基、氢自由基和甲基自由基，等等。在细胞由于自由基非常活泼，化学反应性极强，参与一系列的连锁反应，能引起细胞生物膜上的脂质过氧化，破坏了膜的结构和功能。它能引起蛋白质变性和交联，使体内的许多酶及激素失去生物活性，机体的免疫能力、神经反射能力、运动能力等系统活力降低，同时还能破坏核酸结构和导致整个机体代谢失常等，最终使机体发生病变。因此，自
项目二超氧化物歧化酶的生产 超氧化物歧化酶（英语：Superoxide dismutase，简称SOD）是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢的酶。它广泛存在于各类动物、植物、微生物中，是一种重要的抗氧化剂，保护暴露于氧气中的细胞。 SOD的概况： 1.超氧化物歧化酶（SOD）的概念： 超氧化物歧化酶是一种广泛存在于动物、植物、微生物中的金属酶，是生物体内抗氧化酶系中主要成员之一。 2.SOD的分类 按其结合的金属离子（即金属辅基的成分）可分为： （1）Fe-SOD（2）Mn-SOD（是SOD酶分子内所含金属离子Mn2+） （3）Cu-Zn-SOD（铜．锌超氧化物） 3.SOD的生产： 仪器、试剂和材料： -研钵，石英砂，烧杯（50mL），玻璃棒，pH计，冷冻离心机，离心管 -新鲜蒜瓣 -0.05mol/L磷酸缓冲溶液（pH7.8），氯仿-乙醇混合液（氯仿-无水乙醇3：5），丙酮（用前预冷至-10℃）。 操作步骤： 整个操作过程在0到5℃条件下进行。 （1）SOD酶的提取称取5g大蒜蒜瓣，加入石英研磨破碎细胞后，加入0.05mol/L的磷酸缓冲液（Ph7.8）15ml，继续研磨20min，使SOD酶充分溶解到缓冲液中，然后6000r/min冷冻离心15min，弃沉淀，取上清液。 （2）去除杂蛋白上清液中加入0.25倍体积的氯仿-乙醇混合液搅拌15min，6000r/min离心15min，弃去沉淀，得到的上清液即为粗酶液。 （3）SOD酶的沉淀分离粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000/min离心15min，得到SOD酶沉淀。 （4）将沉淀溶入pH7.8，0.05mol/L的磷酸缓冲液5mL中，然后6000r/min离心15min，放弃沉淀，取上清液，用凝胶sephacylS-200进行纯化，然后超滤浓缩。 （5）用紫外分光光度计测定浓液的蛋白含量 （6）将浓缩冷冻干燥后即得成品。 4.SOD酶的检验： 原理：连苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出氧气，生成带色的中间产物。在自氧化过程的初始阶段，黄色中间产物的积累在滞后30~45s后就与时间成线性关系。中间产物在420nm处有强烈的光吸收，在有SOD存在时由于它能催化生成氧气与过氧化氢，从而阻止了中间物的积累，通过计算就可以求出SOD的活力。 所需溶液的配制： （1）pH值为8.30的50mol/LK2HPO4-KH2PO4缓冲溶液：25℃下96.5mL 1mol/L的LK2HPO4与3.5mL 1mol/L的KH2PO4混合后，用水稀释至2000mL。 （2）0.05mol/L连苯三酚溶液：称取3.15g连苯三酚用0.01mol/L盐酸溶液溶解并定容至500mL。酶活性的测定： （1）连苯三酚自氧化速率的测定
超氧化物歧化酶的现状研究进展(一) 关键词：超氧化物歧化酶;生理功能;特性;应用摘要:超氧化物歧化酶是生物体内清除超氧阴离子自由基的一种重要酶，具有重要的生理功能，在医药、食品、化妆品中有广泛的应用前景。现从分类、分布、结构、性质、催化机理、制备、应用等方面探讨了超氧化物歧化酶的基础研究进展。 关键词:超氧化物歧化酶;生理功能;特性;应用Advanceincurrentresearchofsuperoxidedismutase. Abstract:SuperoxideDismutase（SOD）isanimportantenzymeinorganism，whichcanremovesuperoxidefreeradical.Itiswide-lyusedinclinicaltreatment，food，andcosmeticindustryforitsimportantphysiologicfunction.Thisreviewpresentsabasicreseachoutline ofSOD，includingclassification，distribution，structure，property，thecatalysemechanism，preparationandapplication. Keywords:Superoxidedismutase;Physiologicfunction;Property;Application 1938年Mann和Keilin〔1〕首次从牛红细胞中分离出一种蓝色的含铜蛋白质（Hemocuprein），1969年Mccord及Fridovich〔2〕发现该蛋白有催化O2，发生歧化反应的功能，故将此酶命名为超氧化物歧化酶（SuperoxideDismutase，SOD，EC1.15.1.1）。该酶是体内一种重要的氧自由基清除剂，能够平衡机体的氧自由基，从而避免当体内超氧阴离子自由基浓度过高时引起的不良反应，同时SOD是一种很有用途的药用酶。有关SOD的研究受到国内外学者的广泛关注，涉及到化学、生物、医药、日用化工、食品诸领域，是一个热门研究课题。通过多年努力，在SOD的基础研究方面取得了巨大成果。目前，SOD临床应用主要集中在抗炎症方面（以类风湿以及放射治疗后引起的炎症病人为主），此外对某些自身免疫性疾病（如红斑狼疮、皮肌炎）、肺气肿、抗癌和氧中毒等都有一定疗效;在食品工业主要用作食品添加剂和重要的功能性基料;在其它方面也有相关应用。现就有关SOD的基础研究进展及应用方面作以简述。 1SOD的种类与分布 SOD是一类清除自由基的蛋白酶，对需氧生物的生存起着重要的作用，是生物体防御氧毒性的关键。迄今为止，科学家已从细菌、真菌、原生动物、藻类、昆虫、鱼类、植物和哺乳动物等生物体内都分离得到了SOD。基于金属辅基不同，这些SOD至少可以分为Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD三种类型〔3〕。 表1不同种类型的SOD分布（略） 一般来说，Fe-SOD是被认为存在于较原始的生物类群中的一种SOD类型;Mn-SOD是在Fe-SOD 基础上进化而来的一种蛋白类型，由于任何来源的Mn-SOD和Fe-SOD的一级结构同源性都很高，均不同于Cu/Zn-SOD的序列，可见它们来自同一个祖先;Cu/Zn-SOD分布最广，是一种真核生物酶，广泛存在于动物的血、肝和菠菜叶、刺梨等生物体中。 除以上三种SOD外，Sa-OukKang等人最近又从链霉菌Streptomycesspp.和S.coelicotor中发现了两种新的SOD，一种是含镍酶即Ni-SOD，另一种是含铁和锌的酶即Fe/ZnSOD，它们均为四聚体，表观分子量分别是13KD和22KD，它们之间没有免疫交叉反应〔4～6〕。 2SOD的催化机理 超氧化物歧化酶作用的底物是超氧阴离子自由基（O·-2），它既带一个负电荷，又只有一个未成对的电子。在不同条件下，O·-2既可作还原剂变成O2，又可作氧化剂变成H2O2，H2O2又在过氧氢酶（Catalase，CAT）的作用下，生成H2O和O2，由此可见，有毒性的O·-2在H2O2又在过氧氢酶（Catalase，CAT）的作用下，生成H2O和O2，由此可见，有毒性的O·-2在SOD和CAT共同作用下，变成了无毒的H2O和O2。其作用机理如下:SOD+O·-2SOD-+O2SOD-+O·-2+2H+SOD+H2O22O·-2+2H+SODO2+H2O2H2O2CATH2O+O2
超氧化物歧化酶，分子结构：NH2;SCH2 CHCOOHSCH2 CHCOOHNH2 ，别名肝蛋白、奥谷蛋白，简称：SOD。SOD是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。超氧化物歧化酶是1938年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD 的研究己有七十多年的历史。1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。 超氧化物岐化酶的催化如下的反应：2O2-+2H+→H2O2+O2 O2-称为超氧阴离子自由基，是生物体多种生理反应中自然生成的中间产物。它是活性氧的一种，具有极强的氧化能力，是生物氧毒害的重要因素之一。SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，它通过上述反应可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但体内的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)会立即将其分解为完全无害的水。这样，三种酶便组成了一个完整的防氧化链条。 过氧化物游离基可造成机体的损害，本品由哺乳动物的红细胞、肝和组织中分离提取的一种肽链大分子的金属酶，能促使过氧化物游离基转化成过氧化氢和氧，从而清除炎症过程中伴随产生的过氧化物游离基，而有强大的抗炎作用。临床用于类风湿关节炎、骨关节病、放射性膀胱炎。可以清除体内过量的自由基，提高人体免疫力，延缓衰老；抗疲劳，调节女性生理周期，推迟更年期。 应用 ( 1) 治疗自身免疫性疾病。各种自身免疫性疾病的发病机制虽有不同, 但O2- 前列腺素及由巨噬细胞、单核细胞、中性白细胞产生出来的水解酶类在引起病变上都起了重要作用。动物实验已证实SOD 和其他氧自由基清除剂能抑制自身免疫性疾病的慢性发病过程。应用SOD 治疗红斑狼疮和类风湿性关节炎均有很好的效果。 ( 2) 治疗某些心血管疾病。心血管疾病是人类第一大疾病, 心血管药物研究已成为生物技术革命的尖端领域。美国每年用于这方面的开发费用占到其全国医药工业总研究费用的25% 以上, 我国也把心血管药物研究列为国家医药攻关的重点, 美国和日本正在全力开发SOD。 ( 3) 抗衰老。虽然SOD 与衰老的关系以及SOD 能否作为抗衰老的有效药物, 国内外尚有争议, 但SOD 可减缓衰老的病理过程是无可非议的。衰老机制十分复杂, 按衰老的自由基学说, 氧化是导致衰老、细胞破裂和进行性病变的主要原因。SOD 能阻止、清除自由基的连锁反应, 能有效防止脂质过氧化, 也就抑制了脂褐素的形成。常见的高血压冠心病、动脉硬化和老年性痴呆症, 无不与O2- 堆积有关。如果补充一些SOD, 无疑能起到“雪中送炭” 的作用。 SOD 的开发 随着对SOD 研究的广泛进行, 人们开始对SOD 基因进行分离、序列分析、基因克隆与表达研究。美国Chiron 公司已将重组SOD 用于肾移植。Bio- Technology General 公司将基因工程方法生产的SOD 用于治疗新生儿的氧障碍。德国、日本相继开展了这方面的研究和开发工作。中国医学科学院基础医学研究所和海军总医院分子生物学研究室于1989 年底成功地在F.Coli 中构建的Cu/Zn- SOD 高效表达载体, 其表达量占菌体蛋白
超氧化物酶（SOD）的生产 SOD（超氧化物歧化酶）是一种源于生命体的活性物质，能消除生物体在新陈代谢过程中产生的有害物质。对人体不断地补充SOD具有抗衰老的特殊效果。超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, EC1.15.1.1, SOD）是1938 年Marn等人首次从牛红血球中分离得到超氧化物歧化酶开始算起，人们对SOD 的研究己有七十多年的历史。1969年McCord等重新发现这种蛋白，并且发现了它们的生物活性，弄清了它催化过氧阴离子发生歧化反应的性质，所以正式将其命名为超氧化物歧化酶。 它催化如下的反应：202+2H+→H2O2+O2 O2-称为超氧阴离子自由基，是生物体多种生理反应中自然生成的中间产物。它是活性氧的一种，具有极强的氧化能力，是生物氧毒害的重要因素之一。SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，它通过上述反应可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但体内6性极强的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)会立即将其分解为完全无害 的水。这样，三种酶便组成了一个完整的防氧链条。 一、实验目的 a．掌握有机溶剂沉淀法的原理和基本操作。 b．掌握SOD酶提取分离的一般步骤。 二、实验原理 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)是一种具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用的药用酶。它可催化超氧负离子(O2-)进行歧化反应，生成氧和过氧化氢。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH7.8的磷酸缓冲溶液提取出来。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。 有机溶剂沉淀的原理是有机溶剂能降低水溶液的介电常数，使蛋白质分子之间的静电引力增大。同时，有机溶剂的亲水性比溶质分子的亲水性强，它会抢夺本来与亲水溶质结合的自由水，破坏其表面的水化膜，导致溶质分子之间的相互作用增大而发生聚集，从而沉淀析出。 三、实验器材 研钵，石英纱，烧杯(50ml)，玻璃棒，pH计，冷冻离心机，离心管。 四、试剂和材料 新鲜蒜瓣，0.05mol/L磷酸缓冲溶液(pH7.8)，氯仿－乙醇混合液(氯仿：无水乙醇＝3:5)，丙酮(用前预冷至－10℃)。
超氧化物歧化酶的功能与应用 安徽工程大学生化院食品101 张云学号：3100401114 摘要：超氧化物歧化酶Orgotein (Superoxide Dismutase, SOD)，别名肝蛋白、奥谷蛋白，简称：SOD。它是一种新型酶制剂。它在生物界的分布极广，几乎从动物到植物，甚至从人到单细胞生物，都有它的存在。SOD被视为生命科技中最具神奇魔力的酶、人体内的垃圾清道夫。SOD是氧自由基的自然天敌，是机体内氧自由基的头号杀手，是生命健康之本。耐高温SOD是国家“十五”、“十一五”863计划重大课题项目。 关键字：SOD 原理人体作用耐高温SOD 应用 SOD是Super Oxide Dismutase 缩写，中文名称超氧化物歧化酶，是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD 的地位越来越重要！ SOD类型：超氧化物歧化酶按其所含金属辅基不同可分为三种，第一种是含铜（Cu）锌（Zn）金属辅基的称（Cu.Zn—SOD），最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于机体细胞浆中；第二种是是含锰（Mn）金属辅基的称（Mn—SOD），呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞内；第三种是含铁（Fe）金属辅基的称（Fe—SOD），呈黄褐色，存在于原核细胞中。 1.1催化反应原理 超氧化物岐化酶（SuperoxideDismutase），简称SOD，ECl.15.1.1，它催化如下的反应：2O2-+2H+→H2O2+O2 O2-称为超氧阴离子自由基，是生物体多种生理反应中自然生成的中间产物。它是活性氧的一种，具有极强的氧化能力，是生物氧毒害的重要因素之一。 SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，它通过上述反应可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但体内的过氧化氢酶（CA T）和过氧化物酶（POD）会立即将其分解为完全无害的水。这样，三种酶便组成了一个完整的防氧化链条。 功效认定超氧物歧化酶(Superoxide Dismutase简称SOD)是一种新型酶制剂,它在生物界的分布极广,几乎从人到细胞,从动物到植物,都有它的存在。原多从牛血中提取，1997年欧盟禁止使用动物中提取的SOD。 1.2功效认定 SOD是超氧化物歧化酶(superoxidedismutase)的英文缩写,是一种含有金属元素的活性蛋白酶,是目前生物学、医学和生命科学领域中世界级的高、尖、精课题。超氧化物歧化酶（SOD）目前世界范围内的开发，大都从动物血里提取，不但代价昂贵，而且动物性SOD 的排他性、不易常温保存、艾滋病等血液病毒的交叉感染及其它潜在危险，所以国际卫生组织呼吁：立刻停止动物性SOD的使用。SOD是中国卫生部批准的具有抗衰老、免疫调节、调节血脂、抗辐射、美容功能的物质之一，法定编号为ECl.15.1.1；CAS[905489]1。 世界各国对“超氧化物歧化酶”的作用认定：
超氧化物歧化酶的研究 年级：大三 专业：化学 学号：189940012 姓名：邢敏
超氧化物歧化酶的研究 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD)是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢的酶。它广泛存在于各类动物、植物、微生物中，是一种重要的抗氧化剂，保护暴露于氧气中的细胞，可清除生物体内超氧阴离子自由基,有效地抗御氧自由基对有机体的伤害。 氧化还原反应是生命体最重要的代谢途径，它不仅为生物提供能量，同时还决定着生命体的衰老和死亡。氧对于生命活动极其重要，但氧参与的代谢经常产生一些对细胞有毒害作用的副产物———氧自由基，即通常所说的活性氧(reactiveoxygen species，ROS)。细胞产生的活性氧包括:超氧根阴离子(O·－2)、氢氧根离子(OH－)、羟自由基(·OH)、过氧化氢(H2O2)、单线态氧(·2)和过氧化物自由基(ROO·)。它们都能通过氧化应激损伤细胞大分子，引起一系列有害的生化反应，造成蛋白质损伤、脂质过氧化、DNA突变和酶失活等。为了防止氧自由基对细胞体的破坏，几乎所有细胞都有一套完整的保护体，来清除细胞新陈代谢产生的各种活性氧。其中，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)在保护细胞免受氧自由基的毒害中发挥着重要作用。早在1969年，Mc Cord和Fridovich发现了一种血球铜蛋白能清除自由基(O·－2)，并且将这种血球铜蛋白命名为超氧化物歧化酶(SOD)。SOD几乎存在于所有生物细胞中，通过把O·－2转化为 H2O2，H2O2再被过氧化氢酶和氧化物酶转化为无害的水(H2O)，从而达到清除细胞内氧自由基，保护细胞的目的。
超氧化物歧化酶（SOD）的发现及其应用 早在1930年，Keilin和Mann就发现了SOD，不过，当时他们仅认为是一种蛋白质，并命名为血铜蛋白。直到1969年，McCord和Fridovich在研究对黄嘌呤氧化酶时，发现SOD具有酶的活性，并正式把它命名为superoxidedismutse，中文名即为超氧化物歧化酶。 超氧化物歧化酶 一、超氧化物歧化酶（SOD）分类及作用 根据分子中所含的金属辅基不同，SOD可分为Cu，Zn-SOD，Fe-SOD，Mn-SOD 和Ni-SOD四类。其中Cu，Zn-SOD主要存在于真核细胞的细胞浆中，如猪血、鸭血、猪肝等动物血液和内脏器官等组织中；Mn-SOD存在于真核细胞的线粒体、细菌中；Fe-SOD只存在于原核细胞中，如海藻中的螺旋藻、铁钉叶等；Ni-SOD 是最近发现只存在于某些极少数原核细菌中。 SOD是机体内天然存在的超氧自由基清除因子，它可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢和氧气，生成的过氧化氢会被过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)分解为完全无害的水。因而SOD是机体内防止自由基损伤的第一道防线，，是生物体内最重要的抗氧化酶。SOD作为机体内最有效、最重要的抗氧化酶之一，能有效清除老年机体代谢过程中所产生的超氧自由基，延缓衰老。 二、自由基 自由基是一类非常活跃的化学物质，是个有不成对（奇数）电子的原子或原子团。其中最重要的是超氧自由基，它可聚集体表、心脏、血管、肝脏和脑细胞中。如果沉积在血管壁上，会使血管发生纤维性病变，导致动脉管硬化，高血压，心肌梗塞；沉积在脑细胞时，会引起老年人神经官能不全，导致记忆、智力障碍以及抑郁症，甚至老年性痴呆等，是造成人类衰老和疾病的元凶。而在衰老的皮肤和脑中存在的脂褐素和蜡样质,可使皮肤变黑和粗糙，这两种物质也是由自由
超氧化物歧化酶的研究 班级：生物班姓名：胡金金学号：11 摘要:超氧化物歧化酶是生物体内清除超氧阴离子自由基的一种重要酶,具有重要的生理功能,在医药、食品、化妆品中有广泛的应用前景。现从分类、分布、结构、理化性质、催化机理、分离提取工艺、应用前景等方面探讨了超氧化物歧化酶的基础研究进展。 关键词：超氧化物歧化酶、理化性质、生物学功能、提取工艺、应用前景 到现在为止,人们已从细菌、原生动物、藻类、霉菌、植物、昆虫、鸟、鱼类和哺乳动物等生物体内分离得到SOD。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,简称SOD),是一类广泛存在于生物体内的金属酶,能够催化超氧阴离子自由基发生歧化反应,平衡机体内的氧自由基,己成为化学及生物化学热 门的研究课题。作为生物体内超氧阴离子自由基的清洁剂,SOD在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能,在医学、食品、化妆品等领域得到越来越多的应用。目前,世界各地学者对SOD的研究方兴未艾,深入研究SOD不仅有着大的理论意义,也有着重大的实际应用价值。 1超氧化物歧化酶的结构和理化性质 1.1超氧化物歧化酶的结构 超氧化物歧化酶(SOD)从结构上可分为两族:CuZn-SOD为第一族,Mn-SOD和Fe-SOD为第二族。天然存在的SOD,虽然活性中心离子不同,但催化活性部位却具有高度的结构同一性和进化的保守性,即活性中心金属离子都是与3或4个组氨酸(His)、咪唑基(Mn-SOD含1个天门冬氨酸羧基配位)和1个H2O分子呈畸变的四方锥或扭曲的四面体配位。CuZn-SOD作为SOD结构上的第一族,是人们对于SOD结构研究的突破口,也是人们了解最多的一种SOD。比较不同来源的CuZn-SOD的氨基酸序列可以发现,它们的同源性都很高。有些氨基酸还很保守,在所有序列中都不变,这暗示着这些氨基酸与活性中心有关。如图1牛红细胞CuZn-SOD的结构所示:每个铜原子除分别与4个组氨基酸残基(His1118)的咪唑氮配位外,还与一轴向水分子形成远距离的第五配位,Zn则与3个组氨酸残基(His)和1个天冬氨酸(D81)配位。Cu、Zn共同连接组氨酸61组成/咪唑桥0结构。图1 牛红细胞CuZn-SOD 的结构示意图 图1 牛红细胞CuZn-SOD的结构示意图[1] ] Mn-SOD和Fe-SOD同属于SOD结构上的第二族,Mn-SOD是由203个氨基酸残基构成的四聚体,Mn(ó)是处于三角双锥配位环境中,其中一轴向配位为水分子,另一轴向被蛋白质辅基的配位His-28占据,另3个配基His-83、His-170和Asp-166位于赤道平面。Fe-SOD的活性中心是由3个His,1个Asp 和1个H2O扭曲四面体配位而成。 1.2超氧化物歧化酶的理化性质 SOD 的等电点偏酸性, 为酸性蛋白SOD 对热、pH 值和蛋白水解酶的稳定性比一般酶要高。三种 SOD 的主要理化性质见下表[2]。 2超氧化物歧化酶生物学功能 2.1 超氧化物歧化酶与胁迫 生存环境的变化是不可避免的,任何生物必须去适应各种变化.以植物为例,经研究发现,不同条件、不同物种、不同的发育时期及不同器官发生胁迫后,SOD活性表现有升有降。然而SOD活性不论是升高还是降低,都表现出抗性强的品种比抗性弱的品种活性高.即当SOD活性降低时,抗性强的品种下降幅度小;而当SOD活性升高时,抗性强的品种升高幅度大;或者抗逆性强的品种活性升高而抗逆性弱的品种降低。这说明在逆境条件下植物的抗性强弱与植物体内能否维持较高的SOD活性水平有关。SOD的作用底物是生物体内产生的超氧阴离子自由基O厂,作用机理是: 之后H2O2:被抗坏血酸和过氧化氮酶(前者是主要的)分解为H2O和O2,从而解除O2-所造成的氧化胁迫
植物组织中超氧化物歧化酶和平测定方法 【实验目的】 1. 了解还原法测定抗氧化酶活性测定的原理方法。 2. 熟悉植物叶片中ROS 去除机制。 【实验原理】 超氧化物歧化酶（SOD ）普遍存在于动植物与微生物体内。SOD 是含金属辅基的酶。高等植物有两种类型的SOD ：Mn-SOD 和Cu/Zn-SOD 。SOD 能够清除超氧阴离子自由基 （O 2—），它与CAT 、POD 等酶协同作用来防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞膜系统的伤害，从而减少自由基对机体的毒害。 超氧阴离子自由基（O 2—）是生物细胞某些生理生化反应常见的中间产物。SOD 能通过歧化反应清除生物细胞中的超氧阴离子自由基，生成H 2O 2和O 2。生成的H 2O 2可被过氧化氢酶分解为O 2和H 2O ： 2 O 2—+ 2H + H 2O 2+O 2 2 H 2O 2 O 2+H 2O 超氧自由基非常不稳定，寿命极短，一般用间接方法测定SOD 活性。本实验依据SOD 抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性的大小。有氧化物质存在时，核黄素可在光照条件下还原。被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O 2—。当加入NBT 后，在光照条件下O 2—又可将NBT 还原为蓝色的甲腙，后者在560nm 处有最大光吸收。 当加入SOD 时，SOD 可通过清除O 2—，而抑制NBT 的光还原反应，使蓝色甲腙生成速度减慢。于是，进行光还原反应后，反应液蓝色越深，说明酶的活性越低，反之酶的活性越高。抑制NBT 光还原的相对百分率与酶活性在一定范围内呈正相关关系，据此可以计算出酶活性的大小。常常将抑制50%的NBT 光还原反应时所需的酶量作为一个酶活性单位（U ）。 【器材与试剂】 1. 实验仪器与用具 研钵、高速冷冻离心机、分光光度计、微量移液枪、刻度移液管、离心管、光照箱（光照度为4000lx ）、容量瓶（10ml ）、试管 2. 实验试剂 50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）； 130mmol/L 甲硫氨酸（MET ）溶液； 750μmol/L 氮蓝四唑（NBT ）溶液； 100μmol/L EDTA- Na 2溶液； CAT SOD
超氧化物歧化酶(SOD)的研究、应用和展望 作者：李敬玺， 王选年， 银梅， 唐海蓉， 王新华 作者单位：河南科技学院，河南 新乡 453003 本文读者也读过(10条) 1.时沁峰.曹威荣超氧化物歧化酶(SOD)的研究概况[期刊论文]-畜禽业2009(4) 2.曹淑华.查向东超氧化物歧化酶研究综述[期刊论文]-安徽农业科学2003,31(4) 3.杨卫健.张双全超氧化物歧化酶的研究及应用前景[期刊论文]-淮阴师范学院学报(自然科学版)2002,1(4) 4.陈鸿鹏.谭晓风.CHEN Hong-peng.TAN Xiao-feng超氧化物歧化酶(SOD)研究综述[期刊论文]-经济林研究2007,25(1) 5.李敬玺.刘继兰.王选年.银梅.葛亚明.唐海蓉.LI Jing-xi.LIU Ji-lan.WANG Xuan-nian.YIN Mei.GE Ya-ming. TANG Hai-rong超氧化物歧化酶研究和应用进展[期刊论文]-动物医学进展2007,28(7) 6.王岚超氧化物歧化酶的研究及应用概况[期刊论文]-武汉工业学院学报2002(1) 7.盛良全.郑晓云.闫向阳.肖厚荣.厦炳乐.刘少民.SHENG Liangquan.ZHEN Xiaoyun.YAN Xiangyang.XIAO Hourong .XIA Binle.LIU Shaomin生命体中的超氧化物歧化酶(综述)[期刊论文]-安徽卫生职业技术学院学报2002,1(2) 8.杨东升超氧化物歧化酶的研究与应用[期刊论文]-化学与生物工程2004,21(3) 9.于平.Yu Ping超氧化物歧化酶研究进展[期刊论文]-生物学通报2006,41(1) 10.沈良.郭洪超氧化物歧化酶及其模拟研究[期刊论文]-杭州师范学院学报(自然科学版)2002,1(3) 本文链接：https://www.doczj.com/doc/9b6145353.html,/Conference_7003085.aspx
一.超氧化物歧化酶(SOD): 超氧化物歧化酶，是一种新型酶制剂，是生物体重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体清除自由基的首要物质。SOD在生物体的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD 的地位越来越重要！ 超氧化物歧化酶(SOD)按其所含金属辅基不同可分为三种，第一种是含铜（Cu）锌（Zn）金属辅基的称（Cu.Zn—SOD），最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于机体细胞浆中；第二种是含锰（Mn）金属辅基的称（Mn—SOD），呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞；第三种是含铁（Fe）金属辅基的称（Fe—SOD），呈黄褐色，存在于原核细胞中。 SOD是一种含有金属元素的活性蛋白酶。超氧化物岐化酶（SOD）能催化如下的反应：O2-+H+→H2O2+O2，O2-称为超氧阴离子自由基，是生物体多种生理反应中自然生成的中间产物。它是活性氧的一种，具有极强的氧化能力，是生物氧毒害的重要因素之一。SOD 是机体天然存在的超氧自由基清除因子，它通过上述反应可以把有害的超氧自由基转化为过氧化氢。尽管过氧化氢仍是对机体有害的活性氧，但体的过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶（POD）会立即将其分解
为完全无害的水。这样，三种酶便组成了一个完整的防氧化链条。 目前，人们认为自由基（也称游离基）与绝大部分疾病以及人体的衰老有关。所谓的自由基就是当机体进行代时，能夺去氧的一个电子，这样这个氧原子就变成自由基。自由基很不稳定，它要在身体组织细胞的分子中再夺取电子来使自己配对，当细胞分子推出新一个电子后，它也变成自由基，又要去抢夺细胞膜或细胞核分子中的电子，这样又称会产生新的自由基。如，超氧化物阴离子自由基、羟自由基、氢自由基和甲基自由基，等等。在细胞由于自由基非常活泼，化学反应性极强，参与一系列的连锁反应，能引起细胞生物膜上的脂质过氧化，破坏了膜的结构和功能。它能引起蛋白质变性和交联，使体的许多酶及激素失去生物活性，机体的免疫能力、神经反射能力、运动能力等系统活力降低，同时还能破坏核酸结构和导致整个机体代失常等，最终使机体发生病变。因此，自由基作为人体垃圾，能够促使某些疾病的发生和机体的衰老。虽然自由基会对机体产生诸多危害，但是在一般的条件下人体细胞也存在着清除自由基、抑制自由基反应的体系，它们有的属于抗氧化酶类，有的属于抗氧化剂。像SOD就是一种主要的抗氧化酶，能清除超氧化物自由基，在防御氧的毒性、抑制老年疾病以及预防衰老等方面起着重要作用。 SOD能专一地清除体有害的自由基，以解除自由基氧化体的某些组成成分而造成的机体损害。如氧中毒、急性炎症、水肿、自身免疫性疾病、辐射病等疾病都与活性氧的毒性有关。实验证明，SOD 能够清除自由基，因此可消除上述疾病的病因。此解毒反应过程是两
超氧化物歧化酶(SOD)简述 YB 2012级生物技术 摘要：超氧化物歧化酶首先由Mann和Keilin从牛红细胞中分离提取出,是生物体内一种重要的抗氧化酶,由于其具有清除生物体内超氧阴离子自由基的作用,而引起广大学者的关注。本文概述了SOD的分类、结构、理化性质及研究进展,并对其应用前景进行了展望。 关键词：超氧化物歧化酶;SOD;理化性质 生物体内低浓度超氧阴离子自由基(O-2)是维持生命活动所必需的,其浓度过高时,可引起机体组织细胞氧化损伤,导致机体发生疾病,甚至死亡。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,简称SOD)是清除生物体内超氧阴离子自由基的一种重要抗氧化酶,具有抗衰老、抗癌、防白内障等作用[1],因而受到全世界学术界广泛关注,使之成为涉及分子生物学、微生物学、医学等学科领域及医药、化工、食品等生产行业的一个热门研究课题[2]。 1.SOD的分类 SOD广泛存在于动、植物及微生物中[1]。根据其结合金属种类不同,可分为三类:第一类为Cu·Zn-SOD,呈蓝绿色,相对分子量约为32kDa,主要存在于真核细胞细胞浆、叶绿体和过氧化物酶体内;第二类为Mn- SOD,呈紫红色,相对分子量约为40kDa,主要存在于真核细胞线粒体和原核细胞中;第三类为Fe-SOD,呈黄褐色,相对分子量约为38.7kDa,主要存在于原核细胞及一些植物中[2]。 2.SOD的结构 1975年Richardson得到了Cu?Zn-SOD的三维结构[5],发现它是由2个基本相似的亚基组 成的二聚体,且每个亚基含有1个铜原子 和1个锌原子。2个相同亚基之间通过非 共价键的疏水相互作用而缔合,类似于圆 筒的端面。Cu?Zn-SOD的单个亚基活性中 心结构见图1。 从图中可知Cu与4个来自组氨酸残基
超氧化物歧化酶（SOD）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法 注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。货号：BC0170规格：50T/24S 产品内容： 提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存。试剂一：液体15mL×1瓶，4℃保存。 试剂二：液体160μL×1支，4℃保存；使用前先离心再吹打混匀。试剂三：液体11mL×1瓶，4℃保存。试剂四：粉剂×1支，4℃保存。 试剂五：液体2mL×1瓶，4℃保存；临用前将试剂四加入试剂五中，并震荡溶解。试验中所需的仪器和试剂： 可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水产品说明： SOD（EC 1.15.1.1）是一种广泛存在于生物体内的金属酶，是重要的氧自由基清除剂，能催化超氧化物阴离子发生岐化作用，生成H 2O 2和O 2。SOD 不仅是超氧化物阴离子清除酶，也是H 2O 2主要生成酶，在生物抗氧化系统中具有重要作用。 通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子(O 2-)，O 2-可还原氮蓝四唑生成蓝色甲臜，后者在560nm 处有吸收；SOD 可清除O 2-，从而抑制了甲臜的形成；反应液蓝色越深，说明SOD 活性愈低，反之活性越高。操作步骤： 一、样品的前处理：1. 细菌或培养细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500-1000:1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞
（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次），8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 2.组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为1:5-10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提 取液），进行冰浴匀浆；8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。 3.血清（浆）样品：直接检测。 二、测定步骤： 1.分光光度计预热30min以上，调节波长至560nm，蒸馏水调零。 2.测定前将试剂一、三和五37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min以上。 3.样本测定（在EP管中加入下列试剂） 试剂名称（μL）测定管对照管空白管1空白管2样品9090-- 试剂一240240240240 试剂二6-6- 试剂三180180180180 蒸馏水480486570576 试剂五30303030充分混匀，37℃水浴30min后，置于1mL玻璃比色皿测定560nm下的吸光度，分别记为A测定、A对照、A空1、A空2，计算ΔA测定=A测定-A对照，ΔA空白=A空1-A空2。 注意： 1、样本和试剂二使用时在冰上放置 2、样本较多时，可按表格配置工作液（包含试剂一、二、三），试剂五必须最后加入。 3、空白管1和空白管2各只需做1~2管；每个样本有一个对照管。 4、反应完成后，可能有沉淀生成，混匀后测定即可。 三、SOD活性计算： 1、抑制百分率的计算 抑制百分率＝(ΔA空白-ΔA测定)÷ΔA空白×100%
超氧化物歧化酶(SOD)的生产工艺研究
摘要 本文主要介绍SOD的作用和两种不同的生产工艺。通过一种传统的SOD生产工艺和一种利用选择性热变性的方法的牛血SOD提取生产工艺的对比研究从而反应出，由如今对SOD的需求而需要一种较新的生产工艺来取代传统工艺。讨论如何保证质量，提高酶的回收率和降低成本。 前言 在人体的正常新陈代谢就会产生自由基、是人体活动所需要的，但在某些特殊的情况下，体内会产生过量的自由基。如辐射、电磁波、汽车尾气、工业废气、废水的污染均会让体内产生过量的自由基。而自由基不到会引起人体衰老，还会让人体产生各种疾病如风湿性关节炎、癌症、高血压、肾脏病、白内障等等。SOD 是生物体内重要的抗氧化酶，广泛分布于各种生物体内，如动物，植物，微生物等。SOD具有特殊的生理活性，是生物体内清除自由基的首要物质。SOD在生物体内的水平高低意味着衰老与死亡的直观指标；现已证实，由氧自由基引发的疾病多达60多种。它可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害。由于现代生活压力，环境污染，各种辐射和超量运动都会造成氧自由基大量形成；因此，生物抗氧化机制中SOD的地位越来越重要！ 关键字: SOD 猪血分离纯化鉴定 材料：牛血、猪血、0.9%NaCl、95%乙醇、氯仿、丙酮、去离子
方法一: 工艺流程图 工艺要点:⑴收集、浮洗新鲜猪血经离心去除黄色血浆,红细胞用0.9%NaCl溶液离心浮洗3次，收集红细胞。 ⑵溶血、去血红蛋白收集洗净的红细胞，加去离子水，在5℃下搅拌30min,然后加入0.25倍体积的95%乙醇和0.15倍体积的氯仿,搅拌15min;离心去血红蛋白,收集上清液。 ⑶沉淀、热处理将上清液加入1.2~1.5倍体积的丙酮，产生絮状沉淀；离心去上清液，得沉淀物，操作要在0℃左右进行；沉淀物加适量蒸馏水使其溶解，离心除去不溶性蛋白;上清液于55~65℃热处理10~15min,离心除去热变性蛋白,收集黄绿色澄清液。⑷沉淀、去不溶蛋白0℃条件下，在澄清液中加入适量丙酮，使其产生大量絮状沉淀；离心弃去上清液，沉淀用去离子水溶解；离心除不溶性蛋白；上清液置透析袋中，得透析液。
超氧化物歧化酶的研究与应用 霍荣辉 运城学院，运城，2006142121 摘要：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，简称SOD)，是一类广泛存在于生物体内的金属酶，能够催化超氧阴离子自由基(O2-)发生歧化反应，平衡机体内的氧自由基，己成为化学及生物化学研究领域中热门的研究课题。作为生物体内超氧阴离子自由基的清洁剂，SOD 在防辐射、抗衰老、消炎、抑制肿瘤和癌症、自身免疫治疗等方面显示出独特的功能，在医学、食品、化妆品等领域得到越来越多的应用。目前，世界各地学者对SOD的研究方兴未艾，深入研究SOD不仅有着重大的理论意义，也有着重大的实际应用价值。现从分类、分布、结构、性质、催化机理、制备、应用等方面探讨了超氧化物歧化酶的基础研究进展。 关键字：超氧化物歧化酶；SOD；自由基；应用；研究 1SOD概述： 超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是一种广泛存在于生物体内，能清除生物体内的超氧阴离子自由基(O2-)维持机体中自由基产生和清除动态平衡的一种金属酶。具有保护生物体，防止衰老和治疗疾病等作用。 1938年Mann和Keilin[1]首次从牛红细胞中分离出一种蓝色的含铜蛋白质(Hemocuprein)，1969年Mccord及Fridovich[2]发现该蛋白有催化O2，发生歧化反应的功能，故将此酶命名为超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase，SOD，EC1.15.1.1)。现已发现了3种类型的SOD：Cu/Zn SOD、Mn-SOD、Fe-SOD[3]。 2SOD的分布、分类及理化性质 2.1SOD的分布与分类 SOD是一类清除自由基的蛋白酶，对需氧生物的生存起着重要的作用，是生物体防御氧毒性的关键。迄今为止，科学家已从细菌、真菌、原生动物、藻类、昆虫、鱼类、植物和哺乳动物等生物体内都分离得到了SOD。基于金属辅基不同，这些SOD至少可以分为Cu/ Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD三种类型。 表1 SOD的分类及分布