对啤酒酵母的蔗糖酶的相关测试与研究
兰德新（同组：李建鑫）
浙江工业大学海洋学院食工1201
摘要：
目的学习测试与研究蔗糖酶的相关技术，以20克新鲜啤酒酵母菌为原料进行一系列实验。方法蔗糖酶的提取及初步提纯，蔗糖酶的纯化——Q Sepharose-柱层析法，蔗糖酶活力的测定，Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量测定及比活力计算，微量凯氏定氮法测蔗糖酶中总蛋白氮，SDS-PAGE测定蔗糖酶中蛋白质的相对分子质量。结果通过这一阶段性的综合实验，学会了提取及初步提纯酶及胞内酶的提纯，酶活力的测定方法，蛋白质的测定方法和蛋白质相对分子质量的测定方法。为我们将来的实验奠定了技术上的基础。
关键词：蔗糖酶，Q Sepharose-柱层析法，酶活力，Folin-酚法，微量凯氏定氮法，SDS-PAGE
文献综述:
蔗糖酶能催化水解蔗糖生成果糖和葡萄糖，果糖的甜度较高，约为蔗糖的1.36~1.60倍，在工业上具有较高的经济价值，葡萄糖也是我们的主要碳源，并且在植物中蔗糖酶分解的果糖和葡萄糖能为植物的生长和发育提供碳源和能源。因此人们对蔗糖酶的研究越来越多，做了很多的实验来研究蔗糖酶的性质[2] , 其中在“蔗糖酶水解蔗糖的研究”这篇文章中，作者通过一系列对比实验，得出蔗糖酶的几个性质如下：蔗糖酶的活性达1.575×105u/ml；其表观Km（米氏常数）值约为0.015mol/1；初速度反应时间为0~10min；最适酶量为3.152×103~7.88×103 u/mmol；最适底物浓度为0.5mol/l；最适pH在NaAc-HAc体系中为4.4；最适反应温度为50℃。
而在植物体中，蔗糖酶也起到不可代替的作用。在“蔗糖酶在植物中的生理作用”这篇文章中，作者主要介绍了蔗糖酶在植物体中的5个作用，分别是：1.参与叶片的光合作用 2. 参与贮藏器官碳水化合物组成中的作用 3. 参与细胞对胁迫的响应 4. 参与植物的生长发育 5. 在信号传导中的作用目前，对蔗糖酶的研究已取得了很大的进展，不仅分离、纯化了各种蔗糖酶，建立了活性
测定方法，而且也测定了该酶的部分性质及其在植物体内的时空分布。通过基因工程手段调节植物光合产物和代谢产物的分配是当今研究的热点。植物中蔗糖酶的研究正向分子水平方向发展，无论是其分子结构和作用机理，还是基因表达和调控，都为应用基因工程调节光合产物及代谢组分奠定了基础。
对于蔗糖酶的研究，还有很多有待解决的问题：植物蔗糖酶同工酶的种类比较多，其在植物中的特定作用还不甚清楚；蔗糖酶与蔗糖含量有时并不相关，尽管一些转基因植株检测表明其蔗糖酶活性大大降低，但蔗糖水平却与对照差不多；应用基因工程技术抑制蔗糖酶的活力在一些转基因植株的发育过程中也不一致；是否还有其他的代谢产物或物质调控蔗糖酶的表达等。
因此关于蔗糖酶的研究还有待进一步深入，需要把生理、生化以及分子生物技术有机结合在一起，对于这些问题的最终解决将有助于更好地理解蔗糖酶在植物中的生理作用。
实验1. 蔗糖酶的提取及初步提纯
1.1材料与方法
1.1.1试剂
①新鲜的啤酒酵母（冰冻在冰箱内，由实验室从啤酒厂买来）；
②醋酸钠（AR）；
③甲苯（AR）；
④4mol/L醋酸；
⑤95%乙醇（<-20℃）；
⑥0.5mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。称取121.1g Tris溶于1500ml
的蒸馏水中，用4 mol/L HCl调节pH至7.3（HCl量约为230ml），用蒸馏水稀释到2L，即为0.5 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。
⑦0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液：将0.5mol/L Tris-HCl pH7.3
缓冲液稀释10倍即得。
注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。
1.1.2器材
①锥形瓶250ml（×1），50ml（×1）；
②量筒10ml（×1）25ml（×1）;
③烧杯100 ml（×1），1000 ml（×1）；
④具塞试管10 ml（×3）；
⑤吸球、玻棒、滴管、pH试纸；
⑥培养箱；
⑦恒温水浴箱；
⑧磁力搅拌器，搅拌子；
⑨高速冷冻离心机。
1.1.3操作方法
1．酵母的自溶
在250ml锥形瓶中加入冰冻的啤酒酵母20g、醋酸钠 1.6g，搅拌15~20min，使团块的鲜酵母液化，加1.5ml甲苯用大小合适的软木塞将瓶
口塞住，摇动10min使甲苯和酵母液充分混匀，放入37℃培养箱中保温
60h，使酵母自溶。
因本实验采用的是啤酒酵母，故酵母自溶时散发着浓烈的酒香。经自溶后，酵母液得到颜色加深。
2．初提取液A
在培养箱中取出装有已自溶酵母的锥形瓶，加10ml蒸馏水，摇匀，倒入塑料离心管中，平衡（分给同学酵母液少许少许）后用高速冷冻离心机
4℃、15000r/min离心10min。经离心一次后，离心管中的悬液分两层，
上层为黄褐色浆状液体，下层为固体，呈斜面状。取上层液体后再次离心，
再取上层液体记体积为VA=19.3ml。取3ml保存，用于后续实验，所提取
的液体为初提液A。
3．热提取液B
将初提液A倒入50ml锥形瓶中，加入3.2ml4mol/L的HAc，变为悬浊液，摇匀后入50℃水浴中20min。溶液的颜色变浅，呈乳白色。迅速放入冰块
中冷却，倒入离心管中，离心，取得上清液，为淡黄色澄清液体，得
VB=19.5ml。取3ml保存，用于后续实验。
4．乙醇沉淀提取液C
将热提取液B 倒入100ml小烧杯中，将烧杯放入冰浴中边搅拌边缓慢滴加（-20℃）95%的等体积冰乙醇，30min后继续搅拌5min，烧杯底部产生
白色固体，取液体，离心，保留离心管中的固体，用0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液溶解烧杯中的固体，与离心管中固体一起再次离心，得
Vc=5.6ml。
1.2结果与讨论
VA总=VA=19.3ml
VB总=VB·[VA/(VA-3)]=23.1ml
VC总=Vc·[VA/(VA-3)] ·[VB/(VB-3)]=Vc·[VB总/(VB-3)]=7.84ml。
酵母菌自溶的时间超过60h不可太多，否则可能使蛋白酶进一步自溶，酶量减少。
也可以用其他酵母品种。如酵母粉（超市有售），可使采购原料、实验操作更为简便。
50℃下，除了蔗糖酶，可能有其他酶未完全失活，仍留在上清液中。
用乙醇沉淀蔗糖酶时，添加过程中乙醇温度会回升，达不到要求的-20℃，或者可能有其他与蔗糖酶在乙醇中行为相似的酶，造成误差。
1.3结论
VA总=19.3ml
VB总=23.1ml
VC总=7.84ml。
2．实验2. 蔗糖酶的纯化——Q Sepharose-柱层析法
2.1材料与方法
2.1.1试剂
①0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液；
②1mol/LNaCl的 0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液；
③0.5mol/LNaOH；
④Q Sepharose，长期保存需置于20%乙醇中，4℃保存。
注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。
2.1.2器材
①层析柱；
②梯度混合器;
③磁力搅拌器，搅拌子；
④紫外分光光度计；
⑤点滴板；
⑥尿糖试纸、擦镜纸；
⑦止水夹；
⑧烧杯、试管。
2.1.3操作方法
1．离子交换柱的填充
将层析柱垂直固定，加水，排除气泡，再加少量水，装入离子交换剂，至柱高5cm，交换柱上端保留少许水（不得干柱）。
2．缓冲液盐度梯度发生器的安装
两个杯子的左边一个杯子内加25ml含NaCl的 0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液，右边25ml的Tris-HCl pH7.3缓冲液（不得装反），排除气泡（为了保证连通），在低浓度一段装入搅拌子。
3．柱的平衡
将柱子与恒流泵连通，用25ml Tris-HCl pH7.3缓冲液进行冲洗平衡完成后，交换剂上方需保留5ml左右的缓冲液。
4．加样
将缓冲液放至刚好与交换剂相切，取0.5mlC液，加入交换柱，再放至刚好与交换剂相切，夹紧夹子，上方需加5ml左右的缓冲液。
以每管3ml收集加样后液体。共收集9管液体（记为1~9号）。
5．洗脱
为防止液面低于交换剂表面，加入了5ml缓冲液。
①0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液25ml洗穿透峰。连通梯度发生
器，进行线性梯度洗脱，直到缓冲液全部用完，再用0.05 mol/L
Tris-HCl pH7.3缓冲液配置的1mol/lNaCl溶液25ml洗脱。期间总
共收集13管液体（记为10~22号）。
②离子交换柱的再生。
6．测OD值
在紫外分光计光度计上测出每管在280nm处的紫外吸光度OD值。
得到各管的OD值如下：
7.酶活力的测试
用葡萄糖测验试纸测试每管内蔗糖酶的活力大小，由以上OD值，取15，16两组。
酶活力测试方法：在点滴板中滴2滴5%蔗糖，再加2滴待测洗脱液，用玻璃棒搅匀，放置5min，浸入葡萄糖试纸，1s后取出，60s比较颜色深浅。
得到15管为3+，16管为2+，合并成一管，结果为VD=4.3ml
注:用+-表示酶活力+多活力大。
2.2结果与讨论
VD总=VD·VC总/V样 =4.3×7.84/0.5=67.42ml
由数据得表如下：
Q Sepharose-柱层析法提纯酶数据处理表
装柱时不得干柱。此次试验中由于不慎，可能存在干柱的嫌疑。不过及时又添加了 Tris-HCl pH7.3缓冲液，对本次试验的结果影响减到了较小的程度。
梯度发生器第一次失误的过程，结果相当于多做了洗穿透峰。
在以每管3ml分装液体时，不能很好地控制流量，每管不一定均为标准3ml。
2.3结论
VD总=67.42ml
3．实验3. 蔗糖酶活力的测定
3.1材料与方法
3.1.1试剂
①3,5-二硝基水杨酸
（1）甲液：溶解6.9g结晶酚于15.0ml10%氢氧化钠溶液中并用水稀释至69ml，在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。
（2）乙液：称取255g酒石酸钾钠加到330ml10%氢氧化钠溶液中，再加入880ml1%3,5-二硝基水杨酸溶液。
将甲乙二溶液混合即得黄色试剂，贮于棕色瓶中备用，在室温放置7~10天后使用。
②葡萄糖标准溶液（0.2mg/ml）准确称取20mg分析纯葡萄糖（预先
在105℃干燥至恒重），用少量蒸馏水溶解后，定量移入100ml的容量瓶中，定容。5%蔗糖、；
③0.2mol/L pH4.6醋酸缓冲液溶解10.83g醋酸钠于水中，加近260ml
的1 mol/L醋酸调pH到4.6，稀释至2L；
④ 5%蔗糖用0.2mol/L pH4.6醋酸缓冲液配置；
⑤ 2mol/L NaOH 溶解0.80g氢氧化钠于10ml水中。
3.1.2器材
①电炉；
②恒温水浴;
③紫外分光光度计；
④试管、吸管；
3.1.3操作方法
1．葡萄糖标准曲线的制作
取6支试管，分别按表3-1加入各种试剂。将各管内液体混合均匀，在沸水浴加热5min。取出后立即用冷水冷却到室温，于540nm波长处测OD 值，以葡萄糖的毫克数为横坐标，OD值为纵坐标，画出标准曲线。
表3-1 葡萄糖标准曲线的制作
试管号0 1 2 3 4 5
葡萄糖0 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6
蒸馏水 3.0 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 DNS 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5
总体积 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 4.5 OD 0.000 0.217 0.385 0.554 0.736 0.889 2．酶活力测定
①将前个实验所得四部分提取液用冷蒸馏水按比例稀释：初提取液A（1：
200）；热提取液B(1:200)；乙醇提取液C（1：200）；柱分离液D（1：20）。
②取8支试管，按表3-2加入各种试剂。
测定540nm处OD值。
得到ODA=0.318 ODB=0.170 ODC=0.607 ODD=0.246
3.2结果与讨论
绘制葡萄糖标准曲线得：
图3-1 葡萄糖标准曲线图
总活力单位数=mg/V测·4.5/2·V总·n
酶的回收率=（各提取液的总酶活/初提取液A的总酶活）·100%
将数据整理如表所示
表3-3 蔗糖酶活力测定结果表
葡萄糖标准曲线的绘制是关键。由图像分析得，绘出的标准曲线上的点总体呈明显的线性关系，且R2=0.9995，较为准确，同时可以看到，第二个数据偏小，第三个数据偏小，第五个数据偏小。
计算所得的酶的回收率数据中，按A,B,C,D逐渐降低，说明每一步的提纯都有损失，且C到D这一步中损失较多。
3.3结论
得到葡萄糖标准曲线。
通过DNS法，测定了初提液A、热提取液B、乙醇沉淀提取液C、柱分离液D中的总活力单位数，也计算了各个提取液的酶的回收率。
4．实验4. 蔗糖酶蛋白质含量测定及比活力计算
4.1材料与方法
4.1.1试剂
①试剂A（碱性铜试剂）取Na2CO3（AR）10g和 NaOH（AR）2g，加
蒸馏水30ml，微热溶解：另取酒石酸钠（Na2C2H3O3?2H2O，AR）0.1g和CuSO4?5H2O（AR）0.05g，再加入30ml蒸馏水微热溶解，冷却后将上述两溶液混合，再用水稀释至100ml，即为试剂A。该试剂为含10% Na2CO3，0.1%酒石酸钠和0.05%硫酸铜的0.5mol/L NaOH溶液。保存于塑料试剂瓶中，24℃至少可使用1个月。溶解于500毫升蒸馏水中。；
②试剂B（酚试剂）在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠
（Na2WO4?2H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO4?2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1mol/L左右。
③标准浓度牛血清白蛋白溶液（200μg/ml）精确称取结晶牛血清蛋
白或酪蛋白，必要时预先经微量凯氏定氮法测蛋白质含量，根据其纯度精确称重配成。牛血清白蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%NaCl溶液。；
4.1.2器材
①分光光度计（使用直径为10nm的比色皿）；
②刻度吸管0.5ml（×1），2ml（×1），5ml（×1）;
③试管1.5 cm×15cm（×8）；
④具塞试管10 ml（×3）；
⑥恒温水浴箱（55℃）；
4.1.3操作方法
1．标准曲线的制作
取6支试管，编号0~5分别按表4-1加入各种试剂。将各管内液体混合均匀，在55℃水浴加热5min。取出后立即用冷水冷却到室温，
于660nm波长处测OD值，空白0号位对照。以牛血清白蛋白微克数为横坐标，OD660值为纵坐标，画出标准曲线。
表4-1 标准曲线的配置加样表
管号0 1 2 3 4 5 BSA 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 水 4.5 4.3 4.1 3.9 3.7 3.5 试剂A 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
静置10min（立即充分混匀）
试剂B 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3
静置10min（立即充分混匀）
试剂B 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
混匀55℃水域5min,测A660
OD600 0.000 0.185 0.334 0.454 0.575 0.659 2.未知蛋白浓度的测定
按A（1：100）、B（1：100）、C（1：20）、D（不稀释）进行稀释，A 稀释液去0.4ml，B、C、D稀释液各取5ml测定OD660(所得数据如上表所示)。
【注意】Folin-酚B试剂在酸性条件下稳定，而Folin-酚A试剂在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶液。当Folin-酚B试剂加入后，应迅速摇匀（加一管，摇一管），使还原反应产生在试剂被破坏之前。
4.2结果与讨论
图4-1 蛋白质标准曲线图
总蛋白=（mg/0.5）·n·V总单位：mg
比活力=总活力单位/总蛋白单位：mg
由所得标准曲线可得牛血清蛋白微克数与其对应的OD660呈明显的线关系，其公式为y=0.0031x+0.0715，R2=0.9977，结果较为准确，第一组与第五组数据略偏小。
由计算所得数据分析可得，A,B,C,D的比活力依次增加，蛋白回收率及酶的回收率依次减小，纯化倍数依次增加，其中A到B纯化并不明显，B到C有明显的纯化，C到D具有一定的纯化。可见前几个实验的提取有一定效果，所得出的实验结果证明本次实验还是成功的。
4.3结论
参见实验数据处理结果汇总表。
5．实验5. 微量凯氏定氮法测蔗糖酶中总蛋白氮
5.1材料与方法
5.1.1试剂
①蛋白样品：2g牛血清白蛋白溶于0.9%NaCl溶液并稀释至100ml；
②浓硫酸；
③硫酸钾3份与硫酸铜1份（质量分数）混合研磨成粉末；
④30%NaOH溶液:30g氢氧化钠溶于蒸馏水，稀释至100ml；
⑤2%硼酸溶液：2 g溶于蒸馏水，稀释至100ml；
⑥混合指示剂：0．1％甲基红酒精溶液和 0．1％甲基蓝酒精溶液临时
按2:1的比例混合。或0．1％甲基红酒精溶液和 0．1％溴甲酚绿
酒精溶液临时按1:5的比例混合
⑦0.01mol/L HCl标准溶液
5.1.2器材
①改良式凯氏定氮仪；
②克氏烧瓶50ml（×2）;
③移液管；
④锥形瓶50ml（×3）；
⑤吸球、玻棒、滴管、量筒；
5.1.3操作方法
1．消化
凯氏瓶内加入A 0.1ml、B 0.2ml、C 0.25ml和2ml硫酸，半匙催化剂，消化至淡绿色，定容至50ml。
2.洗涤定氮仪
装配好凯式定氮仪，反应室中加少许水（10ml左右）蒸汽发生室内充入适量额水，加热，冷凝管口用指示剂检测，若指示剂变棕色，须将反应室内的水吸去，重新加入水，至指示剂不变色（颜色保持紫红色不变），则洗涤干净。
实际操作时，观察到随着锥形瓶内水量增多，指示剂变棕红色。
第三次洗涤后，指示剂不变色。
3．蒸馏
反应室加入5ml消化液，用少许水洗涤小漏斗，冷凝管插入指示剂，用量筒加10ml30%NaOH至反应室，保留少许NaOH在小漏斗中，再加3ml水，缓缓放入反应室，并保留少量水作液封。开始蒸馏至指示剂变绿，再蒸馏3min，使冷凝管离开指示剂。再蒸1min，少量水冲洗管口。重复3次，每次都必须将凯式定氮仪洗涤干净。
实际操作时，在加反应液后，反应室内液体变成棕黑色，液体反应剧烈。
指示剂有红色变成棕色，最后变成绿色。
4．滴定
用0.01N HCl将锥形瓶中的指示剂滴定至淡紫色，记录消耗HCl的量。
5.2结果与讨论
次数 1 2
HCl消耗量0.40ml 0.45ml
HCl浓度：0.01mol/L
样品含氮量=(A-B)×N×14.008×V
2/（V
1
×V
3
）=5.95mg/ml
样品含蛋白质量=5.95×6.25=37.2mg/ml
蛋白质是一类复杂的含氮化合物，每种蛋白质都有其恒定的含氮量（约在14%-18%，平均约含氮16%），所以，可用蛋白氮的量乘以6.25，就是样品的粗蛋白含量。
与分析福林酚法比较，得总蛋白含量大大偏高，原因可能是提取液的纯度有限，细胞中含氮物质的干扰，未做对照组，仪器中有残留。
在加入NaOH后，反应室内液体变成棕黑色。是因为CuSO4和过量的NaOH 生成铜酸钠，此时会产生氨气。
试样中若含有硝态氮时，首先要使硝态氮还原为铵态氮，可加入水杨酸和硫代硫酸钠，使硝态氮与水杨酸在室温下作用生成硝基水杨酸，再用硫代硫酸钠（Na2S2O3）或Zn粉使硝基水杨酸转化为铵盐。由于水杨酸与硫代硫
酸钠会消耗一部分硫酸，所以消化时的硫酸用量要酌情增加。
不用C,D提取液是因为其中氮含量较小，难以测出。
5.3结论
样品含氮量=5.95mg/ml
样品含蛋白质量=37.2mg/ml
6．实验6. SDS—PAGE测定蛋白质的相对分子质量
6.1材料与方法
6.1.1试剂
①30%丙烯酰胺贮液: 称丙烯酰胺（AR）29.2g、甲叉双丙烯酰胺0.8g，
先用80ml双蒸馏水溶解，搅拌，直到溶液变成透明，再用双蒸馏水稀释至100ml，过滤。用棕色瓶中，4℃保存一个月。
②10%的TEMED；
③10%过硫酸铵（AP）：现用现配。；
④分离胶缓冲液贮液（1.5mol/L Tris-HCl，pH8.8）：取Tris 9.08g
溶解在40ml双蒸水中，用 4mol/L盐酸调节至pH8.8，用双蒸水定容至50mL，4℃保存；
⑤浓缩胶缓冲液贮液（1.5mol/L Tris-HCl，pH6.8）：取Tris 6.06g
溶解在40ml双蒸水中，用 4mol/L盐酸调节至pH6.8，用双蒸水定容至50mL，4℃保存；
⑥2×SDS-样品缓冲液：1ml浓缩胶缓冲液贮液（1mol/L Tris-HCl，pH6.8）
+4ml10%SDS+1ml巯基乙醇+2mL甘油0.5ml0.1%(质量浓度)溴酚蓝，加双蒸水定容至10mL，4℃保存。
⑦SDS-电极缓冲液贮存液（0.025mol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，
0.1%SDS，pH8.3）: 取Tris 15.1g和94g甘氨酸溶解在900ml双蒸水中，
加入50ml 10%(质量分数)SDS贮存液，加双蒸水定容至1000mL则成5×SDS-电极缓冲液。
⑧10%SDS：25gSDS用双蒸水定容至250mL，室温保存。
⑨染色液：0.25g考马斯亮蓝G-250，加入90mL 50%甲醇溶液和10mL
冰乙酸，用滤纸过滤。
⑩脱色液：50mL甲醇溶液和75mL冰乙酸，加蒸馏水至1000ml。
?蛋白质样品液
?标准蛋白质：包括兔磷酸化酶B，相对分子质量97400；牛血清白蛋白，相对分子质量66200；兔肌动蛋白，相对分子质量43000；牛碳
酸酐酶，相对分子质量31000；胰蛋白酶拟制剂，相对分子质量20100；
鸡蛋清溶菌酶，相对分子质量14400
6.1.2器材
①垂直板型电泳槽；
②玻璃板;
③大培养皿；
④烧杯；吸量管；滴管
6.1.3操作方法
1．分离酸制备
洗干净玻璃板，装配制胶工具，按表比例配制分离胶，混匀后迅速倒入玻璃板中，离度为齿孔下缘1cm左右，小心加满水，待聚合好后，倾去水，用滤纸片吸干胶面。
2.浓缩胶制备
按表配置浓缩胶，迅速混匀，倒在分离胶上层，插上梳子，待聚合好后，拔出梳子，用滤纸片去除齿孔中的气泡。
3.加样
取100μL样品与100μL样品缓冲液混合，沸水浴3-5min，取20μL 各样品加入齿孔中，加一孔Marker，将电极缓冲液倒入电泳槽。
4.电泳
调节电流，电泳至溴酚蓝距酸前沿1.5cm左右，停止电泳。
5.染色和脱色
小心取出凝胶，置于平皿中，加染色液中过夜，用脱色液脱色，换两次脱色液，至背景透明。
6．计算样品相对分子质量。
表6-1 胶体配料表单位:ml
成分分离胶浓缩胶
H2O 3.3 2.7
3%母液 4.0 0.67
分离胶缓冲液 2.5 —
浓缩胶缓冲液—0.5
10%SDS 0.1 40μl
10%TEMED 60μl 40μl
10%AP 0.1 40μl
6.2结果与讨论
由实验可得染料液的迁移距离为2.5cm
表6-2 标准蛋白溶液的迁移距离及相对迁移距离表
编号 1 2 3 4 5 迁移距离/cm 0.8 1.3 1.8 2.3 2.8
相对迁移距离0.32 0.52 0.72 0.92 1.12
图6-1 蛋白质分子质量对数标准曲线图
根据样品蛋白分子相对迁移距离，从坐标曲线得出相对分子质量分别为1.5cm 56175，2.3cm 31000。
6.2.2分析
对数据结合图像分析
第3个数据偏小，第4个数据偏大，可能原因是读书不准确，或者电泳的时间把握不准确。得到的标准曲线方程为y=0.8501x+5.2596 R2=0.9985 样品中得到2条线，由标准曲线方程可得其分子质量分别为56175和31000，可能含有两种蛋白质，这两种蛋白质都具有蔗糖酶的性质。
引起本次实验数据不准的原因①：SDS量不足，或者制胶过程中倒出水时未倒尽，形成的胶质量不高；②：染色后脱色不完全影响观察。
6.3结论
本实验采用SDS-PAGE电泳法测得了样品蛋白分子的相对分子质量，分别为56175和31000
参考文献：
【1】孙培龙，吴石金. 生物化学技术实验指导. 版次：1-1化学工业出版社.
2008-8-5
【2】陈冰，林轩，梁诗莹等蔗糖酶水解蔗糖的研究湛江师院化学系 1997-12 【3】武忠亮兴义民族师范学院蔗糖酶在植物中的生理作用 2010-12
探究影响酶活性的因素 一、探究温度对酶活性的影响 （一）实验原理（注：市售a-淀粉酶的最适温度约600C）： 1．淀粉遇碘后，形成紫蓝色的复合物。 2．淀粉酶可以使淀粉逐步水解成麦芽糖和葡萄糖，麦芽糖和葡萄糖遇碘后不显色。 （二）方法步骤： 1、取3支试管，编上号（A、B、C），然后分别注入2mL可溶性淀粉溶液。 2、另取3支试管，编上号（a、b、c），然后分别注入1mL新鲜淀粉酶溶液。 3、将装有淀粉溶液和酶溶液的试管分成3组，A和a试管放入热水（约600C）、B和b放 入沸水，C和c放入冰块中，维持各自的温度5min。 思考题1、不能只用不同温度处理淀粉溶液或酶溶液，这是为什么？ 4、分别将淀粉酶溶液注入相同温度下的淀粉溶液中，摇匀后，维持各自的温度5min。 5、在3支试管中各滴入1-2滴碘液，摇匀后观察这3支试管中溶液颜色变化并记录。 思考题2、在试管A、B、C中分别能观察到什么现象？ 思考题3、通过上述实验，你能得出什么结论？ 思考题4、在上述实验中，自变量是什么？无关变量是什么？ 思考题5、探究温度对酶活性的影响实验中是否可以用斐林试剂来检验实验结果？ 为什么？ 二、探究PH值对酶活性的影响 （一）实验原理：思考题6、请依据下面所列实验操作步骤，写出该实验的实验原理。
（二）操作步骤：用表格显示实验步骤：（注意操作顺序不能错） 思考题7、请在上表中填入你所观察到的实验现象。 思考题8、通过上述实验，你能得出什么结论？ 思考题9、在上述实验中，自变量是什么？无关变量是什么？ 思考题10、在设计“影响酶活性的条件”实验中最关键的一步是什么？ 附加实验：思考题11、能否用淀粉酶探究PH对酶活性的影响？ 课堂练习： 1.（多选）在证明酶的催化作用受温度影响的实验时，有学生取两支试管分别将淀粉溶液与唾
参考教案：酵母蔗糖酶的提取纯化与鉴定 蔗糖酶（E.C.3.2.1.26）（ —D—呋喃果糖苷果糖水解酶），能催化非还原性双糖（蔗糖）的1，2-糖苷键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。 由于果糖甜度高 ,约为蔗糖1.36～1.60倍 ,在工业上具有较高的经济价值。可用以转化蔗糖,增加甜味,制造人造蜂蜜,防止高浓度糖浆中的蔗糖析出,制造含果糖和巧克力的 软心糖,还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。 蔗糖酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶,其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。 每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解速率可以通过NeLson法测定还原糖的产生数量来测定。一个酶活力单位规定为在标准分析条件下每分钟催化底物转化的数量。比活力单位为每毫克蛋白含有酶活力单位。 （本实验以酵母为原料） 一、教学目的 通过酵母菌扩大培养及蔗糖酶的提取纯化与鉴定使学生学会生物大分子（酶）制备方案设计和开展实践研究的方法，体验从复杂细胞混合物体系中提取纯化酶的基本原理、 过程和方法。 本实验为学生提供一个较全面的科学研究实践机会，整个实验过程学生独立完成，虽然操作难度较大，所需要的实间较长（64学时），但每一步单元操作的原理清晰，技术成熟，实验结果明显，能给学生较多的设计空间和动手机会，有利于培养学生的学习兴趣和从事科学研究的能力。 二、教学内容
华中农业大学本科生课程考试试卷 考试课程与试卷类型：植物生理学实验原理与技术（A）姓名： 学年学期：2008－2009－1 学号： 考试时间：2009－－班级： 一、名词解释 ( 每题 4 分 , 共 12分 ) 1. 聚丙烯酰胺凝胶 2. 离心技术 3．可见光分光光度法/反相纸层析 二、填空题 ( 每空 2 分 , 共 42分 ) 1. 反相纸层析法分离油菜不饱和脂肪酸的实验中 ,分离后的不饱和脂肪酸经红氨酸溶液显色后 , 其最终产物颜色是（1）,从点样端起层析谱带所对应的脂肪酸依次是 (2) 、（3）、（4）、（5）、（6）。 2. 圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物酶同工酶的实验中 , 电泳时上槽接电源（7）极 ,下槽接电源 (8) 极 , 电泳开始电流应调节至每管（9）mA, 十分钟后电流调节至每管 (10) mA; 在上槽或样品中加入溴酚蓝是起（11）的作用。 3. 核酸提取过程中 , 将含有 DNA 的溶液置72℃处理 3 分钟，其目的是（12）；在淀粉酶活性测定过程中将淀粉酶液置于 70℃下处理 15 分钟的目的是（13）。 4．在微量凯氏定氮法测定植物组织中的总氮和蛋白氮，有三个主要的实验阶段，它们分别是（14）、（15）和（16）。在第二阶段，若收集三角瓶中的溶液颜色由_（17）变为（18），表明反应完全。第三阶段所用的标准浓度的滴定溶液名称是（19）。 5. DNA 提取研磨时加入的研磨缓冲液的NaCl浓度是（20），研磨时加入SDS的作用是（21）
三、是非判断题 (判断对错，对的标T，错的标F，每题 2 分，共 10 分 ) 1．萌发的小麦种子中含有很高活性的淀粉酶，其中α－淀粉酶不耐热，在70℃迅速钝化。（） 2．本学期测定还原性糖和可溶性蛋白含量时都用到了斐林试剂，这两个实验中所用的斐林试剂的配方是相同的。（） 3．DNA提取中，加入冷乙醇是为了使DNA分子复性变粗。（） 4．离心机使用中，要求同一台离心机所用的离心管都有相同的重量。（）5．油菜种子硫甙葡萄糖苷的快速分析法中，反应的实质是测定水解硫苷产生的葡萄糖的数量。（） 四、问答题（共36分） 1．试述维生素C测定的基本原理及其实验过程中的注意事项（12分） 2．简述凯氏定氮法测定蛋白质含量的基本原理。为什么一些不法商人要在蛋白质制品中加入三聚氰胺？（12分） 3．凝胶电泳法测定同工酶的原理是什么？为什么本学期所作的胶条染色后显示的谱带就是过氧化物同工酶带？（12分）
生物化学实验的答案 Document number【980KGB-6898YT-769T8CB-246UT-18GG08】
生物化学实验的答案 一、理论考试部分 1.醋酸纤维薄膜电泳时，点样的一端应靠近电极的哪一端为什么 2. 答：负极。因为血清中各种蛋白质在PH为8.6的环境中均带负电，根据同性相吸，异性相斥原理，点样端在负极时蛋白质向正极泳动从而实现蛋白质分离。 3.用分光光度计测定物质含量时，设置空白对照管的意义是什么？ 答：空白对照是为了排除溶剂对吸光度的影响。溶液的吸光度表示物质对光的吸收程度，但是作为溶剂也能吸收，反射和透射一部分的光，因此必须以相同的溶剂设置对照，排除溶剂对吸光度的影响。 4.简述血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳的原理？ 答：血清蛋白中各种蛋白质离子在电场力的作用下向着与自身电荷相反的方向涌动，而各种蛋白质等电点不同，且在PH为8.6时所带电荷不同，分子大小不等，形状各有差异，所以在同一电泳下永动速度不同从而实现分离。 5.何谓R f值？影响R f值的主要因素是什么？ 答：Rf是原点到层析中心的距离与原点到溶剂前沿的距离之比。Rf的大小与物质的结构，性质，溶剂系统，层析滤纸的质量和层析温度有关， 6.什么是盐析盐析会引起蛋白质变性吗一般我们用什么试剂做盐析的实验 答：盐析是指当溶液中的中性盐持续增加时，蛋白质的溶解度下降，当中性盐的浓度达到一定程度的时候，蛋白质从溶液中析出的现象。盐析不会引起蛋白质的变性。一般用饱和硫酸铵溶液进行盐析。 7.简述DNS法测定还原糖浓度的实验原理？ 答：还原糖与DNS在碱性条件下加热被氧化成糖酸，而DNS被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内还原糖的量与3-氨基-5硝基水杨酸颜色的深浅成正比，用分光光度计测出溶液的吸光度，通过查对标准曲线可计算出3-氨基-5硝基水杨酸的浓度，从而得出还原糖的浓度。 8.依据我们所做的实验，说明影响蛋白质沉淀的因素是什么影响蛋白质变性的因素是什 么沉淀和变性有何联系 答：水溶液中的蛋白质分子由于表面形成水化层和双电层从而形成稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下蛋白质颗粒因失去电荷和脱水而沉淀。这些因素包括溶液的酸碱度、盐溶液的浓度、温度、重金属离子以及有机溶剂等。变性蛋白质不一定沉淀，沉淀的蛋白质不一定变性。 8. 什么是碘值脂肪的不饱和程度越大，碘值越大吗在测定碘值的实验中，氯仿的作用是什么 答：每100g脂肪所吸收的碘的克数，即脂肪的碘值。脂肪的不饱和度越大，碘值就越大。氯仿作为溶剂，去溶解脂肪。
酵母蔗糖酶的提取及性质测定 引论及原理 酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究中有重要意义。本实验属综合性实验，接近研究性实验，包括八个连续的实验内容，通过对蔗糖酶的提纯和性质测定，了解酶的基本研究过程；同时掌握各种生化技术的实验原理、基本操作方法。本实验技术多样化，并且多个知识点互相联系，实验内容逐步加深，构成了一个综合性整体，为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。 蔗糖酶（invertase ）（β—D —呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase ）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解1mol 蔗糖，就生成2mol 还原糖。还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson 比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。 在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。 一、蔗糖酶的提取与部分纯化 （一）实验目的 学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。 （二）实验原理（略） （三）实验仪器、材料及试剂 仪器 1. 高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱 2. 电子天平、研钵（＞200ml ）、制冰机、50ml 烧杯 3. 离心管（2ml ，10ml ，30ml 或50ml ）、移液器（1000ul ）或滴管、量筒 材料及试剂 1. 市售鲜啤酒酵母（低温保存） ＋ H 2O 蔗糖酶 O H H O
生物化学实验理论考试题答案 1.醋酸纤维薄膜电泳时点样端应靠近电极的哪一端，为什么？ 答；电泳时点样端应靠近负极，因为血清中各种蛋白质在PH为8.6的环境中均带负电，根据同性相吸，异性相斥原理，点样端在负极时蛋白质向正极泳动从而实现蛋白质分离。 2.用分光光度计测定物质含量时，设置空白对照管的作用,为什么？ 答；空白对照是为了排除溶剂对吸光度的影响。溶液的吸光度表示物质对光的吸收程度，但是作为溶剂也能吸收，反射和透射一部分的光，因此必须以相同的溶剂设置对照，排除溶剂对吸光度的影响。 3.简述血清蛋白的醋酸纤维薄膜的电泳原理？ 答；血清蛋白中各种蛋白质离子在电场力的作用下向着与自身电荷相反的方向涌动，而各种蛋白质等电点不同，且在PH为8.6时所带电荷不同，分子大小不等，形状各有差异，所以在同一电泳下永动速度不同从而实现分离。 4.何谓Rf值？影响Rf值的因素？ 答;Rf是原点到层析中心的距离与原点到溶剂前沿的距离之比。Rf的大小与物质的结构，性质，溶剂系统，层析滤纸的质量和层析温度有关，对同一种物质来讲Rf是一个常量。 5.什么是盐析？盐析会引起蛋白质的变性吗？一般用什么试剂? 答;盐析是指当溶液中的中性盐持续增加时，蛋白质的溶解度下降，当中性盐的浓度达到一定程度的时候，蛋白质从溶液中析出的现象。盐析不会引起蛋白质的变性，因为蛋白质的结构并未发生改变，去掉引起盐析的因素蛋白质仍能溶解；一般用饱和硫酸铵溶液进行盐析 6.简述DNS法测定还原糖浓度的实验原理？ 答;还原糖与DNS在碱性条件下加热被氧化成糖酸，而DNS被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内还原糖的量与3-氨基-5硝基水杨酸颜色的深浅成正比，用分光光度计测出溶液的吸光度，通过查对标准曲线可计算出3-氨基-5硝基水杨酸的浓度，从而得出还原糖的浓度。 7.影响蛋白质沉淀的因素是什么？沉淀和变性有什么联系？ 答;水溶液中的蛋白质分子由于表面形成水化层和双电层从而形成稳定的亲水胶
实验一胆固醇的提取2012-11-15 16:20:00 生物师范班题目 1.比色法测定样品的理论基础是什么？ 被测样品必须要有颜色。 2. 胆固醇含量在多少范围时，与值呈良好的线性关系？ 在400mg/ml范围内。 3.在提取胆固醇的过程中，为什么要加无水乙醇？ 促使蛋白质沉淀。 4.在试管中加入1ml磷硫铁试剂，会产生什么现象？（至少写2点） 产生紫红色化合物。产生热量。 5.在无水乙醇中加磷硫铁试剂时，正确的加法是什么？将产生什么现象？请准确描述 该现象。 沿管壁慢慢加入。溶液分层。上层是无水乙醇，下层是磷硫铁试剂。 1. 胆固醇提取过程中，无水乙醇为什么要分两次加入？ 目的是使蛋白质以分散很细的沉淀颗粒析出。 2.我们用比色法测定胆固醇含量的仪器名称是什么？ 分光光度计 3. P-S-Fe试剂配置时，能用稀硫酸吗？为什么？ 不能。因为FeCl3本身是亲水性物质，稀硫酸中含有水，会降低P-S-Fe试剂的浓度，从而导致反应不能发生。 4.请简述移液枪的使用步骤。 根据所要吸取的溶液的体积选定合适量程的移液枪。 调好量程。 插枪头。 吸取液体。 将移液枪的量程调至最大。 5. 请简述0.08mg/ml胆固醇标准溶液的配置方法。 准确称取胆固醇80mg，溶于无水乙醇，定容至100ml 将贮液用无水乙醇准确稀释10倍既得。
实验二总糖和还原糖测定2012-11-15 16:20:00 生物师范班 1. 请写出还愿糖与非还原糖结构的不同之处 拥有自由的醛基和酮基 2. 对没有还原性的糖，用什么方法进行糖含量的测定？ 酸水解的方法将非还原性的糖降解呈还原糖。 3. DNS之所以能和还原糖反应，是因为其结构中含有__________? 硝基 4. 如果将DNS和其与还原糖反应的产物同时进行比色，谁的A值更大？为什么？ 产物的更大，因为产物生成棕红色，颜色越深，吸光度越高。 5. 还原糖提取过程中，为什么要离心两次？ 因为这样可以更好地将还原糖全部提取出来。第二次洗涤沉淀。 海洋技术班 1.单糖都是还原糖吗？为什么？ 是的，因为有自由醛基和酮基 2.为什么能用比色法测定还原糖的量？ 因为还原糖的量与光吸收值呈线性关系。 3.DNS的全称是？ 3,5-二硝基水杨酸 4.总糖提取过程中，碘液的作用是什么？ 确认淀粉水解完全。 5.请简述标准曲线的作用。 通过标准曲线来算出未知样品的浓度。
生物化学实验习题及解答 一、名词解释 1、pI； 2、层析； 3、透析； 4、SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳； 5、蛋白质变性； 6、复性； 7、Tm 值； 8、同工酶； 9、Km值； 10、DNA变性；11、退火；12、增色效应 二、基础理论单项选择题 1、用下列方法测定蛋白质含量，哪一种方法需要完整的肽键（） A、双缩脲反应 B、凯氏定氮 C、紫外吸收 D、羧肽酶法 2、下列哪组反应是错误的（） A、葡萄糖——Molish反应 B、胆固醇——Libermann-Burchard反应 C、色氨酸——坂口（Sakaguchi）反应 D、氨基酸——茚三酮反应 3、Sanger试剂是（） A、苯异硫氰酸 B、2，4-二硝基氟苯 C、丹磺酰氯 D、?-巯基乙醇 4、肽键在下列哪个波长具有最大光吸收（） A、215nm B、260nm C、280nm D、340nm 5、下列蛋白质组分中，哪一种在280nm具有最大的光吸收（） A、色氨酸的吲哚基 B、酪氨酸的酚环 C、苯丙氨酸的苯环 D、半胱氨酸的硫原子 6、SDS凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量是根据各种蛋白质（） A、在一定pH值条件下所带的净电荷的不同 B、分子大小不同 C、分子极性不同 D、溶解度不同 7、蛋白质用硫酸铵沉淀后，可选用透析法除去硫酸铵。硫酸铵是否从透析袋中除净，你选用下列哪一种试剂检查（） A、茚三酮试剂 B、奈氏试剂 C、双缩脲试剂 D、Folin-酚试剂 8、蛋白质变性是由于（） A、一级结构改变 B、亚基解聚 C、空间构象破坏 D、辅基脱落 9、用生牛奶或生蛋清解救重金属盐中毒是依据蛋白质具有（） A、胶体性 B、粘性 C、变性作用? D、沉淀作用? 10、有关变性的错误描述为（） A、蛋白质变性后，其一级结构和空间结构改变 B、蛋白质变性后，其理化性质和生物学活性改 变C、加热、紫外线照射、超声波等可以引起蛋白质变性D、变性蛋白质粘度增加，易被酶水解，易沉淀 11、双链DNA热变性后（） A、黏度下降 B、沉降系数下降 C、浮力密度下降 D、紫外吸收下降 12、酶的活化和去活化循环中，酶的磷酸化和去磷酸化位点通常在酶的哪一种氨基酸残基上（）
生物化学实验习题及参 考答案 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】
生物化学实验习题及解答 一、名词解释 1、pI； 2、层析； 3、透析； 4、SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳； 5、蛋白质变性； 6、复性； 7、Tm 值； 8、同工酶； 9、Km值； 10、DNA变性；11、退火；12、增色效应 二、基础理论单项选择题 1、用下列方法测定蛋白质含量，哪一种方法需要完整的肽键（ ） A、双缩脲反应 B、凯氏定氮 C、紫外吸收 D、羧肽酶法 2、下列哪组反应是错误的（） A、葡萄糖——Molish反应 B、胆固醇——Libermann-Burchard反应 C、色氨酸——坂口（Sakaguchi）反应 D、氨基酸——茚三酮反应 3、Sanger试剂是（） A、苯异硫氰酸 B、2，4-二硝基氟苯 C、丹磺酰氯 D、-巯基乙醇 4、肽键在下列哪个波长具有最大光吸收（） A、215nm B、260nm C、280nm D、340nm 5、下列蛋白质组分中，哪一种在280nm具有最大的光吸收（） A、色氨酸的吲哚基 B、酪氨酸的酚环 C、苯丙氨酸的苯环 D、半胱氨酸的硫原子 6、SDS凝胶电泳测定蛋白质的相对分子量是根据各种蛋白质（） A、在一定pH值条件下所带的净电荷的不同 B、分子大小不同 C、分子极性不同 D、溶解度不同 7、蛋白质用硫酸铵沉淀后，可选用透析法除去硫酸铵。硫酸铵是否从透析袋中除净，你选用下列哪一种试剂检查（） A、茚三酮试剂 B、奈氏试剂 C、双缩脲试剂 D、Folin-酚试剂 8、蛋白质变性是由于（） A、一级结构改变 B、亚基解聚 C、空间构象破坏 D、辅基脱落 9、用生牛奶或生蛋清解救重金属盐中毒是依据蛋白质具有（） A、胶体性 B、粘性 C、变性作用 D、沉淀作用 10、有关变性的错误描述为（）
生物化学实验的答案 一、理论考试部分 1.醋酸纤维薄膜电泳时，点样的一端应靠近电极的哪一端？为什么？ 答：负极。因为血清中各种蛋白质在PH 为的环境中均带负电，根据同性相吸，异性相斥原理，点样端在负极时蛋白质向正极泳动从而实现蛋白质分离。 2.用分光光度计测定物质含量时，设置空白对照管的意义是什么？ 答：空白对照是为了排除溶剂对吸光度的影响。溶液的吸光度表示物质对光的吸收程度，但是作为溶剂也能吸收，反射和透射一部分的光，因此必须以相同的溶剂设置对照，排除溶剂对吸光度的影响。 3.简述血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳的原理？ 答：血清蛋白中各种蛋白质离子在电场力的作用下向着与自身电荷相反的方向涌动，而各种蛋白质等电点不同，且在PH为时所带电荷不同，分子大小不等，形状各有差异，所以在同一电泳下永动速度不同从而实现分离。 4.xxR f 值？影响R f 值的主要因素是什么？ 答：Rf是原点到层析中心的距离与原点到溶剂前沿的距离之比。Rf的大小与物质的结构，性质，溶剂系统，层析滤纸的质量和层析温度有关， 5.什么是盐析？盐析会引起蛋白质变性吗？一般我们用什么试剂做盐析的实验？ 答：盐析是指当溶液中的中性盐持续增加时，蛋白质的溶解度下降，当中性盐的浓度达到一定程度的时候，蛋白质从溶液中析出的现象。盐析不会引起蛋白质的变性。一般用饱和硫酸铵溶液进行盐析。 6?简述DNS法测定还原糖浓度的实验原理？ 答：还原糖与DNS在碱性条件下加热被氧化成糖酸，而DNS被还原为棕红色的
3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内还原糖的量与3-氨基-5 硝基水杨酸颜色的深浅成正比，用分光光度计测出溶液的吸光度，通过查对标准曲线可计算出3-氨基-5 硝基水杨酸的浓度，从而得出还原糖的浓度。 7.依据我们所做的实验，说明影响蛋白质沉淀的因素是什么？影响蛋白质变 性的因素是什么？沉 xx 变性有何联系？ 答：水溶液中的蛋白质分子由于表面形成水化层和双电层从而形成稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下蛋白质颗粒因失去电荷和脱水而沉淀。这些因素包括溶液的酸碱度、盐溶液的浓度、温度、重金属离子以及有机溶剂等。变性蛋白质不一定沉淀，沉淀的蛋白质不一定变性。 8.什么是碘值？脂肪的不饱和程度越大，碘值越大吗？在测定碘值的实验中，氯仿的作用是什么？ 答：每100g 脂肪所吸收的碘的克数，即脂肪的碘值。脂肪的不饱和度越大，碘值就越大。氯仿作为溶剂，去溶解脂肪。 9.简述薄层层析法分离糖类的原理？答:薄层层析的实质就是吸附层析，也就 是在铺有吸附剂的薄层上，经过反 复地被吸附剂吸附以及被扩展剂扩展的过程。而吸附剂对不同的物质的吸附力不同，从而使糖在薄层上的泳动速度不同达到分离的目的。 10.等电点的定义？蛋白质在等电点时有哪些特点？ 答：当溶液的PH为一定数值时，其中的蛋白质正负电荷相等，即净电荷为 零，此时的PH值就是该蛋白质等电点。蛋白质在等电点时的溶解度最小。 11.在蛋白质显色实验的黄色反应中，反应原理是什么？实验结果为什么会出现深浅不一的黄色？
一、解词 1、总氮量水中各种形态无机和有机氮的总量 2、酶的抑制作用是指在某个酶促反应系统中，某种低相对分子质量的物质加入后，导致酶活力降低的过程。 3、酶的最适温度酶催化活性最高时的温度 4、蛋白质的等电点每个蛋白都存在一个pH使它的表面净电荷为零即等电点 5、盐析增加中性盐浓度使蛋白质、气体、未带电分子溶解度降低的现象 6、蛋白质变性蛋白质在某些物理和化学因素作用下其特定的空间构象被改变，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失6、酶的专一性酶对底物及其催化反应的严格选择性通常酶只能催化一种化学反应或一类相似的反应 7、激活剂能提高酶活性的物质大部分是离子或简单的有机化合物 8、抑制剂凡能使酶催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质 9、酶催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体 二、填空 1、球蛋白可在半饱和中性硫酸铵溶液中析出，清蛋白可在高盐浓度溶液中析出。 2、在PH3.0、和9.5时的电场中，卵清蛋白（PI4.6）移动方向分别为负移 动，正移动。 3、唾液淀粉酶的最适温度是37 4、还原糖与本乃狄试剂共热现象生成生成砖红色沉淀。 5、维生素C也称抗坏血酸，它具有很强还原性 6、用苔黑酚浓盐酸溶液可以鉴定核糖核酸 7、当溶液的PH低于蛋白质等电点时，蛋白质分子带正电荷；当溶液的 PH大于蛋白质等电点时，蛋白质分子带负电荷； 10．凯氏定氮法测定蛋白质含量消化终点颜色为清澈的蓝紫色色。 11．蛋白质变性的实质是空间结构被破坏。 12．常用的RNA提取方法有苯酚法、、高盐法等。 13、维持蛋白质亲水胶体稳定的因素是蛋白质颗粒表面的电荷层 和水化膜、 14、蛋白质在等电点时，主要以两性离子离子形式存在；当溶液的P H＞PI 时，蛋白质分子以负离子形式存在；当溶液的P H＜PI时，蛋白质分子带正离子形式存在。 15、蛋白质分子中氮的平均含量为 5.16% ，样品中的蛋白质含量常以测 氮量乘以 6.25 、即 6 。 三、选择 1、盐析法沉淀蛋白质的原理( ) A 与蛋白质结合成不溶性蛋白盐 B 次级键断裂蛋白质的构象改变 C 中和电荷，破坏水化膜 D 调节蛋白质溶液的等电点 2、以下哪项不是酶的特性（） A 酶是生物催化剂，催化效率极高 B 易受Ph，温度等外界因素的影响 C 能加速化学反应但不改变反应平衡点 D 有高度特异性 3、RNA和DNA的最大紫外吸收值是在（） A 280nm B 260nm C 510nm D 620nm 4、．凯氏定氮法使用的混合催化剂硫酸钾-硫酸铜配比为（） A 1:3 B 5:1 C 3:1 D 1:1
蔗糖酶测定（比色法）： 蔗糖酶是一种可以把土壤中高分子量蔗糖分子分解成能够被植物和土壤微生物吸收利用的葡萄糖和果糖的水解酶，为土壤生物体提供充分能源，其活性反映了土壤有机碳累积与分解转化的规律。 蔗糖酶能酶促蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。因此，蔗糖酶的活性可以根据水解生成物与某些物质（3，5-二硝基水杨酸或磷酸铜）生成有色化合物含量来确定。现介绍3，5-二硝基水杨酸比色法，该方法以蔗糖为基质，根据葡萄糖与3，5-二硝基水杨酸反应生成黄色产物，来确定土壤蔗糖酶活性。 试剂 1）3，5-二硝基水杨酸溶液：称取0.5克二硝基水杨酸，溶于20mL 2mol/L氢氧化钠和50毫升水中，再加入30克酒石酸钾钠，用水稀释至100mL（不超过一周）。 2）pH值为5.5的磷酸缓冲液：1/15mol/L磷酸氢二钠（11.867g Na2HPO4·2H2O溶于1升蒸馏水中）0.5毫升加1/15mol/L 磷酸二氢钾（9.078gKH2PO4溶于1升蒸馏水中）9.5毫升配成。 3）8％蔗糖溶液。 4）甲苯 5) 标准葡萄糖溶液：将葡萄糖先在50-58℃条件下，真空干燥至恒重。然后取500mg 溶于100ml蒸馏水中，即成葡萄糖标准溶液（5mg/ml）。再将此液稀释10倍制成葡萄糖工作液（0.5mg/ml）。 操作步骤 称取5g土，置于50mL三角瓶中，加入5滴甲苯，15min后注入15mL 8％蔗糖溶液和5mL pH 5.5磷酸缓冲液，摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。 到时取出，迅速过滤。从中吸取滤液1mL，注入50mL容量瓶中，加3mL3，5－二硝基水杨酸，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。溶液因生成3－氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50mL，并在分光光度计上于波长508nm处比色。 每一土壤需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。 在分析样品的同时，取0、1、2、3、4、5、6、7mL葡萄糖工作液，分别注入50mL容量瓶中，并按与测定蔗糖酶活性同样的方法进行显色，比色后以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
临床生物化学实验原理、分析方法及检测技术 中国中医研究院广安门医院临床检测中心 生物化学实验——是把化学(分析技术)和生物化学(实验反应原理)的方法应用于疾病的诊断、治疗、监控的实验分支。 一个生化实验的最后测定结果应包括四大部分来完成。 一、实验反应原理及分析方法（理论依据） 二、实验检测技术（手段）生化仪的分析技术。 三、质量控制程序（质量保证）室内质控、室间质评、仪器、试剂、人员五要素。 四、临床意义（目的）咨询服务、异常结果的解释。 实验反应原理及分析方法(理论依据) 一个生物化学实验的反应原理设计，首先要找出所检测的化学特性，如测定体液（首先是血液）中酶的含量血液中除少数酶（如凝血溶血酶、铜氧化酶及假性胆碱脂酶等）含量较多外，血液正常生理状况下含量微乎其微。一般每毫升含微微克（Pg）水平，要直接测定如此微量物质是相当困难的。用免疫化学方法可测定全部酶蛋白分子含量（不论其有无活性）而用化学方法测定只能测定酶的催化活性，间接计算出酶的含量。目前利用酶具有催化活性这一特性，在临床上已普遍应用测定酶蛋白，同时还可以测定三大代谢的产物，如糖、脂类、蛋白质、这样也就建立起利用酶促反应的一级反应测定代谢物的方法。一级反应—反应速度与底物浓度成正比，因此只有当酶反应为一级反应时，才能准确测定底物含量，（如测定血糖、总甘油三脂、总胆固醇等）。从此在临床试剂盒的方法中出现了以酶为试剂测定各种代谢产物。 临床化学方法的分类 特别是自动生化仪方法的特点 以往临床化学实验都采用比色法进行各个项目的测定，这是因为比色法具有微量、迅速、准确的优点，特别适合于微量的生物体体液中各项物质测定。 在一般比色法中，手工使用比色计或分光光度计可以测定各种反应溶液的吸光度，但由于很难控制测定时间和反应温度，很难准确记录反应过程中吸光度变化，因此，毫不奇怪在很长一段时间内我们所使用的方法，都是在呈色反应达到完全或者反应达到平衡时，吸光度达到稳定时才进行测定。即所谓平衡法或终点法。 但自从自动生化仪出现后，从根本上改变了上述情况。通过各项先进技术，人们可以精确测定反应的动态过程。并可以准确计算任何一段反应时间内的反应速率，这样大大开阔了临床化学家对方法选择。除经典的终点法外还可以进行动态测定。这样不仅缩短了操作时间，大大提高了工作效率，还可进行一些用常规比色方法不能进行的测定。如测定酶反应的初速 度（V o ）等等。测酶初速度（V o ）只能用分光光度法。 因此，用好自动生化仪一个重要前提必须对自动生化仪可以提供的测试方法类型有所了解。 生化自动分析仪特点： 1 精确测定反应的动态过程； 2 准确计算任何一段反应时间内的反应速率； 3 除经典的终点法外还可以进行动态测定。 分析方法的分类
《生物化学实验Ⅰ》总复习思考题 部分是自己做的，部分是百度的，各位看官如果要借鉴请酌情考虑，后果自负。 ——江湖游子 1. 请掌握下列生物化学实验常用仪器的正确操作使用方法，并能回答以下问题： （1）离心机使用时为什么要平衡？普通离心机与高速离心机在平衡时有什么不同要求？ 平衡是为了让转动物体重心正好在转轴上，如果不在，会对转轴产生很大作用力，有时整台机器会跟着晃动。这对机器损耗很大。转速越高的离心机不光重量很重，使用时还要特别放平衡，就连离心管里面的试液都要放置等量，离心管还要对称放入转子试管孔内，以确保转子平衡运行，而且在调节转速时，还要使用分段升速法。 (2)为什么用高速组织捣碎机进行动、植物组织捣碎时，需采用间歇式方式进行操作？ 为了防止产热过高，破坏组织内的蛋白质。防止蛋白变性。 (3)用真空泵进行减压抽滤时，为什么要连接缓冲瓶？ 防止负压产生，引起水泵里的水或油泵里的油倒吸，进入滤瓶中，污染滤液。 2.为什么肝糖元只能从刚宰杀的动物肝脏中获取？在提取肝糖元过程中，三氯乙酸、95%乙醇各起什么作用？糖元水解产物中如果存在提取中残留蛋白质时，在用班氏试剂检测水解产物，有什么影响！ 动物死亡后，体内的细胞还能存活一段时间，由于进行细胞呼吸作用，肝细胞会消耗肝糖元，所以必须用新鲜的肝脏细胞。三氯乙酸是固定作用（蛋白质能被三氯乙酸沉淀）；乙醇：糖元不溶于乙醇，可以提取糖元。班氏试剂使用时需要加热，而加热会时残留的蛋白质变性水解，对最终测得的水解产物颜色可能有影响。（水解的产生的氨气结合铜离子，是铜离子的氧化性失去，导致生产绛蓝色沉淀，实验将失败） 3.请阐述分光光度仪的主要部件及其功能；阐述紫外与可见光的光波长范围；在紫外与可见光范围内测定物质吸光度时，对光源与吸收池有何要求？光电管的功能是什么？为什么说光电管是分光光度仪最脆弱和最易损的部件？ 光源（钨灯）：发光。 单色器：把混合光波分解为单一波长光的装置。 吸收池：盛放待测流体（液体、气体）试样的容器。该容器应具有两面互相平行、透光且有精确厚度的平面。它藉助机械操作能把待测试样间断或连续地送到光路中，以便吸收测量的辐射（光）通量。 检测器：将单色器分出的光信号进行光电转换，电信号在工作站显示成出峰。 测量装置：通过测得的电流表·记录器·数字示值读书单元的数据来绘制吸收曲线。 紫外光：200至350nm 可见光波长:350至760nm 紫外测定：其应用波长范围为200～400nm的紫外光做光源，在低于350nm的紫外光区工作时，必须采用石英池或熔凝石英池。 可见光测定：用波长为400～850nm的可见光作光源，可以用玻璃池·石英池·熔凝池。 光电管的功能：光电转换，将光信号转化成电信号。 光电管容易产生光电管疲劳：所以不测定时必须将试样室盖盖好，使光路切断，以延长光电管的使用寿命。
实验报告-不同因素对酶的影响
成绩： 酶的基本性质实验一一底物专一性剂、激活剂和抑制、最适温度 实验名称: 实验类型： 分离鉴定实验 同组学生姓名： 一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填） 三、主要仪器设备（必填） 四、操作方法和实验步骤 五、实验数据记录和处理 六、实验结果与分析（必填） 七、讨论、心得 I .酶的基本性质——底物专一性 一、实验目的和要求 1. 了解酶的专一性。 2.掌握验证酶的专一性的基本原理及方法。 3.学会排除干扰因素，设计 酶学实验。二、实验基本原理 酶是一种具有催化功能的蛋白质。酶蛋白结构决定了酶的功能——酶的高效性，酶催化的 反应（酶促反应）要比相应的没有催化剂的反应快 103-1017倍。 酶催化作用的一个重要特 点是具有高度的底物专一性，即一种酶只能对某一种底物或一类底物起催化作用，对其他底物 无催化反应。根据各种酶对底物的选择程度不同，它们的专一性可以分为下列几种： 1. 相对专一性 一种酶能够催化一类具有相同化学键或基团的物质进行某种类型的反应。 2. 绝对专一性： 有些酶对底物的要求非常严格只作用于一种底物，而不作用于任何其他 物质。如脲酶只能催化尿素进行水解而生成二氧化碳和氨。如麦芽糖酶只作用于麦芽糖而不作 用其它双糖，淀粉酶只作用于淀粉，而不作用于纤维素。 3.立体异构专一性 有些酶只有 作用于底物的立体异构物中的一种，而对另一种则全无作用。如酵母中的糖酶类只作用于 D-型 糖而不能作用于 L-型的糖。 本实验以唾液淀粉酶、蔗糖酶对淀粉、蔗糖水解反应的催化作 用来观察酶的专一性。采用 Benedict 试剂检测反应产物。 Ben edict 试剂是碱性硫酸铜溶液，具有一定的氧化能力，能与还原性糖的半缩醛羟基 发生氧化还原反应，生成砖红色氧化亚铜沉淀。 Na 2CO+ 2H 2O 2NaOH + fCO CuSO+ 2NaOH Cu （OH ） ■ 2 + Na z SO 还原糖（一CHO or — C=O ）+ 2Cu （OH ） 2 CU 2O （砖红色或黄色）+ 2H 2O +糖的氧化产物 在分子结构上，淀粉几乎没有，而蔗糖、棉子糖全无半俪基，它们均无还原性，因此它 们与Ben edict 试剂无呈色反应。 淀粉被淀粉酶水解，产物为葡萄糖；蔗糖和棉子糖被蔗糖 酶水解，其产物为果糖和葡萄糖，它们都为具有自由半缩醛羟基的还原糖，与 Ben edict 试剂共 热，即产生红棕色 Cu2 O 沉淀。本实验以此颜色反应观察淀粉酶、蔗糖酶对淀粉和蔗糖的水解作 用。三、实验材料与试剂 1、实验材料⑴ 蔗糖酶（样品W ）:⑵新鲜唾液（含唾液淀粉酶）；2、实验试剂⑴ 蔗糖酶液 沖门七穿实验报告 课 程名称：生物化学实验（甲） 专业： 姓名： 学号： 日期： 地点： 指导老师：
土壤蔗糖酶活性测定 1.原理 采用3,5-二硝基水杨酸比色法。该方法以蔗糖为基质，基质在土壤蔗糖酶作用下生成葡萄糖，葡萄糖和3,5-二硝基水杨酸反应生成橙黄色的3-氨基-5-硝基水杨酸，并在508nm 波 长下有最大吸光值。 2.测定方法 ①称取壤土0.15g、砂土0.3g、粘土0.1g风干土于10mL离心管中，加入0.06 mL甲苯和 1mL ph5.5磷酸缓冲液，再加3mL 8%蔗糖溶液，摇匀后加盖，放进36~37C的培养箱中进行培养24 个小时； ②培养完成后取出，摇匀，并于4000r/min离心5min ； ③取上层清液0.2ml于20ml玻璃管中，并加入0.5ml3,5-二硝基水杨酸，再立即将玻璃 管沸水浴中加热5min，加热完毕后在自来水流下冷却3min ; ④将显色液体用蒸馏水稀释到5ml，在508nm波长下比色，记录吸光值。 3.蔗糖酶标准曲线的测定方法 （1 ）葡萄糖标准溶液的配制 a. 饱和苯甲酸溶液的配制 在洁净的烧杯中加入适量蒸馏水，慢慢加入少量苯甲酸同时用玻璃棒搅拌，直至苯甲酸溶解的同时出现析出的苯甲酸晶体为止。 b. 标准葡萄糖溶液的配制 称取500mg葡萄糖溶解于适量苯甲酸饱和溶液中，并取100ml容量瓶用苯甲酸饱和溶液定 容（5mg/ml）。 （2）. 操作步骤 a.取11 支洁净20ml 玻璃管编号0—10。 b.按下表加液 编号：0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 葡萄糖母液（ml）0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 饱和苯甲酸（ml）0.2 0.195 0.19 0.185 0.18 0.175 0.17 0.16 0.15 0.14 0.13 葡萄糖浓度（mg/ml）0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 吸光值（A508nm）0 0.05 0.117 0.227 0.31 0.392 0.49 0.666 0.839 1.006 1.176 c.在玻璃管中各加入0.5ml3,5- 二硝基水杨酸溶液，并立刻放入沸水浴中加热5min. 加热 后，立刻将玻璃管在流动自来水下冷却3min. 冷却完毕后，用蒸馏水定容至5ml. d.将显色液在508nm波长下比色。 4.计算 蔗糖酶活性以24h后1g 土壤中含葡萄糖的mg数表示。 葡萄糖（mg）=a x 100 a—从标准曲线查得的葡萄糖mg数 100—换算系数 小贴士：夏季养生常识 立夏已过，炎热的夏季来了。夏季是充满生气的季节，但同时也要特别注意养生保健。我们 该如何保持在炎热的夏季保持身体健康，从而享受这个夏季呢？让我来告诉大家几个夏季养生保健小常识吧。 1.夏季养生保健之多喝温水 每天要喝七八杯白开水，身体要随时保持水分和补充水分，水在人体内起着至关重要的作明，维
《生物化学》实验教学大纲 课程类别：专业基础 适用专业：本科临床学专业 课程总学时：实验学时：32 实验指导书：生物化学与分子生物学实验教程 开课实验室名称：生化实验室 一、目的和任务 生物化学是一门在分子水平上研究生命现象的学科，也是一门重要的实验性较强的基础医学课程．随着医学的发展，该学科已渗透到医学的各个领域。生物化学实验技术已被广泛地应用于生命科学各个领域和医学实验的研究工作。生物化学实验是生物化学教学的重要组成部分，它与理论教学既有联系，又是相对独立的组成部分，有其自身的规律和系统。我们根据国家教委对医学生物化学课程基本技能的要求，开设了大分子物质的常用定量分析法、酶活性分析、电泳法、层析技术、离心技术及临床生化，使学生对生物化学实验有一个比较系统和完整的概念，培养学生的基本技能和科学思维的形成，提高学生的动手能力。 二、基本要求 1.通过实验过程中的操作和观察来验证和巩固理论知识，加深学生对理论课内容的理解。 2.通过对实验现象的观察，逐步培养学生学会观察，比较，分析和综合各种现象的科学方法，培养学生独立思考和独立操作的能力。 3.通过对各类实验的操作和总结，培养学生严谨的科学态度。 4.进行本学科的基本技能的训练，使学生能够熟练各种基本实验方法和实验技术的操作。 三、考试方法及成绩评定方法 四、说明 实验教材及参考书： 1.揭克敏主编：生物化学与分子生物学实验教程（第2版）。科学出版社，2010 参考资料： 1..袁道强主编：生物化学实验（第1版）。化学工业出版社，2011 五、实验项目数据表
2）要求：0：必修1选修 3）类型：0：演示1：验证2：综合3：设计 4）每组人数：指教学实验项目中一次实验在每套仪器设备上完成实验项目的人数。 六、各实验项目教学大纲 实验一蛋白质的沉淀反应 【预习要求】 预习四个小实验的具体实验原理和操作内容。 【实验目的】 1. 加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识； 2. 了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。 【实验内容】 （一）蛋白质的盐折 1. 原理 大量中性盐类如硫酸铵((NH4)2SO4)、硫酸钠(Na2SO4)和氯化钠(NaCl)等加入到蛋白质溶液后，可引起蛋白质颗粒因失去水化膜和电荷而沉淀。各种蛋白质分子的颗粒大小和电荷数量不同，用不同浓度中性盐可使各种蛋白质分段沉淀。例如血清中的球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中沉淀。当硫酸铵浓度达到饱和时血清中的白蛋白使沉淀下来。盐析沉淀蛋白质时能保持蛋白质不变性，加水稀释降低盐浓度，能使沉淀的蛋白质重新溶解，并保持其生物活性。因此，利用盐析法可达到分离提纯蛋白质的目的。 2. 操作步骤 ①取小试管1支、加入5％鸡蛋清溶液20滴，饱和硫酸铵溶液20滴，充分摇匀后静置5min，记录结果。
生物化学实验 一、名词解释： 分配层析法电泳同工酶酶活性分光光度法层析技术比活力 二、填空题： 1. 测定蛋白质含量的方法有，，和。 2. CAT能把H2O2分解为H2O和O2，其活性大小以来表示，当CAT与H2O2反应结束，再用测定未分解的H2O2。 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳是以作为载体的一种区带电泳，这种凝胶是由和交联剂在催化剂作用下聚合而成。化学聚合法一般用来制备_____________胶，其自由基的引发剂是，催化剂是______________；光聚合法适于制备大孔径的_________________胶，催化剂是______________。 4.层析技术按分离过程所主要依据的物理化学性质进行分类，可分成以下几种：_______________，_______________，_______________，_______________和________________。 5. 使用离心机离心样品前，必须使离心管__________且对称放入离心机。 6. 米氏常数可近似表示酶和底物亲合力，Km愈小，表示E对S的亲合力愈，Km愈大，表示E对S 的亲合力愈。 7. 分光光度计在使用之前必须预热，注意预热及样品槽空时必须_________（打开、合上）样品池翻盖。 8. CAT是植物体内重要的酶促防御系统之一，其活性高低与植物的密切相关。 9. 纸层析实验中，____________形成固定相，____________流动相。 10. 聚丙烯酰胺凝胶是是由和交联剂在催化剂作用下聚合而成的，在具有自由基团体系时，两者就聚合。引发产生自由基的方法有两种：和。11. 层析技术按按固定相的使用形式进行分类，可分成以下几种：_______________，_______________，_______________和________________。 三、问答题： 1、简述4种测定蛋白质含量的方法及其原理。 2、简述不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳中的三个不连续及三种物理效应。 3、试分析影响电泳的主要因素有哪些？ 参考答案： 生物化学实验 一、名词解释： 1、电泳：指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。 2、同工酶：指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。 3、分配层析法：用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离目的的一种实验方法。