菌种得复苏传代及保存标准程序
目得:建立菌种得复苏、传代及保存标准程序、
范围:适用于检定用菌种得复苏、传代及保存得操作、
职责:质管部生物测定人员对本规程得实施负责。
内容:
菌种得复苏与传代操作均应在生物检定室阳性对照间或专用超净工作台内进行、操作中使用过得滴管、吸管及菌种管等均需放入消毒液中浸泡,试验结束后经1２1℃３0分钟高温灭菌处理。
１.菌种得复苏
1.1冻干菌种得复苏
检定用标准菌种,由中国药品生物制品检定所提供,为冷冻干燥菌种(0代)。使用前需将其复苏。
1．１.１准备:
①用具:灭菌1ｍl滴管、灭菌双碟、灭菌镊子、砂轮、酒精灯、接种环。
②培养基:根据菌种得性质选择合适得液体培养基(营养肉汤培养基或改良马丁培养基)、营养琼脂(或改良马丁琼脂)斜面数支。
③消毒液:7５%酒精、碘酒、0.1％新洁尔灭或84消毒液等。
1.１。2操作:
1。1。２.１将准备妥得冷冻菌种管、灭菌滴管、灭菌双碟及镊子、培养基移入工作台、
1.1.2。2用砂轮将冻干菌种管颈部挫出刻痕,再７5％酒精棉擦净菌种管外壁,放在灭菌双碟内待干。
1.1。2。3点燃酒精灯,将菌种安瓿得封口一端在火焰上灼烧红热,用灭菌滴管吸取液体培养基少许,滴在灼热得菌种安瓿封口一端,使其骤冷而炸裂。
１．1.2.4取灭菌镊子,在火焰旁,将炸裂得管口打开后,把菌种安瓿放入灭菌双碟内。
1．1。2、5另取一支灭菌滴管,在火焰旁吸取适用液体培养基少许,加至菌种管底部,将
冻干菌搅动促使溶解,随即吸出管内菌液,接种至液体培养基内、用接种环取菌液
划线接种于琼脂斜面培养基上。
1.1。2。6将已接种得液体培养基及琼脂斜面培养基置规定温度下(一般细菌在3０~35℃,真菌在23~28℃)培养24ｈ。
１。1.2。7 取出培养物(第1代),仔细观察菌苔形态、有无杂菌,必要时涂片、革兰氏染色镜检,若呈典型菌落即可应用。如发现菌型不典型,可进行平板分离单菌落。
１、２为保证工作用菌株得传代次数不超过5代,并减少购买冻干菌种得次数,可在对冻干菌种复苏得同时制备部分菌悬液(第1代)冷冻保存,并将此冻存菌液复苏后得第２代培养物冻存保藏。
1.２.1准备:①冻存保护液(４0%无菌甘油)及灭菌冻存管、
②细菌冻存液:由液体培养基与冻存保护液按1:１比例混匀制成。
1.２．２按1.１、２。1～1、1.２。４操作,将冻干菌复溶后,吸取菌悬液加入到细菌冻存液中,混匀。
１。２.3按1mｌ/管得量分装至灭菌冻存管中,密闭。标明菌名、编号及冻存日期等。置-２0℃或－80℃条件下冷冻保存。
１.2.４制备第２代冻存菌悬液时,可用接种环直接刮取第１代冻存菌悬液复苏后转种至琼脂斜面或平板培养基上生长得纯菌落,再接种至细菌冻存液中,混匀后按1.２。3冻存。
1。3冻存菌悬液得复苏:
1.3．1准备:
①用具:灭菌1ml滴管、酒精灯、接种环。
②培养基:根据菌种得特性选择适宜得液体培养基(如营养肉汤培养基10mｌ、硫乙醇酸盐流体培养基１2ml或改良马丁培养基1０ml等)、琼脂斜面或平板培养基。
③消毒液:75％酒精、０、1%新洁尔灭或84消毒液等、
1。3。2操作:
1。3。２。１从低温冰柜中取出菌种冻存管,室温下放置使其自然解冻。1．３。２、2将解冻后菌种管及灭菌滴管、液体培养基等移入工作台、
1.3．2、3用75％酒精棉球擦拭菌种冻存管外壁,稍干。
1.3.
2.4点燃酒精灯,在火焰旁打开菌种冻存管盖,用一支灭菌滴管吸取解冻得菌悬
液,接种至10ｍl液体培养基中(生孢梭菌需接种至12ml硫乙醇酸盐流体培养基中)。或用接种环取菌悬液划线接种于琼脂斜面或平板培养基上。
1．3。2。5将用过得滴管与菌种管投入消毒液内浸泡,接种环在火焰上灼烧。1.3。2.６将上述接种后得培养基在规定温度下培养(细菌在30~35℃恒温培养1８－24小时,真菌在2３~２8℃恒温培养2４—４8小时,黑曲霉＊培养5~7天)。１。3.2、７仔细观察培养物:如呈典型菌落即可作为日常工作中使用得菌种,注明菌名、编号、代次与接种日期后,置2~8℃冰箱内保存;如发现菌苔形状不典型,可进行平板分离单菌落、
1.3。２、8注意:已解冻得冻存管不可再冻存。
２。菌种得接种、传代
2、１.准备
①用具:接种环、酒精灯、
②培养基:营养琼脂或改良马丁琼脂斜面培养基或适宜得液体培养基。培养基应新鲜制备,如斜面已干缩,无冷凝水,则不宜再使用。
③消毒液:75%酒精、0、1%新洁尔灭或84消毒液、
④菌种:根据2010年版《中国药典》得要求,传代次数(ｎ)应不超过4代。
2。２将冰箱中取出得菌种斜面,在室温放置30分钟,待温度平衡后再移入接种室内或超净工作台。
2、3点燃酒精灯,将菌种管与接种管持在左手拇指、食指与中指之间,试管口斜向上,
两试管口平齐靠近火焰旁。
２、４用右手在火焰旁转动两管得棉塞,以便接种时易拔取,再以右手持接种环在火焰上烧红30秒钟,随后将全部铂金丝及金属棒部分在火焰上灼烧,往返通过3次、
2、5右手用无名指、小指及掌部夹住棉塞,左手将管口在火焰上旋转烧灼,右手再轻轻拔出棉塞,夹在无名指、小指及掌部,并勿使其与任何物品接触。
2。6将灼烧过得接种环插入菌种管内,先接触无菌苔生长得培养基上,待冷后,从斜面上挑取菌苔少许,取出时,接种环不能通过火焰,应在火焰旁迅速插入至接种管内液体培养基中,或在琼脂斜面得底部,由底向上,将接种环轻贴斜面得表面曲折移动,使细菌划在斜面得表面上,注意只划动一次,勿重复移动,且勿使菌苔沾在管
壁口。
2.7取出接种环,立即将管口通过火焰灭菌,右手到火焰旁将试管棉塞塞上,然后将接种过细菌得接种环在火焰上灼烧灭菌。
2、8已接种毕得各管贴好标签,注明菌名、编号、代次(ｎ+1)与接种日期,细菌管置３０~３5℃培养18～2４小时;真菌管一般置２3~2８℃培养24~48小时(黑曲霉需培养5~7天)。
2。９培养到期后取出培养物,仔细观察菌苔形态,就是否正常,并与上代菌种比较,有无杂菌、必要时涂片,革兰氏染色镜检,呈典型菌落即可作为日常工作中使用得菌种、如发现菌苔形状不典型,可继续进行平板划线培养,分离单菌落,挑选典型菌苔接种于营养琼脂斜面上,代替原有得工作用菌种。
2.10检查合格得工作用菌种,放入冰箱内2~8℃保存,一般１个月转种一次。
2.1１菌种(第n 代)接种至适宜培养基中,在规定得温度条件下得培养物,即为第n+1代、
注意:黑曲霉*致病性很强,操作时应特别注意:
①黑曲霉孢子相当稳定,其在０。9％氯化钠溶液中,4℃左右得条件下可以保存较长得时间,故可将此孢子悬液作为储备液在１~2月内使用,以减少反复操作得风险性、
②为防止黑曲霉孢子得传播,接种传代时应关闭风机,近酒精灯操作。
③若传代得母代菌种为菌悬液,则用无菌吸管吹吸管内液体,取１～２滴滴在改良马丁琼脂斜面,用吸管涂布均匀,置23~28℃培养5～７日。
④接种传代时,改良马丁斜面必须就是干燥得,否则影响其孢子得形成。
⑤接种传代后,使用过得器具均需在121℃,30分钟高压灭菌后再作处理。
３、菌种得保存:
3。1菌悬液冻存法:
冻干菌种(0代)复苏后,可按上述方法制备第1代菌悬液、第２代菌悬液进行冻存。
3.2琼脂斜面低温保存法:日常使用得工作用菌种可用此法在短期内保存。3．２。1将经常使用得菌种得典型菌落接种在斜面(某些特殊菌种可用液体培养基)上,按规定得温度与时间培养,待充分生长后,把培养好得新鲜菌种用牛皮纸包好,为减缓培养基得水分蒸发,延长保藏时间,可将菌种保藏管得棉花塞换成橡胶塞。放在4℃左右得冰箱中保藏。每隔 1个月移种一次,继续进行保藏。
３.２。2适用范围:细菌、酵母菌、真菌保藏。
3．2.4注意事项:
①保藏得菌种应就是生命活力旺盛得新鲜培养物,至少应就是第三代得培养物。
②保藏时,破伤风杆菌可用庖肉培养基;生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培养基。
③必须定期检查保藏菌种冰箱得温度、湿度以及菌种管得棉塞就是否松动或生霉,如有异常应及时处理。
④每次移植后,应与原菌种得编号、名称逐一核对,确证培养基特征与纯度无误后再继续保藏、
⑤铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡,应在室温下保存、
3、3液体石蜡保存法:利用石蜡将培养物与空气隔绝,以降低菌种得生理生化水平,并可防止水分蒸发,从而延长菌种得保藏期、?3。3。1方法:
3.3。１.1将菌种接种于斜面或穿刺于0。3～０.5 %琼脂半固体高层培养基中,培养好备用。
3．3.1、2取化学纯得液体石蜡装在试管中,每管１０～15ml,加棉塞,瓶口包上纸,１2１℃高压灭菌3０min,取出置37℃温箱或1１0～170℃烤箱中 1 ~２ h 或干燥器内除去液体石蜡中得水分、
3.３。1。3将上述液体石蜡加入培养好得菌种试管内,液体石蜡液面以高出培养基最上端 1 ㎝为宜,将试管直立,放入4℃冰箱中保藏。
３.３。2适用范围:适用于保藏部分霉菌,酵母菌与放线菌,对细菌保藏效果较差、
3.３。3注意事项:
①保藏时,用新鲜培养物接种,应检查纯度与特征后,方可进行保藏。
②保藏过程中,需经常观察斜面就是否干燥,如干燥,需重新移种。
③使用菌种时,先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一边,再用接种针挑取培养物接
种到新鲜斜面上培养,待长出新培养物后,再移种一次到新斜面上即可使用。
④将沾有少量液体石蜡得接种针浸于９5%酒精中片刻,再烧灼灭菌,以免直接在酒精
灯下烧灼时,液体石蜡四溅,引起污染。
⑤液体石蜡在菌种管中高出培养基得高度要严格控制,如太多,会影响菌种交换气体,使保藏效果不好;如太少,斜面容易干燥,将缩短保藏期。一般以高出斜面 1 ㎝为宜、⑥制备无菌液体石蜡时,每管装量不能太多,否则分装到菌种培养基中易造成污染、
４、菌种在传代、保存或使用过程中发现污染、变异,应及时销毁,不得用于常规检验。
5.菌种传代、保存及使用、销毁均应填写相应记录:《０代菌种保管使用记录》、《冻存菌种保管使用记录》、《菌种传代记录》、《菌种使用记录》及《菌种销毁记录》。
6.菌种按“检定菌管理制度”管理、
7。附录:
7.1菌种编号:传代复苏得菌种应有统一编号,编号方法为:菌种代号-G或W－代次—管号、
Ｇ表示用于冻存得菌种,W表示工作用菌种。
注:
①菌种代号:常用菌种得代号见下表:
②菌种购进得年、月:如06０8表示2006年８月购进
③菌种代次,用1、２、3、4、5表示。
④母代冻存菌种得编号,用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ…表示。
⑤菌种得序号,用1、２、３…表示。
7。2常用工作用菌种得生物学特征
①金黄色葡萄球菌
形态与染色:圆球形排列成典型得葡萄状,菌落直径为0.8～1、5mm,革兰氏染色阳性。
培养特性:
⑴在肉汤琼脂培养基、营养肉汤中,生长良好。在２8～3８℃生长较好,ｐH为４。5~9.８,以pH7。4左右最好、
⑵营养琼脂平板,培养24~48小时,形成圆形凸出、边缘整齐、表面光泽且金黄色得菌落,直径1~２mm(应挑选光滑型菌落)。
⑶营养肉汤培养基,生长迅速,经3７℃24小时培养呈均匀混浊,管底稍有沉淀,微微振摇即可上升,消散均匀。但培养基含有可发酵糖类或菌型变为粗糙型者,可出现自然凝集现象, ⑷抵抗力:在干燥情况下,可生存数月,在无糖培养基内生存数年。对热8０℃３０分钟才被杀死。在1%石炭酸液中1５分钟被杀死,碘酒中须１分钟,75%酒精中须数十分钟才被杀死、②藤黄微球菌
形态与染色:个体略大于葡萄球菌,直径0。5～3.５um,单个成双或四联状排列,或呈不规则得团块、革兰氏染色呈阳性。
培养特性:专性需氧菌,营养要求不高,最适温度为２5～30℃、在琼脂平板上培养可形成圆形凸起,光滑、不透明黄色菌落。在液体培养基中均为混浊生长、
③枯草杆菌
形态与染色:菌体细短棒状,０.7~0、8um宽,２。0～３、０uｍ长,单个或呈链状,两端半圆形,染色均匀。芽孢0、6~0.９um宽,1.0～1。5um长,椭圆形或圆柱形,常产生于菌体中央或接近中央。革兰氏染色呈阳性,能运动。
培养特性:
⑴营养琼脂平板:菌落表面粗糙,圆形,凹凸不平,边缘锯齿状,稍有蔓延,呈白色或微黄色,应挑选粗糙形菌落),本菌变异时可出现光滑型菌落。
⑵营养肉汤培养基中呈少量混浊并生沉淀,在液体表面形成皱状厚膜,粘附于试管壁上、
⑶培养最适温度3０~37℃,生长范围15～5５℃,兼性厌氧或需氧。
⑷抵抗力:菌体湿热５5℃,1小时即被杀死,芽孢能耐高温,1０0℃3小时才被杀死,12０℃4０分钟才被杀死。
④短小芽孢杆菌
形态与染色:本菌为杆状,革兰氏染色阳性,无荚膜,芽孢偏生,椭圆形,有动力。
培养特性:本菌与枯草杆菌相似,培养最适温度30～３7℃,生长范围１５~５0℃,兼性厌氧
或需氧。此外,短小芽孢杆菌有两点不同于枯草杆菌:在琼脂培养基上,大多数菌株得菌落为光滑型并变为微黄色,用于检定得菌种,应挑光滑型菌落;有些菌株营养需要生物素(维生素
H)及氨基酸。
⑤大肠埃希菌
形态与染色:短杆菌0。4~0。7uｍ宽,2~4um长,两端钝圆,大多数有５～8根鞭毛,运动活波,但亦有无鞭毛,不运动,不形成芽孢,革兰氏染色阴性。
培养特性:菌落扁平,光滑,圆润,在EMB琼脂平板上呈紫黑色,有金属光泽。
⑥白色念珠菌
形态与染色:本菌为革兰氏阳性,但染色不均匀,卵圆形,壁薄生芽得酵母样菌。大小为2、
5~4um。
培养特性:琼脂平板培养,菌落表面湿润粘稠,圆形,乳白色,微凸,边缘整齐。
⑦生孢梭菌
形态与染色:大多数菌株周身皆有鞭毛,能运动,并可形成杆状或梭状芽孢杆菌,菌体一般较粗
大,长约3～8um,宽约0。4～1、2uｍ。革兰氏染色呈阳性,菌体老化后常可变为阴性、
培养特性:本菌严格厌氧,培养得最适温度为37℃。在琼脂平板上培养24~4８小时,生长缓慢,菌落直径２~5mm,蔓延生长,边缘不规则,有锯齿状突起;在硫乙醇酸盐流体培养基中24～48小时生长良好,呈长絮状,伴有恶臭,再培养数日后菌体可自溶,液体由混浊变清、
⑧铜绿假单孢杆菌:
菌体长短不一,菌落粘连,培养基被染成绿色。革兰氏染色呈阴性。
Lａ型菌落:湿润扁平大山脉状,在营养肉汤培养基中呈易碎菌落,膜下菌液浑浊。
Sm型菌落:表面粗燥突起,呈乳头状,在营养肉汤培养基中形成厚膜,膜下菌液澄清、
⑨黑曲霉:
菌落为近乎透明得小圆点装或匍匐于培养基表面得不规则丝状物、镜检为3～10ｕm圆形。
接种至改良马丁培养基上先就是形成黄色菌落,后长出孢子。培养5~７天后可观察到斜面正面为黑褐色厚绒状,色泽均一,不应有杂色;斜面侧面无色,接近菌层培养基略带黄色。