ELISA法与免疫荧光（IFA）和放射免疫(RIA)的各自优缺点的比较近二十几年来，免疫学分析方法发展很快，特别是在使用标记了的抗原和抗体的分析技术以后，使原来许多经典的分析方法在敏感性和特异性方面都不能相比。继50年代的免疫荧光（IFA）和60年代的放射免疫(RIA)分析技术之后，在70年代初期又建立了用酶来标记抗原或抗体的分析技术。
【药品 名称】 碘标记血管紧张素I放射免疫分析药盒 【概述】肾素-血管紧张素系统在机体的血压、水、电解质平衡的调节上起着重要作用。因此血浆肾素活性(PRA)和血管紧张素Ⅱ(AⅡ)浓度的测定已经成为原发性和继发性高血压的诊断及研究的重要指标。血浆肾素活性(PRA)的测定是以血管紧张素I(AI)产生的速率来表示的，血管紧张素I(AI)是由肾素作用于血管紧张素原而生成的10肽，它被血管紧张素转换酶降解成血管紧张素Ⅱ。血管紧张素I正常生理浓度下无生物活性。PRA、AⅡ二者测定均采用酶抑制剂来阻断转换酶和血管紧张素酶的活性，以达到准确测定PRA和AⅡ的目的。该项指标的测定，可作为判断肾素活性和对多种高血压及肾脏疾病诊断、分型的依据。 【测定原理】本试剂盒采用匀相竞争放射免疫分析方法，测定人血浆中AI的含量。先将校准品(或样品)、标记物和抗体按操作程序依次加入试管中，使标记抗原和抗原与限量抗体发生竞争性结合，待反映平衡后，加入分离剂，离心沉淀，使游离抗原与抗原抗体复合物分离，测量沉淀中放射性强度。随AI含量增加，放射性强度减少。 【试剂组成和配制方法】1.校准品 7瓶(冻干品) 每瓶用 ml缓冲液溶解，浓度分别为:0，0.19，0.38，0.75，1.5，3.0，6.0ng/ml 2.125I —AI 1-2瓶(红色冻干品) 每瓶用5.5ml缓冲液溶解，3.5μCi/μg 3.抗体 1瓶(蓝色冻干品) 使用前用 ml缓冲液溶解(如不填写100T 10ml溶解) 4.缓冲液 1瓶(液体) 5.分离试剂 1瓶(悬浮液) 使用前充分摇匀。 6.8-羟基喹啉 1瓶(液体) 7.二巯基丙醇 1瓶(液体) 8.EDTA-Na21瓶(液体) 9.保温液 1瓶(液体) 10.质控血清 2瓶(冻干品) 使用前用0.5ml缓冲液溶解 【样本要求】1.酶抑制剂的配制:按取血5ml计每支采血管加入50ulEDTA-NA2(如果晶粒析出，可温热溶解)50ul8-羟基喹啉和25ul二巯基丙醇，混匀，备用或2-8℃储存可用一周。 2.标本采集:按常规取静脉血5ml，迅速注入放在冰水浴冷却的酶抑制抗凝试管中，摇匀，立即放回冰水浴中冷却，待离心时取出。1000rpm离心5分钟(最好4℃离心机)，分离取出血浆，此操作应该在15分钟内完成，血浆备检或-25℃保存，可用2个月。 3.标本处理:测定前将冰冻的血浆标本在流动的冰水浴中快速融化，快速取双份标本，每份分别加入10ul保温液。作对照管的一份标本放在冰水浴中，作为测定管的一份标本放在37℃水浴中温育1小时，取样后放入冰水浴中。 【适用 仪器】 GC-2010γ放射免疫计数器、DMF-96型多管放射免疫计数器、γ放射免疫单管分析仪等。 【操作方法】将圆底聚苯乙烯试管编号(按复管操作)，按下表程序操作: AI加样测定程序表单位:μl 试剂NSB管S0-S6校准管对照管样品管生理盐水100 100 100 100 缓冲液200 ――― 校准品―100 ―― 待测血浆标本――100 100 125I―AI 100 100 100 100 AI抗血清―100 100 100 混匀，4℃放置15小时以上，任取3管测量，作为总放射性T(cpm)。 分离试剂1000 1000 1000 1000
荧光和化学发光免疫分析方法 免疫分析是利用抗原抗体反应进行的检测方法，即利用抗原与抗体的特异性反应， 应用制备好的抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。由于免疫的特异性结合，免疫分析方法具有很好的选择性，荧光免疫分析和化学发光免疫分析是其中典型的两种。本文将对这两种免疫分析方法进行详细的介绍。 一、免疫 免疫是指机体免疫系统识别自身与异己物质，并通过免疫应答排除抗原性异物，以维持机体生理平衡的功能。免疫是人体的一种生理功能，人体依靠这种功能识别“自己”和“非己”成分，从而破坏和排斥进入人体的抗原物质，或人体本身所产生的损伤细胞和肿瘤细胞等，以维持人体的健康。 特异性免疫系统，是一个专一性的免疫机制，针对一种抗原所生成的免疫淋巴细胞（浆细胞）分泌的抗体，只能对同一种抗原发挥免疫功能。而对变异或其他抗原毫无作用。 1、抗原 1.1抗原的定义 抗原：是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答(免疫原性) ，并能与相应抗体在体内或体外发生特异性结合的物质(免疫反应性)。 抗原一般为大分子物质，其分子量在10kD以上。 1.2抗原的分类
完全抗原：同时具有免疫原性和免疫反应性的抗原，如细菌、病毒、异种动物血清等。 半抗原：仅具有与相应抗原或致敏淋巴细胞结合的免疫反应性，而无免疫原性的物质。如大多数的多糖、类脂及一些简单的化学物质，它们本身不具免疫原性，但当与蛋白质大分子结合后形成复合物，便获得了免疫原性， 1.3抗原的性质 决定簇是指抗原分子表面的基团，它直接决定免疫学反映的特异性。 抗原通过抗原决定簇与相应淋巴细胞表面抗原受体结合，从而激活淋巴细胞，引起免疫应答，抗原也藉此与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合。 因此，抗原决定簇是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的物质基础。 2、抗体 2.1抗体的定义 抗体：是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。 2.2抗体的结构 抗体是机体受抗原刺激后，由淋巴细胞特别是浆细胞合成的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白，因其具有免疫活性故又称作免疫球蛋白。 人免疫球蛋白有五类，分别为IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。 3、抗原抗体的结合
放射免疫分析技术 摘要RIA 是一种微量分析法, 就是利用放射性核素标记抗原或抗体, 然后与被测的抗体或抗原结合, 形成抗原抗体复合物的原理来进行分析的。它兼有放射性同位素的灵敏性和抗原、抗体反应的特异性两大特点。该法还具有准确性高和精密度好, 便于标准化以及操作简便、经济等优点。由于RIA具有灵敏度高，特异性强，测量简单，成本低等优点，RIA在应用方面具有一定的生命力。但是，又因为它最致命的弱点就是使用放射性核素，此外标记物有效使用时间短，难以实现操作和测量的自动化等，它的进一步发展受到一些局限。现在免疫分析技术都在朝着非同位素标记免疫分析的方向发展，自动化仪器已经投入到临床常规项目的检测中，使得传统的RIA使用市场逐渐缩小。不过第五代RIA技术的出现，使得现在的RIA 技术较其他方法在方法学有了更多的优势，尤其是纳米磁性固相的应用，为RIA自动化的研制提供了很大帮助。此外，在生命科学的实验领域，非放射标记免疫技术始终不能代替RIA。关键字RIA IRIA 基本原理第五代RIA技术 1959 年，美国科学家Berson 和Yalow 将放射性同位素测量的高灵敏度与抗原抗体的高特异性巧妙地结合起来，创立了放射免疫分析( radioimmuoassay，RIA) 技术。RIA 经过半个多世纪的发展，可以分析成百上千种物质，包括激素、维生素、肿瘤相关抗原、抗体、药物、病毒等。使那些曾认为无法检测的微量而又具有重要生物活性的物质得以精确定量，为医学、生命科学的发展做出划时代的贡献。因此，1977 年Yalow荣获诺贝尔生理学或医学奖。随后，各国学者发展了酶免疫分析( EIA) 、荧光( FIA) 、时间分辨荧光( TRFIA) 和化学发光( CLIA) 等非同位素标记免疫分析技术。 1. RIA基本原理 放射免疫分析法的本质是一种分子相同的被侧物质和同位素标记物质, 同另一种浓度有限的特异性结合试剂进行的竞争性结合。当同位素标记化合物和特异性结合试剂的量保持一定时, 加入的被侧物或标准物的量与标记物的量之和多于特异性结合试剂有效结合的数目时, 被测物或标准物与标记物一特异性结合试剂复合物之间就呈现一种函数关系。即被测物的量越多, 则标记物的被稀释程度也就越大, 使标记物一特异性结合试剂复合物的量逐渐减少, 放射性强度侧定就越低。根据这种原理来对生物体内的微量物质进行定量测定。 以标记化合物为P* . , 非标记化合物为P , 特异性结合试剂为Q, 其反应式构成了放射
福州大学专题报告姓名/学号：王佳婕/10112010517 学院：物理与信息工程学院 专业：通信与信息系统 导师：洪蛤畔副教授 研究方向：生物医学信息的检测与处理
荧光免疫分析定量检测技术 免疫分析(immunoassay , IA)是基于抗原和抗体特征性反应的一种分析技术。根据标记技术手段的不同，免疫分析主要分为放射免疫分析、酶免疫分析、化学发光免疫分析、荧光免疫分析等[1]。 1941年，Cons等用荧光素和抗体的结合来定位组织中的抗原，提出了荧光免疫分析法（Fluorescence Immunoassay，FIA）的概念[2]。荧光免疫分析法常用试剂是荧光素，荧光素一直是分析领域中常用的有机荧光分子标记物。在特定波长的激发光作用下，某些有机荧光分子很容易被激发至饱和状态并发出荧光，而这些荧光分子还能在很短的时间内进行多次的重复激发和测量。荧光免疫分析法就是根据荧光分子的这种特性进行定量分析的。 一、荧光免疫分析 荧光免疫分析的方法有很多,常见的有以下几种：荧光偏振免疫分析、荧光猝灭免疫分析、荧光增强免疫分析。 荧光免疫分析在国内外被广泛地应用在临床检测中，如内分泌疾病检测（甲状腺、糖尿病及生长素类的检测）、传染病检测（肝炎、艾滋病等）、妇产科疾病检测（HCG、FSH、Testosterone等）、肿瘤标志物检测（AFP、PSA、CA系列）、遗传科疾病检测（产前筛查、新生儿筛查及基因杂交检测等）、血液及细胞学检测（贫血、白血病及细胞试验与分析等）[3]。免疫组织化学、微阵列、多标记物的免疫分析等新应用也不断地涌现出来[4]。 荧光免疫分析技术的基本原理是将抗原抗体反应的高度特异性 与荧光的可测量性结合起来，以荧光物质作为示踪剂标记抗体（或抗原）制成特异性试剂，可用于检测特定的抗原抗体浓度，以便进一步进行病理学或免疫组织化学的免疫分析[4]。 相对于定性检测和半定量检测，定量检测在临床应用中更具有实际意义。它可以直接读出待测物质的浓度，为临床诊断提高可靠依据，可应用于疾病的早期诊断。 二、荧光免疫定量检测 1.荧光检测机理 某些物质经紫外光的照射，吸收了一定波长的入射光（紫外光）后，即可发射出较入射光波长稍长的光，这种光称为荧光。由于物质的分子结构不同，所能吸收紫外光的波长及发射荧光的波长也有所不同，利用这个特性可以对待测物质进行有针对性的检测。在一定条件
时间分辨荧光免疫分析仪特点及性能 时间分辨荧光免疫分析仪采用现代光学、机械、计算机等先进技术，通过标记离子螯合物产生的特异性荧光寿命长、强度高，消除本底干扰荧光；利用激发光波谱宽、荧光发射波谱窄，增强荧光强度，提高分辨率的原理，对临床免疫血样进行定量分析，为临床血样提供灵敏、准确、可靠的数据。 概述 时间分辨荧光免疫法所用的标记物是镧系元素螯合物，利用这类荧光物质荧光寿命长等特点，通过波长和时间两种分辨技术，有效排除了非特异本底荧光的干扰。 特点 1、灵敏度高； 2、标记物制备简单； 3、稳定性好； 4、标准曲线线性范围宽； 5、操作方便。 技术性能 电源：210～240V，50～60Hz；外型尺寸：550mm×600mm×270mm；重量：25 kg；灵敏度：10-13 mol/L；线性度：10-12～10-8 mol/L；快速测试：1秒/样；高稳定性：< ±1 %；工作制：连续运行；安全分类：I类；防电击程度：B型；熔断器：Φ5×20 5A。 应用领域 主要用于对人的血液和其它体液中的各种免疫检测项目进行定量分析，它可以适用与传染病检查、内分泌科检查、细胞学检查、肿瘤科检查等。随着检验医学的发展，对微量、超微量的测定会越来越多，同时RIA的污染问题会越来越被重视，因此，时间分辨荧光分析法具有越来越大的应用空间。 产品特性产品参数 产品特点： 1) 采用进口光源、光学镜片及光电倍增管，保证检测结果的稳定性及可靠性； 2) 测试速度快，1秒／样本； 3) 标本灵活，适合任意份标本量； 4) 全中文软件，操作界面简便； 5) 是国内首家研发出成功，填补国内空白，并获得国家科技进步二等奖。 技术参数： 1) 测定原理：时间分辨 2) 激发光源：进口氙灯 3) 灵敏度: 10 -17 mol／孔（Eu 3+） 4) 线性范围：10 -13 mol／孔～10 -17 mol／孔 5) 高稳定性：＜5 % 6) 电源：AC 198～242V 50～60Hz 7) 外型尺寸：710mm×520mm×320mm
分析电化学发光免疫法和放射免疫法检测血清FT3、FT4、TSH的方法 【电化学发光免疫法 【摘要目的探索电化学发光免疫法检测替换放射免疫法检测的可靠性及在方法学上前者是否更具上风。方法利用2种方法法分别检测血清FT3、 FT4、TSH，并进行精密度、正确度、患者结果可报告范围、分析灵敏度、分析特异性、回收率等几方面的比较。结果 2种方法法检测结果差异有明显性（P ＜0.05），并且电化学发光免疫法在患者结果可报告范围、精密度、分析灵敏度、抗干扰能力、正确度试验方面均优于放射免疫法。结论电化学发光免疫法完全能够替换放射免疫法，并且还具有报告范围宽，精密度、分析灵敏度高，抗干扰能力强的优点。 【电化学发光免疫法；检测低限；抗干扰试验 由于放射免疫法（RIA）检测血清FT3、FT4、TSH本钱较低，目前还有部分实验室仍在采用，但因该法报告时间长，结果不稳定，且存在同位素污染新题目，在国外已趋于淘汰。近年来国内推出的电化学发光免疫法（ECLIA）检测具有快速、正确、重复性好并平安无毒等优点，受到临床和实验室的关注。本文分别采用2种方法对血清FT3、FT4、TSH检测做了患者结果可报告范围、精密度、分析灵敏度、抗干扰试验、正确度试验，结果报告如下。 1 材料和方法 1.1 仪器和试剂 美国罗氏公司生产的2010型电化学发光免疫分析仪，美国生产的Cap-Ria-16型全自动γ计数仪。电化学发光免疫分析试剂购于罗氏公司，放射免疫分析试剂购于天津九鼎公司。 1.2 方法和结果 1.2.1 精密度 分别取FT3、FT4、TSH 3种不同浓度的混合血清，见表1。其中一半重复测定20次，另外一半分成10份，装进塑料离心管置于-20℃冰箱，天天1次共测定10次，测定结果，见表2。表1 FT3、FT4、TSH 3项不同浓度的混合血清（略）表2 电化学发光免疫法和放射免疫法检测的精密度情况（略） 1.2.2 分析灵敏度
免疫荧光技术的实验方法及其分类 一、免疫标记法及其分类 1.荧光免疫法 原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min 内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。 以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。 传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2.放射免疫法 放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。 RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng/ml 水平。但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。 3.酶联免疫法(ELISA) ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb 和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg/L，线性范围达1 000ug/L。夹心ELISA 法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。
放射免疫分析仪技术参数 *1、对125I的探测效率≥78% *2、本底计数≤60CPM 3、探头不一致性≤2% *4、8小时稳定性：探测效率的附加误差不大于3% *5、计数精密度：γ计数器的计数精密度与幅射统计涨落的理论期望值无显著性差异。用X2双测检验法重复测量21次，应符合（10.851≤X2≤31.410）6、探头数量：5个 *7、一次装样容量：380个样品，测量过程中可随时添加 8、仪器工作方式：全自动测量、机械手抓取样品 *9、具有多核素选择测量功能，可选择125I、57Co、59Fe、75Se、ICo-I等多种放射性核素标记物测量。 10、自动排队测量，采用条码阅读自动识别技术，一次最多可设置10个检 测项目。 11、具有断电续测功能、浓度反查功能、标准曲线调用功能等。 12、具有复管测量功能，复管数最高可设置4个，提高检测准确度。 13、仪器智能化程度高，可自动进行坪、谱曲线的测量、故障自诊断提示等， 操作维护简单。 14、六种检测模式选择：放射免疫（RIA）、免疫放射（IRMA）、肝炎、TG.TM、 胰岛素系列、纯计数测量。 15、七种数据处理方式：线性内插方程、样条函数、三次多项式方程、Log-logit 方程、3/2次方程、四参数、五参数。 16、五种结合率方式：B/T、B/B0、B/Bm、F/B、B/F。 17、可编辑打印多种报告单样式，不同项目的检测结果可综合打印在一张报 告单上。 18、质控分析功能：提供批间质控、批内质控、精密度图、质控图等。 19、数据可网上传输，实现资源共享。 20、同步皮带传送样品，进样、退样不打滑。
21、利用多组光电传感器，控制机械手抓样、放样可靠方便。 22、采用条码阅读技术，实现了多项目测量的自动排队。 23、多核素的选择测量，计算机自动识别，无需旋钮调节。 24、5个探头的测量误差小于2%。 25、电路采用高度集成的模块化设计，维护方便，维修简单。注：本参数无指向性、排它性，仅为满足医院需要。
免疫分析法 1,熟悉免疫分析法的基础知识 ,了解放射免疫分析法,酶免疫分析法,化学发光免疫分析法,荧光免疫分析法 第一:概述 基本原理 基本条件 方法分类 免疫分析法(Immunoassay,IA):是指以特异性抗原-抗体反应为基础的分析方法. 1959年,由美国Yallow和Berson等人将放射性同位素示踪技术的高灵敏性和免疫反应的高特异性结合起来,首先测定了糖尿病人血浆中的胰岛素含量,从而创立了放射免疫分析方法(Radioimmunoassay,RIA). 酶免疫分析法,化学发光免疫分析法,荧光免疫分析法,时间分辩免疫分析方法等. 一,基本原理 (一)竞争抑制原理 实质都是抗原一抗体竞争结合反应 Ag*:标记抗原 Ag:未标记抗原 Ab:特异抗体 Ag*-Ab:标记抗原-抗体结合物, Ag-Ab代表未标记抗原一抗体结物 K:平衡常数(K=K1/K2). 抗原-抗体反应须满足以下条件: Ag*与Ag(待测物)必须是相同的生物活性物质; 所加入Ag*和Ab的量应是固定的; Ag*与Ag的量之和应大于Ab的结合位点; Ag*,Ag及Ab须处在同一反应体系中. 这种竞争抑制的数量关系成为免疫分析的定量基础 (二)竞争抑制曲线(剂量反应曲线) 用待测物的标准品配置一系列已知浓度的标准溶液,再加入一定量的标记抗原和抗体,待抗原抗体反应达到平衡后,测定系列标准溶液的Ag*-Ab的结合率. B代表结合的标记抗原; F代表游离的标记抗原; T代表总的标记抗原. B/F-[Ag] B/(B+F)×100%-[Ag] (三)抗原一抗体反应的特点 1.特异性 一种抗原分子只能与由它刺激产生的抗体发生特异性结合反应. 抗原的特异性主要取决于抗原决定簇(Cluster)的数量,性质及立体构型. 抗体的特异性则取决于抗原结合段(fragment of antigen binding,IgFab)与相应抗原决定簇的结合能力. 交叉反应(cross reaction):结构相近似的其它药物或化合物与抗体的结合. 2.可逆性
1.1 时间分辨荧光分析技术 时间分辨荧光生化分析技术是基于稀土荧光配合物特殊的荧光性质而建立起来的，自1978年提出以来[1]，已广泛的应用于免疫分析、核酸测定、荧光显微镜成像、细胞识别、单细胞原位测定、生物芯片等生化领域，并发展出了相应的时间分辨荧光免疫测定法、时间分辨荧光DNA 杂交测定法、时间分辨荧光显微镜成像测定法、时间分辨荧光细胞活性测定法及时间分辨荧光生物芯片测定法等分支。 本节主要对稀土荧光配合物的发光机理、荧光性质，时间分辨荧光测定的原理，时间分辨荧光免疫分析技术，时间分辨荧光显微镜成像技术的研究进展等加以介绍。 1.1.1 稀土荧光配合物的发光机理及荧光性质 稀土元素指的是元素周期表中IIIB 族的镧系元素以及钪和钇，共17种元素。其中镧系元素的外层电子结构为4f 0-145d 0-106s 1-2，由于5s 和5p 电子对4f 电子的屏蔽作用，导致这些金属及其离子的性质十分相似。图1.1给出了四种三价稀土离子的基态及激发态电子能级图[2]。 1020 152530355 E N E R G Y ,103c m -1 6 H 5/2 G 5/2 6 H 15/2 7 F 0 F 2D 0 5D 1 7F 6 F 5 4 5D 3 13/2 4 9/2 Sm 3+ Eu 3+ Tb 3+ Dy 3+ H 9/2 图1.1 部分三价稀土离子的电子能级图 Fig. 1.1 Electronic energy levels of certain lanthanide(III) ions 大部分稀土离子本身是不具有荧光性质的，只有Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+的水溶液在紫外光或可见光的激发下能够发出微弱的荧光。当Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+与某些有机配位体形成配合物时其荧光强度会显著增强，这种发光是基于配合物内由配位体到中心稀土离子的能量转移所产生的[3-8]。以铕(III)配合物为
放射免疫分析（radioimmunoassay，RIA）是以放射性核素为标记物的标记免疫分析法。于1960年由美国学者Yalow和Berson创立，并首先用于糖尿病患者血浆胰岛素含量的测定。这是医学和生物学领域中方法学的一项重大突破，开辟了医学检测史上的一个新纪元。它使得那些原先认为是无法测定的极微量而又具有重要生物学意义的物质得以精确定量，从而为进一步揭开生命奥秘打开了一条新的道路，使人们有可能在分子水平上重新认识某些生命现象的生化生理基础。此后30年，内分泌学科的飞速进展充分证明了这一超微量分析技术的巨大推动力。1977年，这项技术的发明者荣获诺贝尔生物医学奖。随后这一崭新的技术迅速渗透到医学科学的其他领域，如病毒学、药理学、血液学、免疫学、法医学、肿瘤学等，以及与医学生物学相关的学科，如农业科学、生态学及环境科学等。放射免疫分析的物质，由激素扩大到几乎一切生物活性物质。我国放射免疫分析研究起步于1962年，并迅速发展与普及，对我国生物医学的进展起了很大的促进作用。 放射免疫分析由于敏感度高、特异性强、精密度高、并可测定小分子量和大分子量物质，所以在检验医学中应用极为广泛，常用于测定各种激素（如甲状腺激素、性激素、胰岛素等）、微量蛋白质、肿瘤标志物（如AFP、CEA、CA—125、CA—199等）和药物（如苯巴比妥、氯丙嗪、庆大霉素等）等。各种检测项目均有试剂盒供应，而且仪器设备并不昂贵，所以在国内被广泛采用。但由于核素的放射性对人体有一定的危害性，必须加以防护，核素实验室的建设须经防疫部门的监督，操作人员须经过特殊训练。另外，由于核素有半衰期，试剂盒的货存期较短，因而放射免疫分析在应用中有诸多不便之处。特别是近年来其他标记免疫分析技术如酶免疫分析、发光免疫分析等在技术上有飞跃的进展，高级仪器的自动化程度已可与生化自动分析仪相媲美，因此从长远前景看，放射免疫分析有被取代的趋势。但在目前，从所需的设备和检测的费用上，放射免疫分析还有一定的优越性，还将在一定时期内被医学检验实验室所采用。 一、放射免疫分析的基本试剂 （一）标准品 标准品是放射免疫分析法定量的依据，由于以标准品的量用来表示被涮物质的量，故标准品与被测物质应当化学结构一致并具有相同免疫活性。标准品作为定量的基准。应要求高度纯化。标准品除含量应具有准确性外，还应具备稳定性，即在合理的贮存条件下保持原来的特性。 按实验要求，将标准品用缓冲液配成含不同剂量的标准溶液，用于制作标准曲线。 （二）标记物 标记抗原应具备：①比放射性高，以保证方法的灵敏度；②免疫活性好；③所用的核素的半衰期尽可能长，标记一次可较长时间使用，这对来之不易的抗原尤其重要；④标记简便、易防护。 要准确测量B与F的放射性，必须有足够的放射性强度。所选用的标记抗原的量，在使用125I时达5000～15000cpm。 （三）抗体 应选择特异性高、亲和力强及滴度好的抗体，用于放射免疫测定。 根据稀释曲线，选择适当的稀释度，一般以结合率为50%作为抗血清的稀释度。 （四）B与F分离剂 以2%加膜活性炭溶液为例，2%加膜活性炭溶液的配制： 活性炭2g（杭州木材厂生产，森工牌732型） 右旋糖酐T200.2g
时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay)是在荧光分析的基础上发展起来的一种特殊的荧光分析。它利用具有长效荧光的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）作标记物，充分利用激发光与发射光之间的降移与发射光较长的半寿期，在激发光后延时测量发射光的强度。从而所测的荧光不受激发光和被检物中的非特异荧光干扰，提高了检测的特异性与灵敏度。在激发光后延时400微秒，测量400微秒，间歇200微秒后进入下一个测量周期，每一个周期为1000微秒。对每一个样品实施1秒钟的测量，意味着完成了1000个周期的测量，测量精确度极高。 （一）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪开/关程序 1 开机 1.1 依次打开样品处理器电源，微孔板处理器电源，打印机电源。 1.2 打开计算机显示器。 1.3 启动计算机。 1.4 运行系统软件：Auto DELFIA与Multicalc系统软件在Windows启动后自动运行。Auto DELFIA workstation软件用于控制Auto DELFIA的运行，MultiCalc的主要功能是与主机通讯，对测试结果进行评估和对质控及其他数据处理（可通过双击屏幕上图标不运行）。在MultiCalc Auto DELFIA环境下，只有键盘有效，鼠标无效。 2 开机后准备 1.1 清洗液准备 1.1.1 微孔板处理器洗液（250ml浓缩液＋600ml去离子水混合），每做一块板至少1升用量，洗液在密闭条件可保存2周时间。 1.1.2 准备样品处理器洗液（50ml浓缩液＋5000ml去离子水混合），每做一块板至少需要800ml洗液，洗液在密闭条件下可保存1周时间。 1.2 样品处理器准备 1.2.1 在Wash bottle（清洗液瓶）、Rinse bottle (冲洗液瓶)分别注入足够用量的清洗液和去离子水，倒空废液瓶。拧紧各瓶盖，确保废液瓶管路向下。 1.2.2 如样品需要稀释，放入稀释杯和稀释液。系统安装时已调好有71ml和190ml两种规格的稀释杯，若使用71ml的稀释杯，从最右端开始放置，如有预处理样品，则不能使用190ml 的稀释杯。不能使用多个稀释杯。 1.3 微孔板处理器准备。
时间分辨荧光免疫分析法产前筛查原理与操作规程 一、产前筛查定义及其原理 产前筛查（Prenatal Screening)是指通过经济、简便和较少创伤的检测方法，从孕妇群体中发现怀有某些先天缺陷胎儿的高危孕妇，以便进而进行诊断，以最大限度地减少异常儿的出生。血清学标志物产前筛查已成为非侵入性产前诊断的重要方法。目前产前筛查的两种主要疾病是唐氏综合征（Down’s Sydrome，DS；又称21三体综合征）和胎儿神经管缺陷（Neural Tube Defects，NTDs），也包括一部分18三体综合征。产前筛查可以在妊娠早期（7～13周）或中期（14～21周）进行。目前用于产前筛查的血清学标志物有：甲胎蛋白（AFP）、游离β- ）、妊娠相关血浆蛋白（PAPP-A）、绒毛膜促性腺激素（F-β-hCG）、游离雌三醇（uE 3 抑制素A（inhibin A）等。产前筛查实验测量通用评价指标为中位值倍数（MOM），正常妊娠特定的MOM=标本检测浓度/相应孕周中位值浓度。产前筛查系统由体外诊断试剂、检测仪器和筛查分析软件组成。检测仪器配合体外诊断试剂检测出孕妇血清中标记物（AFP、F-β-hCG、PAPP-A等）的浓度，将检测数据及孕妇相关因素输入筛查分析软件中，即可得出唐氏综合征（DS）和神经管缺陷（NTD）筛查的结果。由于目前的技术水平的限制，产前筛查技术都不能做到筛查100%正确。假阴性病例因此会误诊，假阳性病例一般在产前诊断实验时被纠正。 二、唐氏综合征的产前筛查 唐氏综合征是人类最常见的一种染色体病，发病率约1/800～1/600，男性多于女性。1866年英国医生Langdom Down 首次对此病进行临床描述，因此命名称为Down，s Syndrome，简称DS。1959年Lejeune首先发现本病的病因是多了一条21号染色体，故又将其命名为21三体综合征。唐氏综合征的主要临床表现：严重智力低下、愚型面容，约50%伴有先天性心脏病、小头畸形等发育异常。目前对DS尚未有治疗方法，因此通过产前筛查找出高危孕妇，对其进行产前诊断是防止患儿出生的重要手段。 1.以孕妇年龄作为筛查指标 最早用于DS的筛查指标为孕妇年龄。早期研究发现，DS的发病率随孕妇年龄增高而增高，1977年Hook和Chambers报道了孕妇年龄在20～30岁之间，发病率呈线性增加，而在33岁左右呈对数增加，孕妇年龄为35岁时，发病率约1/384，40岁时约1/110，比30岁时增加了8倍，如图1。一般认为35岁以上
化学发光免疫法(CLIA)较放射免疫法(RIA)的优越性分析 发表时间：2017-06-13T17:44:19.887Z 来源：《医师在线》2017年4月上第7期作者：王欣 [导读] 建议可根据实际状况采用RIA或CLIA方式，此两种检测方式敏感性和特异性有一定相似，但CLIA方式安全性、精密度、准确性更高。 黑龙江省农垦总局总医院150088 【摘要】目的：分析研讨化学发光免疫法（CLIA）较放射免疫法（RIA）的优越性。方法：此研究共讨论108例血清样本，均为我院2015年6月至2016年7月期间住院及门诊患者，用LIAISON全自动化学发光仪和放射免疫计数GC-911-r测定其血清AFP，并进行精密度实验、对比实验、线性实验、回收实验。结果：RIA方式检测回收率为90.5-108.3%，平均为95.7%，线性实验为5ng/ml-401ng/ml；CLIA方式检测回收率为92.1%-107.5%，平均为97.1%，线性实验为2ng/ml-939ng/ml。CLIA线性关系和回收率明显较好。对比分析实验直线回归 性分析，r=0.994，此两种检查方式对比无统计学意义（P>0.05）。高值、中值、低值的精密度实验表明CLIA有较好重复性。结论：测定AFP指数，建议可根据实际状况采用RIA或CLIA方式，此两种检测方式敏感性和特异性有一定相似，但CLIA方式安全性、精密度、准确性更高。 【关键字】优越性；RIA；CLIA；检测；AFP 血清甲胎蛋白（AFP）指数和机体甲状腺功能有密切关系，已发展为临床检测亚临床异常、甲亢、甲低等甲状腺功能的一项灵敏性指数[1-2]，所以AFP指数的准确性对临床判定疾病的规范性和准确性均有直接性影响。以往临床在测定AFP指数上多用RIA方式，随着CLIA 方式的问世，因其重现性好、快速、精准等优势快速在医学界获得认可，其发展前景较长。此研究用论著方式，意在分析CLIA较RIA的优越性。具体报告如下： 1.资料及方法 1.1一般资料 此研究共讨论108例血清样本，均为我院2015年6月至2016年7月期间住院及门诊患者，108例患者中58例男性，50例女性，年龄阶段为37.2岁-71.3岁，平均为（51.3±7.2）岁。排除脂血、溶血、黄疸等患者。且患者均知晓此次检测方式，研究方案经医院相关伦理会批准后实施。 1.2方法 用LIAISON全自动化学发光仪，仪器和配套试剂均由德国公司提供；放射免疫计数GC-911-r测定其血清AFP，仪器和相应设计均由北京北方生物技术研究所提供。 方法：CLIA检测方式发光底物为异鲁米诺，用标本内AFP抗原与固相内单克隆AFP联合的作用，则抗体夹心模式。因AFP试剂含量和仪器所检测的发光单位之间关系为正性，因此AFP指数可计算而出。 1.3 指标判定 实施回收实验，取浓度未35.3ng/ml、26.7ng/ml、18.6ng/ml的混合血清和浓度不同的定值血清进行混合，用CLIA和RIA法测定回收率，并计算平均回收率指数。线性实验标准液为：浓度不同的稀释比例进行稀释处理后，给予线性检测。对比分析CLIA和RIA法测定血清结果，并定量分析。 1.4统计学方法 数据用直线回归法进行处理，用统计学软件（SPSS13.0版本）分析，计量资料表示方式为（ ±s），计数资料表示方式为（n，%），若P<0.05，则判定结果存在统计学意义。 2.结果 2.1 线性实验、回收实验 RIA方式检测回收率为90.5-108.3%，平均为95.7%，线性实验为5ng/ml-401ng/ml；CLIA方式检测回收率为92.1%-107.5%，平均为97.1%，线性实验为2ng/ml-939ng/ml。CLIA线性关系和回收率明显较好。 2.2 对比实验、精密度实验 对比分析实验直线回归性分析，r=0.994，此两种检查方式对比无统计学意义（P>0.05）。高值、中值、低值的精密度实验表明CLIA 有较好重复性。详见下表1： 表1：对比分析CLIA和RIA法检测精密度 3.讨论 CLIA方式具备免疫分析法的特异性和光化学检测的敏感性，所以，和RIA方式比较，前者优势性更大[3-4]。CLIA方式原理为用化学发光激发态分子，让基态状态得到恢复，用光形式进行释放，进而有发光。此方法将抗体和抗原反应指示系统，用化学发光的方式表达出，进而用定量方式测定抗体和抗原则更具有科学性。用发光剂直接性标记抗体，进而让检测更为快捷和便利。异鲁米诺属于有机化合物之一[5]，酸性状况下其稳定性较好，且碱性状况下，在不使用催化剂的状况下，也可快速被激发，进而降低研讨过程内非特异性干扰，提升灵敏度，加速反应速度。异鲁米诺所标记过的化学试剂，有效时间可在一年之上。RIA原理则为同时结合未标记抗原和已标记抗原，让其发生
一、前言 近百年来，“特效试剂”一直是分析化学家追求的目标。所谓“特效试剂”，就是指的是只与一种待测物质反应的试剂。事实上，目前使用的所谓的“铜试剂”、“铁试剂”、“硝酸试剂”等等，都是“盛名之下，其实难副”的。20世纪40-50年代追求合成特效试剂的狂热，早已降温。正在分析化学家心灰意冷之际，人们从免疫学与生物化学的成就看到了这一理想的曙光：免疫系统简直就是天然存在的一部特异性试剂的合成机器。抗原与抗体之间的免疫反应具有高度的特异性，这种识别的专一性超过酶对底物的识别水平，抗原-抗体复合物的稳定常数一般为109，有些高达1010-1015，具有很高的稳定性。免疫反应的特点使得免疫分析已成为一个跨学科的新型分析技术，广泛应用于临床体液分析、药物分析、环境分析、食品分析和生物化学研究，尤其在毒品的鉴定、吸毒人员的认定和疾病的诊断方面，发挥了重要作用。 时间分辨荧光免疫分析技术（TRFIA）是自80年代以来新发展起来的一种新型分析技术，与其它免疫分析技术相比，有其独特的优点。它克服了放射性免疫分析法（RIA）中放射性同位素带来的污染问题；克服了酶免疫分析法（EIA）中酶不稳定的缺点；而且，由于TRFIA法能够很好的消除背景荧光的干扰，使其灵敏度比普通荧光法（FIA）高出几个数量级。正是由于TRFIA的独特优点，使得它成为免疫分析中最有发展潜力的一种分析方法。 二、时间分辨荧光免疫分析的原理 时间分辨荧光免疫分析的原理就是使用三价稀土离子（如Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+）作为示踪物，通过这些稀土离子与具有双功能结构的螯合剂以及抗原形成稀土离子-螯合剂-抗原螯合物。当标记抗原、待测抗原共同竞争抗体，形成免疫复合物，由于免疫复合物中抗原抗体结合部分就含有稀土离子，当采取一些办法将结合部分与游离部分分开后，利用时间分辨荧光分析仪，即可测定复合物中的稀土离子发射的荧光强度，从而确定待测抗原的量。 正常情况下，免疫复合物中的稀土离子自身荧光信号很微弱，若加入一种酸性增强液，稀土离子从免疫复合物中解离出来，和增强液中的β-二酮体、三正辛基氧化膦、Triton X-100等成分形成一种微囊。后者被激发光激发后，则稀土离子可以发出长寿命的极强的荧光信号，使原来微弱的荧光信号增强将近100万倍。 采用时间分辨技术测量荧光，采用了门控技术，它是使背景荧光信号降低到零以后，再测定长寿命标记物的荧光。 三、时间分辨荧光分析的测量方法 （1）解离增强测量法 解离增强测量法是解离增强稀土离子荧光方法，简称DELFIA法。通过双功能基团把Eu3+或Sm3+螯合到抗原、抗体或SA上，免疫反应后，部分标记物结合到固相载体上，未结合的标记物被洗掉。最后用低pH值的增强液，把Eu3+或Sm3+
时间分辨荧光免疫分析实验操作指南以及注意事项
第一节时间分辨反应过程图 TRFIA的操作要点 优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证TRFIA检测结果准确可靠的必要条件。 下面列出TRFIA各个操作步骤的注意要点，严格遵照规定操作. 1、样本的采取和保存 TRFIA测定的样本一般为血清。不能使用含抗凝剂EDTA和柠檬酸的样本，因为二者可以螯合铕，使测定值降低。血清样本可按常规方法采集,溶血和脂血样本可能会影响测值。 样品在2℃-8℃可以保存3-5天，如果需要长期保存，请－20℃保存，避免反复冻融。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，宜轻缓充分混匀，避免气泡，可上下颠倒混和。不要把样本保存在室温，室温放置48小时可能会导致结果不稳定。 2、试剂的准备 整个实验过程应尽量在干净无尘的环境下进行 实验前应检查试剂盒的出厂日期以确定试剂盒是否过期，一般自产品检验合格出厂日期起有效期为一年。 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。TRFIA中用的去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的去离子水。从冰箱中取出的试验用试剂应待其温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。 试剂盒中的标准品或铕标试剂若是冻干的状态，第一次开盒做实验在加去
离子水溶解标准品或铕标后，请不要立刻开始使用，静置10分钟左右待其溶解完全后再开始。 板条若未能一次用完，剩余板条用塑料袋（内有干燥剂）封口后密封保存。 TRFIA受反应温度的不恒定、操作误差以及铕标记物的稳定性等因素的影响，不同日期的荧光值会有所波动，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。 3、加样 在TRFIA中一般有3次加样步骤，即加样本，加铕标记物，加增强液。加样时应将所加物加在微孔板的底部，避免加在孔壁上部，不可溅出，不可产生气泡。 加样本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。加不同的样本应更换吸嘴，以免发生交叉污染。加铕标记和增强液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。 连续加样器使用时要连续流畅，并不是加样越慢越好！ 加样时检测吸嘴是否堵塞，加量是否足够，注意吸头之间是有差异的。 加样品时把样品按12个一排排好，做时每加样一个，就把它前移一排，这样不容易出错。 注意按操作步骤计算试剂的量是否充足，特别是使用全自动仪器时！ 使用干净的一次性容器配制铕标记物。铕标记物的污染是造成实验本底增高的首要原因。注意铕标记物的瓶盖不要与标准品瓶盖混用；所有接触过铕标记物的用品使用完毕应该丢弃，不能重复使用。注意铕标记物原液和工作不要污染实验台面、加样枪及试剂盒中的其他组份。 4、孵育 在TRFIA中一般有一次或两次抗原抗体反应，即加样本和铕标记物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为孵育，或者温育。 目前TRFIA常用模式在微孔板中进行，属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的样本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗体结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的
放射免疫分析 摘要：放射免疫技术（radio immunoassay ,RIA）类型主要包括经典的放射免疫分析(radioimmunoassay, RIA)和免疫放射分析或免疫放射度量分析( immunoradiometric assay，IRMA)。由于受接触放射性物质，损害操作人员的身体，测定完成后放射性材料的处置等问题的存在,再加上80年代初出现的非同位素标记技术得到了极大的发展和广泛应用，放射免疫技术的应用有下降的趋势。 0引言：放射性核素依衰变方式分α、β、γ三种，用于放射性标记的有β和γ两类;分别用液体闪烁计数器及γ计数器测定。目前常用的是γ型放射性核素，如125I、131I、51Cr和60Co，以125I最常用；β型放射性核素有3H、14C和32P，以3H最常用。 关键词：结构，原理，临床应用 1检测的基本结构原理、结构及其探测原理 核射线探测仪器由射线探测器和后续电子学单元两大部分组成。核射线探测器是个能量转化器，其检测原理是当射线作用于闪烁体，闪烁体吸收了射线的能量而引起闪烁体中的原子或分子激发，当受激的原子或分子退激时，则发出光子进入光电倍增管光阴极，转换为光电子，光电子在光电倍增管电场作用下到达阳极，形成电脉冲。转换模式是放射能→光能→电能→脉冲。 液体闪烁测量是在闪烁杯内进行的，放射性样品主要被溶剂和闪烁剂分子包围，射线能量先被溶剂分子吸收，受激溶剂分子退激时释放出能量激发闪烁剂，当激发态回到基态时释放出光子到达光阴极，光阴极产生光电子，在光电倍增管的电场作用下，在阳极获得大量电子，形成脉冲信号，输入后读分析电路形成数据信号，最后由计算机数据处理，求出待测抗原含量。 放射性活度测定方法放射免疫分析中经抗原抗体反应和B、F分离后通过检测放射性量来反映待测物的含量。放射性量的检测需特殊的仪器，放射免疫分析仪实际上就是进行放射性量测定的仪器。测量仪器有两类，即晶体闪烁计数仪（主要用于检测γ射线，如125I、131I、57Cr等）和液体闪烁计数仪（主要用于检测β射线，如3H、32P、14C等）。无论是晶体闪烁计数仪还是液体闪烁计数仪都是将射线（放射能）与闪烁体的作用转换成光脉冲（光能），然后用光电倍增管将光脉冲转换成电脉冲（电能），电脉冲在单位时间内出现的次数（即仪器记