[作者简介 ] 吴富忠 (1964-, 男 , 副主任技师 , 主要从事卫生理化检验工作。化学测定方法
蔬菜、水果及其制品中亚硝酸盐与硝酸盐的 HPLC 法测定吴富忠 , 王恒
(浙江省舟山市疾病预防控制中心 , 浙江舟山 316021
[摘要 ] 目的 :建立蔬菜、水果及其制品中亚硝酸盐与硝酸盐的高效液相色谱同时测定方法。方法 :样品中亚硝酸盐与硝酸盐用超纯水浸提或超声提取 , 经
活性炭脱色后过滤或离心沉淀 , 滤液或上清液经 0. 45 m 水相膜过滤后进样 , 在 Pheno m enex S AX 色谱柱上 , 以 0. 01mo l/L磷酸二氢钾为流动相进行分离 , 205n m 检测 , 外标法定量。结果 :该法最低检出量分别为亚硝酸盐氮 0. 1mg
/kg、硝酸盐氮 0. 07m g /kg。样品加标回收率 , 亚硝酸盐为 91. 0%~101. 9%、
硝酸盐为 94. 7%~106. 0%, RSD <5%。结论 :该方法操作较简单 , 灵敏度高 , 速度快 , 干扰少 , 结果准确 , 适用于蔬菜、水果及其制品中亚硝酸盐与硝酸盐的同时测定。
[关键词 ] 高效液相色谱法 ; 蔬菜、水果及其制品 ; 亚硝酸盐 ; 硝酸盐
[中图分类号 ] O 657. 7+2 [文献标识码 ] A [文章编号 ] 1004-8685(2010 11-2741-03 Determ ination of nitrite and nitrate in vegetables, fruits and derived products by HPLC
W U Fu -zhong , WAN G H eng
(ZhoushanM un icipa l Center for D isease Contro l and P reven tion , Zhoushan 316021, Ch i na
[Ab stract] O b jective :T o deve l op a m ethod for deter m i nati on o f n itr ite and n itrate in vegetables , fru its and derived products by h i gh perfo r m ance li qui d chroma tog raphy . M ethods :T he analytes w ere ex tracted w ith u ltrapure wa ter u ltrason icall y wave , and then deco l orated w it h active carbon or cen trifug ed , filtrate
o r supe rnate w as filtered by 0. 45 m filter membrane . T he sepa ration w as carr i ed out on a Phenom enex S AX co l u m n w ith 0. 01m o l/Lmonopotassi u m phospha te as m ob ile phase and detected at 205nm T he quantifica ti on w as acco m pli shed by exte rnal standard m ethod . Re s u lts :T he detection li m its o f thism e t hod f o r n i trite -n itrogen and n itrate-n i trogen w as 0. 1m g /kgand 0. 07mg /kg,and the recover i es w ere ranged fro m 91. 2%~101. 9%and 94. 7%~106. 0%respecti ve l y w it h R S D s l ess than 5%.Con clusi on :T he m ethod i s si m ple , sensiti ve , rap i d , practi ca, l accu ra te and w hich is su itab l e for the de ter m i na ti on o f nitrite and nitrate in vegetab l es , fru its and de ri v ed products .
[K ey words] HPLC ; V egetab l es ; F ru its and der i ved produc ts ; N itrite ; N itra te
蔬菜、水果及其制品中亚硝酸盐和硝酸盐的标准测定方法是 G B
/T15401-1994! 水果、蔬菜及其制品亚硝酸盐和硝酸盐含量的测定?和 GB
/T5009. 33-2010食品安全国家标准 ! 食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定? , 两标
准均采用盐酸萘乙二胺直接显色法和镉柱还原法测定 ; 其中 GB /T5009. 33-2010食品安全国家标准新增了离子色谱法。在标准检测方法中 , 硝酸盐的测
定 , 化学比色法需通过镉柱还原为亚硝酸盐 [1, 2]; 离子色谱法需将样品提取液经多种预处理小柱处理后才能进样且出峰时间较长 [2], 操作均较繁琐。本研究根据实际 , 将样品中亚硝酸盐和硝酸盐用去离子水浸提 , 活性炭脱色后过滤或离心沉淀 , 滤液或上清液经 0. 45 m 水相膜过滤 , 滤液直接进样 , 205n m 紫外检测 , 结果准确、快速 , 能同时测定蔬菜、水果及其制品中亚硝酸盐和硝酸盐。 1 材料与方法
1. 1 仪器
A g ilen t 1100液相色谱仪 (美国安捷伦公司 , 包括 Ag ilent Che m Stati on 工作站、四元梯度泵、真空脱气箱、恒温柱温箱、紫外检测器。
M illipore M illi-Q 纯水系统 (Mo lshe i m F rance; O r i on 828型 p H 计 (U S A ;
I KA T25可调高速匀浆机 (德国 ; SB2200超声波清洗器 (上海 Branson ; 水浴箱 ; 离心机 (4000r /mi n ; J Y 5002型电子天平 (精度 0. 01g, 上海精宏科器。
1. 2 试剂
0. 01mo l/L磷酸二氢钾 (HPLC 级 , 10%磷酸调 p H 至 3. 2 ; 10%磷酸 ; 220g /L乙酸锌 ; 106g /L亚铁氰化钾 ; 超纯水 (电阻率为 18. 2M #c m ;
标准储备液 :称取优级纯亚硝酸钠 0. 2463g 、硝酸钠 0. 2963g 溶于水并定容至 500m , l 浓度为 0. 1m g /ml(以氮计 , 下同。
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1. 3 色谱条件
检测波长 :205nm ; 色谱柱 :Phenomenex S AX 80A (250? 4. 6mm 5 m ; 流动
相 :0. 01m o l/L磷酸二氢钾溶液 (p H =3. 2; 流速 1. 5m l/mi n ; 柱温 :30%; 进样量10 l 。 1. 4 实验方法
1. 4. 1 试样测定取新鲜蔬菜中食用部分 , 用自来水洗去泥土 , 然后用去离子水漂净、凉干、切碎 , 水果 (去核及其制品剁碎后 , 称取 50g 左右样品与水按
1&1比例用高速匀浆机匀浆后称取 10g , 加约 80m l 水 , 70%水浴提取 20m i n , 冷却后各加 1m l 220g /L乙酸锌和 106g /L亚铁氰化钾溶液 , 水定容至 100m , l 加适量活性炭脱色 , 混匀后过滤或离心沉淀。滤液或上清液经 0. 45 m 滤膜过滤至自动进样器样品瓶中 , 进样 10 l 测定。液体样品按固形物含量不等
1&1~1&5直接用水稀释 , 从冷却后按固体样品方法处理。
1. 4. 2 标准曲线绘制各准确吸取 0. 1m g /ml 标准溶液 10. 0m l 于 50m l 容量瓶 , 用水稀释至刻度 , 配成 20. 0 g /ml 亚硝酸盐氮、硝酸盐氮溶液 , 再逐
级稀释 10倍稀释成 2. 00 g /ml 、 0. 20 g /ml 、 0. 02 g /ml 标准系列溶液 , 分别进样 10 l 。以亚硝酸盐氮、硝酸盐氮含量为横坐标 , 峰面积为纵坐标 , 绘制标准曲线。 2 结果与讨论 2. 1 实验条件选择
2. 1. 1 样品预处理由于蔬菜、水果及其制品中蛋白质、脂肪等大分子有机干扰物质含量极低 , 且此类样品中含有大量的水分 , 有形成分中除纤维素外主要是一些水溶性维生素、糖类、无机盐、有机酸等小分子物质。因此 , 样品中目标成分的提取与净化变得非常简单 , 只需用去离子水浸提后用活性炭脱色 , 以减少叶绿素等色素对测定的影响。试验了 70%水浴、不同时间直接浸提与加约 70%水后超声提取不同时间时的提取效果。试验结果表明在 70%温度时 , 两种提取方法在 15m in~60m i n , 提取效果相同。标准添加回收达到91%~106%。本法选用 70%水浴直接浸提 20m i n 。 2. 1. 2 色谱条件选择
2. 1. 2. 1 色谱柱不同的色谱柱因性能不同对目标成分的分离能力差异很大。文献资料中测定硝酸盐与亚硝酸盐基本上采用不同品牌的 C 18柱 [3,4, 7]或 OD S 柱 [5, 6], 因被测成分的强阴离子特性 , 需用离子对试剂与硝酸根、亚硝酸根阴离子形成中性缔合物才能测定。而色谱柱对含有离子对试剂的流动相进行初始平衡时 , 色谱柱吸收和释放离子对试剂的过程缓慢 , 色谱柱平衡较慢 , 需在确保保留值能重现后再进行测定 [4]。因此 , 根据被测成分的强阴离子特性 , 选用强阴离子交换柱 (SAX 进行测定。
2. 1. 2. 2 流动相流动相对被测成分与干扰成分的分离影响主要有三个方面 :流动相本身组成 ; 流动相浓度与流速 ; 流动相的 p H 值。高效液相色谱法中
流动相的选择随色谱柱和分离对象的不同而不同。本方法参考文献 [3~5, 7], 分别用磷酸二氢钾溶液、甲醇 -磷酸盐溶液和乙腈 -磷酸二氢钾溶液作流动相 , 并进行比对。试验结果表明 , 文献 [4, 5, 7]介绍的流动相在
, [3]分离 , ,
出峰快。
在其他条件相同下 , 流动相用 0. 02m o l/L和 0. 01mo l/L浓度的磷酸二氢钾溶液 , 目标成分的出峰时间 , 低浓度时亚硝酸根和硝酸根出峰时间显著延长。如在 p H 3. 2、流速 1. 0m l/mi n 时 , 亚硝酸根和硝酸根出峰时间分别从约 7. 2m i n 、 9. 8m i n 延长到 12. 5m i n 、 15. 5m i n , 且信号值相同。经试验 , 用 p H =3. 2的 0. 01m ol/L磷酸二氢钾溶液 , 流速为 1. 5m l/mi n 时目标组分间和目标组分与干扰成分间分离效果达到最佳 , 且目标成分出峰时间较流速为 1. 0m
l/mi n 提前到流速为 1. 0m l/mi n 流动相浓度 0. 02m o l/L磷酸二氢钾时相同。
流动相 p H 影响 :由于色谱柱性能关系 , 流动相的 p H 对目标组分分离度有很大影响。流速为 1m l/mi n , 0. 02m o l/L磷酸二氢钾溶液 p H ? 3. 7时 , 目标成分间分离不完全 , p H ? 3. 9两峰重叠 ; 而用稀磷酸调流动相 p H (3. 6时 , 两峰分离完
全 , 且亚硝酸根的出峰时间随流动相 p H 的降低明显提前 , 硝酸根的出峰时间延后 , 两目标组分的分离度增大 , 分离更加良好。 2. 1. 2. 3 柱温由于色谱柱为强极性阴离子交换柱 , 在固定其他条件下经试验 , 20%、 30%、 40%柱温时对目标成分分离与出峰时间基本不产生影响 , 本法采用 30%。
2. 1. 2. 4 波长参考文献 , 对亚硝酸盐和硝酸盐进行紫外吸收波长扫描 , 亚硝酸盐最大吸收波长为 202n m ~210n m, 硝酸盐最大吸收波长为 201nm ~206n m, 在200n m ~210nm 波长范围 , 最大吸光度相对平坦 , 大于 210n m 吸光度下降明显 , 本法选用 205n m 。
根据以上试验结果 , 选择优化色谱分离条件 :流动相为 0. 01m o l/LKH
2PO 4-H 3PO 4缓冲液 (p H =3. 2 , 流速 1. 5m l/mi n , 检测波长 205n m, 柱温30%。标准色谱图见图 1。
图 1 亚硝酸盐与硝酸盐标准色谱图 (1:NO -2; 2:NO -3
2. 1. 3 干扰试验常见的无机阴离子 C l -、 SO 2-4、 SO 2-3、 PO 3-4、CO 2-3、 F -等及山梨酸、苯甲酸、甜蜜素、糖精钠、安赛蜜等常用的食品添加剂 , 对硝酸盐和亚硝酸盐测定不产生干扰。 2. 2 线性范围与最低检出限
2. 2. 1 线性范围在本实验条件下 , 亚硝酸盐氮与硝酸盐氮含量在 0. 02 g /ml ~20. 0 g /ml 范围 , 标准含量 C 与峰面积 A 有良好的线性关系 , 标准系列回归方程
分别为 A =160. 842C +0. 4487, A =340. 098C+0. 3612其相关系数均大于 0. 9995。 2.
2. 2 最低检出限取浓度为 0. 020 g /ml 标准溶液进样 10 l 分析 , 按 3倍声噪比(S /N 计 , 本法最低检出限为 0. 005 g /ml 、 0. 0035 g /ml 。若取 5. 0g 原样品提取定容至 100m l 测定 , 对应的最低定量检出量为 0. 1m g /kg、 m 2742中国卫生检验杂志 2010年 11月第 20卷第 11期 Ch i nes e J ournal ofH ealt h Lab oratory T echnol ogy , N ov 2010; Vol 20 No 11
2. 3 方法加标回收率试验
取 10g 左右 1&1打成匀浆软包装蔬菜制品和腐菜样品 , 分别加入 20 g /ml 的标准液 1. 00m l 、 5. 00m l 、 50. 0m , l 按 1. 4实验方法提取后测定 , 结果见表1。
表 1 加标回收试验结果
样品编号 NO -2
-N 本底值 ( g /m l 加标量
( g /ml 加标测定值 ( g /ml 回收率 (% NO -3
-N 本底值 ( g /ml 加标量 ( g /m l 加标测定值 ( g /m l 回收率
(% 1ND 0. 200. 18291. 03. 206///2ND 1. 000. 99299. 2
3. 206
1. 004. 246104. 03ND 10. 0010. 08100. 83. 20610. 0013. 4310
2. 240. 1510. 200. 34195. 0
0. 613
0. 200. 825106. 050. 1511. 001. 170101. 90. 6131. 001. 59798. 46
0. 151
10. 00
10. 11
99. 6
0. 613
10. 00
10. 08
94. 7
注 :ND:
未检出
2. 4 方法精密度试验
在新鲜蔬菜、软包装蔬菜制品和果汁样品 , 分别加入 100 g 标准液 , 各测定 6次 , RSD 值 NO -2在 1. 59%~4. 37%、 NO -3在 2. 07%~4. 68%之间。 2. 5 方法比较
用本法和 GB 5009. 33-2010食品中亚硝酸盐与硝酸盐测定不同样品进行方法比对 , 结果见下表 2。将数据各自进行配
对 t 检验 , 计算得 t 亚硝酸盐 =1. 272, t 硝酸盐 =1. 228, 查 t 值表 , 均小于 t 0. 2, 4=1. 533, 故 P >0. 2, 2组结果均无显著性差异。因此两种检测方法的测定结果无显著性差异。 (亚硝酸盐测定配对 t 检验时 , 统计量指标中 ND 取 1/2值。
表 2 国标法与本法对不同样品测定结果
检测项目样品名称亚硝酸盐 (mg /kg本法国标法硝酸盐 (mg /kg本法国标法新鲜蔬菜苹果软包装榨菜瓶装果汁腐菜
ND ND ND ND 3. 00
ND ND ND ND 2. 94
2. 734. 7864. 34. 6412. 3
2. 685. 0866. 24. 5112. 5
注 :ND :表示小于方法检出限 (本法 ND<0. 1m g/kg, 国标法 ND<0. 2m g/kg
3 小结
试验采用 25c m Phenom enex S AX 强阴离子交换色谱柱 , 以 0. 01m o l/L磷
酸二氢钾溶液 (p H =3. 2 为流动相 , 流速 1. 5m l/mi n , 检测波长 205n m; 柱温30%条件下 , 同时测定水果、蔬菜及其制品亚硝酸盐和硝酸盐含量 , 具有快速简便、准确、灵敏度高、检测限低 , 测定结果与国标比色法一致 , 充分满足水果、蔬菜及其制品亚硝酸盐和硝酸盐含量的有效分离测定。
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(收稿日期 :2010-07-12
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